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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Substanz in einer Probe, insbesondere einer flüssigen Probe,
wobei in einem gemessenen Spektrum der Probe, welches eine Intensität als Funktion einer Position angibt, ein Signalanteil, welcher auf die Substanz zurückzuführen ist, bestimmt wird.
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Eine häufige Aufgabenstellung in der Qualitätssicherung in zahlreichen industriellen Prozessen, oder auch in Forschung und medizinischer Diagnostik, ist die quantitative Überprüfung der Zusammensetzung einer genommenen Probe, insbesondere die Bestimmung der Konzentration einer bestimmten Substanz in der Probe. Um die Konzentration einer Substanz in eine Probe zu bestimmen, kann die in der Probe enthaltene Substanz mit einem Reagenz quantitativ umgesetzt werden, etwa bis ein Farbumschlag eines zugesetzten Indikators das Ende der Umsetzungsreaktion anzeigt, wobei die Menge des zugesetzten Reagenz mitverfolgt wird. Solche konventionellen chemischen Verfahren sind jedoch recht aufwendig und wurden in letzter Zeit durch spektroskopische Methoden weitgehend ersetzt. Bei spektroskopischen Methoden wird die Wechselwirkung der Substanz in der Probe mit einer untersuchenden Strahlung genutzt, um die Konzentration zu bestimmen.
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Eine leistungsfähige spektroskopische Methode der quantitativen analytischen Chemie ist die NMR(= Kernspinresonanz, nuclear magnetic resonance)-Spektroskopie. Typischerweise werden hierbei in der eindimensionalen NMR-Spektroskopie die in der Probe enthaltenen Kernspins in einem starken, statischen magnetischen Feld ausgerichtet, und mit einem Hochfrequenz-Puls wird die Kernmagnetisierung um 90° gedreht. Anschließend wird die Hochfrequenz-Antwort der Probe als Funktion der Zeit aufgezeichnet (FID-Signal, FID = free induction decay). Durch Fourier-Transformation kann aus dem Zeitsignal ein Frequenzspektrum der Probe erhalten werden, in welchem für die einzelnen Bestandteile der Probe charakteristische Peaks (Spitzen) enthalten sind, wobei die einzelnen Peaks der Bestandteile mehr oder weniger stark überlagern.
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Die Intensität der Peaks der einzelnen Bestandteile der Probe ist grundsätzlich proportional zur Konzentration des zugehörigen Bestandteils in der Probe. Allerdings ist es aufgrund der Überlagerung einer Vielzahl von Peaks in einem Spektrum oft nicht einfach, den Signalanteil, der zu einer bestimmten Substanz gehört, quantitativ zu bestimmen. Dies gilt nicht nur für die NMR, sondern auch für andere spektroskopische Methoden wie IR(= Infrarot)-Spektroskopie oder Röntgen-Spektroskopie (Röntgenfluoreszenz oder Röntgenabsorption).
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In der NMR-Spektroskopie kann in einem so genannten quantenmechanischen Ansatz mithilfe der chemischen Struktur und einem gemessenen Referenzspektrum der zu bestimmenden Substanz die relative Position und relative Intensität der Peaks dieser Substanz bestimmt werden. Dabei werden insbesondere chemische Verschiebungen und Kopplungskonstanten aus dem gemessenen Referenzspektrum der Probe abgeleitet, wofür ein Experte für Spektralanalysen erforderlich ist. Die solchermaßen bestimmten Peaks werden dann durch Gesamt-Frequenzverschiebung und Gesamt-Amplitudenänderung und gegebenenfalls Veränderung der quantenmechanischen Berechnung, insbesondere Variation von Kopplungskonstanten, angepasst, bis eine ausreichende Übereinstimmung mit einem gemessenen Spektrum der Probe besteht. Unter den angepassten Peaks kann dann zur Bestimmung des Signalanteils der Substanz integriert werden. Der quantenmechanische Ansatz ist beispielsweise in der Spektralanalysesoftware „TopSpin” im Softwaremodul „DAISY” der Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, DE, implementiert.
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Es ist auch bekannt, in einem Referenzspektrum der zu bestimmenden Substanz die zur Substanz gehörenden einzelnen Peaks zu identifizieren und die relativen Positionen, Intensitäten, Linienbreiten und Linienformen zu ermitteln. Dies erfordert wiederum einen Experten für Spektralanalyse. Sodann kann ein Anfitten der Peaks an das gemessene Spektrum der Probe erfolgen, und unter den angefitteten Peaks kann wiederum zur Bestimmung des Signalanteils der Substanz integriert werden. Dieser so genannte Multiplet-Ansatz ist beispielsweise in der Spektralanalysesoftware „Chenomx NMR Suite” der Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, CA, implementiert.
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Diesen Ansätzen ist gemeinsam, dass zumindest für die Auswertung des Referenzspektrums der zu bestimmenden Substanz ein Experte für Spektralanalyse benötigt wird. Die Auswertungen des Experten sind zeit- und kostenaufwendig bzw. beschränken die quantitative Analyse von Substanzen, zu denen noch keine Auswertung eines Referenzspektrums existiert.
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Aus der
US 2004/0058386 A1 ist es bekannt, die in einem NMR-Referenzspektrum enthaltenen Peaks durch eine Lorentzfunktion zu beschreiben, wobei Peaks im selben Cluster eine einheitliche Peakbreite zuggewiesen wird. Cluster können zur Anpassung an ein gemessenes NMR-Testspektrum einer Probe bezüglich der Frequenz verschoben werden. Sodann werden obere Konzentrationsgrenzen für einen Bestanteils über die Peakhöhen im Referenzspektrum und im gemessenen Spektrum bestimmt.
