DE102014118898A1

DE102014118898A1 - Infrarot- und Raman-Spektroskopie

Info

Publication number: DE102014118898A1
Application number: DE102014118898.5A
Authority: DE
Inventors: Iris Herpich; Nils Kröger-Lui
Original assignee: Baden Wuerttemberg Stiftung gGmbH
Current assignee: Baden Wuerttemberg Stiftung gGmbH
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2016-06-23
Anticipated expiration: 2034-12-18
Also published as: DE102014118898B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer Probe (1), umfassend die Schritte Anlegen eines nicht-linearen Mediums (3) an die Probe (1), Bestrahlen der Probe (1) von einer dem nicht-linearen Medium (3) abgewandten Seite mit einer ersten elektromagnetischen Strahlung (4), die eine Infrarot(IR)-Strahlung ist, Bestrahlen der Probe (1) mit einer zweiten elektromagnetischen Strahlung (5), und Erfassen eines Summenfrequenzsignals (300) an einer der Probe (1) zugewandten Oberfläche des nicht-linearen Mediums (3). Des Weiteren betrifft die Erfindung eine zur Ausführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Analyse einer Probe mittels elektromagnetischer Strahlung unter Verwendung eines nicht-linearen Mediums.
Hintergrund der Erfindung
Zur mikroskopischen Untersuchung von Proben, insbesondere von biologischen Gewebeschnitten, wird überwiegend mit Färbetechniken gearbeitet. Dabei werden die Proben mit Farbstoffen oder mit Antikörpern behandelt, um zelluläre Strukturen bzw. einzelne Moleküle zu markieren. Diese Verfahren setzen jedoch eine Behandlung der Probe voraus, welche nicht nur arbeitsaufwändig ist, sondern regelmäßig mit einer Veränderung des Gewebes einhergeht. Als Alternative zu Färbetechniken werden daher unter anderem Spektroskopieuntersuchungen verwendet, welche die Analyse von Proben ohne vorherige Behandlung, insbesondere ohne Anfärbung, ermöglichen. Dabei werden mit Hilfe schwingungsspektroskopischer Verfahren sogenannte molekulare Bilder der Probe angefertigt, die Informationen über deren chemische Zusammensetzung sowie über die Identität und Struktur der enthaltenen chemischen Verbindungen geben. Als schwingungsspektroskopische Verfahren werden insbesondere die Infrarot(IR)-Spektroskopie und die Raman-Spektroskopie verwendet. Die IR-Mikrospektroskopie zeichnet sich durch hohe Signalstärken und kurze Messzeiten aus, bietet aufgrund der Wellenlänge der IR-Strahlung aber nur eine begrenzte laterale Auflösung (≥ ca. 10 μm). Die Raman-Spektroskopie hingegen erlaubt entsprechend der kürzeren Anregungswellenlänge eine laterale Auflösung von unter 1 μm, wegen der geringen Stärke des Raman-Signals sind jedoch verhältnismäßig lange Messzeiten notwendig.
Es besteht daher ein Bedarf nach einem Verfahren zur Analyse einer Probe, das es erlaubt, die Vorteile der IR- und Raman-Spektroskopie zu verbinden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer Probe, umfassend die Schritte Anlegen eines nicht-linearen Mediums an die Probe, Bestrahlen der Probe von einer dem nicht-linearen Medium abgewandten Seite mit einer ersten elektromagnetischen Strahlung, die eine Infrarot(IR)-Strahlung ist, Bestrahlen der Probe mit einer zweiten elektromagnetischen Strahlung, und Erfassen eines Summenfrequenzsignals an einer der Probe zugewandten Oberfläche des nicht-linearen Mediums.
Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Analyse einer Probe aufweisend ein nicht-lineares Medium, das an die Probe angelegt wird, eine erste Strahlungsquelle, die eine erste elektromagnetische Strahlung, nämlich eine IR-Strahlung, von einer dem nicht-linearen Medium abgewandten Seite auf die Probe emittiert, eine zweite Strahlungsquelle, die eine zweite elektromagnetische Strahlung auf die Probe emittiert, und einen Detektor, der ein Summenfrequenzsignal an einer der Probe zugewandten Oberfläche des nicht-linearen Mediums erfasst.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 7, bei der die Probe 1 vollständig durch das nicht-lineare Medium 3 abgedeckt ist (A) oder auf diesem aufliegt (B). Die Messung wird dementsprechend in Transmission (A) bzw. Reflexion (B) durchgeführt.
2 zeigt eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 7, bei der ein Zinkselenidkristall 103 einen Teil einer Gewebeprobe 101 bedeckt.
3 zeigt eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 7, bei der ein Zinkselenidkristall 103 Bestandteil eines Objektivs 212 eines Raman-Spektroskopie-Messkopfes 211 ist.
4A zeigt eine schematische Darstellung zur Visualisierung der Entstehung eines Summenfrequenzsignals 300 an der Grenzfläche 6 eines nicht-linearen Mediums 3 zu einer Probe 1. Die Probe 1 ist auf einem Objektträger 2 angeordnet und von einem nicht-linearen Medium 3 bedeckt. Sie wird durch den Objektträger 2 mit einer ersten elektromagnetischen Strahlung 4 und von der gegenüberliegenden Seite mit einer zweiten elektromagnetischen Strahlung 5 bestrahlt. Die Intensität des Summenfrequenzsignals 300 ist proportional zum Produkt aus der Intensität der ersten elektromagnetischen Strahlung 301 und der Intensität der zweiten elektromagnetischen Strahlung 302.
4B und C zeigen schematisch die Bestimmung des Summenfrequenzsignals 300, um die Eignung eines nicht-linearen Mediums 3 zur Summenfrequenzerzeugung zu testen. Das nicht-lineare Medium 3 wird von einer ersten elektromagnetischen Strahlung 4 und einer zweiten elektromagnetischen Strahlung 5 bestrahlt. Ist das nicht-lineare Medium zur Summenfrequenzerzeugung geeignet, entsteht an der Oberfläche des nicht-linearen Mediums ein Summenfrequenzsignal 300. Die Bestimmung des Summenfrequenzsignals 300 kann in Transmission (B) oder in Reflexion (C) durchgeführt werden, wobei das nicht-lineare Medium 3 jeweils von gegenüberliegenden Seiten oder von derselben Seite bestrahlt wird.
4D und E zeigen die Impulserhaltung bei der Bildung des Summenfrequenzsignals 300 bei gleichgerichteter Einstrahlung (D) und entgegen gesetzter Einstrahlung (E). Die Impulsvektoren (Impulsvektor SFS 400, Impulsvektor IR 401, Impulsvektor 402) geben die Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Photons an.
5 zeigt eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 7, bei der die Probe 1 vollständig durch das nicht-lineare Medium 3 abgedeckt ist und die Messung in Transmission erfolgt. Der Detektor 10 ist entgegen der Einstrahlrichtung der zweiten elektromagnetischen Strahlung 5 angeordnet.
6 zeigt die schematische Darstellung einer Ausführungsform des nichtlinearen Mediums 3 mit einer Lochblende 500 einzeln (A) und als Bestandteil eines Objektivs 212 (B).
7 zeigt ein IR-Transmissionsspektrum (A) und ein Raman-Spektrum (B) von Polystyrol.
8 zeigt das vollständige Raman-Spektrum einschließlich Summenfrequenzsignal (SFS) eines Polystyrolpartikels (Präparat 1). Aufnahmezeit: 2 Sekunden.
