DE102014103766A1

DE102014103766A1 - Verfahren zum Einstellen eines Gradientenverzögerungsvolumens

Info

Publication number: DE102014103766A1
Application number: DE201410103766
Authority: DE
Inventors: Hermann Hochgraeber; Thomas Wachinger
Original assignee: Dionex Softron GmbH
Current assignee: Dionex Softron GmbH
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2014-06-12
Anticipated expiration: 2034-03-20
Also published as: US10722816B2; US10005006B2; CN104931625B; DE102014103766B4; US20180272250A1; US20150265944A1; CN104931625A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einstellen eines Gradientenverzögerungsvolumens GDV einer Flüssigkeitschromatographieanlage für einen Chromatographielauf in der Flüssigkeitschromatographie, insbesondere einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographieanlage, bei dem ein gewünschter Wert GDV_soll eines Gradientenverzögerungsvolumens der Flüssigkeitschromatographieanlage ermittelt oder vordefiniert wird und, falls der Wert GDV_soll von einem spezifischen festen Wert GDV_ist einer Flüssigkeitschromatographieanlage abweicht, dieser Wert GDV_soll in einem Bereich 0 ≤ ∆GDV = GDV_soll – GDV_ist ≤ V_max eines Volumens einer Volumeneinstellvorrichtung 5 eingestellt wird. Weiterhin betrifft die Erfindung einen Probengeber zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.

Description

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Flüssigkeitschromatographie, insbesondere der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Die Flüssigkeitschromatographie (insbesondere die HPLC) dient dazu, mittels einer Chromatographiesäule flüssige Proben in ihre Bestandteile zu trennen. Dabei hängt die Trennleistung der (Trenn-)Säule unter anderem von deren Länge und von der Partikelgröße des Packungsmaterials ab. Für eine möglichst gute Trennung werden Säulen mit einer ausreichenden Länge und einer geringen Partikelgröße benötigt. Solche Säulen haben einen hohen Flusswiderstand und benötigen daher zum Betrieb erheblich höhere Drücke als konventionelle Säulen.
Weiterhin ist eine hinreichend schnelle Trennung erwünscht, um einen hohen Probendurchsatz zu ermöglichen. Dies erfordert eine hohe Fließgeschwindigkeit in der Säule, wodurch sich ebenfalls der Gegendruck der Säule erhöht.
Eine Möglichkeit die Trennung zu beschleunigen bzw. die Trennleistung zu erhöhen liegt in der Änderung der Lösungsmittelzusammensetzung über die Zeitdauer der Trennung (im Folgenden als Gradient bezeichnet, d.h. der Grad der Änderung der Elutionskraft bzw. der Anteil eines Lösungsmittels mit der Zeit wird als Gradient bzw. Lösungsmittelgradient bezeichnet).
Durch die unterschiedlichen Anforderungen an die Trennung haben sich zwei unterschiedliche technische Umsetzungen zur Erzielung eines Gradienten durchgesetzt. Die sogenannte Hochdruck-Gradientenformung (HPG) und die Niederdruck-Gradientenformung (LPG). Die Hochdruck-Gradientenformung arbeitet mittels zwei unabhängiger Pumpen, die auf der Hochdruckseite des Systems über ein T-Stück miteinander verbunden sind. Durch die Änderung der Flussraten an den beiden Pumpen wird der Gradient erzeugt. Die Niederdruck-Gradientenformung benötigt nur eine Pumpe mit vorgeschalteter Proportionierventileinheit. Während des Ansaugzyklus der Pumpe werden durch Öffnen und Schließen der Ventile (beispielsweise Solenoidventile) in der Proportionierventileinheit die verschiedenen Lösungsmittel nacheinander in die Pumpe gezogen. Der Gradient bildet sich durch die Variationen in den Öffnungszeiten für die verschiedenen Lösungsmittel. Zur Glättung von kompositionellen Fluktuationen im Lösungsmittelgemisch (Mischungswelligkeit) wird der Pumpe standardmäßig ein Mischer nachgeschaltet.
Bei den verschiedenen Designs gibt es unterschiedliche sogenannte Gradientenverzögerungsvolumen (GDV – Gradient Delay Volume oder auch Dwell Volume). Das Gradientenverzögerungsvolumen bzw. Mischvolumen bemisst sich einerseits durch das Fassungsvermögen aller zwischengeschalteten Komponenten vom Mischpunkt bis zum Eingang der Säule. Bei einer LPG wird das GDV – je nach Ausbildung des Schaltventils und der durchgeschalteten Verbindungsports – beispielsweise durch die Volumina folgender Komponenten (oder eines Teils hiervon) gebildet: Pumpenkopf, Mischer, Verbindungskapillaren, Probenschleife (Sample Loop), Schaltventil, Dosiervorrichtung (Metering Device). Bei einer HPG wird das GDV – je nach Ausbildung des Schaltventils und der durchgeschalteten Verbindungsports – beispielsweise durch die Volumina folgender Komponenten (oder eines Teils hiervon) gebildet: T-Stück, Mischer, Verbindungskapillaren, Probenschleife (Sample Loop), Schaltventil, Dosiervorrichtung (Metering Device). Andererseits muss noch das Auswaschvolumen bedacht werden, welches sich durch die strömungstechnischen Eigenschaften der Komponenten ergibt.
Wurde eine chromatographische Methode an einer bestimmten HPLC-Anlage entwickelt, dann kann diese meist nicht problemlos auf eine andere Anlage übertragen werden. Auch ist die Reproduktion eines publizierten Verfahrens genauso schwierig. Eine Ursache hierfür sind die unterschiedlichen GDVs, die eine Verschiebung und/oder Spreizung der Retentionszeiten mit sich bringen.
