DE102013213362A1

DE102013213362A1 - Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von emittierenden Teilchen in Systemen

Info

Publication number: DE102013213362A1
Application number: DE102013213362.6A
Authority: DE
Inventors: Benjamin Greiner
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2013-07-08
Filing date: 2013-07-08
Publication date: 2015-01-08
Also published as: CA2917662C; EP3019852A1; US20160161390A1; US20190212246A1; DK3019852T3; ES2895972T3; US10928294B2; EP3019852B1; CA2917662A1; CN105518438B; WO2015004046A1; CN105518438A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Teilchen, die bestimmte Emittenden emittieren, und zur Charakterisierung des zeitabhängigen Verhaltens der Teilchen in einem System, das Teilchen zumindest einer Spezies j, insbesondere verschiedener Spezies umfasst, wobei in einer Messung Emissionen der Teilchen in einem Messzeitraum detektiert werden und in einer Auswertung die Anzahl n der Emissionen ermittelt und gespeichert wird, die in einem Zeitintervall mit einer vorbestimmten Intervallbreite innerhalb des Messzeitraums detektiert wurden, wobei die Auswertung insbesondere für mehrere Zeitintervalle mit derselben Intervallbreite durchgeführt wird, wobei eine Verteilungsfunktion p(n) der Anzahl n der detektierten Emissionen bestimmt wird. Für die Intervallbreite werden unterschiedliche Binzeiten τ festgelegt und für jede Binzeit τ die Auswertung durchgeführt und eine Verteilungsfunktion pτ(n) ermittelt, wobei für jede Binzeit τ Momente m Messi,τ der Verteilungsfunktion pτ(n) ermittelt werden, woraus binzeitabhängige Momentenfunktionen m Messi (τ) dargestellt werden. Aus einem numerischen Abgleich einer theoretischen Signalfunktion umfassend Momente m sigi (r) einer theoretischen Signalverteilung Psig(n, τ) werden, die eine über theoretische Funktionen ermittelte, zu erwartende Signalverteilung angibt, mit einer Messwertfunktion umfassend die Momentenfunktionen m Messi (τ) Konstanten ermittelt, die die Teilchen in dem System charakterisieren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Teilchen, die bestimmte Emittenden emittieren, und zur Charakterisierung des zeitabhängigen Verhaltens der Teilchen in einem System, das Teilchen zumindest einer Spezies j umfasst, gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1.
Entsprechende Verfahren werden herkömmlicherweise bei der Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie eingesetzt, bei der Teilchen quantifiziert und charakterisiert werden, die als Emittenden Photonen emittieren. Dabei werden die Teilchen üblicherweise über eine externe Lichtquelle, wie beispielsweise ein Laser, angeregt, wobei über die Detektion der Photonen die Abstrahlcharakteristik des Systems mit den Teilchen bestimmt werden kann, woraus Rückschlüsse über die Teilchen in dem System gezogen werden können.
Als besonders vorteilhaftes Verfahren zur Quantifizierung und Charakterisierung von Teilchen in einem System hat sich in der Vergangenheit die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) erwiesen, wie sie beispielsweise in EP 0 679 251 B1 beschrieben ist. Hierbei wird ein System, das üblicherweise durch eine Lösung dargestellt wird, in der verschiedene Teilchen mit bestimmten Partialkonzentrationen enthalten sind, über eine konfokale Mikroskopoptik vermessen. Über eine solche konfokale Mikroskopoptik wird zum einen ein Laserstrahl eines Anregungslasers so in das System abgebildet, dass nur ein sehr kleines Angregungsvolumen von dem Laser ausgeleuchtet wird, und zum anderen werden die Photonen, die von Teilchen in dem Anregungsvolumen emittiert werden, über die konfokale Mikroskopoptik auf einen Detektor abgebildet. Mit bekannten konfokalen Mikroskopoptiken kann das Anregungsvolumen auf weniger als 1 fl beschränkt werden.
Bei dem Verfahren gemäß der FCS wird während eines Messzeitraums ein Fluoreszenzsignal ermittelt, das die Anzahl der Photonen, die der Detektor während des Messzeitraums detektiert, über den Messzeitraum hinweg angibt. Aus dem Fluoreszenzsignal kann somit der zeitliche Verlauf der Anzahl der detektierten Photonen abgelesen werden. Über die zeitliche Autokorrelationsfunktion des Fluoreszenzsignals können dann Informationen über die Diffusionskonstante der emittierenden Teilchen, die Emissionscharakteristik der Teilchen und die Partialkonzentration der Teilchen ermittelt werden. Aus dem Stand der Technik sind auch FCS-Verfahren bekannt, bei denen der Messzeitraum in mehrere gleichlange Zeitintervalle eingeteilt wird, wobei für jedes der Zeitintervalle die detektierte Photonenanzahl ermittelt wird, woraus dann das Fluoreszenzsignal ermittelt wird, das den über den Messzeitraum zeitlichen Verlauf der Photonenanzahl, die in der Dauer der Zeitintervalle detektiert wurden, darstellt. Entsprechend kann dann wieder über die Autokorrelationsfunktion des Fluoreszenzsignals Informationen über die Partialkonzentration der Teilchen und die Diffusionskonstanten der Teilchen unterschiedlicher Spezies in dem System erhalten werden.
Das FCS-Verfahren beruht somit auf der Ermittlung des zeitlichen Verhaltens des Fluoreszenzsignals über die Autokorrelationsfunktion, wobei über diese zeitdynamischen ermittelten Werte Informationen über die Teilchen der verschiedenen Spezies in dem beobachteten System ermittelt werden. Bei der FCS wird jedoch die Helligkeit, d. h. die absolute Anzahl der detektierten Photonen nicht zur Charakterisierung und Quantifizierung der Teilchen in dem System verwendet. Die Ermittlung von Informationen über die Teilchen in dem System erfolgt somit über einen Datensatz, der im Vergleich zu den von dem Detektor ermittelten Daten, die unter anderem die absolute Anzahl der detektierten Photonen umfasst, deutlich reduziert ist. Demzufolge ist das FCS-Verfahren für einige Anwendungsbereiche kaum geeignet. So ist das FCS-Verfahren beispielsweise kaum für die Ermittlung von Partialkonzentrationen und der Charakterisierung von Teilchen unterschiedlicher Spezies in einem System geeignet, wenn die Teilchen der verschiedenen Spezies ähnliche Massen und/oder ähnliche Diffusionskoeffizienten in dem System aufweisen.
