DE102015201148B4

DE102015201148B4 - Verwendung von Phenylphosphaten und deren Prodrugs als Arzneimittel in der Krebstherapie

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Publication number: DE102015201148B4
Application number: DE102015201148.8A
Authority: DE
Inventors: Thorsten Berg; Nagarajan Elumalai; Angela Berg; Kalaiselvi Natarajan
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2021-08-05
Anticipated expiration: 2035-01-24
Also published as: DE102015201148A1

Abstract

Verwendung einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I)wobei:- n 2 ist,- m eine ganze Zahl von 1 bis 2 ist,- p 0 ist,- der Linker L ist C(R2)2, O, NR2, NR2C(=O), NR2C(=O)CH2, NR2C(=O)O, wobei R2H, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C1bis C15-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C1bis C10-Alkoxyrest,- Q Sauerstoff (O), CH2oder CF2ist, wobei wenn n = 2 die beiden Q voneinander unabhängig ausgewählt sind,- X ist O, S, NR2oder CH2,- R1ist H, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C1bis C15-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Alkoxyrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder polyzyklischer C5bis C15-Arylrest, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Phenyl-, Biphenyl-, Naphthalinyl-, Benzophenon-, Benzylbenzol-, Fluorenyl- und Triphenylmethan-Rest, oder ein gegebenenfalls polyzyklischer und/oder substituierter Fünfring- oder Sechsring- C5bis C15-Heterozyklus, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Dibenzofuran-, Xanthen-, Carbazol- und Phenothiazin-Rest, und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der Formel (IIIa) oder (IIIb)wobei:R° ausgewählt ist aus einer Acetyl-, Propionyl-, n-Butanoyl-, Isobutanoyl-, sec-Butanoyl-, Pivaloyloxymethyl-, Propyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, sec-Butyl-, Benzyl-, Isopropyloxycarbonyloxymethyl, tert-Butyl-Oxycarbonyloxymethyl-, S-Acyl-2-thioethyl-, S-Acylthiopropyl- oder Hydroxyethyl-disufanylethylgruppe, und wobei:- i 0 oder 1 ist,- A und B unabhängig voneinander CH2, CH-Ar, Carboxyl, Carbamoyl, Carbonat, Carbamid, Carbamat, Urea, wobei Ar ein gegebenenfalls substituierter Arylrest, insbesondere Phenyl- oder Pyridinrest, ist, der insbesondere substituiert ist mit Halogen (F, Cl, Br), OH, einem C1-6-Alkylrest oder einem C1-6-Alkoxyrest, einzeln oder als Gemisch dieser als Arzneimittel für eine Anwendung in der Krebstherapie.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Phenylphosphaten, deren Prodrugs und deren (pharmazeutisch) akzeptablen Salzen als Arzneimittel für die selektive Inhibierung des STAT5-Proteins, insbesondere für die Anwendung in der Krebstherapie.
Von einigen Krebsarten weiß man, dass sie von vornherein schlecht auf eine Behandlung mit Zytostatika ansprechen. Aber auch bei Patienten mit eigentlich gut behandelbaren Krebsarten kann die Therapie nach einiger Zeit versagen. Ein möglicher Grund sind Resistenzen, wodurch die Tumorzellen gegen Zytostatika unempfindlich werden. Einige dahinter stehende biologische Prozesse sind bekannt.
So konnte gezeigt werden, dass die Behandlung verschiedener Tumorzelllinien mit Zytostatika zu einer verstärkten Expression zellulärer Proteine führt, die zum Schutz und zur Stabilisierung der korrekten Faltung von Rezeptoren, Enzymen und zellulären Strukturproteinen wichtig sind.
Hierbei ist das intrazelluläre STAT5b-Protein (Signal Transducer and Activator of Transcription 5; hiernach auch Transkriptionsfaktor STAT5) biologisch hervorragend validiert und bietet ein wünschenswertes Target für die Behandlung von Leukämien und anderer Krebsarten, wie zum Beispiel Brustkrebs und Krebs des Kopf- und Nackenbereichs (H. Yu, R. Jove, The STATs of cancer--new molecular targets come of age. Nat Rev Cancer. 2004 Feb;4(2):97-105.). STAT5-Hemmstoffe sind zudem von besonders großem Interesse bei Patienten, die gegen Hemmstoffe der Proteinkinase Bcr-Abl resistent geworden sind. Zu diesen Medikamenten zählen unter anderem Glivec (auch Gleevec oder Imatinib genannt, Fa. Novartis), Tasigna (Nilotinib, Fa. Novartis), Sprycel (Dasatinib, Fa. Bristol-Myers Squibb), Bosulif (Bosutinib, Fa. Pfizer), oder Iclusig (Ponatinib, Fa. Ariad Pharmaceuticals).
Anderson et al. offenbaren steroidale und nicht-steroidale Phosphatester wie Lauroyltyraminphosphat für die Inhibierung der Steroidsulfataseaktivität (C. Anderson et al., Estrone sulfatase: probing structural requirements for substrate and inhibitor recognition. Biochemistry 1997, 36(9):2586-2594). Anderson et al. beschreiben die Sulfatierung von Steroiden als bedeutenden Prozess im Steroidkreislauf, das Vorhandensein deutlich höherer Östronsulfataseaktivität in Brustkrebsgewebe als in gesundem Gewebe sowie die Stimulierung von Brustkrebs durch Steroide wie Östronsulfat als Voraussetzung für deren Wachstum. Anderson et al. weisen daher auf Steroidsulfatasen als mögliches Ziel für die Krebsbehandlung hin.
Hopper et al. offenbaren Lysophosphatidsäure-analoge Verbindungen und deren Interaktion mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zur Calciumionenmobilisierung (D. W. Hopper et al. Structure-activity relationships of lysophosphatidic acid: Conformationally restricted backbone mimetics. Journal of Medicinal Chemistry 1999, 42(6): 963-970).
Chanley und Gindler beschreiben Carboxylnaphthylphosphate und deren Hydrolysemechanismus (J. D. Chanley, E. M. Gindler, The mechanism of hydrolysis of organic phosphates. II. O-Carboxymaphthyl Phosphates. Journal of the American Chemical Society 1953, 75:4035-4040).
EP 2 057 173 B1 offenbart substituierte Phenylamide als Sphingomyelinaseinhibitoren, deren Vorläuferverbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen und Verwendung für die Behandlung von durch Sphingomyelinaseaktivität vermittelten Störungen, u. a. septischen Schock, Autoimmunerkrankungen, Lungenemphysem oder Tumorwachstum.
Björefors et al. beschreiben tyrosinanaloge Thiole wie phosphorylierte Tyrosinthiole zur Bildung von selbstorganisierenden Monolagen auf Goldoberflächen (F. Björefors et al., Electrochemical impedance spectroscopy for investigations on ion permeation in ω-functionalized self-assembled monolayers. Analytical Chemistry 2007, 79(21):8391-8398).
Nakaya et al. offenbaren Poly(phosphatidylcholin)-Analoga als mögliche Bausteine für biologische Membrane (T. Nakaya et al., Poly(phosphatidylcholine) Analogues. Macromolecules 1989, 22(9):3180-3181).
Lober et al. beschreiben die Erzeugung und Charakterisierung spezifischer Antikörper gegen O,O-Diethyl-O-(p-Nitrophenyl)-phosphat (Paraoxon) (M. Lober et al., Erzeugung und Charakterisierung von Antiseren gegen O,O-Diäthyl-O-(p-nitrophenyl)-phosphat (Paraoxon). Acta biologica et medica Germanica 1982, 41(5):487-496).
WO 94/03461 beschreibt Diphosphate von Catecholaminen nach Formel (I) sowie deren pharmazeutische Formulierungen zur Verwendung von kardiovaskulären oder Nierenerkrankungen
Es existieren zwei STAT5-Proteine, die in ihrer Aminosäuresequenz zu 93% identisch sind. Sie besitzen redundante und nicht-redundate Funktionen. Jüngste wissenschaftliche Erkenntnisse weisen darauf hin, dass insbesondere die selektive Hemmung von STAT5b (ohne Hemmung von STAT5a) therapeutisch wertvoll für die Behandlung Bcr-Abl-abhängiger Leukämien sein könnte. (Schaller-Schönitz M, Barzan D, Williamson AJ, Griffiths JR, Dallmann I, Battmer K, et al. BCR-ABL affects STAT5A and STAT5B differentially. PLoS One 2014, 9(5): e97243). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind allerdings noch keine Hemmstoffe für das STAT5-Protein kommerziell verfügbar - es gilt als sehr anspruchsvolles Target.
Weiterhin sind bislang überhaupt keine Verbindungen bekannt, die STAT5b mit Selektivität gegenüber STAT5a hemmen.
Es besteht daher ein ausgeprägtes Interesse und ein großer Bedarf an effizienteren STAT5-Inhibitoren, die das STAT5-Protein selektiv und direkt inhibieren und in Zusammenhang mit der Anwendung in einer multifaktoriellen Kombinationstherapie, insbesondere für die Krebstherapie eingesetzt werden können. Bisher bekannte STAT5-Inhibitoren werden im Konzentrationsbereich von ca. 3 µM - 50 µM eingesetzt.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile zu beseitigen bzw. zu minimieren und chemische Verbindungen bereitzustellen, die den Transkriptionsfaktor STAT5, insbesondere STAT5b, möglichst selektiv und potent inhibieren, insbesondere zur Anwendung in der Krebstherapie bereitzustellen.
Zur Lösung der Aufgabe erfolgt die Verwendung der Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I), nachfolgend entsprechend Phenylphosphate bzw. Phenylphosphonate genannt, angegeben:
wobei:

- n 2 ist,
- m eine ganze Zahl von 1 bis 2 ist,
- p 0 ist,
- der Linker L ist C(R²)₂, O, NR², NR²C(=O), NR²C(=O)CH₂, NR²C(=O)O, wobei R² H, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₅-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₀-Alkoxylrest,
- Q Sauerstoff (O), CH₂ oder CF₂ ist, wobei wenn n = 2 die beiden Q voneinander unabhängig ausgewählt sind,
- X ist O, S, NR² oder CH₂,
- R¹ ist H, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₅-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Alkoxylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder polyzyklischer C₅ bis C₁₅-Arylrest, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Phenyl-, Biphenyl-, Naphthalinyl-, Benzophenon-, Benzylbenzol-, Fluorenyl- und Triphenylmethan-Rest, oder ein gegebenenfalls polyzyklischer und/oder substituierter Fünfring- oder Sechsring- C₅ bis C₁₅-Hetrozyklus, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Dibenzofuran-, Xanthen-, Carbazol- und Phenothiazin-Rest,

Vorteilhaft inhibieren die Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) das STAT5-Protein durch eine selektive und spezifische Interaktion.