Weiterhin hängt auch die Mischungswelligkeit vom GDV ab. Je höher das GDV, umso besser werden die verschiedenen Lösemittel gemischt und desto geringer ist die Mischungswelligkeit.
Auch sind die Erfordernisse an das GDV und die verbliebene Mischungswelligkeit stark abhängig von der Applikation und dem verwendeten Detektortyp. Nicht-optische Detektoren, wie MS, ELSD oder CAD, sind üblicherweise unempfindlicher gegen Mischungswelligkeiten, da diese keine Signalschwankungen durch unterschiedliche Detektionsempfindlichkeiten auf die einzelnen Lösungsmittelkomponenten erzeugen. Ein Mischer mit kleinem GDV bei mäßiger Mischerperformance wäre in einem solchen Fall daher akzeptabel. Ganz anders sieht es dagegen bei der Verwendung eines UV-Detektors aus, vor allem bei niedrigen Wellenlängen. Hier wirken sich kleinste Schwankungen der Lösungsmittelzusammensetzung in sichtbaren Schwankungen in der Basisline aus. Dies erschwert die Bestimmung der Stoffkonzentration aus dem Detektorsignal. Ein Mischer mit einer möglichst hohen Mischungseffizienz bei demensprechend größerem GDV wäre in diesem Fall von Vorteil.
Ein unnötig großes GDV ist ebenfalls nachteilig, da sich dadurch die Analyse-, Wasch- und Equilibrierphasen ebenfalls unnötig erhöhen würden.
Wird eine Methode auf eine andere HPLC-Anlage transferiert, welche abweichende GDVs aufweisen, könnte eine Offset-Zeit (tgdv = Vgdv/Flow rate) berechnet werden und entsprechend die Gradientenformung verzögert oder verfrüht gestartet werden.
Probleme mit der Welligkeit können hiermit aber nicht vollständig behoben werden. Dazu tauscht man normalerweise manuell den Mischer gegen einen anderen Mischer aus. Selbstverständlich wäre auch eine Automatisation eines solchen Tauschs mittels eines Schaltventils denkbar. Diese Lösung wäre aber aufgrund der Größe der Mischer unhandlich und zudem kostenintensiv.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie eine Anlage bzw. einen Probengeber zu dessen Durchführung zu schaffen, welche auf kostengünstige und baulich einfache Weise eine Anpassung des GDVs bzw. Mischvolumens ermöglichen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 sowie durch eine Flüssigkeitschromatographieanlage mit den Merkmalen des Patentanspruchs 10 gelöst.
Nach der Erfindung ist in einer Chromatographieanlage zwischen Mischpunkt (Gradientenentstehung) und Eingang einer Trennsäule eine Volumeneinstellvorrichtung vorgesehen, welche eine einfache, automatisierte und kostengünstige Änderung des GDVs bzw. Mischvolumens ermöglicht. Eine derartige Volumeneinstellvorrichtung bietet ein, beispielsweise über eine Steuervorrichtung, vorzugsweise stufenlos einstellbares Volumen, welches von einem sich in der Zusammensetzung ändernden Laufmittel bzw. Lösemittel (Gradient) während eines Chromatographielaufs durchströmt wird und entsprechend zum GDV zählt.
Je nach Ausbildung der Chromatographieanlage befinden sich in dem Pfad – in bzw. durch welchen ein Gradient gefahren wird – Komponenten, wie beispielsweise:
Bei einer LPG – je nach Ausbildung des Schaltventils und der durchgeschalteten Verbindungsports: Pumpenkopf, Mischer, Verbindungskapillaren, Probenschleife (Sample Loop), Schaltventil, Dosiervorrichtung (Metering Device) oder Teile hiervon und;
bei einer HPG – je nach Ausbildung des Schaltventils und der durchgeschalteten Verbindungsports: T-Stück, Mischer, Verbindungskapillaren, Probenschleife (Sample Loop), Schaltventil, Dosiervorrichtung (Metering Device) oder Teile hiervon.
Das Fassungsvermögen bzw. die von einem Gradienten durchströmten Innenvolumina der in diesem Pfad jeweils befindlichen Komponenten ergeben daher ein für eine jeweilige Anlage spezifisches GDV.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren sowie durch die erfindungsgemäße Flüssigkeitschromatographieanlage ist es nunmehr möglich ein gewünschtes GDV – abweichend von einem anlagespezifischen (festen) GDV – bereit zu stellen. So kann ein vordefiniertes, beispielsweise bei einer Methodenentwicklung ermitteltes oder ein bekanntes GDV einer anderen Anlage eingestellt werden, ohne dass hierzu Komponenten (Mischer, etc.) an der aktuellen Anlage gewechselt, hinzugefügt, ersetzt oder getauscht werden müssen. Die Änderung des GDV erfolgt hierbei in einem Bereich zwischen dem maximalen und minimalen einstellbaren Volumen, beispielsweise 0 bis 1000 µL, insbesondere 0 bis 500 µL, vorzugsweise 0 bis 120 µL der Volumeneinstellvorrichtung, vorzugsweise mittels einer elektronischen Steuereinrichtung.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist der gewünschte Wert durch entsprechende Stellung der Volumeneinstellvorrichtung stufenlos einstellbar. Selbstverständlich ist es aber auch denkbar innerhalb des änderbaren Bereiches des GDV diskrete Stufen vorzusehen.
In bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung wird als Volumeneinstellvorrichtung eine in der Anlage, insbesondere in dem Probengeber bereits für eine Probenentnahme und/oder Injektion vorhandene Dosiervorrichtung verwendet. Die zusätzliche Verwendung einer bereits vorhandenen Komponente ermöglicht ein bauliches und kostenreduzierendes Einsparungspotenzial.
Das gewünschte GDV kann in beliebiger Ausgestaltung der Erfindung vor einem Chromatographielauf (bei welchem ein Gradient gefahren wird), beispielweise vor einer Probenentnahme oder vor einer Probeninjektion, voreingestellt werden oder während einer Injektion oder während eines Chromatographielaufs eingestellt werden.
In einer Anordnung (bzw. mit einem Probengeber), in welcher die Dosiervorrichtung bzw. dessen Fassungsvermögen zum GDV zählt, kann auf diese Weise durch ein voreingestelltes Fassungsvermögen (größer als 0 bzw. abweichend von einer anlagespezifischen Ausgangsstellung für die Entnahme) vor der Probenentnahme das GDV verändert werden, da dieses voreingestellte, von der Standardposition abweichende Volumen nach einem Umschalten der Pfade (Entnahme-Injektion) zum GDV hinzuzählt.
Selbstverständlich ist es aber auch denkbar das GDV während und/oder nach einer Probeninjektion einzustellen oder zu verändern. Vorzugsweise kann hierbei eine (in einer Chromatographieanlage ebenfalls bereits vorhandene) Pumpvorrichtung, insbesondere eine Lösemittelpumpe entsprechend gegenläufig angesteuert werden, so dass der resultierende Volumenstrom bzw. die Flussrate und/oder der Druck im Pfad zur Trennsäule, insbesondere vor deren Eingang, im Wesentlichen konstant (d.h. mit einer Abweichung der bestehenden Flussrate bzw. des bestehenden Drucks kleiner 20%, beispielsweise kleiner 10%, insbesondere kleiner 5%, vorzuggsweise kleiner 1%) gehalten wird und eine Schädigung der Trennsäule vermieden sowie die Reproduzierbarkeit der Analyse gewährleistet werden kann.
Erfolgt die Änderung des GDVs in Strömungsrichtung zur Säule gesehen hinter einer eingesetzten Probe bzw. einem sogenannten Probenplug (also im Bereich zwischen Mischpunkt bzw. Entstehung des Gradienten und Injektionsstelle), verändert sich die Laufzeit des Gradienten auch relativ zur Position des Probenplugs. Entsprechend ergibt sich bei der Analyse beispielsweise bei der Erhöhung des GDVs eine zeitliche Spreizung bzw. Streckung des Ergebnisses (bzw. der als Peaks detektierten Komponenten der Probe über die Zeit). Erfolgt die Änderung des GDVs bzw. ∆GDV in Strömungsrichtung zur Säule gesehen dagegen vor einer eingesetzten Probe bzw. einem sogenannten Probenplug (also im Bereich zwischen Injektionsstelle und Eingang der Trennsäule), bleibt die Laufzeit des Gradienten relativ zum Probenplug unverändert (keine Spreizung), allerdings erfolgt das Ergebnis (bzw. die detektierten Peaks über die Zeit) verzögert mit dem Faktor ∆GDV/Flussrate.
Wird eine bereits vorhandene Dosiervorrichtung als Volumeneinstellvorrichtung verwendet und die Dosiervorrichtung vom Gradienten durchströmt, zählt ein neben einem vorgegebenen Probevolumen zusätzlich eingestelltes oder verändertes Volumen zum GDV. In dieser Ausgestaltung der Erfindung ist es möglich das gewünschte GDV in einem Bereich von 0 bzw. Minimum der Dosiervorrichtung bis zu deren Maximum abzüglich dem vorgegebenen Probenvolumen einzustellen.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung kann am Ende eines Chromatographielaufs nach diesem das kleinste Volumen der Volumeneinstellvorrichtung eingestellt werden, um die Zeit für ein Auswaschen auf einem Minimum zu verkürzen.
Neben den bereits genannten Vorteilen (Einstellung des GDVs stufenlos und ohne manuellen Eingriff, kostengünstige Nutzung eines vorhandenen Bauteils hierfür, mögliche Einsparung eines Mischers oder Unterstützung des Mischers) kann nach der Erfindung durch einfache Änderung des GDVs bzw. des Mischvolumens auch ein unerwünschtes, zu großes GDV in der Anlage vermieden bzw. behoben werden. In jedem Fall ist es nach der Erfindung im Unterschied zu herkömmlichen Verfahren und Anlagen möglich, allen applikationsspezifischen Erfordernissen an GDV und Mischungsperformance gerecht zu werden, ohne die entsprechenden Komponenten auszutauschen.