Um diesen Problemen des FCS-Verfahrens zu begegnen, wird das FCS-Verfahren häufig in Kombination mit dem PCH-Verfahren (photon counting histogram) angewandt. Das PCH-Verfahren basiert dabei wie das FCS-Verfahren auf einer Datengewinnung über die Detektion von Photonen, die von Teilchen in einem System emittiert wurden, wobei die Ermittlung der Daten wie oben beschrieben über eine konfokale Mikroskopoptik mit Anregung durch eine Laserquelle erfolgt. Das PCH-Verfahren ist beispielsweise bei Chen Y. et al., The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy, Biophysical Journal, 77, 553–567, 1999 beschrieben. Bei dem PCH-Verfahren wird während des Messzeitraums mehrfach die Anzahl der Photonen ermittelt, die in einem Zeitintervall mit einer vorbestimmten Intervallbreite detektiert wurden. Aus diesen Daten wird ein Photonenzählratenhistogramm erstellt, das die Verteilung der Anzahl der detektierten Photonen angibt. In dem Photonenzählratenhistogramm ist somit Information über die absolute Anzahl der in dem Zeitintervall detektierten Photonen enthalten. Damit ist das PCH-Verfahren dafür geeignet, in einem System mit Teilchen unterschiedlicher Spezies, die jeweils eine unterschiedliche Abstrahlcharakteristik aufweisen, eine Quantifizierung der Teilchen zu ermöglichen, insbesondere die Partialkonzentrationen der unterschiedlichen Spezies zu ermitteln. Dagegen ist das PCH-Verfahren nicht dafür geeignet, ein zeitabhängiges Verhalten der Teilchen in dem System zu analysieren, da die in dem PCH-Verfahren ermittelten Daten keine zeitabhängigen Informationen enthalten.
Sowohl das FCS-Verfahren als auch das PCH-Verfahren ermöglichen die Ermittlung von Daten, die die Teilchen unterschiedlicher Spezies in dem vermessenen System charakterisieren, indem die über das FCS- bzw. das PCH-Verfahren ermittelten Datensätze mit Hilfe von numerischen Algorithmen ausgewertet werden. Wie oben erläutert bieten PCH-Verfahren und FCS-Verfahren dabei Zugang zu unterschiedlichen charakteristischen Daten, die die Teilchen der unterschiedlichen Spezies und ihre Partialkonzentration in dem System charakterisieren. Zur umfassenden Charakterisierung ist dabei stets die vollständige Durchführung des FCS-Verfahrens und die vollständige Durchführung des PCH-Verfahrens notwendig. Dies ist zeitaufwendig und erfordert erhebliche Rechnerressourcen. Darüber hinaus kann auch die Kombination von PCH-Verfahren und FCS-Verfahren keine vollständige Analyse eines Systems mit Teilchen unterschiedlicher Spezies gewährleisten. So ist insbesondere die Analyse des zeitabhängigen Verhaltens in einem System mit unterschiedlichen Spezies, die eine ähnliche Diffusionskonstante und/oder eine ähnliche Masse aufweisen, kaum möglich. Insbesondere bei der Beobachtung zeitabhängiger Vorgänge, wie beispielsweise biochemische Reaktionen in Systemen, die zwischen Teilchen unterschiedlicher oder derselben Spezies in dem System erfolgen, ist die Analyse der über eine konfokale Mikroskopoptik gewonnenen Messdaten über FCS- und PCH-Verfahren zur Gewinnung von Daten über die chemischen Reaktionen kaum möglich.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Quantifizierung von emittierenden Teilchen und zur Charakterisierung des zeitabhängigen Verhaltens der Teilchen in einem System bereitzustellen, das die obengenannten Probleme zumindest teilweise löst und eine einfachere und/oder umfassendere Analyse der Teilchen in dem System ermöglicht.
Als eine Lösung der genannten technischen Aufgabe schlägt die Erfindung ein Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 1 vor. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden in einer Messung Emissionen der Teilchen in einem Messzeitraum detektiert. In einer Auswertung wird dann die Anzahl n der Emissionen ermittelt und gespeichert, die in einem Zeitintervall mit einer vorbestimmten Intervallbreite innerhalb des Zeitraums detektiert wurden. Die Auswertung kann insbesondere für mehrere Zeitintervalle mit derselben Intervallbreite durchgeführt werden, die jeweils innerhalb des Messzeitraums liegen. Insbesondere können die Zeitintervalle so ausgewählt werden, dass sie nicht überlappen. Bei der Auswertung wird dann eine Verteilungsfunktion p(n) der Anzahl n der detektierten Emissionen bestimmt. Die Verteilungsfunktion p(n) gibt an, mit welcher relativen Häufigkeit verschiedene Werte für die Anzahl n ermittelt wurden. Im Fall einer Auswertung, bei der für die Anzahl n der detektierten Emissionen in Zeitintervallen mit jeweils derselben Intervallbreite Werte von 0 bis m ermittelt wurden, gilt somit:
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass für die Intervallbreite unterschiedliche Binzeiten τ festgelegt werden und für jede Binzeit τ die Auswertung durchgeführt wird und eine Verteilungsfunktion p_τ(n) ermittelt wird. Die Verteilungsfunktion p_τ(n) gibt dabei die relativen Häufigkeiten an, mit der verschiedene Werte für die Anzahl n an Emissionen in einem Zeitintervall mit der Binzeit τ als Intervallbreite detektiert wurden. Für jede Binzeit τ wird somit eine Verteilungsfunktion p_τ(n) ermittelt. Aus der Verteilungsfunktion p_τ(n) werden die Momente m Mess / i,τ als Kenngrößen der Verteilungsfunktion p_τ(n) auf herkömmliche Weise ermittelt. Hieraus werden binzeitabhängige Momentenfunktionen m Mess / i (τ) dargestellt, wobei die Momentenfunktionen m Mess / i (τ) über die einzelnen Punkte m Mess / i,τ an den jeweiligen Binzeiten τ gebildet werden. Beispielsweise wird die erste Momentenfunktion m Mess / 1 (τ) über die ersten Momente m Mess / 1,τ der Verteilungsfunktionen p_τ(n) zu den jeweiligen Binzeiten τ dargestellt. Dies gilt entsprechend für höhere Momentenfunktionen betreffend höhere Momente, die aus entsprechend höheren Momenten der Verteilungsfunktionen p_τ(n) für verschiedene Binzeiten τ dargestellt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Analyse der in dem Messzeitraum ermittelten Messdaten bzw. der in dem Messzeitraum ermittelten Emissionen auf Basis eines Messdatensatzes, der die Momentenfunktionen m Mess / i (τ) umfasst. Die Auswertung des Datensatzes umfasst erfindungsgemäß einen numerischen Abgleich einer theoretischen Signalfunktion umfassend Momente m sig / i (τ) einer theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) mit einer Messwertfunktion umfassend die Momentenfunktion m Mess / i (τ), womit Konstanten, die die Teilchen in dem System charakterisieren und in P_sig(n, τ) enthalten sind, ermittelt werden. Messwertfunktion und theoretische Signalfunktion umfassen m Mess / i (τ) bzw. m sig / i (τ) in dem Sinne, dass die Messwertfunktion über eine Funktion umfassend m Mess / i (τ) und die Signalfunktion über eine Funktion umfassend m sig / i (τ) darstellbar sind. Der Messdatensatz kann ferner den zeitaufgelöst ermittelten Verlauf der Anzahl n über den Messzeitraum, sowie die daraus errechneten p_τ(n) umfassen. Damit enthält der Messdatensatz eine so umfassende Information über die Messergebnisse, dass eine umfassende Charakterisierung und Quantifizierung der Teilchen in dem System möglich ist.