Der Vorteil der Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) für die Anwendung in der Krebstherapie besteht darin, dass diese Verbindungen eine mindestens 50fach höhere Aktivität für die selektive Inhibierung des STAT5-Proteins aufweisen als derzeit bekannte Verbindungen.
Einzigartig ist die Selektivität der Substanzen für das Protein STAT5b gegenüber STAT5a. Bevorzugt weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber STAT5b eine mehr als 30-fach höhere Aktivität auf, als gegen STAT5a. Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung können die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verwendet werden, um selektiv die Funktion von STAT5b und STAT5a in deren natürlicher Umgebung, insbesondere in genetisch nicht modifizierten biologischen Systemen, zu untersuchen.
So weisen die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) insbesondere gegenüber dem STAT5b-Protein besonders vorteilhaft bereits eine Aktivität im submikromolaren Wirkstoffkonzentrationsbereich auf. Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden die Phenylphosphate der Formel (I) mit einer Wirkstoffkonzentration im Bereich von 1 nmol/L bis 1000 µmol/L, bevorzugt im Bereich von 10 nmol/L bis 100 µmol/L, besonders bevorzugt 100 nmol/L bis 50 µmol/L eingesetzt.
Die Selektivität der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) für STAT5b gegenüber STAT5a ist aber kein Ausschlusskriterium für die in dieser Anmeldung beschriebenen Substanzen. Eine vergleichbare starke Aktivität der Substanzen gegen beide STAT5-Proteine oder sogar bevorzugte Hemmung von STAT5a gegenüber STAT5b durch die Substanzen konnte ebenfalls beobachtet werden. „Inhibierung des STAT5-Proteins“ bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass durch Interaktion des STAT5-Proteins, vorzugsweise des STAT5b-Proteins mit einer niedermolekularen Verbindung, bevorzugt den Phosphaten bzw. Phosphonaten der allgemeinen Formel (I) die Phosphorylierung von STAT5b an Tyr699 bzw. die Phosphorylierung von STAT5a an Tyr694 inhibiert wird. Besonders vorteilhaft verliert das STAT5-Protein, vorzugsweise das STAT5b-Protein, durch Interaktion mit den Phosphaten bzw. Phosphonaten der allgemeinen Formel (I) die Fähigkeit zur Interaktion mit krebsauslösenden Bindungspartnern (bspw. Proteinen) und zugleich wird vorteilhaft die Einleitung der Apoptose induziert (bspw. durch stimulierte Aktivität von Caspasen). Caspasen sind in Tieren die wichtigsten Enzyme der Apoptose (programmierter Zelltod).
Bei in vitro Versuchen wurde nun gefunden, dass die Verbindungen der Formel (I) gegenüber dem STAT5b-Protein eine mittlere inhibitorische Konzentration (IC₅₀) im Bereich von 10 nmol/L bis 500 µmol/L, bevorzugt im Bereich von 100 nmol/L bis 100 µmol/L aufweisen.
Als niedermolekulare, organische Verbindung werden im Sinne der Erfindung molekulare Verbindungen verstanden, die primär aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff aufgebaut sind und vorzugsweise ein Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 1200 g/mol, insbesondere von 150 bis 750 g/mol, vor allem 200 bis 650 g/mol aufweisen.
Niedermolekulare, organische Verbindungen weisen gegenüber großen Molekülen (bspw. Nukleotid-basierende Inhibitoren wie Antisense-Oligonukleotide oder RNA-Oligonukleotide) den signifikanten Vorteil auf, dass diese eine wesentlich bessere Handhabbarkeit und Stabilität unter physiologischen Bedingungen aufweisen. Ferner sind niedermolekulare, organische Verbindungen zumeist zellgängig und daher leichter in die Zelle oder einen Organismus zu applizieren.
Erfindungsgemäß erfolgt die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) derart angepasst, dass zwei Phosphatgruppen bzw. Phosphonatgruppen am Phenylring des Phenylphosphats lokalisiert sind, sodass n = 2 ist.
Durch diese Anpassung des Phenylphosphats bzw. des Phenylphosphonats, weisen die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) besonders vorteilhaft eine IC₅₀ im submikromolaren, besonders bevorzugt im nanomolaren Konzentrationsbereich auf. Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) als Bisphosphate, d.h. Q ist Sauerstoff (O) und n=2, ausgestaltet, da insbesondere diese Verbindungen selektiv gegenüber dem STAT5b-Protein eine Aktivität im submikromolaren Wirkstoffkonzentrationsbereich aufweisen, ohne die Funktion des STAT5a-Proteins in diesem Konzentrationsbereich wirksam zu inhibieren.
Die Bindungsaffinität der Verbindung der allgemeinen Formel (I) zum STAT5-Protein wird u.a. von der Art des Substituenten R bestimmt. Bevorzugt ist R ein hydrophober Substituent ausgewählt aus H, einem gegebenenfalls verzweigten C₃-C₁₂-Alkylrest, wie bspw. n-Propyl-, iso-Propyl, n-Butyl-, iso-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl-, n-Hexyl, n-Heptyl-, n-Oktyl-, iso-Oktyl-, n-Nonyl-, iso-Nonyl-, n-Dodecyl-Rest, einem gegebenenfalls polyzyklischen und/oder substituierten Fünfring- oder Sechsring-Hetrozyklus und einem gegebenenfalls polyzyklischen und/oder substituierten Arylrest.
Unter einem „polyzyklischen Arylrest bzw. Heterozyklus“ im Sinne dieser Erfindung soll ein konjugiertes System verstanden werden, das mindestens zwei Arylene (bspw. Phenylen, Naphthylen) enthält, die direkt miteinander verbunden sind, d.h. in Konjugation miteinander stehen. Dabei können die Arylene auch über einen Elektronendonator (bspw. Stickstoff, Sauerstoff, CH₂) direkt miteinander verbunden sein und damit die Planarität des Systems herbeiführen, wie bspw. bei einem Fluorenyl-, Benzophenon-, Benzylbenzol-, Xanthen-, Carbazol-, Phenoxyphenyl-, Phenothiazin- oder Triphenylmethan-Rest.
Insbesondere zeigten Verbindungen der allgemeinen Formel (I), bei denen der Substituent R ein gegebenenfalls polyzyklischer und/oder substituierter Arylrest, ganz besonders bevorzugt ein Fluorenyl-, Phenyl-, Biphenyl-, Naphthalinyl-, Benzophenon-, Benzylbenzol-Rest ist eine besonders hohe Bindungsaffinität zum STAT5-Protein (d.h. niedriger IC₅₀-Wert). Vorzugsweise weisen derartige Verbindungen der allgemeinen Formel (I), bei denen R wie vorstehend definiert ist, gegenüber dem STAT5-Protein einen IC₅₀-Wert im Bereich von 10 nmol/L bis 1,5 µmol/L auf, besonders bevorzugt im Bereich von 50 nmol/L bis 1 µmol/L.
Nach einer alternativ bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist R ein gegebenenfalls verzweigter C₃-C₁₀-Alkylrest, insbesondere ausgewählt aus n-Propyl-, iso-Propyl, n-Butyl-, iso-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl-, n-Hexyl, n-Heptyl-, tert-Heptyl, n-Oktyl-, iso-Oktyl-, sec-Oktyl-n-Nonyl-, iso-Nonyl-, sec-Nonyl-Gruppe. Derart substituierte Verbindungen der allgemeinen Formel (I), bei denen R wie vorstehend definiert ist, weisen gegenüber dem STAT5-Protein einen IC₅₀-Wert im Bereich von 250 nmol/L bis 2 µmol/L, besonders bevorzugt im Bereich von 80 nmol/L bis 3 µmol/L auf.
Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I), bei denen R² ein Wasserstoff (H) ist.
Bei Verbindungen der allgemeinen Formel (I) kann vorgesehen sein, dass L einen von H abweichenden Substituenten R¹ aufweist. Dabei wurde nun überraschend gefunden, dass insbesondere im Fall das R¹, wie vorstehend für R näher definiert, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₃ bis C₁₂-Alkylrest ist, niedrige IC₅₀-Werte erreicht werden. Dies ist ein Beleg für die hohe Bindungsaffinität dieser Verbindungen.
Typische Beispiele für Phenylphosphate der allgemeinen Formel (I) (mit dem jeweiligen Mittelwert der IC₅₀ gegenüber dem STAT5b-Protein in µmol/L und Standardabweichung) sind:
Typische Vertreter für Phenylphosphonate der allgemeinen Formel (I) mit n 2 und entsprechend p = 0 sind:
R⁹= R¹⁰ = CF₂PO(OH)₂ für alle Substanzen gilt: n =1 oder 2
R⁹= R¹⁰= CF₂PO(OH)₂ für alle Substanzen gilt: n =1 oder 2
Dem gegenüber zeigten typische Vergleichsverbindungen, wie bspw. die nachstehenden Verbindungen, keine (messbare) inhibitorische Aktivität gegenüber dem STAT5-Protein:
Von der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen wie pharmakologisch akzeptable Salze, Prodrugs, Enantiomere, Diastereomere, racemische Gemische, kristalline Formen, amorphe Formen und Solvate, aufweisend eine Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I), für die Verwendung als Arzneimittel in der Krebstherapie und die Behandlung von Mukoviszidose mitumfasst.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können erfindungsgemäß auch in Form ihrer pharmakologisch akzeptablen Salze vorliegen. Unter einem pharmakologisch akzeptablen Salz sind im Sinne der vorliegenden Erfindung chemische Verbindungen einer Verbindung gemäß Formel (I) aus positiv und negativ geladenen Ionen zu verstehen, die in Abhängigkeit der Substituenten des Phosphats bzw. Phosphonats bspw. durch Behandlung mit einer schwachen, pharmazeutisch akzeptablen Säure oder Base erhalten werden können.