Obwohl das GDV bzw. Mischvolumen während eines Chromatographielaufs bei herkömmlichen Verfahren konstant ist, ist es nach der Erfindung weiterhin auch denkbar, das GDV über die Zeit der Analyse zu verändern. Fördert ein Block bei einer HPG beispielsweise sehr wenig Lösemittel im Gegensatz zum anderen Block, dann wird ein höheres GDV benötigt, um die Mischungswelligkeit zu unterdrücken. Zu einem anderen Zeitpunkt, wenn beide Blöcke annähernd gleiche Mengen fördern, kann ein geringeres GDV ausreichend sein.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert. In der Zeichnung zeigen:
1 zwei Diagramme zur Darstellung der Auswirkung zweier unterschiedlicher GDVs während eines Chromatographielaufs auf das detektierte Ergebnis;
2 eine schematische Darstellung eines HPLC-Systems mit einem Probengeber nach der Erfindung, an welchen eine Chromatographiesäule angeschlossen ist, wobei sich das Injektionsventil in der INJECT-Position befindet und im dargestellten Zustand eine Equilibrierphase erfolgt;
3 das HPLC-System in 2, wobei das Injektionsventil von der INJECT-Position in die DRUCKAUSGLEICH-Position geschaltet wurde und die Probeschleife aus dem analytischen Pfad geschaltet wurde;
4 das HPLC-System in 3, wobei das Injektionsventil in die WASTE-Position geschaltet wurde;
5 das HPLC-System in 4, wobei die Probennadel zur Probenentnahme in den Probenbehälter bewegt wurde und nachfolgend der Kolben der Spritze zum Ansaugen des Probenvolumens in die Endposition (Position C) bewegt wurde;
6 die HPLC-Anlage nach 5, wobei das Injektionsventil von der LOAD-Position in die DRUCKAUSGLEICH-Position geschaltet wurde und nachfolgend zum Druckausgleich (Druckerhöhung) in der Probenschleife der Kolben in die Position B bewegt wurde und
7 das HPLC-System in 6, wobei das Injektionsventil von der DRUCKAUSGLEICH-Position in die INJECT-Position geschaltet wurde.
Die in 1 dargestellten Diagramme verdeutlichen, wie sich eine Veränderung des GDVs auf eine Analyse über die Zeit bei einer (Proben-)Injektion zum Zeitpunkt 0 Minuten auswirkt. In den Diagrammen ist eine Lösemittelzusammensetzung über die Zeit als gestrichelte Linie dargestellt. Die Lösemittelzusammensetzung ändert sich (Übergänge in Form von Knickpunkten) von einer konstanten (unterer bzw. vorderer horizontaler Abschnitt) unteren Grenze (Acetonitril 40%) über eine sich ändernde (von 40% auf 70% Acetonitril) Zusammensetzung bzw. Gradient (gerader, ansteigender, mittlerer Bereich) bis zu einer konstanten (horizontaler oberer bzw. hinterer Abschnitt) oberen Grenze (Acetonitril 70%). Als Gradient wird beispielsweise ein Gradient mit einer Erhöhung eines Lösemittelanteils B, beispielsweise Acetonitril ACN, von 40%–70% in 16 Sekunden (und entsprechender Verringerung des Lösemittelanteils A oder der restlichen Lösemittelanteile von 60%–30%) verwendet. Im oberen Diagramm (Fall A) beträgt das voreingestellte Pumpenvolumen der Volumeneinstellvorrichtung V_A = 25 µL, d.h. das GDV ist um 25 µL erhöht, wohingegen im unteren Diagramm (Fall B) das eingestellte Pumpenvolumen V_A = 100 µL, d.h. das GDV ist um 100 µL erhöht, beträgt.
Da die Erhöhung des GDV (∆GDV = 75 µL = 100 µL – 25 µL) von Fall A zu Fall B durch die Volumeneinstellvorrichtung, insbesondere eine Dosiervorrichtung 5 im Ausführungsbeispiel in Strömungsrichtung zur (Trenn-)Säule 41 gesehen im Bezug zur Position eines eingesetzten Probenplugs hinter dieser (also nachfolgend der hinteren Trennfläche zwischen Probenplug und Laufmittel bzw. zwischen Mischpunkt und Spitze der Probennadel 42) erfolgt, verschiebt sich das Eintreffen und damit Auswirken des Gradienten bzw. einer jeweiligen Konzentration im Bezug auf die Probe am Eingang der Trennsäule 41, ohne dass der Zeitpunkt des Eintreffens der Probe selbst verzögert wird. Infolge der zeitlichen Verschiebung bzw. Verzögerung des Eintreffens der jeweiligen Konzentration am Eingang der Säule 41 verschiebt bzw. verzögert sich allerdings die eluierende Wirkung des Gradienten auf zu eluierende Komponenten der Probe. Infolgedessen tritt eine zeitliche Spreizung bzw. Streckung der als Peaks detektierten (Proben-)Komponenten ein, welche mit schwerer zu eluierenden Komponenten (in Richtung der Zeitachse) zunimmt.

Wie in 1 (unteres Diagramm) als Ausschnitt eines Analyseergebnisses (mit dargestellten Peak 2 bis Peak 7 in mAU = milli absorption unit) ersichtlich, treten die einzelnen Peaks mit zunehmender Zeit gegenüber ihrem Auftreten im oberen Diagramm desto stärker verzögert auf, je später die entsprechenden Komponenten (durch eine höhere Konzentration) eluiert werden. Entsprechend erhöhen sich die Zeitpunkte des Auftretens der Peaks wie nachfolgend dargestellt.

Peak 2 von 26,090s	auf	26,450s	Verzögerung ∆t = 0,360s
Peak 3 von 45,150s	auf	47,250s	Verzögerung ∆t = 2,100s
Peak 4 von 58,520s	auf	62,780s	Verzögerung ∆t = 4,260s
Peak 5 von 68,390s	auf	73,630s	Verzögerung ∆t = 5,240s
Peak 6 von 71,960s	auf	77,560s	Verzögerung ∆t = 5,600s
Peak 7 von 79,430s	auf	85,520s	Verzögerung ∆t = 6,090s

Die minimale Verzögerung bei Peak 2 liegt hierbei unter einer Messtoleranz, so dass dessen Auftreten im Fall A zu Fall B als gleichzeitig bzw. ohne Verzögerung angesehen werden kann. Grund hierfür ist der isokratische Teil des Laufmittels bei dem dieser Peak 2 bereits eluiert wird, ohne dass zu diesem Zeitpunkt bereits ein Gradient einwirkt.