9 zeigt die schematische Wiedergabe einer Aufnahme von Polystyrolpartikeln (Präparat 1) anhand ihres Raman-Signals (A) und ihres Summenfrequenzsignals (B). Die Aufnahmen erfolgten mittels Abtasten der Polystyrolpartikel bei einer Schrittlänge von Δx = Δy = 0,25 mm. Die durch Fotografie dargestellte Struktur (C) ist in beiden Abbildungen zu erkennen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer Probe, umfassend die Schritte Anlegen eines nicht-linearen Mediums an die Probe, Bestrahlen der Probe von einer dem nicht-linearen Medium abgewandten Seite mit einer ersten elektromagnetischen Strahlung, die eine Infrarot(IR)-Strahlung ist, Bestrahlen der Probe mit einer zweiten elektromagnetischen Strahlung, und Erfassen eines Summenfrequenzsignals an einer der Probe zugewandten Oberfläche des nicht-linearen Mediums. Zur Analyse der Probe wird ein nicht-lineares Medium an diese angelegt. Es kann beispielsweise als Objektträger für die Probe dienen oder in Form eines Deckglases auf die Probe gelegt werden. Das nichtlineare Medium und die Probe werden dann in einer geeigneten Vorrichtung, z. B. einem Mikroskop, positioniert, sodass sie mit der ersten und einer zweiten elektromagnetischen Strahlung bestrahlt werden. Indem die Probe gleichzeitig mit zwei elektromagnetischen Strahlungen bestrahlt wird, entsteht an der Oberfläche des nicht-linearen Mediums, die der Probe zugewandt ist, ein Summenfrequenzsignal (4A). Dieses wird durch einen geeigneten Detektor erfasst. Als Summenfrequenzsignal bzw. Summenfrequenzerzeugung (engl.: sum frequency generation) wird ein nicht-linearer Effekt zweiter Ordnung bezeichnet, der in nicht-linearen Medien beobachtet werden kann. Durch Überlagerung von elektrischen Feldern, die durch zwei unterschiedliche Frequenzen charakterisiert sind, entsteht ein nicht-linearer Polarisationsdichteterm, der das Produkt der elektrischen Felder enthält. Aufgrund der exponentiellen Termini des elektrischen Feldes addieren sich die Frequenzen. Die Summenfrequenzerzeugung kann mathematisch beschrieben werden als: P_nonlinear(ω₁ + ω₂, t) ~ |(E(ω₁, t)E(ω₂, t)| (1)
Das entspricht der Addition von zwei Photonen zu einem neuen Photon mit der Frequenz _ωSFG = ω₁ + ω₂. Darüber hinaus muss das Moment beibehalten werden, so dass die Wellenvektoren k₁ und k₂ die sogenannte Phasenübergangsbedingung (engl.: phase matching condition) erfüllen: k →_SFG = k →₁ + k →₂ (2)
Die Symmetriebrechung, durch die das Summenfrequenzsignal entsteht, ist an der Grenzfläche des Mediums zur Probe hin am höchsten. Daher ist auch das Summenfrequenzsignal an dieser Position am stärksten, und wird dementsprechend an der Grenzfläche, die der Probe zugewandt ist, erfasst. Das Summenfrequenzsignal ist durch die Verwendung eines nicht-linearen Mediums unmittelbar von der IR-Transmission der Probe abhängig und nicht, wie bei herkömmlichen Verfahren, vom nicht-linearen Koeffizienten der Probe und deren Symmetrie. Das Summenfrequenzsignal gibt damit die IR-Transmission der Probe wieder, so dass das IR-Transmissionssignal der Probe aus dem Summenfrequenzsignal berechnet werden kann. Zudem befindet sich die Oberfläche des nicht-linearen Mediums, an der das Summenfrequenzsignal entsteht, in Einstrahlrichtung der ersten elektromagnetischen Strahlung unmittelbar hinter der Probe, das heißt in deren Nahfeld. Als Nahfeld wird der Bereich in einer Entfernung unterhalb der einstrahlenden Wellenlänge bezeichnet. Diese Entfernung beträgt gewöhnlich 5–14 μm. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird somit die IR-Transmission einer Probe im Nahfeld, das heißt mit subbeugungsbegrenzter Auflösung, ermittelt. In der herkömmlichen IR-Spektroskopie ist dies aufgrund der Wellenlänge der IR-Strahlung nicht möglich.
Darüber hinaus kann anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens eine IR-Analyse einer Probe ohne spektrale Auflösung durchgeführt werden. Wird die IR-Strahlung, die durch die Probe auf das nicht-lineare Medium fällt (erste elektromagnetische Strahlung), mit einem Quantenkaskadenlaser generiert, wird durch die Wellenlänge des Lasers die Position des Summenfrequenzsignals im Spektrum festgelegt. Eine spektrale Auflösung des Signals ist somit nicht notwendig. In diesem Fall kann das Summenfrequenzsignal mit einer Fotodiode detektiert werden, womit eine molekulare Bildgebung (engl. molecular imaging) im IR-Bereich mit subbeugungsbegrenzter Auflösung und minimaler Messzeit möglich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe durch das nicht-lineare Medium hindurch mit der zweiten elektromagnetischen Strahlung bestrahlt und das Summenfrequenzsignal in Transmission erfasst. Hierfür wird die Probe auf einem Objektträger positioniert und das nicht-lineare Medium von der gegenüberliegenden Seite an die Probe angelegt, beispielsweise in Form eines Deckglases (1A). Anschließend wird die Probe von Seiten des Objektträgers mit IR-Strahlung und von Seiten des Mediums mit der zweiten elektromagnetischen Strahlung bestrahlt, wobei auch die zweite elektromagnetische Strahlung eine IR-Strahlung sein kann. Der Objektträger und das nicht-lineare Medium sind dabei so gewählt, dass sie für die erste bzw. die zweite elektromagnetische Strahlung durchlässig sind. Das Summenfrequenzsignal, das an der Oberfläche des nicht-linearen Mediums entsteht ist unmittelbar von der IR-Transmission der Probe abhängig und ermöglich somit eine IR-Analyse der Probe in Transmission.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe mit der zweiten elektromagnetischen Strahlung von einer dem nicht-linearen Medium abgewandten Seite bestrahlt und das Summenfrequenzsignal in Reflexion erfasst. Dabei kann das nicht-lineare Medium beispielsweise als Objektträger der Probe dienen. Die Probe wird von der dem nicht-lineare Medium gegenüberliegenden Seite gleichzeitig mit der ersten und der zweiten elektromagnetischen Strahlung bestrahlt, wobei sich die Strahlungen in ihrer Wellenlänge unterscheiden (1B). Beispielsweise kann die erste elektromagnetische Strahlung eine MIR-Strahlung und die zweite Strahlung eine zur Aufnahme eines Raman-Spektrum geeignete Strahlung aus dem Bereich der UV-Strahlung, des sichtbaren Lichts, oder der NIR-Strahlung sein. Das an der Oberfläche des nicht-linearen Mediums entstehende Summenfrequenzsignal ist unmittelbar von der IR-Transmission der Probe abhängig und wird im Reflexionsmodus erfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Summenfrequenzsignal entgegen der Einstrahlrichtung der zweiten elektromagnetischen Strahlung erfasst. Dabei kann das Bestrahlen der Probe durch die erste und zweite Strahlung co-linear von unten erfolgen und das Erfassen des Summenfrequenzsignals von oben (5). Dazu kann ein Objektträger verwendet werden, der für beide elektromagnetischen Strahlungen transparent ist, oder der für die