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Aufgabe der Erfindung
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein vereinfachtes Verfahren für die Bestimmung der Konzentration einer Substanz in einer Probe bereitzustellen, insbesondere wobei die Mitwirkung eines Experten für Spektralanalyse nicht erforderlich ist.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Substanz in einer Probe, insbesondere einer flüssigen Probe,
wobei in einem gemessenen Spektrum der Probe, welches eine Intensität als Funktion einer Position angibt, ein Signalanteil, welcher auf die Substanz zurückzuführen ist, bestimmt wird,
wobei aus einem gemessenen Referenzspektrum der Substanz jeweils eine Vielzahl von Zwischenspektren berechnet wird, bis eine vorgegebene Übereinstimmung zwischen einem resultierenden Zwischenspektrum und dem gemessenen Spektrum erreicht ist,
und wobei der Signalanteil durch Integration des an das gemessene Spektrum angefitteten resultierenden Zwischenspektrums berechnet wird,
wobei zur Berechnung der Zwischenspektren auf das Referenzspektrum folgende Einzelschritte angewandt werden:
- a) Verschiebung der Position gemäß einem Verschiebeparameter;
- b) Multiplikation mit einem Amplitudenfaktor;
- c) Faltung mit einer Systemfunktion gemäß einem Linienverbreiterungsparameter;
wobei der Verschiebeparameter, der Amplitudenfaktor und der Linienverbreiterungsparameter im Rahmen eines Optimierungsalgorithmus, welcher die Übereinstimmung zwischen den Zwischenspektren und des gemessenen Spektrums iterativ optimiert, verändert werden.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Referenzspektrum der quantitativ in der Probe zu bestimmenden Substanz, das typischerweise drei oder mehr auf die Substanz zurückgehende Peaks aufweist und typischerweise einen wesentlich kleineren Positionsbereich (in der NMR: Frequenzbereich) als das gemessene Spektrum der Probe überstreicht, für die Konzentrationsbestimmung direkt verwendet, d. h. ohne Identifikation einzelner Peaks im Referenzspektrum.
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Das Referenzspektrum wird durch drei Einzelschritte, die jeweils in einem Iterationsdurchgang angewandt werden, in ein Zwischenspektrum ungerechnet, dessen Übereinstimmung mit dem gemessenen (experimentellen) Spektrum der Probe verglichen wird. In jedem Iterationsdurchgang des Optimierungsalgorithmus wird also ein Zwischenspektrum neu aus dem Referenzspektrum bestimmt. Der Optimierungsalgorithmus berechnet typischerweise eine Korrelationsfunktion (Abweichungsfunktion) für jedes Zwischenspektrum gegenüber dem gemessenen Spektrum, bis eine Abbruchbedingung erreicht ist (beispielsweise eine maximale Anzahl von Iterationen, oder ein durch die Korrelationsfunktion bestimmter Abweichungsparameter ist kleiner als ein vorgegebener Schwellwert). Eine typische Korrelationsfunktion bestimmt die quadratische Abweichung zwischen dem gemessenen Spektrum und dem berechneten Zwischenspektrum.
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Im Rahmen des erfindungsgemäßen Optimierungsalgorithmus wird als einer der Einzelschritte (Schritt c) eine Faltung des Referenzspektrums mit einer Systemfunktion („point spread function”) angewandt, um eine gleichmäßige Linienverbreiterung gegenüber dem Referenzspektrum zu erhalten. Eine solche gleichmäßige Linienverbreiterung entspricht recht exakt der Veränderung von NMR-Linien (Peaks in einem NMR-Spektrum) einer Substanz, die in einem flüssigen Lösungsmittel gelöst ist. In der Infrarot-Spektroskopie treten gleichmäßige, instrumentenbedingte Linienverbreiterungen auf, die ebenfalls durch die erfindungsgemäße Faltung (gemäß Schritt c) gut nachgebildet werden können. Die Linienverbreiterung wird mit einem Linienparameter beschrieben (z. B. einer Halbwertsbreite); bei komplexeren Systemfunktionen (insbesondere zusammengesetzten Systemfunktionen, etwa einer gemischten Gauß- und Lorentz-Funktion) kann der Linienparameter auch mehrdimensional sein.
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Weitere Einzelschritte im erfindungsgemäßen Optimierungsalgorithmus sind Positionsverschiebung (Schritt a) und Amplitudenanpassung (Schritt b). Die Positionsveränderung des Referenzspektrums lässt bevorzugt eine Verschiebung auch um Bruchteile des Punktabstands der Positionsvariable zu, wodurch ein besonders genauer Fit des Zwischenspektrums an das gemessene Spektrum erreicht werden kann. Die Amplitudenanpassung erfolgt typischerweise in der Weise, dass für die in einem Iterationsdurchgang gewählte Positionsverschiebung und Linienverbreiterung die maximale Amplitude gewählt wird, mit der das Zwischenspektrum überall (an allen Positionen) noch unterhalb oder genau am gemessenen Spektrum bleibt; dadurch werden unrealistische Fits vermieden.
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Die vorliegende Erfindung wird bevorzugt in der NMR-Spektroskopie, insbesondere der eindimensionalen NMR-Spektroskopie eingesetzt, wobei das gemessene Spektrum aus einem FID-Signal der Probe durch Fouriertransformation gewonnen wird. Die Positionsangabe im Spektrum ist dann eine Frequenz, meist angegeben in ppm einer chemischen Verschiebung. In der optischen Spektroskopie (insbesondere IR-Spektroskopie) und der Röntgenspektroskopie ist die Positionsangabe meist eine Wellenlänge. Man beachte, dass auch mehrdimensionale Positionsvariablen im Rahmen der Erfindung in Betracht kommen (etwa in der so genannten 2-dimensionalen NMR-Spektroskopie).