Dagegen kann die Amplitude bzw. das Maximum der Absorption, wie aus 1 ersichtlich gleich bleiben oder verringert werden.
Als Resultat der GDV-Änderung ∆GDV verschieben sich die Übergänge bzw. Knickpunkte zwischen Horizontale (isokratisch) und der linearen Steigung (Gradient) auf der Zeitachse im Falle des Übergangs Horizontale zur Steigung von 31 Sekunden auf 36 Sekunden und im Falle des Übergangs Steigung zur Horizontale von 47 Sekunden auf 52 Sekunden im Vergleich des oberen zum unteren Diagram der 1 nach rechts. Diese Verzögerung von ca. 5 Sekunden entsteht durch das um ∆GDV = 75 µL höhere GDV (unteres Diagramm) und der Flussrate von 0,95 mL/min (= 15,83 µL/s).
Erfolgt die Erhöhung des GDV dagegen in Strömungsrichtung zur Säule 41 gesehen örtlich vor dem Probenplug (also zwischen Nadelsitz bzw. Injektionsport 45 und Eingang der Trennsäule 41 bzw. vor der vorderen Trennfläche zwischen Probenplug und Laufmittel), wird das detektierte Ergebnis bzw. Peaks der Komponenten der Probe ohne Streckung um die veränderte Laufzeit zeitlich verzögert bzw. im Diagramm nach rechts verschoben.
2 bis 7 zeigen in schematischer Darstellung eine HPLC-Anlage bzw. ein HPLC-System mit einem nach dem Split-Loop-Prinzip arbeitenden Probengeber 10, der eine Dosiervorrichtung 5, ein Injektionsventil 3 und eine Hochdruckpumpe 40 aufweist. Darüber hinaus weist der Probengeber 10 eine Probenschleife auf, die aus einem ersten Verbindungsstück 51, einem zweiten Verbindungsstück 52, 44 und einem Pumpenvolumen V (je nach Kolbenposition Minimum, V_A, V_B oder V_C bis Maximum V_max, von beispielsweise 120 µL) besteht. Hierbei kann es sich um eine druckfeste Leitung mit einem geringen Durchmesser, beispielsweise in Form von Glas – oder Edelstahlkapillaren, handeln. Das Verbindungsstück 51 ist mit einem ersten Probenschleifenport 16 des Injektionsventils 3 verbunden und mit der Probenfördereinrichtung bzw. deren Pumpenvolumen V. Das aus einem Ansaugstück 44 und einem Zuführstück 52 bestehende zweite Verbindungsstück ist auftrennbar ausgebildet. Hierzu mündet das Zuführstück 52 in einen Injektionsport 45, welcher über das Zuführstück 52 mit einem zweiten Probenschleifenport 13 des Injektionsventils 3 verbunden ist. Das mit einem Ende mit dem Pumpenvolumen V der Dosiervorrichtung 5 verbundene Ansaugstück 44 weist am anderen Ende eine Probennadel 42 auf, mit welcher das Ansaugstück 44 mit dem Injektionsport 45 verbunden werden kann.
Die Probennadel 42 kann jedoch auch zu einem Probenbehälter 43 bewegt werden und aus diesem – in der nachstehend erläuterten Weise – ein definiertes Probenvolumen in das Ansaugstück 44 ansaugen. Des Weiteren kann die Probennadel 42 auch zu einem Behälter für ein Spülfluid (nicht dargestellt) bewegt werden, um aus diesem Spülflüssigkeit für einen Spülvorgang zu entnehmen, mit welcher die Probenschleife 51, 52, 44, das Pumpenvolumen V und gegebenenfalls auch die Ports und Nuten bzw. Kanäle des Injektionsventils gereinigt werden kann. Durch die spezielle Topologie des dargestellten Split-Loop-Prinzips ist jedoch normalerweise ein Spülen der Probenschleife 51, 52, 44 sowie der Probenfördereinrichtung 5 nicht erforderlich, da diese ohnehin bei einem Injektionsvorgang mit Laufmittel, welches von der Pumpe 40 zugefördert wird, durchspült wird. Es kann jedoch die Außenseite der Probennadel 42 durch das Eintauchen in einen Behälter mit Reinigungs- oder Spülflüssigkeit gereinigt werden. Alternativ kann die Nadel 42 auch auf einen in der Zeichnung nicht dargestellten Wasch- und/oder Wasteport gefahren werden, um gereinigt zu werden und/oder überschüssiges Lösemittel auszuscheiden.
Die Dosiervorrichtung 5 umfasst in der dargestellten Ausführungsform eine Spritze 50, in welcher ein Kolben 53 druckdicht und verschiebbar geführt ist. Der Kolben 53 wird mittels eines Antriebs 55, beispielsweise einem Schrittmotor, angetrieben. Der Antrieb 55 wird von einer Steuereinheit 60 angesteuert. Die Steuereinheit 60 steuert auch die Schaltvorgänge des Injektionsventils 3, welches einen nicht dargestellten, ansteuerbaren Antrieb aufweist.
Ein Waste-Port 12 des Injektionsventils ist mit einer Waste-Leitung 47 verbunden, aus welcher Fluid in ein nicht dargestelltes Waste-Reservoir abführbar ist.
Die Hochdruckpumpe 40 ist mit einem Hochdruckport 15 des Injektionsventils verbunden. Eine Chromatographiesäule 41 ist mit dem weiteren Hochdruckport 14 verbindbar. Die Hochdruckpumpe 40 kann als Bestandteil in den Probengeber integriert sein, kann jedoch auch in einer anderen Einheit oder einer separaten Pumpeneinheit vorgesehen sein.