erste elektromagnetische Strahlung transparent ist und die Wellenlänge des Summenfrequenzsignals reflektiert (z. B. Silizium). Der Impulsbetrag (p) eines Photons ist gegeben durch p = h/λ (h: Planck'sches Wirkungsspektrum, λ: Wellenlänge). Hat die erste elektromagnetische Strahlung eine größere Wellenlänge (z. B. MIR-Strahlung) als die zweite elektromagnetische Strahlung (z. B. UV/sichtbares Licht/NIR-Strahlung), ist der Impulsbetrag, des Raman-Photon, das durch die zweite elektromagnetische Strahlung erzeugt wird, größer als der Impulsbetrag des IR-Photons, das durch die erste elektromagnetische Strahlung erzeugt wird. Somit bestimmt der Impulsvektor des Raman-Photons die Ausbreitungsrichtung des Summenfrequenzsignal-Photons. Um eine optimale Signalstärke zu erhalten, ist daher die Detektion entgegen der Einstrahlrichtung der zweiten elektromagnetischen Strahlung (Raman-Photon) bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Summenfrequenzsignal spektral aufgelöst erfasst. Dies kann beispielsweise durch die Verwendung eines Polychromators oder eines Interferometers und einer CCD-Kamera (engl.: charged-coupled device) erfolgen. Die spektrale Auflösung des Summenfrequenzsignals erlaubt die Verwendung thermischer Strahler als IR-Strahlungsquelle, die kostengünstiger und einfacher zu bedienen sind als Quantenkaskadenlaser. Zudem können so auch Summenfrequenzen aus dem Bereich unterhalb von 2000 cm^–1 erzeugt werden, die regelmäßig eine Identifizierung von Stoffen erlauben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste elektromagnetische Strahlung eine mittlere IR-Strahlung (MIR-Strahlung). Diese umfasst den Bereich von ca. 4000 bis 400 cm^–1 (entspricht einer Wellenlänge von ca. 2,5 bis 25 μm) und ist insbesondere geeignet, um CH-, OH-, NH- und Doppelbindungen abzubilden. Zudem werden im Bereich von unter 1500 cm^–1 Deformations-, Valenz- und Gerüstschwingungen erfasst, die dazu verwendet werden um unterschiedliche Moleküle zu charakterisieren. Spektren aus diesem Wellenlängenbereich werden für eine Vielzahl von Stoffen ermittelt und in Datenbanken gespeichert. Die ermittelten Spektren können mit diesen Datenbanken abgeglichen werden, um so einzelne Substanzen anhand ihrer spezifischen Spektren zu identifizieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt Erfassen eines Raman-Signals der Probe, wobei das Summenfrequenzsignal und das Raman-Signal simultan erfasst werden. Zur simultanen Erfassung des Summenfrequenzsignals und des Raman-Signals wird als zweite elektromagnetische Strahlung eine für die Raman-Spektroskopie geeignete Strahlung gewählt, und es werden beide Signale mit einen Raman-Spektrometer erfasst. Das Summenfrequenzsignal erscheint dabei als zusätzliches Signal im Raman Anti-Stokes Spektrum. Indem Informationen über die IR-Transmission der Probe nicht unmittelbar, sondern über das Summenfrequenzsignal gewonnen werden, ist eine gleichzeitige Aufnahme des Raman-Signals möglich. Herkömmliche IR- und Ramanspektroskopische Analysen müssen, aufgrund der unterschiedlichen physikalischen Grundlagen der Verfahren, aufeinanderfolgend durchgeführt werden. Aufgrund der endlichen Stellgenauigkeit von Mikroskoptischen kommt es dabei zu einem zufälligen Versatz, wenn die Probe beim wechseln von IR- zu Ramanspektroskopie neu positioniert wird. Dadurch entstehen insbesondere bei subbeugungsbegrenzten Messungen Fehler, die eine eindeutige Zuordnung des IR- und des Ramansignals zum selben Probenvolumen erschweren, wenn nicht sogar unmöglich machen. Im Gegensatz dazu ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren keine sukzessive Anwendung der Spektroskopiemethoden notwendig. Die Analyse kann in einem Arbeitsschritt und somit wesentlich schneller durchgeführt werden. Zudem werden die Informationen aus dem Raman- und dem Summenfrequenzsignal jeweils vom selben Punkt der Probe aufgenommen, so dass beide in unmittelbaren Zusammenhang gesetzt werden können. Es kann somit für dasselbe Probenvolumen das IR-Spektrum als auch das Ramansignal ermittelt werden, womit eine zuverlässigere Identifizierung möglich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erste elektromagnetische Strahlung mit einem Quantenkaskadenlaser generiert. Quantenkaskadenlaser (engl.: quantum cascade lasers, QCL) sind Intraband-Halbleiterlaser, bei denen, im Gegensatz zu herkömmlichen Halbleiterlasern, der Intraband-Übergang als tunnelnder Übergang in einer Reihe von quantenmechanischen Potentialtöpfen betrachtet werden kann. Die Energiedifferenz zwischen der oberen und unteren Laserebene kann für nahezu jede spektrale Region gebildet werden, so dass Systeme gestaltet werden können, die Photonen im mittleren oder sogar entfernten Infrarotspektrum emittieren. QCLs stellen im Vergleich zu thermischen Strahlern IR-Strahlung in verhältnismäßig hoher Intensität zur Verfügung, wodurch auch das zu erfassende Summenfrequenzsignal verstärkt wird. Zudem umfasst der QCL regelmäßig nur ein geringes Spektrum, so dass das erzeugte Summenfrequenzsignal durch die Wellenlänge des Lasers definiert wird. Daher ist keine spektrale Auflösung des Summenfrequenzsignals notwendig und das Signal kann mittels einer Fotodiode aufgenommen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zweite elektromagnetische Strahlung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus sichtbarem Licht, UV-Strahlung, naher IR-Strahlung (NIR-Strahlung) und MIR-Strahlung. Die zweite elektromagnetische Strahlung kann jede elektromagnetische Strahlung sein, die zur Summenfrequenzgeneration geeignet ist. Um gleichzeitig mit dem Summenfrequenzsignal auch ein Raman-Signal zu erfassen, sollte sie zudem zur Aufnahme eines Raman-Spektrums geeignet sein. Das ohnehin relativ schwache Raman-Signal nimmt mit zunehmender Wellenlänge weiter ab und wird häufig durch Autofluoreszenz der Probe überlagert. Als zweite elektromagnetische Strahlung ist daher NIR-Strahlung (12500 bis 4000 cm^–1, Wellenlänge: 0,8 bis 2,5 μm) besonders bevorzugt. Sie erzeugt ein relativ starkes Raman-Signal, ohne eine ausgeprägte Autofluoreszenzbildung zu verursachen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die zweite elektromagnetische Strahlung auf die der Probe zugewandten Oberfläche des nicht-linearen Mediums fokussiert. Das Summenfrequenzsignal entsteht aufgrund der Symmetriebrechung an der Oberfläche des nicht-linearen Mediums. Indem die zweite elektromagnetische Strahlung auf die Oberfläche des nicht-linearen Mediums fokussiert wird, die der Probe zugewandt ist, dominiert das dort entstehende Signal gegenüber dem Summenfrequenzsignal, das auf der der Probe abgewandten Oberfläche des nicht-linearen Mediums entsteht (4A). Dementsprechend wird bei einer Fokussierung der zweiten elektromagnetischen Slrahlung auf diesen Bereich ein bestmögliches Signal erzeugt und gleichzeitig