Bevorzugt sind die pharmazeutisch akzeptablen Salze zusammengesetzt aus der korrespondierenden Base der Verbindungen der Formel (I) und einfach- oder mehrfach positiv geladenen Gegenionen, insbesondere ausgewählt aus Alkalimetall- und Erdalkalimetallionen, wie Natrium-, Kalium-, Calcium,- oder Magnesiumsalze. Außerdem bevorzugt sind pharmakologisch akzeptable Salze von den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) Ammoniumsalze mit Ammoniak oder organischen Aminen, wie bspw. Mono- oder Diniederalkylaminen, z.B. Methylamin, Ethylamin, Dimethylamin oder Diethylamin, oder mit gegebenenfalls niederalkylierten Mono- oder Di(hydroxylalkyl)-aminen, oder mit Tri(hydroxyalkyl-)aminen, z.B. 2-Aminoäthanol, 2-(Diethylamino)-ethanol, 2,2'-Iminodiethanol, N-Methyl-2,2'-iminodiethanol oder 2,2' ,2"-N itrilotri-ethanol.
Zur Erleichterung der Resorbierbarkeit der Verbindungen oder um insbesondere eine Zersetzung von oral verabreichten Verbindungen im Magen-Darmtrakt zu verhindern, kann es von Vorteil sein, gewisse funktionelle Gruppen einer pharmazeutisch aktiven Verbindung durch die Umsetzung mit einem pharmazeutisch geeigneten Maskierungsmittel zumindest temporär zu maskieren.
Von der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von pharmakologisch unbedenklichen Prodrugs von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) einzeln oder als Gemisch dieser als Arzneimittel für eine Anwendung in der Krebstherapie umfasst. Als Prodrugs werden beispielsweise Ester, Ether oder Amide von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder sonstige Verbindungen bezeichnet, die im Organismus zu Verbindungen der allgemeinen Formel (I) metabolisieren.
Erfindungsgemäß erfolgt auch die Verwendung von Vorläuferverbindungen (auch Prodrugs) von Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) der allgemeinen Formel (IIIa) bzw. (IIIb):
wobei die Variablen n, m, L, X und R¹ die gleiche Bedeutung wie vorstehend definiert haben:

- n ist 2,
- p ist 0,
- m ist eine ganze Zahl von 1 bis 2,
- L ist C(R²)₂, O, NR², NR²C(=O), NR²C(=O)CH₂, NR²C(=O)O, wobei R² H, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₅-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₀-Alkoxylrest,
- Q Sauerstoff (O), CH₂ oder CF₂ ist, wobei wenn n = 2 die beiden Q voneinander unabhängig ausgewählt sind,
- X ist O, S, NR² oder CH₂,
- R¹ ist H, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₅-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Alkoxylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder polyzyklischer C₅ bis C₁₅-Arylrest, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Phenyl-, Biphenyl-, Naphthalinyl-, Benzophenon-, Benzylbenzol-, Fluorenyl- und Triphenylmethan-Rest, oder ein gegebenenfalls polyzyklischer und/oder substituierter Fünfring- oder Sechsring- C₅ bis C₁₅-Hetrozyklus, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Dibenzofuran-, Xanthen-, Carbazol- und Phenothiazin-Rest, wobei:
- die Maskierungsgruppe R° ausgewählt ist aus einer Acetyl-, Propionyl-, n-Butanoyl-, Isobutanoyl-, sec-Butanoyl-, Pivaloyloxymethyl-, Propyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, sec-Butyl-, Benzyl-, Isopropyloxycarbonyloxymethyl, tert-Butyl-Oxycarbonyloxymethyl-, S-Acyl-2-thioethyl-, S-Acylthiopropyl- oder Hydroxyethyl-disulfanylethylgruppe, und wobei die Variablen der zyklisierenden Maskierungsgruppe OA-(•)_i-BO die folgende Bedeutung aufweisen:
  - - i 0 oder 1 ist,
  - - A und B unabhängig voneinander CH₂, CH-Ar, Carboxyl, Carbamoyl, Carbonat, Carbamid, Carbamat, Urea, wobei Ar ein gegebenenfalls substituierter Arylrest, insbesondere Phenyl- oder Pyridinrest, ist, der insbesondere substituiert ist mit Halogen (F, Cl, Br), OH, einem C_1-6-Alkylrest oder einem C_1-6-Alkoxyrest einzeln oder als Gemisch dieser als Arzneimittel für eine Anwendung in der Krebstherapie.

Besonders vorteilhaft weisen Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (IIIa) und (IIIb) gegenüber Verbindungen der allgemeinen Formel (I) eine erhöhte Zellpermeabilität auf, da negative Ladungen der Phosphatgruppe bzw. der Phosphonatgruppe maskiert sind.
Zellpermeabilität (Zellmembranpassage) definiert sich erfindungsgemäß als intrazellulärer Transport einer niedermolekularen Verbindung, wobei die Membran- und Zellintegrität nicht gestört wird. Mögliche Modelle für den intrazellulären Transport niedermolekularer Verbindung sind dem Fachmann bekannt und sind unter anderem die Endozytose (Hällbrink et al., 2001) oder die rezeptorvermittelte Aufnahme (Tyagi et al., 2001). Per definitionem von zellpermeablen Verbindungen erfolgt ihre Translokalisation rezeptor-, energie- und temperaturunabhängig (Thoren et al., 2000). Bevorzugt sind die Verbindungen zellpermeablen Verbindungen, die durch Passage der Lipiddoppelschicht in eine Zelle eindringen, wobei die Zellpermeabilität der erfindungsgemäßen Verbindungen nicht auf bestimmte Zellen beschränkt ist.
Der Begriff „Prodrug“ wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine pharmakologisch inaktive oder wenig aktive Vorläuferverbindung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wie oben definiert, wobei die Vorläuferverbindung eine kovalente Bindung zwischen der Verbindung der allgemeinen Formel (I) und einer abspaltbaren Maskierungsgruppe aufweist. Die Vorläuferverbindung wird erst in vivo, vorzugsweise intrazellulär, durch eine chemische Modifizierung unter physiologischen Bedingungen (d.h. durch Verstoffwechselung oder Metabolisierung) im Organismus in die entsprechende pharmakologisch aktive Verbindung der allgemeinen Formel (I) umgewandelt. Dabei kann auch vorgesehen sein, dass die Prodrug durch chemische oder biochemische Methoden in einer ex vivo Umgebung in die entsprechend pharmakologisch aktive Form einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) überführt wird. Prodrugs können dabei sowohl oral als auch intravenös einem Patienten verabreicht werden. Bei intravenöser Verabreichung beträgt die Halbwertszeit vorzugsweise maximal 10 bis 600 Minuten.
Aus dem Stand der Technik ist eine Vielzahl in-vivo spaltbarer Gruppen bekannt, welche als Phosphonsäure- und Phosphorsäureester-maskierende Gruppen dienen können (J. E. Starret et al. Journal of Medicinal Chemistry 1994, 37, 1857; H. T. Serafinowska et al. Journal of Medicinal Chemistry 1995, 38, 1372; J. P. Krise und V. J. Stella in Advanced Drug Delivery Reviews 1996, 19, 287; S. Freeman und K. C. Ross in Progress in Medicinal Chemistry 1997, 34, 111; P. Ettmayer et al. Journal of Medicinal Chemistry 2004, 47, 2393 sowie die darin zitierte Referenzliteratur).
Erfindungsgemäß ist die Maskierungsgruppe R° eine Acetyl-, Propionyl-, n-Butanoyl-, Isobutanoyl-, sec-Butanoyl- oder Pivaloyloxymethylgruppe, eine Propyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, sec-Butyl- oder tert-Butyl-Oxycarbonyloxymethylgruppe, S-Acyl-2-thioethyl- (SATE), S-Acylthiopropyl (SATP) oder Hydroxyethyl-disufanylethyl-Gruppen („Dithiodiethyl“ oder DTE), wobei die Spaltbarkeit der Phosphonsäureester durch geeignete Substituenten beeinflusst werden kann. Weiterhin erfindungsgemäße Phosphonsäure-maskierende Gruppen R° sind Isopropyloxycarbonyloxymethyl), Benzyl (Bn) und Pivaloyloxymethyl (Piv).
Typische Beispiele für die erfindungsgemäßen Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (IIIa) und (IIIb)sind:
Des Weiteren werden auch zyklische Phosphonsäureester beschrieben, worin OA-(•)_i-BO zusammen bevorzugt eine gegebenenfalls substituierte 1-Aryl-propan-1,3-dioxy-Gruppe oder 2-(3-chlorophenyl)-[1,3,2]dioxaphosphinan sind.
Maskierungsgruppen (Phosphonsäure-maskierende Gruppen) können auch derart ausgewählt sein, dass die sterische Hinderung um eine funktionelle Gruppe, insbesondere die Phosphonsäuregruppe) minimiert ist, so dass die Geschwindigkeit der biologischen Umwandlung erhöht ist und dadurch die maximale Plasmakonzentration schneller erreicht wird.
Generell werden Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (Illa,b) durch Reaktion einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einem geeigneten Maskierungsmittel (bspw. einer organischen Säure oder Lewissäure) umgesetzt.
Nach einer bevorzugen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (IIIa) synthetisiert, indem Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Methode 6 umgesetzt werden. Nach einer alternativ bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (IIIb)synthetisiert, indem offenkettige Verbindungen der allgemeinen Formel (I) unter Zugabe von organischen Säuren oder Lewissäuren zu der entsprechenden Verbindung der allgemeinen Formel (IIIb)zyklisiert werden.