Der Auswertung kann eine theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) des Systems zugrunde gelegt werden, die so definiert wird, dass sie die Parameter umfasst, die von der Binzeit τ unabhängig sind. Ausgehend von theoretischen Formulierungen, die beispielsweise aus dem FCS- oder dem PCH-Verfahren bekannt sind, kann der Fachmann ohne Weiteres einen Ausdruck für P_sig(n, τ) angeben.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden bei der Formulierung der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) folgende Annahmen gemacht:
Für ein Teilchen der Spezies j wird eine bestimmte lokale Detektionsrate μ_j(r →) = μ_0,jf(r →) angenommen. Es wird angenommen, dass diese lokale Detektionsrate μ_j(r →) für jedes Teilchen der Spezies j gültig ist. Für ein System, in dem Teilchen unterschiedlicher Spezies enthalten sind, wird für eine jede Spezies eine charakteristische bestimmte lokale Detektionsrate angenommen, beispielsweise für die Spezies b die lokale Detektionsrate μ_b(r →) = μ_0,bf(r →).
Im Folgenden wird die bestimmte lokale Detektionsrate μ_j(r →) der Spezies j näher erläutert. Die Erläuterungen sind auf die bestimmten lokalen Detektionsraten anderer Spezies, die in dem System enthalten sein können, analog anzuwenden. Der Parameter μ_0,j stellt eine charakteristische Detektionshelligkeit eines Teilchens der Spezies j dar. Der Parameter μ_0,j ist somit eine Konstante, in der charakteristische Eigenschaften eines Teilchens der Spezies j sowie der Messapparatur enthalten sind. Beispielsweise sind in der Konstanten μ_0,j Eigenschaften des Teilchens der Spezies j wie etwa der Wirkungsquerschnitt oder die Quanteneffizienz eines solchen Teilchens enthalten. Außerdem sind in μ_0,j apparative Größen wie etwa die Quanteneffizienz des Detektors oder, falls anwendbar, die maximale Anregungsrate, mit der die Teilchen in dem System zur Emission angeregt werden, enthalten. Die Funktion f(r →) stellt die Ortsabhängigkeit der lokalen Detektionsrate dar. Je nachdem, an welchem Ort sich ein Teilchen in dem zu vermessenden System befindet, ändert sich die lokale Detektionsrate. In der Funktion f(r) können beispielsweise die ortsabhängigen Eigenschaften des in der Messapparatur verwendeten Linsensystems und/oder die ortsabhängigen Eigenschaften des Anregungsprofils, wie etwa die ortsabhängige Intensitätsverteilung der Abbildung eines Lasers in das System, enthalten sein. Die Funktion f(r →) kann beispielsweise über die normalisierte Point-Spread-Function des Messapparatur über die Gleichung
gegeben sein. Dabei stellt R den Raum dar, in dem sich ein Teilchen der Spezies j während der Messung theoretisch befinden kann. Die Formulierung der normalisierten Point-Spread-Function für eine Messapparatur ist hinreichend bekannt und kann von dem Fachmann für die jeweils verwendete Messapparatur ausgeführt werden.
Ferner wird angenommen, dass ein jedes Teilchen der Spezies j eine bestimmte lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit und eine bestimmte lokale Emissionswahrscheinlichkeit aufweist. Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein System mit verschiedenen Spezies wird für jede Spezies eine speziestypische bestimmte lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit und eine speziestypische bestimmte lokale Emissionswahrscheinlichkeit der Teilchen einer jeden Spezies angenommen. Die lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit stellt die Wahrscheinlichkeit dar, mit der sich ein Teilchen an einem bestimmten Ort befindet. Die lokale Emissionswahrscheinlichkeit stellt die Wahrscheinlichkeit dar, mit der ein Teilchen ein Emittend emittiert. Je nach Art der Emission und je nach den Randbedingungen der Messapparatur kann der Fachmann eine geeignete bekannte Wahrscheinlichkeitsverteilung für die anzunehmende bestimmte lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit und für die anzunehmende bestimmte lokale Emissionswahrscheinlichkeit der Teilchen einer Spezies auswählen und für die Formulierung der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) annehmen.
Ferner wird für die Formulierung von P_sig(n, τ) angenommen, dass sich die Teilchen in einem bestimmten Messvolumen V befinden müssen, damit Emissionen der Teilchen detektiert werden können. Beispielsweise kann das Messvolumen V als über das Abbildungsvolumen eines Anregungslasers in dem System bestimmt angenommen werden, wenn die Emission der Teilchen auf einer Anregung durch einen Laser beruht und nur durch einen Laser angeregte Teilchen Emittenden emittieren können. Beispielsweise kann das Messvolumen V auch durch eine über die Messapparatur festgelegte Volumenbegrenzung bestimmt sein. Beispielsweise kann eine solche Beschränkung die rein geometrische äußere Beschränkung, wie etwa eine Umwandung, des Systems sein. Beispielsweise kann eine solche Beschränkung aufgrund der Optik, mit der Emissionen der Teilchen auf den Detektor projiziert werden, vorgegeben sein.
Die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ), die auf Basis der genannten Annahmen definiert wird, umfasst als binzeitunabhängige Parameter die lokale Detektionsrate μ_j(r →), eine Partialkonzentration c_j und eine Zerfallszeit ϑ_j der Teilchenspezies j. Darüber hinaus umfasst die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) des Systems das Rauschverhalten der Messapparatur. Das Rauschverhalten der Messapparatur kann zeitlich konstant angenommen werden oder auch als zeitabhängige bzw. zeitvariable, insbesondere statistisch verteilte Größe. Bei der Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) kann auch angenommen werden, dass das Rauschverhalten der Messapparatur vernachlässigt werden kann. Auch hierüber umfasst die definierte theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) das Rauschverhalten der Messapparatur. Bei Anwendung des Verfahrens auf ein System, in dem verschiedene Teilchenspezies erwartet werden, umfasst die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) des Systems entsprechende binzeitunabhängige Parameter für jede der Teilchenspezies.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden nach der Definition der Signalverteilung P_sig(n, τ) auf herkömmliche Weise Momente m sig / i (τ) ermittelt. Beispielsweise können das erste Moment m sig / 1 (τ) und das zweite Moment m sig / 2 (τ) der Signalverteilung P_sig(n, τ) ermittelt werden. Ferner wird eine theoretische Signalfunktion definiert, die zumindest eines der ermittelten Momente m sig / i (τ) umfasst, sowie eine Messwertfunktion, die zumindest eine der ermittelten Momentenfunktionen m Mess / i (τ) umfasst. Über einen numerischen Abgleich der theoretischen Signalfunktion mit der Messwertfunktion werden dann zumindest Konstanten betreffend zumindest die Parameter μ_0,j und ϑ_j ermittelt. Dies bedeutet, dass zumindest μ_0,j und ϑ_j aus den Konstanten direkt berechnet werden können. Insbesondere bei der Auswertung bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein System mit s verschiedenen Teilchenspezies können aus dem numerischen Abgleich auch Konstanten betreffend die s verschiedenen Partialkonzentrationen c_j, c_j+1...c_j+s-1 ermittelt werden.