das Summenfrequenzsignal erfasst, welches im Nahfeld der Probe entsteht. Um die Fokussierung der zweiten elektromagnetischen Strahlung zu optimieren, kann eine Messreihe mit unterschiedlichen Positionen entlang der zur Probe senkrechten Achse der Einstrahlung (z-Achse) durchgeführt und so die Position mit dem stärksten Signal ermittelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Raman-Signal ein Raman Anti-Stokes Signal. Als Raman-Signal wird ein Streuphänomen bezeichnet, welches beobachtet wird, wenn sich die Energie bzw. Frequenz der Streustrahlung aufgrund von Molekülschwingungen und/oder Molekülrotationen von jener der eingehenden Strahlung unterscheidet. Je nach Änderung des energetischen Zustands des Moleküls ist die Frequenz der Streustrahlung gegenüber der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung verringert (Raman Stokes Signal) oder erhöht (Raman Anti-Stokes Signal). Da das Summenfrequenzsignal im Anti-Stokes Spektrum liegt, ist das Erfassen des Raman Anti-Stokes Spektrums zur Ausführung des Verfahrens grundsätzlich ausreichend. Zudem ist die Gefahr einer Überlagerung der Signale durch unspezifische Fluoreszenz im Bereich des Raman Anti-Stokes Spektrums geringer.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das nicht-lineare Medium ein Chalkogenidkristall, bevorzugt Zinkselenid, Zinktellurid oder Galliumarsenid. Als nicht-lineare Medien werden Stoffe, bevorzugt Feststoffe, bezeichnet, die sich durch eine hohe effektive Suszeptibilität zweiter oder höherer Ordnung auszeichnen. Sie haben die Fähigkeit Wechselwirkungen zwischen elektromagnetischen Wellen zu vermitteln (z. B. Summenfrequenzerzeugung) ohne selbst Energie aufzunehmen oder abzugeben. Die Intensität des Summenfrequenzsignals ist proportional zur Summe des Quadrats des Produkts aus dem nicht-linearen Fresnel-Koeffizienten und dem jeweiligen Element des Suszeptibilitäts-Tensors. Zudem ist die Intensität des Summenfrequenzsignals proportional zum Quadrat der effektiven Suszeptibilität zweiter Ordnung. Eine möglichst große effektive Suszeptibilität zweiter Ordnung des nicht-linearen Mediums ist daher von Vorteil. Demgemäß sind für das hier beschriebene Verfahren vor allem nicht-lineare Medien mit einem hohen nicht-linearen Koeffizienten geeignet. Die nicht-linearen Koeffizienten bezeichnen Einträge des Suszeptibilitäts-Tensors (Tensor dritter Stufe), wobei für nicht-lineare Medien bestimmter Symmetrien bereits ein einzelner Koeffizient zur vollständigen Beschreibung der nicht-linearen Eigenschaften des Mediums ausreicht. Zu diesen nicht-linearen Medien gehört beispielsweise Zinkselenid, dessen entscheidender nicht-linearer Koeffizient d₃₆ 26,6 ± 1,7 pm/V beträgt (Marvin J. Weber, Handbook of Optical Materials, 2003; Seite 201). Zinkselenid hat sich als besonders geeignet zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erwiesen.
Die Eignung eines nicht-linearen Mediums zur Summenfrequenzerzeugung kann ermittelt werden, indem das Summenfrequenzsignal ohne Objekt und Objektträger gemessen wird (4B, C).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Objektträger für die erste und die zweite elektromagnetische Strahlung durchlässig. Dies ermöglicht einerseits eine Messung in Transmission und andererseits das Erfassen des Summenfrequenzsignals entgegen der Einstrahlrichtung der zweiten elektromagnetischen Strahlung. Ist die erste elektromagnetische Strahlung eine MIR-Strahlung und die zweite elektromagnetische Strahlung eine NIR-Strahlung, ist die Verwendung eines Objektträgers aus Barium Fluorid oder Calcium Fluorid besonders bevorzugt, da dieser für beide Strahlungen transparent ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Objektträger für die erste elektromagnetische Strahlung durchlässig und reflektiert das Summenfrequenzsignal. Derartige Objektträger sind für Messungen bevorzugt, bei denen die erste und zweite elektromagnetische Strahlung aus entgegen gesetzten Richtungen auf die Probe fallen, und die Detektion aus der Einstrahlrichtung der zweiten elektromagnetischen Strahlung erfolgt (z. B. 1A, 2 und 3). Der Objektträger kann beispielsweise aus Silizium bestehen. Das Summenfrequenzsignal wird am nichtlinearen Medium erzeugt und strahlt bevorzugt nach unten, wird dann jedoch am Silizium reflektiert, so dass sich die bevorzugte Detektionsrichtung umkehrt und das Signal vom gegenüberliegenden Detektor erfasst werden kann. Diese Ausführungsform ist vor allem bevorzugt, wenn das Summenfrequenzsignal im sichtbaren Bereich liegt, wie es beispielsweise der Fall, wenn die erste elektromagnetische Strahlung MIR-Strahlung und die zweite elektromagnetische Strahlung NIR-Strahlung ist (z. B. bei 785 nm Wellenlänge).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine ungefärbte Probe. Herkömmliche mikroskopische Verfahren zur Untersuchung von Proben, insbesondere solchen, die von Lebewesen abstammen (z. B. Gewebeproben), verwenden Farbstoffe oder andere künstliche Markierungen, um Zellverbände, einzelne Zellen oder zelluläre Strukturen sichtbar zu machen. Dies kann der Verbesserung des Kontrasts im Gewebe und der Sichtbarmachung von Zellkern, Zellwänden und weiteren Organellen dienen (z. B. Hämatoxylin-Eosin-Färbung). Einzelne Moleküle werden üblicherweise durch spezifische Antikörper markiert. Derartige Färbungen gehen jedoch mit einer Veränderung der Probe einher und benötigen häufig zudem eine chemische Vorbehandlung, so dass sich die chemische Zusammensetzung der Probe nach der Färbung entscheidend von jener der ursprünglichen Probe unterscheiden kann. Bei der Verwendung von Infrarot- und Raman-Spektroskopie ist hingegen keine Behandlung, insbesondere keine Anfärbung, der Probe notwendig. Es werden somit unverfälschte Informationen über die chemische Zusammensetzung der Probe gewonnen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine Gewebeprobe, bevorzugt ein Gewebeschnitt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet, um Gewebeproben und Gewebeschnitte zu untersuchen. Es erlaubt die Analyse der molekularen Zusammensetzung des Gewebes ohne die Probe durch chemische Vorbehandlung oder Färbungen zu verändern. Beispielsweise kann das Verfahren unmittelbar nach der Entnahme der Probe durchgeführt werden. Dies ist insbesondere für die operationsbegleitende Diagnoslik von Vorteil. Zunehmend werden bei Operationen Gewebeproben entnommen und sofort analysiert, um den weiteren Verlauf der Operation abzustimmen. Eine Vorbehandlung und Färbung der Gewebeproben kann hierbei zu einer erheblichen Verzögerung der Operation führen, wodurch die ohnehin starke Belastung des Patienten weiter steigt. Die unverzügliche Analyse von Gewebeproben anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens bietet einen erheblichen Zeitgewinn und damit einen unmittelbaren Vorteil für den Patienten.