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Das gemessene Spektrum kann vor dem Beginn des Optimierungsalgorithmus vorprozessiert werden, insbesondere durch Basislinien-Korrektur oder Phasenkorrektur. Ebenso kann das gemessene Referenzspektrum vor Beginn des Optimierungsalgorithmus vorprozessiert werden, insbesondere um schmale Spektrallinien (Peaks) zu erhalten.
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Im Rahmen der Erfindung wird auf einfache Weise ein guter Fit eines besten (resultierenden) Zwischenspektrums an das gemessene Spektrum einer Probe erreicht, und entsprechend wird auf einfache Weise eine Bestimmung des Signalanteils der Substanz im gemessenen Spektrum ermöglicht. Zusammen mit dem Signalanteil einer Kalibriersubstanz (die in bekannter Konzentration der vermessenen Probe vor der Messung zugesetzt wurde) kann dann die Konzentration der Substanz in der Probe leicht berechnet werden. Ebenso ist es möglich, eine separate, externe Kalibrierungsmessung vorzunehmen, und auf deren Grundlage aus dem Signalanteil der Substanz im gemessenen Spektrum deren Stoffmenge bzw. Konzentration in der gemessenen Probe zu bestimmen, insbesondere nach dem unter dem Namen PULCON bekannt gewordenen Verfahren, vgl. G. Wider, L. Dreier, J. Am. Chem. Soc. 2006, No. 128, S. 2571–2576.
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Man beachte, dass die Substanz in der Regel nur eine einzige Art von Molekül (einschließlich ionisiertem Molekül) umfasst; es ist allerdings auch möglich, ein Gemisch von zwei oder mehr Arten von Molekülen als Substanz zu analysieren, insbesondere wenn die verschiedenen Arten von Molekülen der Substanz in einem festen, relativen Verhältnis zu einander stehen. Typische zu bestimmende Substanzen in einer Probe sind Glukose, Fruktose, Rohrzucker, Ethanol, Methanol, Glykol, Kreatin, Kreatinin, Harnstoff und Milchsäure. Typische Proben sind Fruchtsaft, Wein, Urin (insbesondere menschlicher Urin), Blut und Blutplasma (insbesondere menschliches Blut und Blutplasma). Die Erfindung wird bevorzugt in der Qualitätssicherung von industriellen Prozessen, der Forschung (insbesondere medizinischen Forschung, bevorzugt Metabolomics) und der medizinischen Diagnostik eingesetzt.
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Bevorzugte Varianten der Erfindung
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Bei einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Referenzspektrum ein diskretes Spektrum mit der gleichen Auflösung wie das gemessene Spektrum der Probe verwendet. Ein diskretes Referenzspektrum ist leicht zu handhaben, und bei gleicher Auflösung (gleichem Abstand zwischen zwei Positionspunkten in den beiden Spektren, in der NMR meist gemessen in ppm) wird ein punktweises Verschieben des Referenzspektrums gegenüber dem gemessenen Spektrum leicht möglich, ohne dass es einer Interpolation für die Bestimmung eines Abweichungsparameters bedarf. Letzteres kann insbesondere in einem zeitlich ersten Teil des Optimierungsalgorithmus genutzt werden, in welchem zunächst eine grobe Anpassung an das gemessene Spektrum durch Verschiebung und Amplitudenanpassung erfolgt, meist ohne eine Linienverbreiterung vorzunehmen. Man beachte, dass ein gemessenes Spektrum grundsätzlich diskret vorliegt.
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Eine bevorzugte Weiterentwicklung dieser Variante sieht vor, dass das Referenzspektrum aus einem gemessenen Vor-Referenzspektrum mit anderer Auflösung als das gemessene Spektrum der Probe bestimmt wird, und die Intensität zumindest an einem Teil der Positionen im Referenzspektrum durch Interpolation bestimmt wird. Dadurch kann leicht auf Vor-Referenzspektren zurückgegriffen werden, deren Auflösung (Abstand zwischen zwei Positionspunkten) nicht mit dem gemessenen Spektrum der Probe übereinstimmt. Zur Interpolation kann beispielsweise lineare Interpolation oder auch eine Polynom-Interpolation angewendet werden.
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Bevorzugt ist auch eine Weiterentwicklung, bei der in einem ersten Teil des Optimierungsalgorithmus lediglich der Verschiebeparameter und der Amplitudenfaktor verändert werden. In einem zeitlich ersten Teil erfolgt hier zunächst eine grobe Anpassung (Anfittung) an das gemessene Spektrum durch die Zwischenspektren, wofür die Faltung noch nicht notwendig ist, und entsprechend durch Weglassen der Faltung Rechenkapazität eingespart werden kann bzw. das Verfahren beschleunigt werden kann. Die Faltung wird dann erst in einem zeitlich späteren (insbesondre letzten) Teil des Optimierungsalgorithmus eingesetzt.
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Bei einer bevorzugten Verfahrensvariante ist die Systemfunktion eine Lorentzfunktion, eine Gauss-Funktion oder eine Mischung aus einer Lorentz- und einer Gauss-Funktion. Diese Funktionstypen sind vergleichsweise einfach numerisch zu handhaben und haben sich für das Verfahren praktisch bewährt. Zudem sind sie symmetrisch, was für die Systemfunktion bevorzugt ist. Alternativ ist die Systemfunktion eine bezüglich ihrer Mittenposition unsymmetrische Funktion, insbesondere wobei die Systemfunktion einen Imaginärteil einer Lorentzfunktion enthält. Damit kann im Einzelfall ein verbesserter Fit der Zwischenspektren an das gemessene Spektrum der Probe erreicht werden, insbesondere bei der Quantifizierung von phasensensitiven 2D-Spektren.