Beispielsweise kann die theoretische Signalfunktion dieselben K-ten Momente m sig / K (τ) wie entsprechend die Messwertfunktion über m Mess / K (τ) aufweisen. Um hierfür ein Beispiel zu nennen: Beispielsweise kann die theoretische Signalfunktion m sig / 1 (τ), m sig / 2 (τ) und m sig / 3 (τ) und die Messwertfunktion m Mess / 1 (τ), m Mess / 2 (τ) und m Mess / 3 (τ) umfassen. Insbesondere können die theoretische Signalfunktion und die Messwertfunktion jeweils nur dieselben K-ten Momente aufweisen. Dabei weist die theoretische Signalfunktion nur solche K-ten Momente m sig / K (τ) auf, die entsprechend als m Mess / K in der Messwertfunktion enthalten sind, und umgekehrt. Insbesondere können die K-ten Momente m sig / K (τ) in der theoretischen Signalfunktion zueinander in demselben funktionalen Verhältnis stehen wie die entsprechenden K-ten Momente m Mess / K (τ) in der Messwertfunktion zueinander.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist für eine Analyse von einem jedweden System geeignet, das Teilchen zumindest einer Spezies umfasst, die bestimmte Emittenden emittieren. Solche Emittenden können beispielsweise Photonen sein, beispielsweise aber auch α-Teilchen oder Gammastrahlung. Je nach Art der Emittenden und Charakter der Teilchen kann eine Anregung von außen erforderlich oder nicht notwendig sein.
Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt die grundlegende Erkenntnis zugrunde, dass in den binzeitabhängigen Momentenfunktionen m Mess / i (τ) sowohl Informationen über die absolute Anzahl der detektierten Emissionen als auch über das zeitabhängige Verhalten der Teilchen enthalten sind. Über die Definition der Messwertfunktion umfassend Momentenfunktionen m Mess / i (τ) wird somit eine Funktion bereitgestellt, die auf Messwerten basiert, mittels der eine umfassende und detaillierte Analyse des Systems bzw. der Teilchen in dem System möglich ist. Aufgrund dieser Erkenntnis schlägt die Erfindung die Variation der Binzeit τ, das Ermitteln der Verteilungsfunktion p_τ(n) für jede Binzeit τ, das Ermitteln der Momente m Mess / i,τ für jede Binzeit τ und das Ermitteln der binzeitabhängigen Momentenfunktionen m Mess / i (τ) vor.
Ferner beruht das erfindungsgemäße Verfahren auf der Erkenntnis, dass über einen numerischen Abgleich der Messwertfunktion mit einer theoretischen Signalfunktion, die Momente m sig / i (τ) der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) umfasst, Konstanten ermittelt werden können, die binzeitunabhängig sind und die die Teilchen in dem System und die Konzentration der Teilchen in dem System charakterisieren. Die Konstanten betreffen in einer Ausführungsform zumindest die Parameter μ_0,j und ϑ_j, insbesondere auch c_j, insbesondere c_j der verschiedenen Spezies bei Vorliegen eines Systems mit mehreren Spezies. Die Konstanten können beispielsweise mit μ_0,j, c_j und/oder ϑ_j identisch sein. Beispielsweise können μ_0,j, c_j und/oder ϑ_j in jeweils einer Konstanten enthalten sein, beispielsweise können sie in den Konstanten in einem mathematischen Verhältnis zu konstanten Werten, beispielsweise Zahlen, stehen. Insbesondere kann ϑ_j mehrere Komponenten umfassen, die jeweils getrennt voneinander über den numerischen Abgleich zu ermitteln sind, beispielsweise für jede Raumdimension eine eigene Zerfallskomponente ϑ_j,x, ϑ_j,y, ϑ_j,z. Beispielsweise kann die theoretische Signalfunktion für jede der Zerfallskomponenten eine die jeweilige Zerfallskomponente betreffende Konstante umfassen.
Die binzeitunabhängigen Parameter werden über einen numerischen Abgleich der theoretischen Signalfunktion mit der Messwertfunktion ermittelt. Der numerische Abgleich erfolgt rechnergesteuert, wobei die in der theoretischen Signalfunktion enthaltenen Konstanten umfassend die binzeitunabhängigen Parameter μ_0,j und ϑ_j und insbesondere c_j während des numerischen Abgleichs so eingestellt werden, dass sich der funktionale Verlauf der theoretischen Signalfunktion an den funktionalen Verlauf der Messwertfunktion anpasst. Der Fachmann kann somit unter Berücksichtigung der vorgenannten Annahmen eine theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) zur Bestimmung der theoretischen Signalfunktion im Hinblick auf einen Kompromiss definieren, der keine zu hohe Rechenleistung erfordert und dennoch eine hinreichend genaue Angabe der relevanten Konstanten, insbesondere der Parameter u_0,j, c_j und ϑ_j ermöglicht.
Über die vorgenannten Annahmen ist der Fachmann in die Lage versetzt, eine theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) für das System zu definieren. Die bestimmte lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit gibt die Wahrscheinlichkeit an, ein Teilchen der Spezies j zu einem bestimmten Zeitpunkt t an einem bestimmten Ort r → aufzufinden. Entsprechend kann die bestimmte lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit über die Funktion ψ(r →, t) angegeben werden. Die Funktion ψ(r →, t) kann der Fachmann über die Randbedingungen der Messapparatur und der Messumgebung festlegen. Hierfür können etwa die rein räumliche Begrenzung des Systems und/oder der Transport der Teilchen bzw. die Bewegung der Teilchen im System, beispielsweise ob eine freie, stochastische Diffusion oder ein fluidischer Transport vorliegt, relevant sein. Beispielsweise kann für den Fall einer Diffusion die lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit über die bekannte homogene Transportgleichung festgelegt werden, wobei für ψ(r →, t|r →₀, t₀) unter der Annahme, dass sich das Teilchen zum Zeitpunkt t₀ am Ort r →₀ befindet, angenommen werden kann:
Der Fachmann kann entsprechende bestimmte lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeiten für andere Messapparaturen mit anderen Messumgebungen, die andere Randwerte für die τ(r →, t|r →₀t₀)-Bestimmung vorgeben, festlegen, insbesondere für den Fall eines fluidischen Massentransports der Teilchen in dem System.
Für die Annahme der bestimmten lokalen Emissionswahrscheinlichkeit ist die Art des Emissionsprozesses der Teilchen relevant. Der Emissionsprozess kann beispielsweise von der inneren Struktur der Teilchen und/oder der Wechselwirkung der Teilchen mit einem Anregungsfeld abhängen. Die innere Struktur kann beispielsweise die emissionserzeugenden Übergänge in den Teilchen betreffen. Beispielsweise kann für den Fall einer Emission von Photonen häufig die bestimmte lokale Emissionswahrscheinlichkeit über eine Poisson-Verteilung angenähert werden. Je nach Art der Emittenden kann der Fachmann auf bekannte lokale Emissionswahrscheinlichkeiten zurückgreifen, um die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) zu definieren.