Bevorzugt sind die Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (Illa,b) pH-labile Verbindungen, d.h. Moleküle mit einer hohen Stabilität im pH-Bereich von 7,0 bis 7,5, die im Bereich um pH 7,4 wesentlich labiler sind, so dass die Vorläuferverbindung nach einer gewissen (vorgegebenen) Halbwertszeit zerfallen und die entsprechend pharmazeutisch aktive Verbindung der allgemeinen Formel (I) freisetzen. Aus therapeutischen Überlegungen werden Prodrugs angestrebt, die im Bereich von pH 6.4 Halbwertszeiten zwischen 0,1 und 20 h aufweisen. Detaillierte pharmakokinetische Messungen ermöglichen dazu die endgültige Auswahl geeigneter Maskierungsmittel für die Synthese von Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (Illa,b).
Da die Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (Illa,b) zellpermeabel sind, weisen sie bevorzugt eine derartige Stabilität auf, dass sie erst nach dem Passieren der Zellmembran intrazellulär gespaltet werden. Dabei weisen die Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (Illa,b) insbesondere auch den Vorteil auf, dass die entsprechend pharmazeutisch aktiven Verbindungen der allgemeinen Formel (I) je nach individuellem Bedarf der Patienten intrazellulär freigesetzt werden.
Besonders bevorzugt werden die Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formeln (Illa,b) nach Passage der Lipiddoppelschicht in den Zellen durch intrazelluläre Esterasen gespalten.
Beispielsweise spaltet bei dem Einsatz von Oxyalkylgruppen (bspw. bei Verwendung von Pivaloyloxymethyl) der verbleibende Molekülteil nachfolgend Alkylaldehyd (bspw. Formaldehyd) ab unter Freisetzung der aktiven Substanz.
Die Möglichkeit der Applikation einer Verbindung, aufweisend eine Verbindung der Formel (I), insbesondere ein Phenylphosphat, in einen Organismus hängt von der Struktur der Verbindung ab. Eine besonders vorteilhafte Eigenschaft der Verbindungen der Formel (I) gegenüber konventionellen Nukleotid-basierten Inhibitoren ist, dass sie als niedermolekulare, organische Verbindungen eine bspw. vom Magen-pH-Wert weitgehend unabhängige Bioverfügbarkeit aufweisen. Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen, enthaltend eine Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I), einem Organismus durch orale oder parentale Applikation verabreicht und über die Schleimhäute resorbiert. Für die orale Applikation eignen sich pharmazeutische Formulierungen bspw. in Form als Tablette, Kapsel oder Flüssigkeit oder rektal in Form von Suppositorien. Beispiele für Organismen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Säugetiere, wobei die Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) ganz besonders bevorzugt einem Menschen appliziert werden kann.
Eine weitere Ausführungsform betrifft die Verwendung einer pharmazeutischen Formulierung, enthaltend eine wirksame Menge mindestens einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I), insbesondere ein Phenylphosphat, und/oder der Vorläuferverbindungen gemäß der allgemeinen Formel (Illa,b) für eine Anwendung in der Krebstherapie.
Dabei können die Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder deren angegebene Vorläuferverbindungen gemäß der allgemeinen Formel (Illa,b) in der pharmazeutischen Formulierung als einzig pharmakologisch aktiver Wirkstoff oder auch in Kombination mit mindestens einem Zytostatikum verwendet werden, um so z.B. das Wirkungsspektrum zu verbreitern oder Resistenzentwicklungen vorzubeugen. In vielen Fällen erhält man dabei additive oder synergistische Effekte, d.h. die Wirksamkeit der Mischung ist größer als die Wirksamkeit der Einzelkomponenten.
Bevorzugt ist allerdings eine pharmazeutische Formulierung, enthaltend die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder deren Vorläuferverbindungen gemäß der allgemeinen Formel (Illa,b) in Kombination mit mindestens einem Zytostatikum. Eine solche pharmazeutische Formulierung bietet somit den besonderen Vorteil, dass die Resistenzbildung bei einer Zytostatikabehandlung verhindert oder zumindest deutlich verzögert ist. Beispiele für Zytostatika sind: Folsäureantagonisten (bspw. Methotrexat, Pemetrexed), Pyrimidinanaloga (bspw. 5-Fluoruracil, Gemcitabin), Purinanaloga (bspw. Pentostatin, Azathioprin) und N- bzw. C-terminal geschützte Oligopeptide (bspw. Bortezomib).
Wie oben beschrieben, kann die erfindungsgemäße Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder Vorläuferverbindungen gemäß der allgemeinen Formel (Illa,b) oral in Form von Tabletten, Kapseln, Flüssigkeiten oder Sirup, rektal in Form von Suppositorien oder intravenös verabreicht werden.
Bevorzugte Füllstoffe zur Herstellung von Tabletten, beschichteten Tabletten, Dragees und Hartgelatinekapseln sind bspw. Laktose, Stärke und deren Derivate, Talk, Stearinsäuren und deren Salze.
Bevorzugte Hilfsstoffe zur Herstellung von Gelatinekapseln sind bspw. Pflanzenöle, Wachse, Fette und flüssige Polyalkoholen.
Der Fachmann kennt geeignete Arzneistoffträger zur Herstellung von Lösungen oder Sirupen, wie bspw. Wasser, pharmazeutisch akzeptable Polyalkohole, Saccharose, Invertzucker und Glucose.
Dabei sind dem Fachmann Arzneistoffträger für Injektionslösungen grundsätzlich bekannt, und sind bspw. ausgewählt aus Wasser, pharmazeutisch akzeptablen Salzlösungen, Alkoholen, Polyalkoholen, Glycerin und Pflanzenölen.
In Abhängigkeit von der Art des zu behandelnden Karzinoms, kann die Kombination einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder eine der entsprechend angegebenen Vorläuferverbindungen bei der selektiven Inhibierung des STAT5-Proteins vorteilhaft zu überadditiven („synergistischen“) Effekten führen. So sind bspw. die folgenden Effekte möglich, die über die eigentlich zu erwartenden Effekte hinausgehen: verringerte Anwendungskonzentration und/oder erweitertes Wirkungsspektrum und/oder erhöhte Wirksamkeit der einzelnen Verbindungen (d.h. Wirkstoffe) und pharmazeutischen Formulierungen.
In Ausführungsformen erfolgt die Methode zur Verringerung der Funktionalität des STAT5-Proteins in einer Zelle oder einem Organismus umfassend die Applikation einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer entsprechenden Vorläuferverbindung der allgemeinen Formel (Illa/b) in einer physiologisch wirksamen Konzentration zur Inhibierung des STAT5-Proteins, wobei die angegebenen Verbindungen selektiv mit dem STAT5-Protein interagieren.
Die Erfindung umfasst auch die Anwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung der allgemeinen Formel (IIIa,b)zur Behandlung von Krankheitszuständen, die mit einem erhöhten STAT5-Signaling, insbesondere Krebs einhergehen.
In Ausführungsformen erfolgt die Methode zur Behandlung bei der Krebstherapie durch Verabreichung einer effektiven Dosis eines Inhibitors des Transkriptionsfaktor STAT5, insbesondere einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung der allgemeinen Formel (IIIa,b).
Die Methode zur Behandlung umfasst dabei die Applikation einer pharmazeutischen Formulierung, enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung der allgemeinen Formel (IIIa,b) in einer physiologisch wirksamen Konzentration. Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Behandlung bei der Krebstherapie, ist die pharmazeutische Formulierung für die Applikation fest oder flüssig, bspw. in Form als Tablette, Kapsel oder Flüssigkeit oder rektal in Form von Suppositorien, so dass die pharmazeutische Formulierung einem Organismus durch orale oder parenterale Applikation verabreicht und über die Schleimhäute resorbiert wird. Vorzugsweise werden die Verbindung gemäß derallgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung derallgemeinen Formel (IIIa,b) in einer Menge von etwa 0,1-30 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht und idealerweise in einer Menge von 0,5-15 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Als Organismus für eine derartige Behandlung kommen bspw. Säugetiere, wie der Mensch, in Betracht.
Gegenstand der Erfindung sind auch die Verwendung von Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) und der entsprechenden Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (IIIa,b) oder eines Gemisches zur Verwendung als Arzneimittel für eine Anwendung in der Krebstherapie.
Die Dosierung der Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) aber auch der Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (IIIa,b) hängt von verschiedenen Faktoren ab, bspw. der Verabreichungsmethode, dem Alter, dem Gewicht sowie der Gesundheit, einschließlich der Art des zu behandelnden Organismus.
In Ausführungsformen erfolgt dabei auch die Verwendung der zuvor beschriebenen Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (IIIa,b), pharmakologisch akzeptabler Salze, Enantiomere, Diastereomere, racemischer Gemische, kristalliner Formen, amorpher Formen und Solvate, jeweils enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) .
In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder eines Gemisches derart zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung für eine Anwendung in der Krebstherapie.
Vorzugsweise werden die Verbindungen der Formel (I) einem Patienten in einer Menge von etwa 0,1-30 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht und idealerweise in einer Menge von 0,5-15 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Der Fachmann wird erkennen, dass, wenn eine weitere Verbindung, bspw. in Kombination mit einer Vorläuferverbindungen der allgemeinen Formel (IIIa,b) eingesetzt wird, die korrekte Dosierung sowohl anhand der Untersuchung der Wirksamkeit der Verbindung in den Zellproliferationsassays als auch durch Bestimmung der Toxizität beim Patienten ermittelt werden kann.
Besonders vorteilhaft werden Phenylphosphonate zur selektiven und potenten Inhibierung des Transkriptionsfaktors STAT5, insbesondere STAT5b eingesetzt, da diese Verbindungen im Körper, insbesondere in der Zelle nicht durch Enzyme, insbesondere Phosphatasen, gespalten werden und daher gegenüber den physiologischen Bedingungen wesentlich stabiler sind. Mithin weisen insbesondere Phenylphosphonate und die entsprechenden Prodrugs daraus unter physiologischen Bedingungen eine hohe Langzeitstabilität auf und zeigen über einen langen Zeitraum eine sehr gute therapeutische Wirkung.
In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) bzw. deren Vorläuferverbindungen zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung für eine Anwendung in der Krebstherapie.
In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) bzw. deren angegebenen Vorläuferverbindungen in Kombination mit einer Krebsimmunotherapie zur Verwendung bei der Behandlung von Krebserkrankungen, wobei vorteilhaft die Resistenzbildung (d.h. Widerstandsfähigkeit eines Tumors bzw. Tumorzellen gegenüber die eingesetzten Behandlungsmethode) gegenüber der Behandlungsmethoden vermindert, insbesondere unterdrückt wird.