Das Injektionsventil 3 besteht aus einem Stator 1 und einem Rotor 2. Der Stator 1 weist die beiden Hochdruckports 14, 15, die beiden Probenschleifen-Ports 13, 16 und den Waste-Port 12 auf. Selbstverständlich sind anstelle des dargestellten Injektionsventils auch Injektionsventile mit mehr als 5 Ports zur Realisierung der Erfindung denkbar. Über diese Ports ist das Injektionsventil 3 über die vorstehend beschriebenen Verbindungsleitungen, die als Kapillarverbindungen ausgebildet sein können, mit den anderen Funktionselementen des HPLC-Systems verbunden. Die dafür benötigten Hochdruckverschraubungen sind der Übersichtlichkeit halber in 1 nicht dargestellt. Aus Gründen der Einfachheit ist das Injektionsventil in der Grenzfläche zwischen Stator 1 und Rotor 2 dargestellt, wobei sowohl die Ausgestaltung der Stirnfläche des Stators 1 als auch die Ausgestaltung der Stirnfläche des Rotors 2 gezeigt ist, um das Verständnis der Funktionsweise zu erleichtern. Innerhalb des Injektionsventils 3 sind die Ports als Bohrungen ausgebildet, die zur anderen Seite des Stators 1 führen. Der Rotor 2 weist eine Anzahl bogenförmiger Nuten 21, 23, 25 auf, die genau auf die Bohrungen der Ein- und Ausgangsports ausgerichtet sind.
Der Rotor 2 wird mit einer Andruckkraft gegen den Stator 1 gepresst, so dass sich eine gemeinsame Grenzfläche zwischen Rotor 2 und Stator 1 ausbildet, an der die beiden Teile gegeneinander dichten. Die Andruckkraft wird dabei so bemessen, dass die Anordnung auch bei den höchsten zu erwartenden Drücken noch dicht ist.
In der in 2 dargestellten sogenannten Equilibrierungsphase der Anlage befindet sich das Schalt- bzw. Injektionsventil in der INJECT-Position, so dass die Probenschleife aktiv von der Pumpe Richtung Säule mit Lösemittel durchspült wird. Ein benötigtes GDV der gesamten Anlage bzw. des Probengebers 10, das bei der Methodenentwicklung bestimmt wurde oder bereits vorgegeben ist, wird mittels Positionierung des Kolbens 53 bei der Equilibrierung eingestellt (GDV der Gesamtanlage und zusätzliches ∆GDV der Dosiervorrichtung 5).
In dem dargestellten Ausführungsbeispiel wird hierzu eine Position Pos. B eingenommen, in welcher die Dosiervorrichtung ein Pumpenvolumen V_B aufweist. Dieses Volumen beinhaltet bereits eine gewünschte Änderung ∆GDV (= V_A) des GDV des Probengebers 10 (bzw. dessen herkömmliches GDV) sowie eine (zu einem späteren Zeitpunkt) gewünschte aufzunehmende Probenmenge V_Probe (= V_B – V_A), wobei selbstverständlich auch andere Varianten ohne ein Einschließen eines Probenvolumen zu einem solchen Zeitpunkt denkbar sind.
Eine bei der Equilibrierung veränderte Kolbenpositionierung und ein damit verändertes Pumpenvolumen V der Volumeneinstellvorrichtung führt zu einem veränderten Druck und Fluss (Möglichkeit 1), wobei die Volumenänderung in bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung durch Anpassung der Flussrate kompensiert werden kann, so dass der Druck und Fluss weiterhin stabil bleibt (Möglichkeit 2). Die Anpassung der Flussrate erfolgt hierbei durch entsprechende zur Dosiervorrichtung 5 gegenläufige Ansteuerung der Pumpe 40 durch die Steuereinheit 60.
Anschließend schaltet das Ventil 3, wie in 3 dargestellt, in eine DRUCKAUSGLEICH-Position, in der das Verbindungsstück 51 und das zweite Verbindungsstück bzw. das Zuführstück 52 der Probenschleife keine Verbindung zu den anderen an das Injektionsventil 3 angeschlossenen Komponenten haben und die Probenschleife damit aus dem analytischen Pfad geschaltet ist. Die Probenschleife hat zu dieser Zeit ebenfalls Systemdruck (Hochdruck größer 500bar oder gar größer als 1500bar).
Der Antrieb 55 der Dosiervorrichtung 5 kann in einer Variante (nur bei einer im Folgenden erläuterten Methode 1 nötig) kurz vorwärts fahren, bis sich der Kolben 53 bewegt. Dabei wird die Kraft auf den Kolben 53 oder das Drehmoment des Antriebs 55 gemessen und gespeichert. Sie ist ein Maß für den Druck in der Probenschleife (Systemdruck). In einer anderen Variante wird der Druck mittels Sensor ermittelt bzw. überwacht oder die Kolbenposition detektiert und zur späteren Verwendung gespeichert.
Im Folgenden dekomprimiert die Dosiervorrichtung 5 die Probenschleife durch Änderung der Kolbenposition von Pos. B auf Pos. C bzw. Erhöhung des Pumpenvolumens von V_B auf V_C bis kurz vor Atmosphärendruck. Hierbei kann der erforderliche Verfahrweg des Kolbens 53 durch Messung der Kraft auf den Kolben 53 oder des Antriebsmoments beim Aufziehen der vorhergehenden Probe ermittelt oder durch einen Drucksensor in der Probenschleife bestimmt werden.