Wie oben erläutert kann der Fachmann über eine bekannte Point-Spread-Function der Messapparatur ebenfalls ohne Weiteres eine Funktion f(r →) angeben, um die bestimmte lokale Detektionsrate μ_j(r →) für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) festzulegen.
Der Erfindung liegt somit auch die Erkenntnis zugrunde, dass eine theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) definiert werden kann, indem eine bestimmte lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit definiert wird, über die festgelegt ist, mit welcher Wahrscheinlichkeit ein Teilchen zum Zeitpunkt t am Ort r → anzutreffen ist, indem eine bestimmte lokale Emissionswahrscheinlichkeit festgelegt wird, die angibt, mit welcher Wahrscheinlichkeit ein Teilchen an dem Ort r → einen Emittenden emittiert, indem eine bestimmte lokale Detektionsrate μ_j(r →) festgelegt wird, die charakteristische Helligkeitseigenschaften des Teilchens und Detektionseigenschaften der Messapparatur berücksichtigt, und indem ein bestimmtes Messvolumen V angenommen wird, in dem sich ein Teilchen befinden muss, damit Emissionen des Teilchens detektiert werden können.
Über die genannten Annahmen ist der Fachmann in der Lage, über herkömmliche Verfahren eine theoretische Signalverteilung zu ermitteln. Hierbei kann der Fachmann beispielsweise im Fall der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein System mit Teilchen, die Photonen als Emittenden emittieren, für die theoretische Signalverteilung eine funktionale Abhängigkeit annehmen, wie sie in der Entwicklung des PCH-Verfahrens angenommen wird (siehe hierzu Chen Y. et al., Biophysical Journal, 77, 553–567, 1999 und die in der Literatur bekannten weiteren Entwicklungen des PCH-Verfahrens). Beispielweise kann der Fachmann für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) für ein System mit nur einer Emittenden emittierenden Spezies j unter der Annahme, dass sich nur ein Teilchen im Messvolumen befindet, die einfache funktionale Abhängigkeit annehmen, dass
wobei E_j(n, t) die bestimmte lokale Emissionswahrscheinlichkeit der Teilchen der Spezies j angibt und wobei die Zerfallszeit ϑ_j bei der Formulierung von ψ_j(r, t) berücksichtigt wird. ϑ_j kann beispielsweise eine mittlere Reaktionszeit angeben, während der ein Teilchen der Spezies j in dem System so reagiert, dass es keine Emittenden mehr emittieren kann. ϑ_j kann beispielsweise die Durchtrittszeit eines Teilchens der Spezies j durch das Messvolumen V angeben. ϑ_j kann beispielsweise die Halbwertszeit für den Zerfall eines Teilchens der Spezies j angeben. Beispielsweise kann bei der Formulierung dieser Signalverteilung für ein zu beobachtendes Teilchen das Rauschverhalten der Detektoreinheit berücksichtigt werden über:
Dabei kann über R(n, t) das Rauschverhalten der Messapparatur berücksichtigt sein. Beispielsweise kann aus solchen P 1 / sig (n, τ) für ein Teilchen die Signalverteilung für ein System mit beliebig vielen m Teilchen über eine m-fache Faltung von P 1 / sig (n, τ) und unter Berücksichtigung der Wahrscheinlichkeit, m Teilchen im Messvolumen anzutreffen, formuliert werden über:
Beispielsweise kann erst an dieser Stelle das Detektorrauschen berücksichtigt werden über:
Der Fachmann kann bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auch andere funktionale Zusammenhänge unter Berücksichtigung der erfindungsgemäßen Annahmen zur Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) annehmen. Insbesondere kann der Fachmann hierfür annehmen, dass mit den genannten Annahmen eine Funktion aufzustellen ist, die zur Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) über das bestimmte Messvolumen V und anschließend über das Zeitintervall der Binzeit τ zu integrieren ist. Die Ermittlung der Momente m sig / i (τ) der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) kann dann aufgrund herkömmlicher mathematischer Umformungen oder algorithmischer Mehrungen durchgeführt werden.
Für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) werden die lokale Detektionsrate μ_j(r →), die bestimmte lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit und die bestimmte lokale Emissionswahrscheinlichkeit für jede Spezies getrennt festgelegt. Zumindest einige der genannten Funktionen können jedoch auch als für jede Spezies identisch festgelegt werden. Insbesondere kann die bestimmte lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit und die bestimmte lokale Emissionswahrscheinlichkeit als für jede Spezies identisch festgelegt werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein System mit s verschiedenen Teilchenspezies für jede Teilchenspezies eine eigene theoretische Speziessignalverteilung P j / sig (n, τ) ermittelt, wobei die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) des Systems durch die s + 1-fache Faltung der s verschiedenen Signalverteilungen P j / sig (n, τ) der s verschiedenen Spezies und eine Rauschsignalverteilung P_noise(n, τ) ermittelt wird. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Rauschsignalverteilung P_noise(n, τ) vernachlässigt werden, so dass die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) des Systems durch die s-fache Faltung der s verschiedenen Signalverteilungen P j / sig (n, τ) definiert werden kann. Die genannte vorteilhafte Ausführungsform ermöglicht das verhältnismäßig einfache Aufstellen von theoretischen Speziessignalverteilungen P j / sig (n, τ) für jede einzelne Spezies getrennt, wonach über die Faltung der s theoretischen Speziessignalverteilungen eine konkrete Angabe der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) des gesamten Systems umfassend die Teilchen der s verschiedenen Spezies erfolgen kann.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das für die Definition von P_sig(n, τ) verwendete Messvolumen V über ein binzeitabhängiges, fiktiv eingeführtes effektives Volumen V_eff,j(τ) definiert. Dabei wird V_eff,j(τ) darüber definiert, dass per Definition von jedem Teilchen der Spezies j, das sich in dem Volumen τV_eff,j(τ) befindet, in der Binzeit τ zumindest eine Emission detektiert wird und das Teilchen das Volumen τV_eff,j(τ) während der Binzeit τ nicht verlässt, wobei per Definition die mittlere Anzahl der Teilchen der Spezies j im Volumen τV_eff,j(τ) durch eine mittlere Besetzungsanzahl ω_j(τ) mit ω_j(τ) = c_jV_eff,j(τ)τ bestimmt ist.