Klassische Methoden zur Behandlung bei Krebserkrankungen sind bspw. die operative Tumorentfernung (Resektion), die Chemotherapie und die Strahlentherapie, wobei häufig zwei oder gar alle drei Behandlungsmethoden gleichzeitig bei einem Organismus angewendet werden. Bei den Krebsimmunotherapiemethoden unterscheidet man zwischen der aktiven und der passiven Immunisierung. Bei der aktiven Immunisierung bekommt der Patient Substanzen verabreicht, die in seinem Immunsystem eine Immunantwort auslösen sollen. Bei der passiven Immunisierung kommen Antikörper oder Antikörper-Fragmente zum Einsatz. Bei der adoptiven Immuntherapie werden dem Patienten Leukozyten entnommen, ex vivo kultiviert und anschließend wieder dem Patienten injiziert. Werden bei der Behandlung aber nicht alle Zellen des Tumors und seiner Metastasen vernichtet, so ist die weitere Behandlung von Krebserkrankungen durch Resistenzbildung deutlich erschwert.
Eine Behandlungsmethode mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) bzw. deren Vorläuferverbindungen bietet somit den besonderen Vorteil, dass die Resistenzbildung bei der Krebsimmunotherapie, insbesondere der Zytostatikabehandlung, verhindert oder zumindest deutlich verzögert ist. Beispiele für Zytostatika sind: Folsäureantagonisten (bspw. Methotrexat, Pemetrexed), Pyrimidinanaloga (bspw. 5-Fluoruracil, Gemcitabin), Purinanaloga (bspw. Pentostatin, Azathioprin) und N- bzw. C-terminal geschützte Oligopeptide (bspw. Bortezomib).
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Beispiele der Erfindung nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
Die vorliegende Erfindung ist sowohl für den humanmedizinischen als auch den veterinärmedizinischen Bereich einsetzbar. Der Begriff „Patient“ wie hierin verwendet bezieht sich folglich auf zu behandelnde Organismen, insbesondere Menschen und Tiere.
Die in der Beschreibung und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen von Bedeutung sein.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung sollen anhand folgender Ausführungsbeispiele näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind auf verschiedenen Wegen zugänglich. Die im Folgenden beschriebenen Herstellungsverfahren bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Die obigen Formeln und die oben geschilderten Synthesestufen sind in Schema 1 zusammengefasst.
Allgemeine Angaben
Zur Aufnahme der ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren wurde ein Spektrometer der Firma Varian (¹H: 300 MHz; ¹³C: 75 MHz) oder der Firma Bruker (¹H: 400 MHz; ¹³C: 101 MHz) verwendet. Als innerer Standard für die chemische Verschiebung δ, angegeben in ppm, diente das jeweils verwendete Lösungsmittel.
Die Bestimmung der Schmelzpunkte erfolgte am Mikroheiztischmikroskop der Firma Büchi. Die Werte sind nicht korrigiert angegeben.
Die IR-Spektren wurden an einem FT-IR-Spektrometer FT/IR-4100 Typ A der Firma Jasco als Film oder mit Kaliumbromid-Presslingen aufgenommen.
Die Bestimmung der molaren Masse erfolgte mit einem hochauflösenden Massenspektrometer mit Elektrosprayionisation (HR-ESI-MS) der Firma Bruker-Daltonics.
Dabei zeigt:

1 das Syntheseschema für den Zugang zu Verbindung (13).
2 das Schema der induzierten Signaltransduktion über STATs durch aktivierte Zelloberflächenrezeptoren und Nicht-Rezeptortyrosinkinasen wie Src oder Bcr-Abl. Ein niedermolekularer Ligand der SH2-Domäne (symbolisiert durch das Dreieck) eines STAT-Proteins hemmt die Signaltransduktion über das betreffende STAT-Protein, indem es die Phosphorylierung am konservierten Tyrosinrest C-terminal von der Transaktivierungsdomäne hemmt. Die Abbilddung ist an die Literaturreferenz angelehnt.³¹
3 die selektive Hemmung der STAT5b Tyrosinphosphorylierung durch 17, den Pivaloyloxymethylester von 13. a) Struktur von 17 und der Negativkontrollverbindung 18. b) Hemmung der Tyrosinphosphorylierung des STAT5b-GFP-Fusionsproteins durch 0,3 µM - 10 µM 17 in K562-Zellen, die mit STAT5b-GFP transfiziert wurden. Die Negativkontrollverbindung 18 (10 µM) hemmt die STAT5b-Phosphorylierung nicht. Oberer Blot: mit phosphorylierungsabhängigem STAT5-Antikörper. Dieser erkennt STAT5b und STAT5a nur dann, wenn diese an Tyr699 (STAT5b) bzw. Tyr694 (STATa) phosphoryliert sind. Zweitoberster Blot: mit phosphorylierungsunabhängigem STAT5-Antikörper. Dieser erkennt STAT5a und STAT5b unabhängig von der Phosphorylierung an Tyr699 (STAT5b) bzw. Tyr694 (STAT5a). Die Identität des STAT5-GFP-Proteins ergibt sich aus dem Konstrukt, mit dem die Zellen transfiziert wurden.

Ein getrenntes Gel wurde angefertigt, um die gleichmäßige Transfektion mittels des GFP-Tags zu überprüfen. Der entsprechende Blot wurde zunächst mit anti-GFP-Antikörper inkubiert (dritter Blot von oben), und danach mit anti-Actin Antikörper (unterster Blot).
c) Quantifizierung der pSTAT5b-GFP-Banden (STAT5b-GFP-Fusionsprotein, das an STAT5b Tyr699 phosphoryliert ist), normalisiert gegen STAT5b-GFP (STAT5b-GFP-Fusionsprotein unabhängig vom Phosphorylierungszustand an STAT5b Tyr699). Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung zweier unabhängiger Experimente an.
4 in d) Die STAT5a Tyrosinphosphorylierung durch 0,3 µM - 10 µM 17 in K562-Zellen, die mit STAT5b-GFP transfiziert wurden, ist nicht inhibiert. Ein getrenntes Gel wurde angefertigt, um die gleichmäßige Transfektion mittels des GFP-Tags zu überprüfen. Die Negativkontrollverbindung 18 (10 µM) hemmt die STAT5a-Phosphorylierung auch nicht. Zur Erklärung der Blots siehe Legende unter b). 4 e) zeigt die Quantifizierung der pSTAT5a-GFP-Banden (STAT5a-GFP-Fusionsprotein, das an STAT5a Tyr694 phosphoryliert ist), normalisiert gegen STAT5a-GFP (STAT5a-GFP-Fusionsprotein unabhängig vom Phosphorylierungszustand an STAT5a Tyr694). Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung zweier unabhängiger Experimente an.
5 f) die Hemmung der Tyrosinphosphorylierung von endogenem STAT5 durch 0,3 µM - 10 µM 17 in K562-Zellen. Die Negativkontrollverbindung 18 (10 µM) hemmt die Phosphorylierung von endogenem STAT5 nicht. Oberer Blot: mit phosphorylierungsabhängigem STAT5-Antikörper. Dieser erkennt endogenes STAT5b und STAT5a nur dann, wenn diese an Tyr699 (STAT5b) bzw. Tyr694 (STATa) phosphoryliert sind. Zweitoberster Blot: mit phosphorylierungsunabhängigem STAT5-Antikörper. Dieser erkennt STAT5a und STAT5b unabhängig von der Phosphorylierung an Tyr699 (STAT5b) bzw. Tyr694 (STAT5a). Unterer Blot: mit Antikörper gegen Actin. 5 g) zeigt die Quantifizierung der endogenen pSTAT5-Banden normalisiert gegen endogenes STAT5 unabhängig vom Phosphorylierungszustand. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung von vier unabhängigen Experimenten an.
6 h) die Zeitabhängigkeit der Tyrosinphosphorylierung des STAT5b-GFP-Fusionsproteins durch 17 in K562-Zellen, die mit STAT5b-GFP transfiziert wurden. Die Zellen wurden für die angegebenen Zeiten mit 10 µM 17 behandelt. Oberer Blot: mit phosphorylierungsabhängigem STAT5-Antikörper. Dieser erkennt STAT5b nur dann, wenn es an Tyr699 phosphoryliert ist. Zweitoberster Blot: mit phosphorylierungsunabhängigem STAT5-Antikörper. Dieser erkennt STAT5b unabhängig von der Phosphorylierung an Tyr699. Ein getrenntes Gel wurde angefertigt, um die gleichmäßige Transfektion mittels des GFP-Tags zu überprüfen. Der entsprechende Blot wurde zunächst mit anti-GFP-Antikörper inkubiert (dritter Blot von oben), und danach mit anti-Actin Antikörper (unterster Blot).
7 die Bindung des BODIPY-FL-markierten Derivats von Verbindung (31) als Verbindung (10) an ein STAT5-Proteinderivat (natives STAT5b, STAT5b-Punktmutanten Arg618Ala, Arg618Lys und Trp641Ala, natives STAT5a) wird durch die Erhöhung der Fluoreszenzpolarisation festgestellt.
Allgemeine Synthesevorschriften
Methode 1: Benzylschützung von Carbonsäuren
KHCO₃ (1.2 mmol) und Benzylbromid (1.5 mmol) wurden zu einer Lösung des Benzoesäurederivates (1 mmol) in 4 mL trockenem DMF gegeben und bei 40°C für 3-4 h gerührt. Nach Beendigung der Reaktion werden 10 mL Wasser und mit Ethylacetat (2 x 20 mL) extrahiert. Die organische Phase wird mit 5% NaHCO₃ gewaschen und Na₂SO₄ getrocknet. Nach Abdestillation des Lösungsmitttels im Vakuum wird das Rohprodukt ohne weitere Reinigung in der Folgereaktion eingesetzt.^[1]
Methode 2: Umsetzung einwertiger aromatische Alkohole zu Phosphodibenzylestern
Zu einer gerührten Lösung des aromatischen Alkohols (1 mmol) in trockenem Acetonitril (8 mL) werden CCl₄(5 mmol), Diethylisopropylamin (DIPEA) (2.1 mmol) und eine katalytische Menge Dimethylaminopyridin (DMAP) gegeben)^[2] Danach wird bei 0°C tropfenweise Dibenzylphosphit (1.5 mmol) zugegeben und die Mischung für 30-60 Minuten gerührt. Nach Beendigung der Reaktion werden 2 mL einer 0.5 mol/L KH₂PO₄ Lösung zugegeben. Die Reaktionsmischung wird wiederholt mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 5% NaCl Lösung und Wasser gewaschen und danach über Na₂SO₄ getrocknet. Nach Destillation des Lösungsmittels im Vakuum wird das Produkt durch Flash-Chromatographie gereinigt.