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Besonders bevorzugt ist eine Verfahrensvariante, bei der zumindest in einem letzten Teil des Optimierungsalgorithmus der Verschiebeparameter Bruchteile einer Auflösung des gemessenen Spektrums umfasst. Im zeitlich letzten Teil des Optimierungsalgorithmus kann dann eine Feinanpassung (Anfittung) des Zwischenspektrums an das gemessene Spektrum der Probe erfolgen. Durch die Verschiebung des Referenzspektrums um Bruchteile der Auflösung (d. h. nichtganzzahlige Vielfache des Abstand zwischen zwei benachbarten Positionspunkten des diskreten Spektrums) kann eine bessere Übereinstimmung als bei einer Beschränkung der Anfittung auf ganzzahlige Punktabstände erreicht werden.
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Vorteilhafter Weise ist in einer Weiterentwicklung hierzu vorgesehen, dass im Rahmen des Optimierungsalgorithmus Intensitäten der Zwischenspektren durch Interpolation bestimmt werden. Durch Interpolation kann dann die Intensität des Zwischenspektrums für die entsprechenden (festen) Positionen des gemessenen Spektrums der Probe ermittelt werden, wenn das Zwischenspektrum um einen Bruchteil der Auflösung gegenüber dem gemessenen Spektrum (bzw. dessen diskreten Punktpositionen) verschoben ist. Bevorzugt wird lineare Interpolation oder eine Polynom-Interpolation eingesetzt.
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Bevorzugt ist weiterhin eine Verfahrensvariante, bei der zumindest in einem ersten Teil des Optimierungsalgorithmus nur Amplitudenfaktoren zugelassen werden, mit denen das jeweilige Zwischenspektrum an jeder Position eine Intensität kleiner oder gleich der Intensität des gemessenen Spektrums an der jeweiligen Position aufweist. Dadurch werden unrealistische Amplitudenfaktoren bzw. Anpassungsparameter des Zwischenspektrums insgesamt vermieden, und die Konzentrationsbestimmung wird zuverlässiger.
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Bevorzugt wird diese Zulassungsbedingung nicht nur in einem zeitlich ersten Teil des Optimierungsverfahrens, sondern während des gesamten Optimierungsverfahrens eingesetzt.
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Ebenso bevorzugt ist eine alternative Verfahrensvariante, bei der zumindest in einem ersten Teil des Optimierungsalgorithmus nur Amplitudenfaktoren zugelassen werden, mit denen das jeweilige Zwischenspektrum an jeder Position eine Intensität aufweist, die maximal um einen Grenzwert GW größer ist als die Intensität des gemessenen Spektrums an der jeweiligen Position. Auch dadurch werden unrealistische Amplitudenfaktoren bzw. Anpassungsparameter des Zwischenspektrums insgesamt vermieden, und die Konzentrationsbestimmung wird zuverlässiger. Durch den Grenzwert können kleine Übertretungen des gemessenen Spektrums, wie sie etwa durch Signalrauschen erhalten werden, zugelassen werden. Entsprechend wird der Grenzwert GW entsprechend bevorzugt in der Größenordnung der typischen Amplitude eines beobachteten Rauschens des Referenzspektrums oder des gemessenen Spektrums gewählt. Bevorzugt wird diese Zulassungsbedingung nicht nur in einem zeitlich ersten Teil des Optimierungsverfahrens, sondern während des gesamten Optimierungsverfahrens eingesetzt.
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Besonders bevorzugt ist eine Verfahrensvariante, die vorsieht, dass die Aufnahme des Referenzspektrums unter gleichen Messbedingungen erfolgt ist wie die Aufnahme des gemessenen Spektrums der Probe. Bei übereinstimmenden Messbedingungen wird die erfindungsgemäße Konzentrationsbestimmung besonders zuverlässig, da Verfälschungen des Referenzspektrums gegenüber dem Signalanteil des gemessenen Spektrums durch eine abweichende Messbedingung vermieden werden, und dadurch ein fehlerbehaftetes Anfitten vermieden wird. Die übereinstimmenden Messbedingungen umfassen insbesondere die Probentemperatur, und/oder das/die verwendete/n Lösungsmittel in der Probe, und/oder die Stärke des statischen Magnetfelds bei der jeweiligen Messung.
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Vorteilhaft ist auch eine Variante, bei der der Optimierungsalgorithmus den Marquardt-Levenberg Algorithmus anwendet. Der Marquardt-Levenberg Algorithmus ist in der Praxis bewährt. Man beachte, dass während eines Teils des Optimierungsalgorithmus auch andere Optimierungsverfahren angewandt werden können.
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Ebenso vorteilhaft ist eine Variante, bei der das Optimierungsverfahren den Simplex Algorithmus anwendet. Der Simplex Algorithmus ist ebenfalls in der Praxis bewährt. Man beachte, dass während eines Teils des Optimierungsalgorithmus auch andere Optimierungsverfahren angewandt werden können.
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Besonders bevorzugt ist eine Verfahrensvariante, bei der das Verfahren in der NMR(= Kernspinresonanz)-Spektroskopie angewendet wird. Insbesondere durch Verwendung des Schritts c) der Faltung des Referenzspektrums mit der Systemfunktion können in der NMR typische Linienverbreiterungen durch Lösungsmittel wie Wasser oder Aceton gut angefittet werden, und entsprechend kann eine besonders genaue Konzentrationsbestimmung erfolgen.
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Ebenso ist eine Verfahrensvariante möglich, bei der das Verfahren in der optischen Spektroskopie, insbesondere der IR(= Infrarot)-Spektroskopie, oder der Röntgenspektroskopie oder der Massenspektroskopie angewandt wird. Auch hier können die einfachen Schritte des Verfahrens ohne einen Experten für spektrale Analysen leicht angewandt werden.
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Weiterhin ist eine Verfahrensvariante vorteilhaft, bei der die Probe eine flüssige Probe oder eine feste Probe, insbesondere eine pulverförmige Probe, ist. Bei flüssigen Proben treten starke Linienverbreiterungen insbesondere in der NMR auf, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gut gehandhabt werden können. Die Erfindung ist aber auch bei festen Proben gut anwendbar.