Dabei ist zu berücksichtigen, dass das effektive Volumen V_eff,j(τ) kein durch die Messapparatur räumlich begrenztes Volumen darstellt. Vielmehr ist das effektive Volumen V_eff,j(τ) ein binzeitabhängiges, über ein Gedankenexperiment eingeführtes Mittel, um die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) zu vereinfachen. Denn mit der Einführung des effektiven Volumens geht die Annahme einher, dass die Wahrscheinlichkeit, ein Teilchen, von dem eine Emission in der Binzeit τ detektiert wird, in dem über das fiktiv eingeführte effektive Volumen definierte Volumen τV_eff,j(τ) aufzufinden, den Wert 1 hat. Entsprechend kann über die Einführung des effektiven Volumens bei der Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) über sämtliche, aus dem Volumen τV_eff,j(τ) emittierten Emissionen summiert werden, indem die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) auf das Volumen τV_eff,j(τ) normiert wird. Eine solche Summation kann beispielsweise über eine Ortsintegration über das Volumen τV_eff,j(τ) realisiert werden. Der funktionale Zusammenhang, über den eine solche räumlich Ortsintegration durchgeführt werden kann zur Bestimmung der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) kann beispielsweise die bestimmte lokale Detektionsrate μ_j(r →), die lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit und die lokale Emissionswahrscheinlichkeit umfassen. Mit Hilfe der Definition der mittleren Besetzungszahl ω_j(τ) = c_jV_eff,j(τ)τ ist zudem das effektive Volumen V_eff,j(τ) in Abhängigkeit von der Besetzungsanzahl ω_j(τ), der Konzentration c_j und der Binzeit τ ausdrückbar, so dass das effektive Volumen V_eff,j(τ) auf Größen rückführbar ist, die über die ermittelten Messdaten, nämlich die Messwertfunktion, bestimmbar sind. Die Einführung des effektiven Volumens erlaubt eine Normierung von P_sig(n, τ) bzw. von P_sig(n, τ) konstituierenden Funktionen, wie etwa die Signalverteilung für ein einzelnes Teilchen, auf τV_eff,j(τ). Erfindungsgemäß stellt die Berücksichtigung der Definition von V_eff,j(τ) und die entsprechende Normierung von P_sig(n, τ) insbesondere deshalb eine vorteilhafte Ausführungsform dar, da eine entsprechende Ortsintegration räumlich unbegrenzt durchführbar ist, ohne zu divergenten Ausdrücken zu führen, wodurch die Integration vereinfacht wird, P_sig(n, τ) einfacher darstellbar wird und damit der numerische Abgleich einfacher und präziser durchführbar wird.
Die Einführung des effektiven Volumens V_eff,j für eine Teilchenspezies j kann somit über mathematische Umformungen, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind, bei der Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) berücksichtigt werden. Dabei ist insbesondere zu berücksichtigen, dass das effektive Volumen V_eff,j(τ), wie aus der Definition ω_j(τ) = c_jV_eff,j(τ) ersichtlich, alleine für die Spezies j eingeführt wird, und dass für jede Spezies ein eigenes effektives Volumen einzuführen ist. Entsprechend kann es für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) des Systems vorteilhaft und einfacher sein, zunächst theoretische Signalverteilungen P j / sig (n, τ) für jede Teilchenspezies zu ermitteln unter Annahme eines effektiven Volumens V_eff,j(τ) für jede Teilchenspezies, und anschließend aus diesen theoretischen Speziessignalverteilungen P j / sig (n, τ) die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) für das System zu ermitteln.
Insbesondere kann für die Verteilung der Besetzungsanzahl, d. h. für die Verteilung der Anzahl der Teilchen der Spezies j in dem effektiven Volumen V_eff,j(τ), eine Poisson-Verteilung angenommen werden. Die Wahrscheinlichkeit, dass m Teilchen der Spezies j innerhalb der Binzeit τ das effektive Volumen V_eff,j(τ) besetzen, kann somit durch die Poisson-Verteilung
gegeben sein. In anderen Ausführungsformen können auch andere Verteilungen der Besetzungsanzahl angenommen werden, je nach zu analysierendem System.
Insbesondere kann für die Bestimmung der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) angenommen werden, dass die lokale Emissionswahrscheinlichkeit der Teilchen gemäß einer Poisson-Verteilung verteilt ist.
Über die Annahme bestimmter Wahrscheinlichkeitsverteilungen, insbesondere über die Annahme der poissonischen Verteilung der Besetzungszahl in dem effektiven Volumen und über die Annahme der poissonischen Verteilung der lokalen Emissionswahrscheinlichkeit, lässt sich die Formulierung der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) weiter vereinfachen, was zu einem einfachen numerischen Abgleich und damit zu einer Vereinfachung des erfindungsgemäßen Verfahrens führen kann. Die Annahmen können über mathematische Umformungen, mit denen der Fachmann hinreichend vertraut ist, bei der Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eingearbeitet werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform werden der binzeitabhängige Mittelwert n (τ) und die binzeitabhängige Varianz σ²(τ) aus den Verteilungsfunktionen p_τ(n) für jede Binzeit τ ermittelt, wobei die Messwertfunktion so definiert wird, dass sie n (τ) und σ²(τ) umfasst. Für den Fachmann ist verständlich, dass dies damit gleichzusetzen ist, dass für jede Binzeit τ das erste Moment m Mess / 1,τ und das zweite Moment m Mess / 2,τ der Verteilungsfunktion p_τ(n) ermittelt werden, woraus die binzeitabhängigen Momentenfunktionen m Mess / 1 (τ) und m Mess / 2 (τ) dargestellt werden, da aus m Mess / 1 (τ) und m Mess / 2 (τ) n (τ) und σ²(τ) eindeutig errechnet werden können und umgekehrt. Entsprechend bedeutet die Definition der Messwertfunktion als m Mess / i (τ) umfassend, dass die Messwertfunktion Funktionen von τ enthält, die eindeutig in zumindest ein m Mess / i (τ ) oder in eine Funktion, die aus mehreren m Mess / i (τ) zusammengesetzt ist, umgewandelt werden kann. Erfindungsgemäß können auch solche Funktion anstelle der m Mess / i (τ) aus dem P_τ(n) ermittelt werden. Indem die Messwertfunktion so definiert wird, dass sie n (τ) und σ²(τ) umfasst, kann der Ausdruck der Messwertfunktion einfach gehalten werden und dennoch gleichzeitig gewährleistet sein, dass über den numerischen Abgleich zwischen der Messwertfunktion und der theoretischen Signalfunktion eine hinreichend präzise Ermittlung der relevanten Parameter möglich ist. Dies beruht auf der Erkenntnis, dass in n (τ) und σ²(τ) eine ausreichende Menge an Information über die während des Messzeitraums erhaltenen Messdaten enthalten sind, um eine hinreichend genaue Quantifizierung und Charakterisierung der Teilchen in dem System zu gewährleisten.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird als Messwertfunktion
festgelegt, wobei der numerische Abgleich über die Relation
durchgeführt wird, wobei m sig / 1 (τ) das erste Moment und m sig / 2 (τ) das zweite Moment von P_sig(n, τ) darstellt. Die Varianz σ²(τ) und der Mittelwert n (τ) lassen sich bekanntermaßen über m Mess / 1 (τ) und m Mess / 2 (τ) ermitteln. Dieser vorteilhaften Ausführungsform liegt die Erkenntnis zugrunde, dass der numerische Abgleich zwischen der entsprechend definierten Messwertfunktion und der entsprechend definierten theoretischen Signalfunktion für eine Vielzahl an Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders einfach durchführbar ist, dass über den entsprechend numerischen Abgleich mit verhältnismäßig geringem Aufwand eine sehr genaue Angabe für die binzeitunabhängigen Parameter μ_0,j, c_j und ϑ_j möglich ist und dass die Auswertung der gewonnenen Messdaten wegen der Beschränkung auf Betrachtung von ersten und zweiten Momenten der theoretischen Signalfunktion und der Verteilungsfunktionen p_τ(n) der Aufwand bei der Auswertung geringgehalten werden kann.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bei der Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eine mittlere lokale Detektionsrate μ _1,j der Spezies j über das Integral