Diese Methode wird in analoger Form für zweiwertige aromatische Alkohole angewandt. Dabei werden jedoch nur 0.5 mmol des zweiwertigen aromatischen Alkohols eingesetzt.
Methode 3: Spaltung der Phosphodibenzylester durch Hydrogenolyse
Zu einer Lösung von Phosphodibenzylester (100 mg) in absolutem Ethanol (20 mL) werden 10% Pd auf Kohle (15 mg) unter einer inerten Atmosphäre gegeben. Durch wiederholtes Anlegen von Vakuum und Füllen des Gasraums mit Wasserstoff wird eine Wasserstoffatmosphäre erzeugt. Nach Beendigung der Reaktion wird die Reaktionsmischung über Celite filtriert und das Celite mehrfach mit Ethanol gewaschen. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum werden die Phosphorsäurederivate in Wasser gelöst und mit Dichlormethan gewaschen. Nach Lyophilisation werden die Produkte in quantitativer Ausbeute und in hochreiner Form erhalten.
Methode 4: Amidkupplung
Zu einer Lösung der Carbonsäure (1 mmol) mit wasserfreiem DMF (10 mL) werden bei 0°C EDC (1 mmol) und HOBT (1 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wird erst für 30 Minuten bei 0°C, und dann für 90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Triethylamin (3 mmol) und das zu kuppelnde Amin (1 mmol) werden zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von Wasser (100 mL) wird das Produkt durch Zugabe von Ethylacetat (2x30 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Nach Destillation des Lösungsmittels im Vakuum wird das Produkt säulenchromatographisch gereinigt.
Methode 5: Spaltung von Methylphenylethern zu Phenolen
Zu einer Lösung des Methylphenylethers (1 mmol) in 2 mL trockenem Dichlormethan wird bei 0°C eine 1M Lösung von BBr₃ in Dichlormethan (3 mmol) zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wird die Reaktionsmischung zweimal mit 2 mL Methanol versetzt und anschließend flüchtige Bestandteile im Vakuum entfernt. Die Rohprodukte werden säulenchromatographisch gereinigt.
Methode 6: Umsetzung von Phosphorsäureestern in die entsprechenden Pivaloyloxymethylester
0.1 mmol Phosphorsäurester werden in Acetonitril suspendiert. Diisopropylamin (4 äq / Phosphorsäureesterfunktion) und Pivaloyloxymethyliodid (4 äq. / Phosphorsäureesterfunktion) werden bei Raumtemperatur zugegeben. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernung der flüchtigen Komponenten im Vakuum wird das Produkt säulenchromatographisch gereinigt.
Methode 7: Analyse der Substanzaktivitäten mittels Fluoreszenzpolarisations-Assays
Die Analyse der Substanzaktivitäten gegen STAT5b erfolgte nach dem Prinzip der Fluoreszenzpolarisation und folgt dem publizierten Verfahren.^[3-5] Zur Gewinnung des STAT5b-Proteins wurden die für die Aminosäuren 136-703 kodierenden Nukleotide menschlichen STAT5b durch PCR amplifiziert und in die Fsel/Ascl Schnittstellen eines modifizierten pQE70-Vektors kloniert. Das Protein wurde exprimiert aus E. coli Rosetta (Novagen) wie beschrieben,^[6-7] durch Affinitätschromatographie gereinigt und dialysiert gegen einen Puffer der folgenden Zusammensetzung: 50 mmol/L Hepes (pH 7.5), 100 mmol/L NaCl, 10% glycerol, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, und 0.1% Nonidet P-40 Ersatzstoff. Das STAT5b Protein (120 nmol/L) wurde mit dem Peptid 5-carboxyfIuorescein-GY(PO₃H₂)LVLDKW (10 nM) inkubiert in dem folgenden Puffer: 10 mmol/L Hepes, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA, 0.1% Nonidet P-40, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L dithiothreitol, und 2% DMSO. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 30-120 Minuten wurde die Fluoreszenzpolarisation in Gegenwart der Testsubstanzen gemessen (Tecan Infinite F500).
Methode 8: Analyse der zellulären Substanzaktivitäten
Humanes Volllängen STAT5a und STAT5b wurde aus K562 cDNA PCR-amplifiziert, und in einen Expressionsvektor basierend auf pCS2 kloniert. Dieser Expressionsvektor hat einen C-terminalen GFP-Tag. Daher werden in der Zelle die Fusionproteine STAT5a-GFP bzw. STAT5b-GFP gebildet.
K562 Zellen werden in RPMI 1640 Medium (Invitrogen) kultiviert, das 10% FBS (Gibco Life Technologies), 2 mM L-Glutamin (PAA Laboratories) und Penicillin/Streptomycin (PAA Laboratories) enthält. Die Zellen werden transfiziert, entweder mit STAT5a-GFP, oder mit STAT5b-GFP-Plasmid, unter Verwendung von Fugene HD Transfection Reagent (Promega). Nach 24 h werden die Zellen für 4 h mit Testsubstanz oder DMSO behandelt (finale DMSO Konzentration: 0.2 %). Die Zellen werden geerntet und mit Lysepuffer lysiert (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM Na₄P₂O₇, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 100 ng/ml Aprotinin, 1 m Na₃PO₄, 10 mM NaF and 1 mM PMSF). Die Komponenten der Zelllysate werden auf einem Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) aufgetrennt, dann auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Für jedes Experiment wurden zwei Gele und Membranen präpariert. Eine Membran wurde mit Stat5-Antikörpern inkubiert (anti-pSTAT5, erkennt Stat5a pTyr694 und STAT5b pTyr699, Cell Signaling; anti-total Stat5, Cell Signaling; anti-β-actin, Cell Signaling). Die andere Membran wird mit anti-GFP (Cell Signaling) gefolgt von anti-β-actin inkubiert, um die gleichmäßige Transformation zu überprüfen. Membranen mit gebundenem Primärantikörper werden mit sekundärem Antikörper (α-rabbit-HRP secondary antibody, Dako) inkubiert. Die Signale werden nach Zugabe von Westem Lightning Plus Chemilumineszenz-Reagenz (Perkin-Elmer) mit einem ImageQuant Imagesystem (GE Healthcare) detektiert. Die quantitative Analyse erfolgte mit der Software ImageJ (NIH). (Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods 2012, 9(7): 671-675).
Beispiel 1: Synthese von 4-(Nonanamidomethyl)-1,2-phenylenbis(dihydrogen phosphat) (31)
Synthese von N-(3.4-dihvdroxvbenzvl)nonanamid (31a)
31a wurde ausgehend von N-Vanillylnonanamide gemäß Methode 5 hergestellt. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch (2% bis 5% Methonol in Dichlormethan) gereinigt. Ausbeute: 50 %, weißer Feststoff.
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃ _+CD40) δ = 0.82 (t, J=6.8, 3H), 1.14-1.31 (m, 10H), 1.56 (p, J=7.4, 2H), 2.13 (t, 2H), 2.84 (s, 3H), 4.19 (s, 2H), 6.57 (dd, J=8.1, 2.1, 1H), 6.70 (d, J=2.1, 1H), 6.72 (d, J=8.1, 1H).
MS (ESI) gefunden: [M+Na]⁺m/z = 302,2, berechnet für C₁₆H₂₅NNaO₃: 302.2
Synthese von Tetrabenzyl(4-(nonanamidomethyl)-1,2-phenylen)bis(phosphat) (31b)
31b wurde ausgehend von 31a gemäß Methode 2 hergestellt. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch gereinigt (2% bis 4% Methanol in Dichlormethan). Ausbeute: 90%.
¹H NMR (400 MHz, cd₃od) δ = 0.87 (t, J=6.9, 3H), 1.17-1.39 (m, 10H), 1.61 (p, J=7.1, 2H), 2.21 (t, J=7.5, 2H), 4.28 (s, 2H), 5.00-5.16 (m, 8H), 7.09 (dd, J=8.5, 2.1, 1H), 7.18-7.43 (m, 22H).
¹³C NMR (101 MHz, cd₃od) δ = 14.44, 23.69, 23.71, 27.04, 30.29, 30.31, 30.36, 30.40, 32.98, 37.09, 43.07, 49.63, 71.72, 71.76 (dd, J=5.7, 2.0), 71.80, 106.16, 121.84, 122.74, 126.13, 129.27, 129.69, 129.84, 129.86, 136.61 (d, J=7.1), 139.08, 139.09, 141.51 (d, J=6.2), 142.52 (d, J=6.3), 176.20.
³¹P NMR (162 MHz, cd₃od) δ = -5.60 (1P), -5.54 (1P)
MS (ESI) gefunden: [M+Na]⁺ m/z = 822.3, berechnet für C₄₄H₅₁NNaO₉P₂: 822.3
Synthese von 4-(Nonanamidomethyl)-1,2-phenylenbis(dihydrogen phosphat) (31)
31 wurde ausgehend von 31b gemäß Methode 3 hergestellt.
¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ = 0.84 (t, J=6.7, 3H), 1.23 (s, 10H), 1.49 (t, J=7.2, 2H), 2.09 (t, J=7.5, 2H), 4.16 (d, J=5.8, 2H), 6.50 (bs, 4H), 6.93 (d, J=8.1, 1H), 7.04-7.31 (m, 2H), 8.26 (t, J=6.1, 1H).
¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ = 13.97, 22.09, 25.27, 28.60, 28.75, 31.27, 35.36, 38.89, 40.14, 41.37, 121.27, 122.09, 122.95, 136.06, 141.75, 142.81, 172.12.