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In den Rahmen der vorliegenden Erfindung fällt auch eine Spektroskopie-Apparatur, eingerichtet zur automatischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere wobei die Spektroskopie-Apparatur eine Messeinheit zur Aufnahme des gemessenen Spektrums der Probe und/oder des gemessenen Referenzspektrums der Substanz umfasst. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders gut dazu geeignet, automatisch eingerichtet zu werden. Dazu können übliche Computersysteme mit entsprechender Programmierung und geeigneten Schnittstellen eingerichtet werden. Der Eingriff von Experten für spektroskopische Analyse ist grundsätzlich nicht notwendig, auch nicht für die Auswertung eines Referenzspektrums. Insofern ist es auch möglich, durch den Anwender neue Referenzspektren vermessen zu lassen und im erfindungsgemäßen Verfahren sogleich einzusetzen. Bevorzugt ist dafür die Spektroskopie-Apparatur nicht nur für die Datenauswertung, sondern auch für die Datenaufnahme eingerichtet.
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Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der Zeichnung. Ebenso können die vorstehend genannten und die noch weiter ausgeführten Merkmale erfindungsgemäß jeweils einzeln für sich oder zu mehreren in beliebigen Kombinationen Verwendung finden. Die gezeigten und beschriebenen Ausführungsformen sind nicht als abschließende Aufzählung zu verstehen, sondern haben vielmehr beispielhaften Charakter für die Schilderung der Erfindung.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung und Zeichnung
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Die Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
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1a eine Ausschnitt eines experimentellen NMR-Spektrums von Hippursäure, mit Markierung eines im Rahmen der Erfindung für ein Referenzspektrum verwendeten Teilbereichs; aufgetragen ist nach rechts die chemische Verschiebung in ppm, nach oben die Intensität;
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1b das sich aus 1 ergebende Referenzspektrum; aufgetragen ist nach rechts die chemische Verschiebung in ppm, nach oben die Intensität;
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2 einen Ausschnitt eines experimentellen NMR-Spektrums einer Urinprobe, das als gemessenes Spektrum einer Probe im Rahmen der Erfindung verwendet werden kann; aufgetragen ist nach rechts die chemische Verschiebung in ppm, nach oben die Intensität;
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3a–3d jeweils denselben Ausschnitt aus dem gemessenen Spektrum von 2 (einzeln gezeichnete Linie) und ein unterschiedlich weit verschobenes und amplitudenmaximiertes Referenzspektrum von 1a (schwarz unterlegte Linie);
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4 einen Ausschnitt aus dem gemessenen Spektrum von 2 (einzeln gezeichnete Linie) und das am besten übereinstimmende, um ganze Punkte verschobene und amplitudenmaximierte Referenzspektrum von 1a (schwarz unterlegte Linie);
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5 verschiedene Formen von Zwischenspektren B), C), D), E), die durch Faltung mit einer Lorenzfunktion mit jeweils anderer Halbwertsbreite aus dem Referenzspektrum A) hervorgegangen sind;
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6 einen Ausschnitt aus dem gemessenen Spektrum von 2 (einzeln gezeichnete Linie) und das resultierende, d. h. am besten mit dem gemessenen Spektrum übereinstimmende Zwischenspektrum, dass durch Verschiebung, Amplitudenveränderung und Faltung mit einer Lorentzfunktion aus dem Referenzspektrum von 1a gemäß der Erfindung erhalten wurde;
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7 eine Lorenzfunktion (x-Werte) und eine Gaußfunktion (o-Werte), die als Systemfunktion im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden können; nach rechts aufgetragen ist die Position (hier ausgedrückt in vollen Punkten), nach oben der Funktionswert;
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8 ein aus diskreten Punkten aufgebauter Peak und ein durch Polynom-Interpolation aus diesem erhaltener, um 0,5 Punkte verschobener Peak;
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9 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Spektroskopie-Apparatur zur automatischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, mit einer Messeinheit zur Aufnahme von Spektren.
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Ausführungsbeispiel zum erfindungsgemäßen Anfitten eines Referenzspektrums an ein gemessenes Spektrum
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Im Folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand eines Beispiels, nämlich der Konzentrationsbestimmung von Hippursäure in einer Urinprobe durch quantitative Kernspinresonanz-Analyse, beschrieben.
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Hippursäure ist eine organische Verbindung, die in Urin auftritt. Die Konzentration von Hippursäure im Urin dient als Indikator für die Diagnose bestimmter angeborener Stoffwechselerkrankungen. Auch bestimmte therapeutische Maßnahmen verändern die Konzentration von Hippursäure im Urin.
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Konzentrationen im Urin werden wegen der unterschiedlichen Verdünnung durch Trinken meist relativ zu einer bekannten Substanz im Urin angegeben. Üblicherweise verwendet man als solche bekannte Substanz Kreatinin, als Einheit verwendet man „mmol/mmol Kreatinin”. Kreatinin tritt im NMR-Spektrum als einzelner Peak auf, der durch Anfitten einer Gauss-Lorentz-Linie an das experimentelle Spektrum quantifiziert wird, was hier nicht näher erläutert zu werden braucht.
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1a zeigt einen Ausschnitt eines experimentellen NMR-Spektrums von Hippursäure (in wässriger Lösung). Es ist ein komplexes Spektrum zu erkennen, wobei die einzelnen Peaks nicht voneinander getrennt sind, sondern miteinander überlagert auftreten. Prinzipiell könnte dieser Ausschnitt (oder ein noch größerer Teil des experimentellen NMR-Spektrums von Hippursäure) als Referenzspektrum für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden; in diesem Beispielspiel wird jedoch nur der mit REF markierte Frequenzbereich (Frequenzintervall) für das Referenzspektrum ausgewählt. Dieser Frequenzbereich weist hier fünf lokale Maxima auf, wovon zwei sehr klein an den inneren Flanken von zwei äußeren, großen Peaks ausgebildet sind. Dieser Frequenzbereich ist für eine quantitative Analyse gut geeignet.