In einem weiteren Aspekt, betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Analyse einer Probe aufweisend ein nicht-lineares Medium, das an die Probe angelegt wird, eine erste Strahlungsquelle, die eine erste elektromagnetische Strahlung, nämlich eine IR-Strahlung, von einer dem nicht-linearen Medium abgewandten Seite auf die Probe emittiert, eine zweite Strahlungsquelle, die eine zweite elektromagnetische Strahlung auf die Probe emittiert, und einen Detektor, der ein Summenfrequenzsignal an einer der Probe zugewandten Oberfläche des nicht-linearen Mediums erfasst. Die Vorrichtung ist dabei so konstruiert, dass die erste und zweite elektromagnetische Strahlung gleichzeitig auf die Probe fallen, wenn diese im Strahlengang positioniert ist. Dadurch entsteht an der Oberfläche des nicht-linearen Mediums ein Summenfrequenzsignal, welches von dem Detektor erfasst wird. Aus dem Summenfrequenzsignal kann das IR-Transmissionssignal berechnet werden. Zudem befindet sich die Grenzfläche, an der das detektierte Summenfrequenzsignal erzeugt wird, im Nahfeld der Probe, so dass das Summenfrequenzsignal und damit die IR-Transmission mit subbeugungsbegrenzter Auflösung aufgezeichnet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform emittiert die zweite Strahlungsquelle die zweite elektromagnetische Strahlung von einer dem nicht-linearen Medium abgewandten Seite auf die Probe, und das Summenfrequenzsignal wird in Reflexion erfasst. In dieser Ausführungsform ist die Vorrichtung derart konstruiert, dass die erste und zweite elektromagnetische Strahlung von derselben Seite auf die Probe treffen, nämlich von der dem nicht-linearen Medium abgewandten Seite der Probe (1A). Die durch die Probe hindurch tretende IR-Strahlung (erste elektromagnetische Strahlung) trifft auf die zweite elektromagnetische Strahlung, so dass an der Oberfläche des nicht-linearen Mediums ein Summenfrequenzsignal entsteht. Dieses ist unmittelbar abhängig von der IR-Transmission der Probe.
In einer bevorzugten Ausführungsform emittiert die zweite Strahlungsquelle die zweite elektromagnetische Strahlung durch das nicht-lineare Medium hindurch auf die Probe, und das Summenfrequenzsignal wird in Transmission erfasst. Dabei wird die erste elektromagnetische Strahlung, bei der es sich um eine IR-Strahlung handelt, durch den Objektträger hindurch auf die Probe eingestrahlt. Der Teil der IR-Strahlung, welcher von der Probe nicht absorbiert wird, durchdringt diese (Transmission) und fällt auf das nicht-lineare Medium, welches auf der gegenüberliegenden Seite der Probe angeordnet ist (1B). Die durch die Probe hindurch tretende IR-Strahlung trifft auf die zweite elektromagnetische Strahlung, wobei es an der Oberfläche des nicht-linearen Mediums zu einer Summenfrequenzerzeugung kommt. Das entstehende Summenfrequenzsignal wird von dem Detektor aufgenommen. Es ist direkt von der IR-Transmission der Probe abhängig und gibt somit Aufschluss über deren molekulare Zusammensetzung.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste Strahlungsquelle ein Quantenkaskadenlaser. Wird ein Quantenkaskadenlaser zur Erzeugung des Summenfrequenzsignals verwendet, ist keine spektrale Auflösung des Signals notwendig, weil es durch die Wellenlänge des einstrahlenden Lasers festgelegt wird. Dies erlaubt die Verwendung einer Fotodiode als Detektor, wodurch eine schnelle und verhältnismäßig einfache und kostengünstige Erfassung des Signals möglich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Detektor auf der der zweiten Strahlungsquelle gegenüberliegenden Seite der Probe angeordnet. Dadurch wird die Detektion des Summenfrequenzsignals in Einstrahlrichtung der zweiten elektromagnetischen Strahlung, welche die Ausbreitungsrichtung des Summenfrequenz Photons bestimmt, ermöglicht (5).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Detektor ein Spektrometer. Mittels eines Spektrometers, beispielsweise unter Verwendung eines Polychromators oder Interferometers, ist es möglich das Summenfrequenzsignal spektral aufgelöst zu erfassen. Die Detektion und Umwandlung in ein elektrisches Signal erfolgt anschließend mittels Halbleiterdetektoren, beispielsweise einer Zeilen- oder CCD-Kamera.
In einer besonders bevorzugt Ausführungsform ist der Detektor ein Raman-Spektrometer, welches das Summenfrequenzsignal und das Raman-Signal simultan erfasst. Die Verwendung eines Raman-Spektrometers ermöglicht die simultane Erfassung des Summenfrequenzsignals und des Raman-Spektrums der Probe. Das Summenfrequenzsignal erscheint dabei im Raman Anti-Stokes Spektrum, so dass beide Signale im selben Messvorgang detektiert werden. Die sukzessive Aufnahme eines IR-Transmissionsspektrums und eines Raman-Spektrums ist somit nicht notwendig. Dies bietet einen erheblichen Zeitgewinn, der insbesondere bei operationsbegleitenden Untersuchungen von Vorteil ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform bedeckt das nicht-lineare Medium nur einen Teil der Probe und ist über die Probe bewegbar. Das nicht-lineare Medium kann auf unterschiedliche Weise zwischen der Probe und der zweiten Strahlungsquelle angeordnet sein. Dabei kann das nicht-lineare Medium die Probe vollständig bedecken, beispielsweise in Form eines Deckglases, das auf die Probe gelegt wird (vgl. 1A). Zur Messung wird die mit dem nicht-linearen Medium bedeckte Probe im Strahlengang der Vorrichtung positioniert und mittels eines steuerbaren Objekttisches bewegt, um verschiedene Positionen der Probe zu vermessen. Die Absorption der zweiten elektromagnetischen Strahlung kann jedoch innerhalb des nicht-linearen Mediums variieren, so dass der Einfluss der Absorption auf das Messergebnis an unterschiedlichen Stellen des nicht-linearen Mediums unterschiedlich sein kann. Bedeckt das nicht-lineare Medium hingegen nur einen Teil der Probe und wird es für jeden Messvorgang auf den zu vermessenden Punkt der Probe aufgesetzt (vgl. 2), wird die Absorptionsvariabilität reduziert und die Auswertung der Messdaten vereinfacht. Darüber hinaus wird bei dieser Ausführungsform die Größe der Probe nicht durch die Größe des nicht-linearen Mediums limitiert. Das nicht-lineare Medium kann eine beliebige Form und Größe aufweisen, sofern seine Abmessungen ausreichen, um die zweite elektromagnetische Strahlung passieren zu lassen. Die minimale Größe des nicht-linearen Mediums wird dabei durch die Wellenlänge der verwendeten elektromagnetischen Strahlung bestimmt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Fläche des nichtlinearen Mediums mindestens das Quadrat der 0,1-fachen, bevorzugt der 0,7-fachen Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung. In einer ferner bevorzugten Ausführungsform weist das Medium eine Fläche von 0,01 mm² bis 4 mm², bevorzugt 0,01 mm² bis 0,25 mm² auf. Die minimale Größe des nicht-linearen Mediums entspricht in etwa der minimal möglichen Spotgröße d der zweiten Strahlungsquelle. Diese ergibt sich aus der Formel für das Strahlparameterprodukt (SPP): SPP = φ·ω₀ = M²λ/π wobei λ die Wellenlänge, φ den Öffnungswinkel des Objektivs, ω₀ den Strahlradius im Fokus und M² die Beugungsmaßzahl bezeichnet. Für ein hochauflösendes Objektiv mit einer numerischen Aperatur von etwas 0,8 und einem Nahinfrarot-Laser als zweite Strahlungsquelle (λ = 785 nm, M² = 1,1) folgt für d = 2* ω₀ = 0,6 μm.