Wie in 4. dargestellt, schaltet das Schaltventil 3 anschließend auf die WASTE-Position, in welcher durch die Dosiervorrichtung 5 die Menge Lösemittel ausgestoßen wird, die der aufzuziehenden Probenmenge V_Probe(= V_C – V_A) entspricht.
In dem in 5 dargestellten Zustand wurde die Probennadel 42 anschließend in den Probenbehälter 43 bewegt, so dass ein Probenvolumen angesaugt werden kann. Hierzu befindet sich der Kolben 53 anfänglich in Position A und wird von der Steuereinheit 60 für das Ansaugen in Position C gesteuert. Hierbei wird das gewünschte, definierte Probenvolumen V_Probe(= V_C – V_A) in das Ansaugstück 44 angesaugt, wobei das Volumen der Probe vorzugsweise kleiner ist als das Volumen des Ansaugstücks 44 damit im Pumpenvolumen keine Vermischung des Probenfluids mit dem von der Hochdruckpumpe zugeförderten Fluid erfolgen kann. 5 zeigt den Zustand des HPLC-Systems nach dem Beenden des Ansaugvorgangs.
In der in 5 gezeigten ersten LOAD-Position des Ventils 3 sind die Nuten 21, 23, 25 zu den Ports 12 bis 16 so ausgerichtet, dass die Nuten 23 und 25 die beiden Hochdruckports 14, 15 bzw. den Waste-Port 12 und den Probenschleifen-Port 13 verbinden. In dieser LOAD-Position fördert die Hochdruckpumpe 40 somit Fluid in Richtung auf die Chromatographiesäule 41. Des Weiteren ist der Probenschleifen-Port 16 druckdicht verschlossen.
Beim Aufziehen kann die Kraft auf den Kolben 53 oder das Antriebsmoment der Dosiervorrichtung 5 gemessen werden, wobei das Antriebsmoment oder die Kolbenkraft hier ein Maß für den Atmosphärendruck darstellt und wie vorstehend beim Dekomprimieren erläutert, verwendet werden kann. Selbstverständlich ist es auch denkbar den (Atmosphären-)Druck mittels eines Drucksensors zu ermitteln, zu überwachen und/oder für eine spätere Verwendung zu speichern.
Anschließend schaltet das Schaltventil 3 auf eine DRUCKAUSGLEICH-Position, in der das Verbindungsstück 51 und das zweite Verbindungsstück bzw. das Zuführstück 52 der Probenschleife keine Verbindung zu den anderen an das Injektionsventil 3 angeschlossenen Komponenten haben. Um während der Förderung des für die Kompression des Probenschleifeninhalts notwendigen Volumens die Strömung durch die Chromatographiesäule 41 nicht zu unterbrechen ist die Nut 25 im Rotor 2 des Ventils entsprechend verlängert ausgeführt, so dass auch in der DRUCKAUSGLEICH-Position noch die beiden Hochdruckports 14, 15 verbunden sind.
Die Probenschleife wird hierbei in einer Variante (Methode 1) solange komprimiert, bis das gespeicherte (wie vorstehend erläutert) Antriebsmoment oder die Kolbenkraft als Maß für den Systemdruck erreicht ist. Der Druck entspricht dann wieder dem Systemdruck (Hochdruck). Eine vom Laufmittel bzw. Lösemittel abweichende Kompressibilität der Probe kann hierbei bewirken, dass die resultierende Kolbenposition unter Umständen nicht mehr genau der Anfangsstellung Pos. B des Kolbens 53 entspricht. Hierdurch erfolgt eine exakte Vorkompression der Probenschleife auf den Systemdruck bei einer geringen vernachlässigbaren Abweichung des gewünschten Wertes GDV_soll des GDV.
In einer anderen denkbaren Variante (Methode 2) wird der Kolben 53, wie in 6 dargestellt, wieder auf die Anfangsstellung Pos. B gefahren und komprimiert hierdurch die Probenschleife. Hierbei ergeben Abweichungen der Kompressibilität der Probe im Vergleich zur Kompressibilität des Lösemittels geringe zu vernachlässigende Abweichungen zum Systemdruck. Dafür entspricht das erreichte GDV exakt dem gewünschten Wert GDV_soll des GDV.
Um das Probenvolumen, das sich im Ansaugstück 44 befindet, injizieren zu können wird die Probennadel 42 in den Injektionsport 45 bewegt. Dieser dichtet die Nadelspitze hochdruckfest ab. Anschließend schaltet das Schaltventil bzw. Injektionsventil 3 auf die Inject-Position, in welcher das angesaugte Probenvolumen durch das von der Pumpe 40 geförderte Laufmittel vollständig aus dem Ansaugstück 44 zur Säule 41 gefördert wird (Injektion). Wird für einen Chromatographielauf für das Lösemittel bzw. Laufmittel ein Gradient gefahren (zeitlich gesteuertes Mischungsverhältnis des Laufmittels) entstehen vorteilhafterweise keine unerwünschten Verzögerungen.
In bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung kann eine durch die Vorkompression verursachte Abweichung des GDV nach der Injektion nachgeregelt werden, wobei die Korrekturbewegung des Kolbens (auf Pos. B) durch entsprechende Anpassung der Flussrate kompensiert wird. Hierdurch kann bei exakter Vorkompression dennoch ein exaktes (eingestelltes bzw. gewünschtes) GDV_soll erhalten werden. Zudem ist es auch möglich (insbesondere falls das Probevolumen nach der Kompression größer als das gewünschte GDV_soll ist) das gewünschte GDV_soll während des Chromatographielaufs nachzuregeln.