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Das in 1a wiedergegebene experimentelle NMR-Spektrum verfügt über eine Auflösung von 0,002 ppm (Abstand zwischen zwei benachbarten Punkten, auch genannt Positionen, an denen jeweils ein Intensitätswert erfasst wurde).
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Die 2 zeigt einen Ausschnitt eines experimentellen NMR-Spektrums einer Urinprobe, in näherungsweise den gleichen Frequenzgrenzen wie 1a. Die Urinprobe enthält Hippursäure, so dass im NMR-Spektrum des Urins an ähnlichen Stellen Peaks zu finden sind wie im NMR-Spektrum der reinen Hippursäure von 1a. Durch Effekte, die durch die Urinprobe (d. h. deren Zusammensetzung) verursacht werden, sind die einzelnen Peaks im Spektrum des Urins jedoch breiter als im Spektrum der reinen Hippursäure von 1a. Dies gilt insbesondere in dem für das Referenzspektrum ausgewählten Frequenzbereich FRB. So sind hier nur noch drei lokale Maxima zu erkennen; die kleinen Maxima an den inneren Flanken der beiden äußeren Peaks sind nicht mehr zu erkennen.
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Das in 2 wiedergegebene NMR-Spektrum, also dieses gemessene Spektrum GS der (Urin-)Probe, soll nun quantitativ ausgewertet werden, d. h. die Konzentration der Hippursäure (relativ zum Kreatinin) soll bestimmt werden. Dazu wird derjenige Flächenanteil unter dem Spektrum im Frequenzbereich FRB, der der Hippursäure zugeordnet werden kann, bestimmt. Nur ein Teil der Fläche unter dem Spektrum der 2 im Frequenzbereich FRB geht auf Hippursäure zurück; weitere Substanzen im Urin erhöhen die Intensität in diesem Frequenzbereich FRB, was nicht der Hippursäure zugerechnet werden darf. Das erfindungsgemäße Verfahren schlägt dazu vor, ein Referenzspektrum der zu bestimmenden Substanz, hier der Hippursäure, durch Frequenzverschiebung, Amplitudenanpassung und Faltung an das gemessene Spektrum GS anzufitten, und dann die Fläche unter dem am besten passenden, angefitteten Referenzspektrum (hier genannt resultierendes Zwischenspektrum) zu bestimmen.
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Die Auflösung des gemessenen Spektrums GS der Urinprobe von 2 beträgt hier 0,001 ppm. Zur Vorbereitung der weiteren Verfahrensschritte wird nun ein Referenzspektrum herangezogen. Dieses ergibt sich als der mit REF markierte Ausschnitt aus dem Spektrum der reinen Hippursäure von 1a („Vor-Referenzspektrum”), wobei allerdings noch zwischen je zwei benachbarten Messpunkten durch Interpolation ein weiterer Messpunkt berechnet wird, um so auch im Referenzspektrum eine Auflösung von 0,001 ppm zu erhalten. Das so berechnete Referenzspektrum RS ist in 1b dargestellt. Man beachte, dass in den dargestellten Spektren, insbesondere in 1a, 1b, 2, die Messpunkte bzw. berechneten Punkte so dicht liegen, dass diese nicht mehr einzeln erkannt werden können.
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In einem zeitlich ersten Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun das Referenzspektrum RS grob an das gemessene Spektrum GS der (Urin-)Probe angepasst.
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Dazu wird das Referenzspektrum RS punktweise (also in Schritten der Auflösung von hier 0,001 ppm) gegen das gemessene Spektrum GS verschoben, und die Amplitude des Referenzspektrums jeweils durch einen aufmultiplizierten Vorfaktor („Amplitudenfaktor”) maximiert, so dass das Referenzspektrum gerade noch an allen Frequenzpositionen unterhalb oder am gemessenen Spektrum GS bleibt. Dadurch werden in diesem ersten Teil des Verfahrens jeweils Zwischenspektren ZW1 erhalten.
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Zu jedem solchen Zwischenspektrum ZW1 wird eine Abweichungsfunktion (auch genannt Korrelationsfunktion oder Zielfunktion) berechnet, die die Abweichung zwischen dem jeweiligen Zwischenspektrum ZW1 und dem gemessenem Spektrum GS quantifiziert. Diese Abweichungsfunktion ist beispielsweise die Summe der quadratischen Abweichungen der Intensitätswerte des jeweiligen Zwischenspektrums ZW1 von den Intensitätswerten des gemessenen Spektrums GS an allen Frequenzpositionen des Zwischenspektrums ZW1.
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Die 3a bis 3d zeigen hierzu jeweils das gemessene Spektrum GS und unterschiedlich weit verschobene Zwischenspektren ZW1. Im Rahmen des ersten Verfahrensteils können alle möglichen punktweisen Verschiebungen durchgerechnet werden, was bevorzugt ist, oder es kann bereits ein Optimierungsalgorithmus angewandt werden, der gezielt Zwischenspektren mit sich aus dem Algorithmus ergebenden Verschiebeparametern (Beträgen der Frequenzverschiebung) auswählt und auswertet. Das beste, durch Frequenzverschiebung über ganze Punkte und Amplitudenmaximierung unter dem gemessenen Spektrum GS aus dem Referenzspektrum RS erhaltene Zwischenspektrum ZW1, welches die geringste Abweichung vom gemessenen Spektrum GS hat, ist in 4 dargestellt.
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Sodann schließt sich ein zweiter Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens an, in welchem eine feine Anpassung des Referenzspektrums an das gemessene Spektrum erfolgt.