HRMS (ESI) gefunden: [M-H]^-m/z = 438.1083, berechnet für C₁₆H₂₆NO₉P₂: 438.1088
Beispiel 2: Synthese von 4-((8-Methylnonanamido)methyl)-1,2-phenylenbis(dihydrogenphosphat) (32)
Synthese von N-(3, 4-Dihvdroxvbenzyl)-8-methylnonanamid (32a)
32a wurde entsprechend Methode 3 (katalytische Hydrierung der C=C-Doppelbindung) und Methode 5 aus Capsaicin hergestellt. Das Rohprodukt wurde gereinigt durch Säulenchromatographie (2% Methanol in Dichlormethan). Ausbeute: 47% Feststoff.
¹H NMR (300 MHz, CDCI₃) δ = 0.84 (d, J=6.6, 6H), 1.11 (d, J=6.3, 2H), 1.23 (s, 6H), 1.48 (dt, J=13.1, 6.6, 1H), 1.60 (s, 2H), 2.20 (s, 3H), 4.26 (s, 2H), 6.16 (s, 1H), 6.59 (d, J=7.5, 1H), 6.68
- 6.89 (m, 2H), 7.58 - 8.86 (m, 1H).
¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ = 22.75, 25.94, 27.33, 28.05, 29.40, 29.66, 36.93, 39.04, 43.69, 115.00, 115.21, 119.88, 129.91, 144.33, 144.69, 165.93, 165.97.
MS (ESI) gefunden: [2M]^-m/z = 585.3, berechnet für C₃₄H₅₃N₂O₆: 585.4
Synthese von Tetrabenzyl (4-((8-methylnonanamido) methyl)-1_.2-phenylen)bisphosphat (32b)
32b wurde aus 32a gemäß Methode 2 hergestellt. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch gereinigt (1% bis 2% Methanol in Dichlormethan). Ausbeute: 99%
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 0.86 (d, J=6.6, 6H), 1.09 - 1.20 (m, 2H), 1.20 - 1.39 (m, 7H), 1.51 (hept, J=13.2, 6.6, 1H), 1.57 - 1.73 (m, 2H), 2.17 (dd, J=8.6, 6.8, 2H), 4.31 (d, J=5.6, 2H), 5.03-5.16 (m, 8H), 5.70 (t, J=5.7, 1H), 7.00 (dd, J=8.4, 1.3, 1H), 7.17-7.21 (m, 1H), 7.20 - 7.35 (m, 21H)..
¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ = 22.77, 25.84, 27.36, 28.07, 29.53, 29.75, 36.84, 39.09, 42.70, 70.23, 70.27, 70.29, 70.33, 77.47, 121.05 (d, J=2.3), 121.96 (d, J=2.3), 125.16, 128.15, 128.68, 128.73, 128.75, 135.40, 135.47, 136.64, 140.67 (t, J=6.6), 141.44 (t, J=6.5), 173.09.
³¹P NMR (162 MHz, CDCI₃) δ = -3,17 (s, 1P), -3,29 (s, 1P)
MS (ESI) gefunden: [M+Na]⁺ m/z = 836.4, berechnet für C₄₄H₅₁NNaO₉P₂: 836.3
Synthese von 4-((8-Methylnonanamido)methyl)-1,2-phenylenbis(dihydroaenphosphat) (32)
32 wurde ausgehend von 32b gemäß Methode 3 hergestellt.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ = 0.83 (d, J=6.5, 6H), 1.04 - 1.28 (m, 8H), 1.38 - 1.58 (m, 3H), 2.09 (t, J=7.5, 2H), 4.16 (d, J=5.7, 2H), 6.94 (d, J=8.1, 1H), 7.15-7.28 (m, 2H), 7.99 (s, 3H), 8.28 (d, J=6.0, 1H).
¹³C NMR (75 MHz, DMSO) δ = 22.55, 25.28, 26.70, 27.39, 28.79, 29.06, 35.38, 38.46, 41.36, 121.13, 121.96, 123.05, 136.21, 141.44, 142.53, 160.63, 172.14.
³¹P NMR (162 MHz, DMSO) δ = -4.68 (s, 1P), -4.52 (s, 1P)
HRMS (ESI) gefunden: [M-H]^-m/z = 452.1247, berechnet für C₁₇H₂₈NO₉P₂: 452.1245
Beispiel 3: Synthese von Verbindung (13)
1 zeigt das Syntheseschema für den Zugang zu Verbindung (13), wobei in den einzelnen Reaktionsstufen a) bis h) zu den entsprechend erhaltenen Zwischenstufen folgende Reaktanden zugegeben werden:

a) Benzylbromid, KHCO₃, DMF, 4h; b) Ethylbromacetat, K₂CO₃, DMF, 1h; c) Pd/C, H₂, EtOH, 1h; d) Anilin, EDC, HOBt, DMF, 16h; e) 1M NaOH, THF, 1h; f) 4-(Aminomethyl)benzol-1,2-diol, EDC, HOBt, Triethylamin, DMF, 16h; g) Dibenzylphosphit, CCI4, Diisopropylethylamin, DMAP, 1h; h) Pd/C, H₂, EtOH, 1h.

Synthese von 6-(2-((3,4-dihydroxvbenzyl)amino)-2-oxoethoxy)-N-phenyl-2-naphthamide (14)
Die Verbindung (14) wird aus 13e (0.36 g, 1.12 mmol) und 4-(Aminomethyl)benzol-1,2-diol (0.27 g, 1.23 mmol) gemäß Methode 4 hergestellt. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Dichlormethan/Methanol 50:1) gereinigt. Die Verbindung (14) wird als weißer Feststoff erhalten (0.35 g, 70%).
Schmelzpunkt: 219 - 222 °C
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ = 4.18 (d, J=6.0, 2H), 4.67 (s, 2H), 6.51 (dd, J=8.0, 2.1, 1H), 6.62 (d, J=8.0, 1H), 6.70 (d, J=2.1, 1H), 7.03 - 7.15 (m, 1H), 7.30 - 7.40 (m, 4H), 7.80 (dd, J=8.6, 1.1, 2H), 7.88 (d, J=8.7, 1H), 7.95 -8.06 (m, 2H), 8.50 (d, J=1.5, 1H), 8.58 (t, J=6.1, 1H), 8.71 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 10.32 (s, 1H)
¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ = 41.53, 67.04, 107.20, 115.02, 115.24, 118.25, 119.60, 120.32, 123.55, 125.04, 126.85, 127.66, 127.84, 128.59, 130.06, 130.20, 130.57, 135.66, 139.30, 144.16, 145.06, 157.07, 165.55, 167.07
UV/Vis: λ [nm] = 285, 237, 204; IR [KBr]: ν̃ [cm^-1] = 3839, 3820, 3802, 3748, 3737, 3673, 3647,3564, 3417, 2324, 1746, 1736, 1715, 1651, 1630, 1603, 1535, 1506, 1478, 1442, 1393, 1363, 1323, 1273, 1239, 1203, 1173, 1117, 1066, 1022, 948, 906, 885, 858, 812, 756, 691, 631, 587, 505, 474, 421
HRMS (ESI) gefunden: [M-H] ^- m/z = 441.1457 berechnet für C₂₆H₂₁ N₂O₅ = 441.1456
Synthese von Tetrabenzyl (4-((2-((6-(phenvlcarbamoyl) naphthalen-2-vl) oxy) acetamido)methyl)-1,2-phenylene) bis(phosphate) (13g)
Die Verbindung (13f) wird aus 14 (0.28 g, 0.63 mmol) gemäß Method 1 gewonnen. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch gereingt (Dichlormethan/Aceton 20:1 → 9:1). Das Produkt wird als Öl erhalten (0.485 g, 80%).
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 4.35 (d, J=6.1, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.96 - 5.10 (m, 8H), 6.83 (dd, J=8.5, 1.6, 1H), 7.00 (d, J=2.2, 1H), 7.07 - 7.34 (m, 27H), 7.61 (dd, J=23.8, 8.8, 2H), 7.78 (d, J=7.3, 2H), 7.88 (dd, J=8.6, 1.8, 1H), 8.27 (d, J=1.8, 1H), 9.02-9.14 (m, 1H)
¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ = 41.95, 67.24, 70.11 - 70.28 (m), 107.38, 118.97, 120.44, 121.01 (d, J=2.2), 121.59 (d, J=2.0), 124.16, 124.84, 125.00, 127.19, 127.79, 127.94 (d, J=2.1), 128.42, 128.57 (d, J=1.3), 128.66, 128.87, 130.99, 131.05, 135.13 (dd, J=7.0, 4.1), 135.76, 135.96, 138.73, 140.52 (t, J=6.3), 141.09 (t, J=6.7), 156.26, 166.33, 167.99
³¹P NMR (162 MHz, CDCl₃) δ = -5.53 (s, 1P), -5.44 (s, 1P)
UV/Vis: λ [nm] = 280, 240
IR [KBr]: ν̃ [cm^-1] = 3645, 3633, 3625, 3604, 3592, 3583, 3572, 3563, 3426, 3308, 3062, 3023, 2924, 2897, 1768, 1667, 1660, 1652, 1629, 1600, 1539, 1506, 1478, 1456, 1441, 1393, 1321, 1274, 1203, 1173, 1157, 1124, 1081, 1018, 1001, 880, 813, 741, 695, 596, 511, 499, 475, 456; HRMS (ESI) gefunden: [M+Na] ⁺ m/z =985.2621, berechnet für C₅₄H₄₈N₂N_aO₁₁P₂ = 985.2626
Synthese 4-((2-((6-(phenylcarbamoyl) naphthalen-2-yl)oxy) acetamido)methyl)-1,2-phenylene bisfdihydrogen phosphate) (13)
13 wird aus 13f hergestellt (0.3 g, 0.31 mmol) gemäß Methode 2 hergestellt. Lyophilisation ergab das Produkt als weißen Feststoff (0.178 g, 95%).