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Vorrichtung ferner ein Objektiv auf, wobei das nicht-lineare Medium ein Bestandteil des Objektivs ist. Als Objektiv wird eine optische Vorrichtung bezeichnet, die zur Aufnahme elektromagnetischer Strahlung geeignet ist und die dafür notwendigen Komponenten, wie beispielsweise Linsen, Filter und Spiegel enthält. Dabei kann es sich beispielsweise um ein Mikroskopobjektiv oder ein Objektiv eines Messkopfes handeln. Das nicht-lineare Medium kann in Form eines zylindrischen Fensters auf der der Probe zugewandten Seite in den Rahmen des Objektivs eingebracht sein (6B). Das Objektiv nimmt das Summenfrequenzsignal und gegebenenfalls das Raman-Signal auf und gibt es an den Detektor weiter. Indem das nicht-lineare Medium Teil des Objektivs ist, erfolgen alle Messungen an derselben Grenzfläche des nicht-linearen Mediums zur Probe (3). Dadurch sind die Absorptionseffekte des Mediums für jede Messung identisch und können bei der Auswertung entsprechend berücksichtigt werden. Dies vereinfacht die Datenauswertung und erhöht die Bildqualität, wodurch insbesondere die Analyse von Strukturen unterhalb von 50 μm verbessert wird. Zur Ausführung einer Messung wird das Objektiv an die Probe angenähert und innerhalb des Nahfelds der Probe positioniert ohne dass ein Kontakt zwischen Objektiv und Probe entsteht, oder mit dieser in Berührung gebracht. Vor allem bei biologischen Proben, wie beispielsweise Gewebeschnitten, ist es von Vorteil, dass das Objektiv bzw. das nicht-lineare Medium die Probe nicht berührt, da ansonsten Spuren der Probe an dem nicht-linearen Medium haften und so die Resultate weiterer Messpunkte beeinflussen könnten. Indem das nicht-lineare Medium Bestandteil des Objektivs ist, ist es zudem möglich, die Probe punktweise abzutasten, indem sie zwischen den einzelnen Messpunkten relativ zum Objektiv verschoben wird. Ein zusätzliches Versetzen des nicht-linearen Mediums ist in diesem Fall nicht notwendig.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Objektiv ein Objektiv eines Raman-Spektroskopie-Messkopfes. Dies ermöglicht die simultane Erfassung des Summenfrequenzsignals und des Raman-Spektrums.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Objektiv eine Lochblende auf, die auf einer der Probe zugewandten Seite des nicht-linearen Mediums angeordnet ist. Ist das nicht-lineare Medium Bestandteil eines Objektivs, kann vor dem Medium eine Lochblende positioniert werden, so dass sich diese während der Messung zwischen dem nicht-linearen Medium und der Probe befindet. Die Lochblende kann beispielsweise mittels Elektronenstrahllithographie auf das nichtlineare Medium aufgebracht werden. Die IR-Strahlung, welche durch die Probe hindurch tritt, kommt in diesem Fall nur im Zentrum der Lochblende mit dem nichtlinearen Medium in Berührung. Dementsprechend erfolgt die Summenfrequenzerzeugung nur im tatsächlichen Messpunkt. Jenseits des zentralen Messpunkts wird eine durch Streulicht verursachte Summenfrequenzerzeugung hingegen verhindert. Um eine optimale Summenfrequenzerzeugung zu gewährleisten, sollte der Durchmesser der Lochblende an den Durchmesser des Fokus der zweiten elektromagnetischen Strahlung angepasst sein (Strahlparameterprodukt). Bei einer simultanen Erfassung des Summenfrequenzsignals und des Raman-Signals ist der Durchmesser entsprechend dem Fokus des Lasers, der zur Erzeugung des Raman-Signals verwendet wird, zu wählen. Unter Verwendung der Lochblende ist es möglich, das Summenfrequenzsignal und damit die IR-Transmission mit einer Auflösung unterhalb des Beugungslimits zu erfassen, sofern der Durchmesser der Blende kleiner ist als die Wellenlänge der IR-Strahlung (erste elektromagnetische Strahlung). Dadurch lassen sich, im Gegensatz zur herkömmlichen Weitfeldmikroskopie, Strukturen darstellen, die kleiner sind als durch das Rayleigh-Kriterium festgelegt (subbeugungsbegrenzte Auflösung).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung ein Mikroskop.
Beispiele
1. Bevorzugte Ausführungsformen
1A zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 7 zur Untersuchung einer Probe 1 in Transmission. Die Probe ist auf einem Objektträger 2 angeordnet und mit einem nicht-linearen Medium 3 in Form eines Deckglases abgedeckt. Der Objektträger 2 mit der Probe 1 und dem nicht-linearen Medium 3 ist im Strahlengang zwischen einer ersten Strahlungsquelle 8 und einer zweiten Strahlungsquelle 9 angeordnet. Von der ersten Strahlungsquelle 8 fällt eine erste elektromagnetische Strahlung 4, nämlich IR-Strahlung, durch den Objektträger 2 auf die Probe 1. Von der gegenüberliegenden Seite fällt eine zweite elektromagnetische Strahlung 5 durch das nicht-lineare Medium 3 auf die Probe 1. An der Grenzfläche 6 des nicht-linearen Mediums 3 zu der Probe 1 kommt es zur Summenfrequenzerzeugung aus der ersten und zweiten elektromagnetischen Strahlung (vgl. 4A). Das Summenfrequenzsignal der Probe 1 wird durch einen Detektor 10 erfasst.
1B zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 7 zur Untersuchung einer Probe 1 in Reflexion. Die Probe ist auf einem nicht-linearen Medium 3 angeordnet, das als Objektträger dient. Beides ist im Strahlengang einer ersten Strahlungsquelle 8 und einer zweiten Strahlungsquelle 9 angeordnet, wobei die Probe 1 zu den Strahlungsquellen hin orientiert ist. Die erste Strahlungsquelle 8 emittiert eine erste elektromagnetische Strahlung 4, nämlich IR-Strahlung, und die zweite Strahlungsquelle 9 eine zweite elektromagnetische Strahlung 5, auf die Probe 1. Beide Strahlungen fallen von derselben, dem nichtlinearen Medium 3 abgewandten, Seite auf die Probe 1. An der Grenzfläche 6 des nicht-linearen Mediums 3 zu der Probe 1 kommt es zur Summenfrequenzerzeugung aus der ersten und zweiten elektromagnetischen Strahlung (vgl. 4A). Das Summenfrequenzsignal der Probe 1 wird durch einen Detektor 10 erfasst.