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Im zeitlich zweiten Teil des Verfahrens werden jeweils Zwischenspektren ZW2 aus dem Referenzspektrum RS berechnet, wobei sowohl eine Verschiebung des Referenzspektrums um Bruchteile der Auflösung, als auch eine Faltung des Referenzspektrums mit einer Systemfunktion erfolgt, und auch die Amplitude des Referenzspektrums angepasst (und bevorzugt unter dem gemessenen Spektrum GS maximiert) wird.
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5 illustriert die Linienverbreiterung, die durch Faltung mit einer Lorenzfunktion als Systemfunktion aus dem Referenzspektrum RS erhalten wird. Die Linienverbreiterung kann anhand der Halbwertsbreite (FWHM, full width at half maximum) der angewandten Lorentzfunktion eingestellt werden. Angewandt wurde als Halbwertsbreite A) = 0 Punkte, deckungsgleich mit Referenzspektrum RS, B) 1 Punkt, C) 2 Punkte, D) 3 Punkte E) 3.8 Punkte. Gut zu erkennen ist in 5, dass ab dem Zwischenspektrum ZW2 bei C) die Zwischenspektren ZW2 nur noch drei lokale Maxima aufweisen, ähnlich wie das Spektrum der Urinprobe im betrachteten Frequenzbereich FRB in 2.
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Durch einen geeigenten Optimierungsalgorithmus, beispielsweise einen Simplex Algorithmus, wird nun dasjenige Zwischenspektrum ZW2 bestimmt, mit dem eine beste Übereinstimmung mit dem gemessenen Spektrum GS erreicht wird. Dazu werden interativ zahlreiche Zwischenspektren ZW2 berechnet, bei denen unterschiedliche Verschiebungsparameter (d. h. hier Beträge der Frequenzverschiebung), Linienverbreiterungsparameter (hier Halbwertsbreiten der Lorentzfunktion als Systemfunktion) und Amplitudenfaktoren (hier maximiert, so dass das jeweilige Zwischenspektrum ZW2 an allen Positionen noch unterhalb oder an dem gemessenen Spektrum GS bleibt) angewandt werden. Zu jedem Zwischenspektrum ZW2 wird wiederum die oben erwähnte Abweichungsfunktion berechnet, um die Abweichung vom gemessenen Spektrum GS zu quantifizieren. Der Abweichungswert wird iterativ minimiert.
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Der Optimierungsalgorithmus beginnt mit dem Verschiebeparameter und dem Amplitudenfaktor, der sich am Ende des ersten Teils des Verfahrens als am Besten herausgestellt hat (vgl. Zwischenspektrum ZW1 in 4). Durch das Zulassen Bruchteilsverschiebungen und Durchführung der Faltung kann nun noch eine deutlich bessere Übereinstimmung der Zwischenspektren ZW2 mit dem gemessenen Spektrum GS erreicht werden als im ersten Teil des Verfahrens.
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Der Optimierungsalgorithmus wird durch eine geeignete Abbruchbedingung beendet. Typischerweise ist als Abbruchbedingung eine maximale Zahl von Interationen, oder das Unterschreiten einer Schwelle für den Wert der Abweichungsfunktion vorgesehen. Ebenso ist es möglich, den Optimierungsalgorithmus abzubrechen, wenn über eine vorgegebene Anzahl von Iterationen die Verbesserung des Werts der Abweichungsfunktion eine Schwelle unterschreitet.
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In 6 ist das resultierende, am besten übereinstimmende Zwischenspektrum ZW2res und zum Vergleich das gemessene Spektrum GS der (Urin-)Probe dargestellt. Mit der Fläche unter dem angefitteten resultierenden Zwischenspektrum ZW2res, in der 6 schwarz dargestellt, kann die Konzentration der Hippursäure in der Urinprobe (unter Anwendung einer üblichen Kalibrierung) quantifiziert werden.
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Würde man die Konzentrationsbestimmung der Hippursäure mit dem nach dem ersten Teil des Verfahrens erhaltenen Zwischenspektrum ZW1 (vgl. 4) durchführen, würde die Konzentration der Hippursäure im Vergleich zur Konzentrationsbestimmung mit dem nach dem zweiten Teil des Verfahrens erhaltenen resultierenden Zwischenspektrum ZW2res deutlich unterschätzt. In dem gezeigten Beispiel ergäbe sich bei der untersuchten Urinprobe mit dem Zwischenspektrum ZW1 aus 4 eine Konzentration von 27 mmol Hippursäure pro mmol Kreatinin, wohingegen sich mit dem resultierenden Zwischenspektrum ZW2res von 6 eine Konzentration von 40 mmol Hippursäure pro mmol Kreatinin ergibt.
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Systemfunktionen
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Die 7 illustriert eine Lorenztfunktion 70 (mit x-Werten markiert) und eine Gaußfunktion 71 (mit o-Werten markiert), die als Systemfunktionen im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden können. Ebenso kann eine Mischung aus beiden Funktionstypen (d. h. eine Lorentzfunktion ist mit einer Gauß-Funktion multipliziert) eingesetzt werden. Im obigen Beispiel erfolgt die Anwendung der Faltung mit einer Lorentzfunktion auf das Referenzspektrum im zweiten Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Durch Faltung des Referenzspektrums mit einer Systemfunktion kann eine Linienverbreiterung im Zwischenspektrum im Vergleich zum Referenzspektrum erreicht werden. Insbesondere bei Verwendung einer Lorentzfunktion 70 kann die Linienverbreiterung, wie sie in NMR-Spektren durch Lösungsmittel oft auftritt, sehr gut angenähert bzw. angefittet werden.