Auch wenn es im Ausführungsbeispiel anders dargestellt ist, ist es aber selbstverständlich auch denkbar, das GDV (abweichend von einem anlagespezifischen GDV_ist) statt vor auch während eines Chromatographielaufs auf ein gewünschtes Maß GDV_soll einzustellen bzw. zu variieren. Hierzu kann über die Steuereinrichtung 60 die Pumpe 40 entsprechend gegenläufig zur Änderung der Dosiervorrichtung 5 angesteuert werden, um die Flussrate bzw. den Volumenstrom zur Säule 41 konstant zu halten.
Optional kann am Ende des Chromatgraphielaufs die Abweichung ∆GDV (= GDV_soll – GDV_ist) und damit GDV bzw. das Mischvolumen durch Stellung des Kolbens 53 auf Pos. 0 auf ein Minimum (minimales Pumpenvolumen) gesetzt werden, um die Auswaschzeit des Systems, insbesondere der Probenschleife zu verkürzen.
Bezugszeichenliste

1: Stator
2: Rotor
3: Injektionsventil
5: Dosiervorrichtung
10: Probengeber bzw. Chronatographieanlage
12: Waste-Port
13: zweiter Probenschleifenport
14: weiterer Hochdruckport
15: Hochdruckport
16: erster Probenschleifenport
21, 23, 25: Nuten
40: Hochdruckpumpe
41: Trennsäule
42: Probennadel
43: Probenbehälter
44: Ansaugstück
45: Injektionsport
47: Waste-Leitung
50: Spritze
51: erstes Verbindungsstück
52: Zuführstück
53: Kolben
55: Antrieb
60: Steuereinheit
V: Pumpenvolumen
V_A: Pumpenvolumen in Position A
V_B: Pumpenvolumen in Position B
V_C: Pumpenvolumen in Endposition C
V_Probe: Probenmenge
V_max: maximales Volumen der Dosiervorrichtung
Pos. 0: unterste Position des Kolbens
Pos. A: Position A des Kolbens
Pos. B: Position B des Kolbens
Pos. C: Endposition des Kolbens
GDV: Gradientenverzögerungsvolumen der gesamten Anlage
GDV_ist: anlagespezifischer Wert des GDV
GDV_soll: gewünschter Wert des GDV
∆GDV: Abweichung des GDVs durch entsprechende Kolbenstellung

Claims

Verfahren zum Einstellen eines Gradientenverzögerungsvolumens (GDV) einer Flüssigkeitschromatographieanlage für einen Chromatographielauf in der Flüssigkeitschromatographie, insbesondere einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographieanlage, bei dem ein gewünschter Wert (GDV_soll) eines Gradientenverzögerungsvolumens der Flüssigkeitschromatographieanlage ermittelt oder vordefiniert wird und, falls der Wert (GDV_soll) von einem spezifischen festen Wert (GDV_ist) einer Flüssigkeitschromatographieanlage abweicht, dieser Wert (GDV_soll) in einem Bereich (0 ≤ ∆GDV = GDV_soll – GDV_ist ≤ V_max) eines Volumens einer Volumeneinstellvorrichtung (5) eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wert (GDV_soll) stufenlos eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Wert (GDV_soll) während und oder/nach einer Probeninjektion eingestellt oder verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussrate und/oder der Druck innerhalb des zum GDV zählenden Bereichs der Flüssigkeitschromatographieanlage während einer Änderung des Wertes (∆GDV) mittels entsprechend gegenläufiger Steuerung einer Pumpe (40) durch eine Steuervorrichtung (60) im Wesentlichen konstant gehalten wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Volumeneinstellvorrichtung (5) eine Dosiervorrichtung (5) für eine Probenentnahme und/oder -injektion verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Wert (GDV_soll) in einem Bereich (0 ≤ ∆GDV ≤ V_max – V_Probe) auch vor einer Probeninjektion oder einer Probenentnahme voreingestellt werden kann.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass am Ende eines Chromatographielaufs oder nach einem solchen das kleinste Volumen (∆V = 0) der Volumeneinstellvorrichtung (5) eingestellt wird, um die Zeit für ein Auswaschen zu verkürzen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumeneinstellvorrichtung (5) mittels einer Steuereinheit (60) angesteuert wird.
Verwendung einer für eine Probenentnahme und/oder Probeninjektion vorhandenen Dosiervorrichtung (5) als Volumeneinstellvorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Probengeber zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, der in einem Pfad (zwischen Mischpunkt und Eingang Säule), durch welchen ein Gradient gefahren wird, eine Volumeneinstellvorrichtung (5) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der Probengeber eine Steuereinheit (60) zur Steuerung der Volumeneinrichtung (5) aufweist, die derart ausgebildet ist, dass die Volumeneinstellvorrichtung (5) derart angesteuert wird, dass sich ein vom anlagespezifischen Gradientenverzögerungsvolumen (GDV_ist) abweichendes Volumen (∆GDV) einstellen lässt.
Probengeber nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumeneinstellvorrichtung (5) als Dosiervorrichtung für die eine Probenentnahme und/oder Probeninjektion ausgebildet ist.
Probengeber nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (60) zudem derart ausgebildet ist, dass sie eine Pumpvorrichtung (40) zur Erzeugung des Gradienten gegenläufig zur Ansteuerung der Volumeneinstellvorrichtung (5) ansteuert, so dass der Volumenstrom und/oder Druck auch bei einer Änderung (∆GDV) des Gradientenverzögerungsvolumens im Wesentlichen konstant gehalten wird.