2 zeigt eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 7. Eine Gewebeprobe 101 ist auf einem Siliziumwafer 102 angeordnet. Auf der Gewebeprobe 101 ist ein Zinkselenidkristall 103 von 0,01 mm² positioniert. Der Silizumwafer 102 mit der Gewebeprobe 101 und dem Zinkselenidkristall 103 ist im Strahlengang zwischen einem Quantenkaskadenlaser (QCL) 108 für MIR-Strahlung und einem Laser 109 für NIR-Strahlung angeordnet. Von dem QCL 108 fällt MIR-Strahlung 104 durch den Siliziumwafer 102 auf den Gewebeprobe 101. Von der gegenüberliegenden Seite fällt NIR-Strahlung 105 durch den Zinkselenidkristall 103 auf die Gewebeprobe 101. An der Grenzfläche 6 des Zinkselenid Kristalls 103 zu der Gewebeprobe 101 kommt es zur Summenfrequenzerzeugung aus der ersten und zweiten elektromagnetischen Strahlung (vgl. 4A). Das Summenfrequenzsignal der Gewebeprobe 101 wird durch eine Fotodiode 110 erfasst.
Bei der in 3 gezeigten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 7 ist ein Siliziumwafer 102 mit einer Gewebeprobe 101 im Strahlengang zwischen zwei einander gegenüberliegenden Strahlungsquellen, einem thermischen Strahler 208 (z. B. Globar) und einem Raman-Spektroskopie-Messkopf 211 mit einem Raman-Spektroskopie-Laser 209 (z. B. Invictus 785 nm NIR Laser) positioniert. Von dem thermischen Strahler 208 fällt eine MIR-Strahlung 104 durch den Siliziumwafer 102 auf die Gewebeprobe 101. Der Raman-Spektroskopie-Laser 209 emittiert NIR-Strahlung, die über ein Objektiv 212 des Raman-Spektroskopie-Messkopfes 211 auf die Gewebeprobe 101 fällt. Die Bestrahlung erfolgt durch ein im Rahmen des Objektivs 212 eingelassenes Fenster, das aus einem Zinkselenidkristall 103 besteht. Zur Abtastung der Gewebeprobe 101 wird der Siliziumwafer 102 mit der Gewebeprobe 101 zwischen den einzelnen Messpunkten relativ zum Messkopf 211 verschoben. Das Objektiv 212 kann außerdem eine Lochblende 500 wie in 6 gezeigt aufweisen. Der Durchmesser der Lochblende beträgt 1 μm und ist somit kleiner als die Wellenlänge von IR-Strahlung. Dadurch können Infrarotbilder mit Auflösung unterhalb des Beugungslimits erzielt werden. Die Lochblende 500 kann durch Elektronenstrahllithographie erzeugt werden. Als Bestandteil eines Objektivs 212 ist der Zinkselenidkristall 103 in Form eines Fensters in den Rahmen des Objektivs 212 eingelassen, wobei die Lochblende 500 auf einer der Probe 1 zugewandten Seite des Zinkselenidkristalls 103 angebracht ist (6B).
2. Simultane Summenfrequenzerzeugung und Raman-Spektroskopie
2.1 Material und Methoden
Eine Vorrichtung entsprechend 1A wurde verwendet, um simultan Aufnahmen eines Summenfrequenzsignals und eines Raman Anti-Stokes Spektrums von Polystyrolpartikel anzufertigen. Hierzu wurde ein Quantenkaskadenlaser-2-Strahl eingesetzt, der durch ein Käfigsystem mit Polarisationsoptik geführt wurde, um Reflexionsschäden zu vermeiden. Der Strahl wurde anschließend aufwärts zu einem zweidimensionalen Piezoaktor M686 (Physikinstrumente, Karlsruhe, Deutschland) geleitet. Die Reichweite des Piezoaktors betrugt insgesamt 25 mm in jede Richtung (x und y) und gewährleistet eine Positionsgenauigkeit von 0,3 μm. Der Tisch, auf dem die Präparate montiert wurden, verfügt über eine Öffnung, durch die der Strahl des Quantenkaskadenlasers die Probe erreichte. Zur Illumination und Detektion des Signals wurde ein Invictus NIR-Laser zusammen mit einer Raman-Installation (Kaiser Optical Systems, USA) verwendet. Die Messungen wurden mit einem 20x- oder einem 10x-Objektiv durchgeführt. Darüber hinaus wurde der Raman-Spektroskopie-Messkopf auf einer mobilen Plattform (Thorlabs GmbH, Deutschland) mit einer Reichweite von 25 mm montiert, so dass dessen Fokus in vertikaler Richtung (z-Achse) verändert werden konnte.

Als Probe für die Untersuchungen wurden Polystyrolpartikel gewählt. Das farblose und harte Vinylpolymer eignet sich aufgrund seiner sehr kleinen Strukturen (≥ 50 nm) als Modell für mikrospektroskopische Untersuchungen. Zudem besitzt Polystyrol ein ausgeprägtes IR (7A) und Raman Anti-Stokes Spektrum (7B). Für die Untersuchungen wurden Polystyrolpartikel von 90 μm bzw. 45 μm Durchmesser verwendet, und auf unterschiedliche Weise präpariert (Tabelle 1). Tabelle 1: Herstellung unterschiedlicher Präparate zur Analyse

Präparat	⌀ Partikel	Objektträger	nicht-lineares Medium
1	90 μm	Siliziumwafer	polykristallines CVD (Chemically vapor deposited) Zinkselenid, Deckglas, Dicke: 1 mm
2	45 μm	Siliziumwafer	polykristallines CVD (Chemically vapor deposited) Zinkselenid, Deckglas, Dicke: 1 mm
3	45 μm	Zinkselenid	polykristallines CVD (Chemically vapor deposited) Zinkselenid, Deckglas, Dicke: 1 mm (Korth Kristalle, Deutschland)
4	45 μm	Zinkselenid	monokristallines Zinkselenid, Deckglas, Dicke: 0.5 mm (Semiconductor Wafers, Taiwan)

2.2 Ergebnisse

Zunächst wurde die optimale relative Position des Raman-Spektroskopie-Messkopfes zur Probe (z-Position) ermittelt. Hierzu wurde die Position des Messkopfes auf der vertikalen Achse über der Probe (z-Achse) variiert, und für jede Position das maximale Summenfrequenzsignal ermittelt. Der Quantenkaskadenlaser wurde hierbei entsprechend dem zu erwartenden Maximum auf 1069,00 cm^–1 eingestellt. Das Summenfrequenzsignal wurde von Pixel 582 der CCD-Kamera, entsprechend einer Raman-Verschiebung (engl.: Raman shift) von 1069,72 cm^–1, extrahiert. Das Raman-Signal wurde von Pixel 674, entsprechend einer Raman-Verschiebung von –1001,79 cm^–1, extrahiert. Eine Abbildung des Summenfrequenzsignals und des Raman Anti-Stokes Spektrums ist in 7 gezeigt. Serien von Aufnahmen bei unterschiedlichen z-Positionen des Raman-Messkopfs zeigten, dass die maximale Summenfrequenzerzeugung an der Grenzfläche des nicht-linearen Mediums zu den Polystyrolpartikeln beobachtet werden kann. Das Raman-Signal ist hingegen im Zentrum der Partikel am stärksten (Tabelle 2). Tabelle 2: Maximales Raman- und Summenfrequenzsignal bei unterschiedlichen z-Positionen

	z-Position [mm] Präparat 1 (90 μm)	z-Position [mm] Präparat 2 (45 μm)
maximales Raman-Signal maximales Summenfrequenzsignal	16.162 ± 0.001 16.110 ± 0.001	16.236 ± 0.001 16.204 ± 0.001
Differenz	0.032 ± 0.002	0.052 ± 0.002

Für die weiteren Messungen wurde die z-Position des Messkopfes, entsprechend dem Maximum des Summenfrequenzsignals, so gewählt, dass der NIR-Laser auf die Grenzfläche des nicht-linearen Mediums zur Probe fokussiert war.