über einen, insbesondere unbegrenzten Raum R festgelegt und als binzeitunabhängiger Parameter in die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) eingeführt. Der Raum R kann beispielsweise das Messvolumen sein. Bei entsprechender Wahl der lokalen Aufenthaltswahrscheinlichkeit kann der Raum beispielsweise unbegrenzt sein. Die mittlere lokale Detektionsrate μ _1,j ist dabei eine binzeitunabhängige Konstante. Aufgrund der Relation μ _j(r →) = μ_0,jf(r →) ist in μ _1,j die charakteristische Detektionshelligkeit μ_0,j enthalten. Über die Einführung von μ _1,j in der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) kann somit bei einem numerischen Abgleich zwischen der theoretischen Signalfunktion und der Messwertfunktion die Konstante μ _1,j ermittelt werden, die den Parameter μ_0,j betrifft. Die mittlere lokale Detektionsrate μ _1,j entspricht gemäß ihrer Definition der über den bei der Messung verwendeten Detektor ermittelbaren Detektionsrate eines hypothetischen Teilchens der Spezies j, das während der Messung zu jedem Zeitpunkt mit seiner teilchenspezifischen über das räumliche Volumen aufsummierten charakteristischen Rate Emittenden emittiert. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass mit der Einführung der mittleren lokalen Detektionsrate μ _1,j die Formulierung der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) stark vereinfacht werden kann. Dies ermöglicht einen einfacheren numerischen Abgleich zwischen Messwertfunktion und theoretischer Signalfunktion. Für den Fall einer Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein System mit s verschiedenen Spezies an Teilchen kann für jede der s Spezies eine entsprechende mittlere lokale Detektionsrate μ _1,s festgelegt werden. Der vorteilhaften Ausführungsform liegt der Ansatz zugrunde, den Ausdruck für die theoretische Signalverteilung zu vereinfachen, indem die ortsabhängige Funktion μ_j(r →) mittels einer räumlich summarischen Betrachtung durch eine binzeitabhängige Konstante μ _1,j ersetzt wird, die über den numerischen Abgleich gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelt werden kann und die Konstante μ_0,j umfasst.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform zeichnet sich dadurch aus, dass bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf einen stochastischen Transport der Teilchen für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eine mittlere detektierte Emissionsanzahl eines einzelnen Teilchens der Spezies j festgelegt wird auf
Bei der Anwendung des Verfahrens auf einen deterministischen Transport der Teilchen wird für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eine mittlere detektierte Emissionsanzahl eines einzelnen Teilchens der Spezies j festgelegt auf
Dabei kann R jeweils je nach Vorgehensweise bei der Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) einen bestimmten Raum darstellen, wie beispielsweise ein begrenztes Messvolumen, oder beispielsweise einen unbegrenzten Raum. Insbesondere kann eine Integration über einen unbegrenzten Raum Vorteile mit sich bringen, da die Integrale leichter analytisch ausführbar sind. Beispielsweise kann die Integration über einen unbegrenzten Raum erfolgen, wenn gleichzeitig für die Definition von P_sig(n, τ) für das verwendete Messvolumen V das oben erläuterte binzeitabhängige, fiktive effektive Volumen V_eff,j(τ) eingeführt wird und entsprechend bei der Definition berücksichtigt wird.
Die Einführung der mittleren detektierten Emissionsanzahl ϕ_1,j(τ) ermöglicht eine noch weitere Vereinfachung bei der Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ). Mit Hilfe von ϕ_1,j(τ) kann nämlich unter Annahme einer bestimmten Verteilung der Emissionsereignisse für Teilchen der Spezies j auf einfache Art und Weise direkt die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) formuliert werden. Die hierfür zu wählende Verteilung hängt von der Art der Teilchen der Spezies j und von den zu emittierenden Emittenden ab. Für eine solche Verteilung kann beispielsweise eine Binomialverteilung, eine Gaußverteilung oder eine Poisson-Verteilung, je nach Anwendungsbereich des erfindungsgemäßen Verfahrens, angenommen werden. Besonders einfach ist die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) bei Anwendung der genannten Ausführungsform auf ein System mit nur einer Emittenden emittierenden Spezies j. Das Verfahren kann jedoch analog auch für Systeme mit s verschiedenen Spezies von emittierenden Teilchen angewandt werden.
Beispielsweise kann bei der Annahme einer poissonischen Verteilung der Emissionsereignisse bei der Spezies j formuliert werden:
für n = 0, 1, ....
In einer Ausführungsform wird für den numerischen Abgleich als Messwertfunktion
angesetzt, wobei σ²(τ) und n (τ) auf herkömmliche Weise ermittelt werden können, wobei der numerische Abgleich über die Relation
erfolgt. Dabei wird das erfindungsgemäße Verfahren auf ein System angewandt, in dem von s verschiedene Teilchenspezies ausgegangen wird, wobei das Rauschverhalten der Messapparatur über die Rauschkonstante λ berücksichtigt wird. Mit Hilfe dieses funktionalen Ausdrucks kann bei Einsetzen eines entsprechenden ϕ_1,j(τ) für die Teilchen der Spezies j für jede der s verschiedenen Teilchenspezies der numerische Abgleich unmittelbar und einfach durchgeführt werden. Bei dieser Ausführungsform wird somit für die theoretische Signalfunktion der Ausdruck
definiert. Die Ausführungsform beruht auf den erläuterten erfindungsgemäßen Annahmen zur Definition der theoretischen Signalverteilung. Der in der Ausführungsform angewandte funktionale Zusammenhang zwischen Messwertfunktion und theoretischer Signalfunktion zur Durchführung des numerischen Abgleichs beruht neben den erfindungsgemäßen Annahmen auf herkömmlichen mathematischen Umformungen, die durch Einführung zusätzlicher Annahmen, die in diese Ausführungsform der Erfindung zur Formulierung eines möglichst einfachen Ausdrucks für den numerischen Abgleich eingeführt werden. Es hat sich herausgestellt, dass mit dem genannten funktionalen Zusammenhang zwischen Messwertfunktion und theoretischer Signalfunktion eine besonders einfache, schnelle und genaue Ermittlung der die binzeitunabhängigen Parameter μ_0,j, ϑ_j und insbesondere c_j betreffenden Konstanten möglich ist. Insbesondere hat sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, zur Definition von P_sig(n, τ), auf der diese Ausführungsform beruht, zusätzlich die Definition des effektiven Volumens einzuführen und analog zur Bestimmung von μ _1,j die Integration über den unbegrenzten Raum auszuführen. Dadurch können charakteristische Teilcheneigenschaften, wie etwa die Diffusionskonstante von Teilchen oder die Zerfallszeit von Teilchen und die Konzentration einer Teilchenspezies in dem System einfach und genau über den numerischen Abgleich bestimmt werden.