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In dem in 7 illustrierten Beispiel sind die Systemfunktionen jeweils an diskreten (vollen) Punkten beschrieben. Die Systemfunktionen 70, 71 werden jeweils durch eine Mittenposition 72, eine Halbwertsbreite 73 (ausgedrückt als volle Breite bei halbem Maximum) und einem Maximalwert (hier normiert auf 1) charakterisiert. Im gezeigten Beispiel beträgt die Halbwertsbreite 73 für beide Systemfunktionen jeweils 10 Punkte, und die Mittenposition 72 liegt jeweils beim Punktwert 25.
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Interpolation bei Bruchteilsverschiebungen
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In 8 ist (mit x-Werten) die Spitze einer diskreten Lorentzkurve 74 als Beispiel für ein diskretes Spektrum eingezeichnet, das um einen Bruchteil der Auflösung, hier beispielsweise um einen halben Punkt, verschoben werden soll. Entsprechende Operationen erfolgen mit dem Referenzspektrum in obigem Beispiel im zweiten Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens. Typischerweise werden Bruchteilsverschiebungen im Stufen von Zehntel-Punkten oder noch kleineren Punkt-Bruchteilen im Rahmen der Erfindung erlaubt; ebenso ist es möglich, durch den Optimierungsalgorithmus praktisch stufenlos Verschiebungen kleiner als ein Punktabstand zuzulassen, entsprechend den durch den Optimierungsalgorithmus numerisch verarbeitbaren reellen Zahlen.
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Hierfür müssen zunächst Zwischenwerte der diskreten Lorentzkurve 74, hier bei den Halbpunktpositionen bestimmt werden. Am einfachsten kann dies durch lineare Interpolation erfolgen. Im hier vorgestellten Fall wird dazu der Mittelwert zwischen den Intensitätswerten der beiden benachbarten (gemessenen) Punkte bestimmt, vgl. jeweils das hintere Ende der durchgezogenen Pfeile. Dieser Punktwert wird dann um die gewünschte Verschiebung, hier einen halben Punkt, versetzt, vgl. vordere Spitze der durchgezogenen Pfeile. Dieses Vorgehen ist sehr einfach, verfälscht aber die zu verschiebende Kurve nahe eines Maximums ein wenig.
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Eine bessere Interpolation kann mit einer Polynominterpolation erreicht werden. Hierbei wird durch einige Punkte um die gesuchte Halbpunktposition herum ein Polynom (wenigstens zweiten, bevorzugt wenigstens dritten Grades) gelegt, und der Funktionswert des Polynoms an der gewünschten Halbpunktposition bestimmt (vgl. jeweils hinteres Ende der gepunkteten Pfeile) und um die gewünschte Verschiebung versetzt (vgl. vordere Spitze der gepunkteten Pfeile in 8). Beispielsweise kann durch zwei Punkte vor und zwei Punkte nach der gewünschten Halbpunktposition ein Polynom dritten Grades gelegt werden. In der 8 kann aus den diskreten Punkten der Lorentzkurve 74 durch eine solche Polynominterpolation die um einen halben Punkt verschobene diskrete Kurve 75 (mit den o-Werten) erhalten werden, die eine Mittenposition von 25,5 aufweist. Die Verbesserung der Genauigkeit durch die Polynominterpolation im Vergleich zur linearen Interpolation kann durch die unterschiedliche Position der durchgezogenen Pfeile und der gepunkteten Pfeile, insbesondere nahe des Maximums, ersehen werden.
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Spektroskopie-Apparatur
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9 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Spektroskopie-Apparatur 96, mit der das erfindungsgemäße Verfahren zur Konzentrationsbestimmung durchgeführt werden kann, hier auf Basis von NMR-Spektren.
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Die Spektroskopie-Apparatur 96 verfügt hier über eine Messeinheit 95, mit der experimentelle NMR-Spektren aufgenommen können, insbesondere Referenzspektren von quantitativ zu bestimmenden Substanzen (typischerweise in reiner Form oder als einzige Substanz gelöst in einem reinen Lösungsmittel) und Spektren von zu untersuchenden Proben. Im gezeigten Ausführungsbeispiel verfügt die Messeinheit 95 über einen Magneten 90 (beispielsweise einen supraleitenden Magneten in einem Kryostaten), in dessen Probenvolumen ein homogenes Magnetfeld B0 erzeugt wird. In diesem Probenvolumen werden zu untersuchende Proben 91, hier gezeigt eine flüssige Probe 91 in einem Probenröhrchen, angeordnet und über einen HF-Resonator 92 mit Hochfrequenzpulsen bestrahlt. Die Hochfrequenzantwort der Probe 91 wird hier ebenfalls mit dem HF-Resonator 92 empfangen („Kombiresonator”). An den HF-Resonator ist 92 ein kombinierter HF-Generator und HF-Empfänger 93 angeschlossen.
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Die Spektroskopie-Apparatur 96 verfügt weiterhin über eine Auswerteeinheit 94. Diese kann aus den vom HF-Generator 93 weitergegebenen Signalen durch Fouriertransformation NMR-Spektren erzeugen. Die Auswerteeinheit 94 kann weiterhin gespeicherte gemessene Referenzspektren von quantitativ zu bestimmenden Substanzen an ein gemessenes Spektrum einer Probe (das ebenfalls gespeichert werden kann) gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren durch eine geeignete Programmierung automatisch anfitten. Aus dem zur jeweiligen Substanz gehörenden, durch Frequenzverschiebung, Faltung und Amplitudenanpassung angefitteten Referenzspektrum kann der zur Substanz gehörende Signalanteil im gemessenen Spektrum automatisch bestimmt werden, und daraus wiederum die Konzentration dieser Substanz in der Probe automatisch berechnet und ausgegeben werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 2004/0058386 A1 [0008]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- G. Wider, L. Dreier, J. Am. Chem. Soc. 2006, No. 128, S. 2571–2576 [0017]