Präparat 1 wurde vermessen, indem die Probe von x = 1 mm bis x = 4 mm und y = 9 mm bis y = 13,5 mm bei einer Schrittlänge von 0,25 mm sukzessive bewegt wurde. An jedem Messpunkt wurden das Summenfrequenzsignal und das Raman Anti-Stokes Spektrum gleichzeitig aufgenommen. Das Ergebnis (8) zeigt, dass der Dynamikbereich des Kontrastes für das Summenfrequenzsignal etwa dreimal höher ausfällt im Vergleich zum Raman Anti-Stokes Spektrum. Aufnahmen mit höherer Vergrößerung (10x-Objektiv) erlaubten eine detaillierte Darstellung der Polystyrolpartikel bei einer Schrittlänge von 0,01 mm.
9 zeigt Aufnahmen von Polystyrenepartikeln anhand ihres Raman-Signals (9A) und ihrer IR-Transmission basierend auf dem erfassten Summenfrequenzsignal (SFS, 9B). In beiden Aufnahmen sind die Strukturen der Polystyrenepartikel klar zu erkennen (vgl. Fotographie 9C).
Untersuchungen von Polystyrolpartikel mit einem Durchmesser von 45 μm ergaben gute Raman-Signale, die eine Unterscheidung einzelner Partikel erlaubten. Das Summenfrequenzsignal zeigte hingegen eine gewisse Unschärfe und war um ca. 10 μm lateral verschoben. Es wird davon ausgegangen, dass dieser Effekt aufgrund einer Beeinflussung des Summenfrequenzsignals durch die Absorption der NIR-Strahlung durch das nicht-lineare Medium entsteht. Nachdem ähnliche Effekte sowohl bei der Verwendung polykristalliner als auch monokristalliner Zinkselenidkristalle beobachtet wurden, wird zudem davon ausgegangen, dass deren Ursache in der Beschaffenheit des Kristalls selbst begründet ist. Entsprechende Artefakte können vermieden werden, indem die Messungen zum Scannen einer Probe stets an derselben Position des Kristalls erfolgen. Hierzu bietet sich die Verwendung kleiner Kristalle an, die nur einen Teil der Probe abdecken. Für Jede Messung wird der Kristall auf der Probe und unterhalb des Objektivs des Raman-Spektroskopie-Messkopfes positioniert. Dadurch ist die Beeinflussung des Messergebnisses durch die Absorption des Kristalls für jede Messung identisch und kann bei der Auswertung subtrahiert werden.
Bezugszeichenliste

1: Probe
2: Objektträger
3: nicht-lineares Medium
4: erste elektromagnetische Strahlung
5: zweite elektromagnetische Strahlung
6: Grenzfläche
7: Vorrichtung zur Analyse einer Probe
8: erste Strahlungsquelle
9: zweite Strahlungsquelle
10: Detektor
101: Gewebeprobe
102: Siliziumwafer
103: Zinkselenidkristall
104: MIR-Strahlung
105: NIR-Strahlung
108: Quantenkaskadenlaser
109: NIR-Laser
110: Fotodiode
208: thermischer Strahler
211: Raman-Spektroskopie-Messkopf
212: Objektiv
300: Summenfrequenzsignal
301: Intensität der ersten elektromagnetischen Strahlung
302: Intensität der zweiten elektromagnetischen Strahlung
400: Impulsvektor Summenfrequenzsignal
401: Impulsvektor IR
402: Impulsvektor Raman
500: Lochblende

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

Marvin J. Weber, Handbook of Optical Materials, 2003; Seite 201 [0031]

Claims

Verfahren zur Analyse einer Probe (1), umfassend die Schritte – Anlegen eines nicht-linearen Mediums (3) an die Probe (1), – Bestrahlen der Probe (1) von einer dem nicht-linearen Medium (3) abgewandten Seite mit einer ersten elektromagnetischen Strahlung (4), die eine Infrarot(IR)-Strahlung ist, – Bestrahlen der Probe (1) mit einer zweiten elektromagnetischen Strahlung (5), und – Erfassen eines Summenfrequenzsignals (300) an einer der Probe (1) zugewandten Oberfläche des nicht-linearen Mediums (3).
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) durch das nicht-lineare Medium (3) hindurch mit der zweiten elektromagnetischen Strahlung (5) bestrahlt und das Summenfrequenzsignal (300) in Transmission erfasst wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) mit der zweiten elektromagnetischen Strahlung (5) von einer dem nichtlinearen Medium (3) abgewandten Seite bestrahlt und das Summenfrequenzsignal (300) in Reflexion erfasst wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Summenfrequenzsignal (300) entgegen der Einstrahlrichtung der zweiten elektromagnetischen Strahlung (5) erfasst wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend den Schritt – Erfassen eines Raman-Signals der Probe (1), dadurch gekennzeichnet, dass das Summenfrequenzsignal (300) und das Raman-Signal simultan erfasst werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite elektromagnetische Strahlung (5) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus sichtbarem Licht, UV-Strahlung, naher IR-Strahlung und mittlerer IR-Strahlung.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite elektromagnetische Strahlung (5) auf die der Probe (1) zugewandte Oberfläche des nicht-linearen Mediums (3) fokussiert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-lineare Medium (3) ein Chalkogenidkristall, bevorzugt Zinkselenid, Zinktellurid oder Galliumarsenid ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine ungefärbte Probe ist.
Vorrichtung (7) zur Analyse einer Probe (1) aufweisend ein nicht-lineares Medium (3), das an die Probe (1) angelegt wird, eine erste Strahlungsquelle (8), die eine erste elektromagnetische Strahlung (4), nämlich eine IR-Strahlung, von einer dem nicht-linearen Medium (3) abgewandten Seite auf die Probe (1) emittiert, eine zweite Strahlungsquelle (9), die eine zweite elektromagnetische Strahlung auf die Probe (1) emittiert, und einen Detektor (10), der ein Summenfrequenzsignal (300) an einer der Probe (1) zugewandten Oberfläche des nicht-linearen Mediums (3) erfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Strahlungsquelle ein Quantenkaskadenlaser ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (10) auf der der zweiten Strahlungsquelle (9) gegenüberliegenden Seite der Probe (1) angeordnet ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (10) ein Spektrometer ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 10 bis 13, ferner aufweisend ein Objektiv (212), dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-lineare Medium (3) ein Bestandteil des Objektivs (212) ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Objektiv (212) eine Lochblende (500) aufweist, die auf einer der Probe (1) zugewandten Seite des nicht-linearen Mediums (3) angeordnet ist.