Schmelzpunkt: 192 - 194 °C
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ = 4.30 (d, J=6.0, 2H), 4.70 (s, 2H), 6.99 (d, J=8.2, 1H), 7.09 (t, J=7.4, 1H), 7.21 (d, J=8.3, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.30 -7.43 (m, 4H), 7.80 (d, J=7.7, 2H), 7.90 (d, J=8.6, 1H), 7.94-8.07 (m, 2H), 8.50 (s, 1H), 8.76 (t, J=6.1, 1H), 10.34 (s, 1H)
¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ = 41.29, 67.01, 107.26, 119.59, 120.34, 121.32, 122.02, 123.21, 123.56, 125.08, 126.90, 127.69, 127.85, 128.61, 130.25, 130.62, 135.67, 139.32, 141.68, 142.61, 157.05, 165.60, 167.43
³¹P NMR (162 MHz, DMSO-d₆) δ = -4.66, -4.50
UV/Vis: λ [nm] = 301, 250, 238, 201
IR [KBr]: ν̃ [cm^-1] = 3434, 1651, 1631, 1601, 1537, 1510, 1479, 1441, 1394, 1324, 1273, 1236, 1208, 1175, 1122, 1076, 1065, 1020, 977, 951,914, 842, 823, 753, 692 ,584, 569, 558, 539, 526, 512, 502, 495, 481, 473
HRMS (ESI) found: [M-H] ^- m/z = 601.0787, berechnet für C₂₆H₂₃NO₁₁ P₂ = 601.0783
Synthese ((((4-((2-((6-(phenylcarbamoyl)naphthalen-2-yl)oxy)acetamido)methyl)-1_.2-phenylene)bis(oxy))bis(oxo-15-phosphanetriyl))tetrakis(oxy))tetrakis(methylene)tetrakis(2,2-dimethylpropanoate) (17)
17 wird gemäß Methode 6 aus 13 (40 mg, 0.07 mmol) hergestellt. Nach Säulenchromatographischer Reinigung (Hexan / Essigsäureethylester 3:1 → 2:1) wird das Produkt als Öl erhalten (35 mg, 50%).
¹H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ = 1.18 (d, J=4.6, 36H), 4.48 (d, J=6.1, 2H), 4.68 (s, 2H), 5.60 - 5.79 (m, 8H), 6.94 - 7.06 (m, 2H), 7.11 - 7.18 (m, 2H), 7.18 - 7.25 (m, 2H), 7.29 (s, 1H), 7.33 - 7.40 (m, 2H), 7.75 (dd, J= 18.0, 7.9, 3H), 7.84 (d, J=9.0, 1H), 7.91 (dd, J=8.6, 1.8, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.44 (d, J=5.4, 1H)
³¹P NMR (162 MHz, cdcl₃) δ = -8.73 (s, 1P), -9.00 (s, 1P)
¹³C NMR (101 MHz, cdcl₃) δ = 26.96, 38.90, 42.19, 67.56, 77.33, 83.35, 83.39, 83.41, 83.45, 107.75, 119.37, 120.46, 121.37 - 121.46 (m), 121.96 - 122.05 (m), 124.58, 124.97, 125.65, 127.70, 127.86, 128.81, 129.24, 131.30, 136.13, 136.65, 138.57, 140.30 (t, J=6.7), 140.86 (t, J=6.9)., 156.60, 156.65, 166.19, 168.15, 176.72, 176.79
HRMS (ESI) gefunden: [M+Na]⁺m/z= 1081.3461, berechnetfür C₅₀H₆₄N₂NaO₁₉P₂: 1081.3471
Beispiel 4: Bestimmung der Bindungstasche
Um für die Verbindung (31) aus Beispiel 1 die Wirkstoffbindetasche des STAT5b-Proteins experimentell nachzuweisen, wurde das BODIPY-FL-markierte Derivat von Verbindung (31) als Verbindung (10) synthetisiert. Die Verbindung (10) dient als Indikator für die direkte Bindungsuntersuchung basierend auf der Fluoreszenzpolarisation. Die Verbindung (10) wird über fünf Syntheseschritte erhalten.
Die Bindung der Substanz an ein Protein wird durch die Erhöhung der Fluoreszenzpolarisation festgestellt. Es wurde festgestellt, dass die Verbindung (10) gegenüber dem Wildtyp des STAT5b eine Bindungsaffinität von K_d = 862 ± 77 nM aufweist. Die STAT5b-Punktmutanten Arg618Ala, Arg618Lys und Trp641Ala ist erheblich geringer als die Affinität des Wildtyp-Proteins (vgl. 7). Wildtyp-STAT5a bindet ebenfalls sehr viel schwächer an Verbindung 10 als Wildtyp-STAT5b. Dies belegt die ausgesprochen hohe Selektivität der Catecholbisphosphate für STAT5b.

Claims

Verwendung einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I)
wobei: - n 2 ist, - m eine ganze Zahl von 1 bis 2 ist, - p 0 ist, - der Linker L ist C(R²)₂, O, NR², NR²C(=O), NR²C(=O)CH₂, NR²C(=O)O, wobei R² H, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₅-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₀-Alkoxyrest, - Q Sauerstoff (O), CH₂ oder CF₂ ist, wobei wenn n = 2 die beiden Q voneinander unabhängig ausgewählt sind, - X ist O, S, NR² oder CH₂, - R¹ ist H, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₅-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Alkoxyrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder polyzyklischer C₅ bis C₁₅-Arylrest, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Phenyl-, Biphenyl-, Naphthalinyl-, Benzophenon-, Benzylbenzol-, Fluorenyl- und Triphenylmethan-Rest, oder ein gegebenenfalls polyzyklischer und/oder substituierter Fünfring- oder Sechsring- C₅ bis C₁₅-Heterozyklus, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Dibenzofuran-, Xanthen-, Carbazol- und Phenothiazin-Rest, und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der Formel (IIIa) oder (IIIb)
wobei: R° ausgewählt ist aus einer Acetyl-, Propionyl-, n-Butanoyl-, Isobutanoyl-, sec-Butanoyl-, Pivaloyloxymethyl-, Propyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, sec-Butyl-, Benzyl-, Isopropyloxycarbonyloxymethyl, tert-Butyl-Oxycarbonyloxymethyl-, S-Acyl-2-thioethyl-, S-Acylthiopropyl- oder Hydroxyethyl-disufanylethylgruppe, und wobei: - i 0 oder 1 ist, - A und B unabhängig voneinander CH₂, CH-Ar, Carboxyl, Carbamoyl, Carbonat, Carbamid, Carbamat, Urea, wobei Ar ein gegebenenfalls substituierter Arylrest, insbesondere Phenyl- oder Pyridinrest, ist, der insbesondere substituiert ist mit Halogen (F, Cl, Br), OH, einem C_1-6-Alkylrest oder einem C_1-6-Alkoxyrest, einzeln oder als Gemisch dieser als Arzneimittel für eine Anwendung in der Krebstherapie.
Verwendung einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der Formel (IIIa) oder (IIIb)nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ H, C_3-12-Alkylrest, ein Fünfring- oder Sechsring-Heterozyklus oder ein Arylrest ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der Formel (IIIa) oder (IIIb)nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R² H ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der Formel (IIIa) oder (IIIb) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder Vorläuferverbindungen gemäß der allgemeinen (IIIa) oder (IIIb)in Form einer pharmazeutische Formulierung, enthaltend eine wirksame Menge mindestens einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der Formel (IIIa) oder (IIIb), vorliegt.
Verwendung einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I)
wobei: - n 2 ist, - m eine ganze Zahl von 1 bis 2 ist, - p 0 ist, - der Linker L ist C(R²)₂, O, NR², NR²C(=O), NR²C(=O)CH₂, NR²C(=O)O, wobei R² H, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₅-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₀-Alkoxyrest, - Q Sauerstoff (O), CH₂ oder CF₂ ist, wobei wenn n = 2 die beiden Q voneinander unabhängig ausgewählt sind, - X ist O, S, NR² oder CH₂, - R¹ ist H, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C₁ bis C₁₅-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Alkoxyrest, ein gegebenenfalls substituierter und/oder polyzyklischer C₅ bis C₁₅-Arylrest, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Phenyl-, Biphenyl-, Naphthalinyl-, Benzophenon-, Benzylbenzol-, Fluorenyl- und Triphenylmethan-Rest, oder ein gegebenenfalls polyzyklischer und/oder substituierter Fünfring- oder Sechsring- C₅ bis C₁₅-Heterozyklus, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Dibenzofuran-, Xanthen-, Carbazol- und Phenothiazin-Rest, und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der allgemeinen Formel (IIIa) oder (IIIb)
wobei: R° ausgewählt ist aus einer Acetyl-, Propionyl-, n-Butanoyl-, Isobutanoyl-, sec-Butanoyl-, Pivaloyloxymethyl-, Propyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, sec-Butyl-, Benzyl-, Isopropyloxycarbonyloxymethyl, tert-Butyl-Oxycarbonyloxymethyl-, S-Acyl-2-thioethyl-, S-Acylthiopropyl- oder Hydroxyethyl-disufanylethylgruppe, und wobei: - i 0 oder 1 ist, - A und B unabhängig voneinander CH₂, CH-Ar, Carboxyl, Carbamoyl, Carbonat, Carbamid, Carbamat, Urea, wobei Ar ein gegebenenfalls substituierter Arylrest, insbesondere Phenyl- oder Pyridinrest, ist, der insbesondere substituiert ist mit Halogen (F, CI, Br), OH, einem C_1-6-Alkylrest oder einem C_1-6-Alkoxyrest, in Kombination mit einer Krebsimmunotherapie zur Verwendung bei der Behandlung von Krebserkrankungen.
Verwendung einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der Formel (IIIa) oder (IIIb)nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ H, C_3-12-Alkylrest, ein Fünfring- oder Sechsring-Heterozyklus oder ein Arylrest ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der Formel (IIIa) oder (IIIb)nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass R² H ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der Formel (IIIa) oder (IIIb)nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder Vorläuferverbindungen gemäß der allgemeinen (IIIa) oder (IIIb)in Form einer pharmazeutische Formulierung, enthaltend eine wirksame Menge mindestens einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder einer Vorläuferverbindung gemäß der Formel (IIIa) oder (IIIb), vorliegt.