Insbesondere kann bei der Anwendung des Verfahrens auf ein System mit nur der Teilchenspezies j als einziger die Emittenden emittierende Spezies der numerische Abgleich über die Relation Q(τ) = ϕ_1,j(τ) erfolgen. Dies ermöglicht eine besonders einfache Ermittlung der Konstanten betreffend die binzeitunabhängigen Parameter μ_0,j, ϑ_j und insbesondere c_j.
In einer Ausführungsform wird für die lokale Detektionsrate μ_j(r →) eine Gaußfunktion mit
mit den Konstanten a_xy und a_z angenommen. Somit ist die Ortsabhängigkeit der lokalen Detektionsrate μ_j(r →) über eine Gaußfunktion dargestellt. Die angegebene Gleichung für μ_j(r →) ist eine Möglichkeit, μ_j(r →) für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) darzustellen. x, y und z stellen die Ortskoordinaten des Raumvektors r → dar. Die Annahme einer entsprechenden lokalen Abhängigkeit von μ_j(r →) ist beispielsweise im Falle der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein System, in dem die zu analysierenden Teilchen Photonen als Emittenden emittieren und zur Emission mittels 1-Photonenanregung angeregt werden, eine Näherung, die sehr gute Ergebnisse für das erfindungsgemäße Verfahren liefert. Je nach Anwendungsbereich können auch andere Ortsabhängigkeiten für die Definition von P_sig(n, τ) angenommen werden. Beispielsweise können entsprechende, bekannte Ortsabhängigkeiten der Emission für den Fall der Anwendung des Verfahrens auf ein System mit Photonen emittierenden Teilchen, das durch zwei Photonenanregungen angeregt wird, und für die Anwendung des Verfahrens auf eine Messung per STED-Mikroskopie angewendet werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Anwendung des Verfahrens auf ein System, in dem die zu analysierenden Teilchen einem fluidischen Transport mit der Transportgeschwindigkeit ν unterliegen, wird für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eine mittlere detektierte Emissionsanzahl eines einzelnen Teilchens der Spezies j festgelegt auf
Dabei sind ϑ_j, a und ν binzeitunabhängige Konstanten. Die Zerfallszeit ϑ_j lässt sich dabei in Abhängigkeit von ν und a ausdrücken über:
In diesem Sinne gibt ϑ_j die über √ 2 reduzierte Zeit an, mit der ein Teilchen die Strecke a in Transportrichtung zurücklegt. Die Zerfallszeit ϑ_j kann in diesem Fall beispielsweise als eine Zeit interpretiert werden, die die Zeit charakterisiert, in der ein Teilchen der Spezies j sich innerhalb des Volumens befindet, von dem aus das Teilchen Emittenden so emittieren kann, dass sie von einem Detektor detektiert werden können. Die Strecke a kann beispielsweise durch die Optik einer Messapparatur, die die Emittenden aus dem Messvolumen auf den Detektor projiziert, festgelegt sein. Über ϑ_j kann beispielsweise die Transporteigenschaft von Teilchen der Spezies j in dem System charakterisiert werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Anwendung des Verfahrens auf ein System, in dem die zu analysierenden Teilchen einem Diffusionstransport mit sphärischer Messsymmetrie unterliegen, d. h. die lokale Abhängigkeit der lokalen Detektionsrate im Messvolumen ist sphärisch symmetrisch, wird für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eine mittlere detektierte Emissionsanzahl eines einzelnen Teilchens z der Spezies j festgelegt auf
Der Diffusionstransport kann dabei beispielsweise als isotroper Zerfall von Teilchen interpretiert werden, die vor dem Zerfall während der Messung Emittenden emittieren und nach dem Zerfall keine Emittenden emittieren können. Beispielsweise kann der Diffusionstransport als ein Massentransport über Diffusion von Teilchen interpretiert werden, wobei von den Teilchen nur dann Emittenden detektiert werden können, wenn sie sich in einem bestimmten Messvolumen befinden. Je nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine entsprechende Interpretation des Diffusionstransports und entsprechend eine an der Anwendung orientierte Interpretation von ϑ_j notwendig. In dem ersten angeführten Beispiel kann ϑ_j beispielsweise die Zeit charakterisieren, innerhalb der Teilchen der Spezies j zerfallen. Bei dem zweiten angegebenen Beispiel kann ϑ_j die Zeit charakterisieren, die Teilchen der Spezies j zum Durchtreten des Messvolumens benötigen. In diesem Fall kann ϑ_j beispielsweise bei einem sphärisch symmetrischen Messvolumen über
beschrieben werden, wobei a den Durchmesser des Messvolumens und D_j die Diffusionskonstante von Teilchen der Spezies j in dem System angibt.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Anwendung des Verfahrens auf ein System, in dem die zu analysierenden Teilchen einem Diffusionstransport mit rotationsellipsoidischer Messsymmetrie unterliegen, d. h. durch die Messapparatur ist eine rotationsellipsoidische Symmetrie der räumlichen Detektionsratenabhängigkeit im Messvolumen festgelegt, kann für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eine mittlere detektierte Emissionsanzahl eines einzelnen Teilchens z der Spezies j festgelegt werden auf
Dabei stellen ϑ_j,xy und ϑ_j,z Zerfallszeiten für Teilchen der Spezies j dar, die von der Zerfallszeit ϑ_j umfasst sind. Wie oben erläutert kann der Diffusionstransport je nach Anwendung des Verfahrens unterschiedlich interpretiert werden. Bei der Interpretation des Diffusionstransports als einen tatsächlichen Massentransport der zu analysierenden Teilchen in dem System, wie oben erläutert, können im Fall der rotationsellipsoidischen Symmetrie der räumlichen Detektionsratenabhängigkeit im Messvolumen ϑ_j,xy, und ϑ_j,z über
beschrieben werden, wobei entsprechend a_xy und a_z Konstanten sind, die das Messvolumen beschreiben, und D_j die Diffusionskonstante von Teilchen der Spezies j in dem System darstellt.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und unter Bezugnahme auf die 1 bis 9 näher beschrieben.
Es zeigen:
1: die gemäß einem Ausführungsbeispiel zur Ermittlung von P_sig(n, τ) angenommene Einzelmolekülverteilung;
2: die gemäß einer Ausführungsform ermittelte theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) als Funktion der Binzeit für verschiedene Werte von n;
3: in einer Prinzipdarstellung den schematischen Aufbau einer Messapparatur;
4: eine graphische Darstellung des Ergebnisses des numerischen Abgleichs gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
5: eine graphische Darstellung des numerischen Abgleichs gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform;
6: eine graphische Darstellung der Ergebnisse des numerischen Abgleichs einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform;
7: eine graphische Darstellung der charakteristischen Daten, die aus dem numerischen Abgleich bei der Ausführungsform nach 6 gewonnen wurden;
8: eine graphische Darstellung der Ergebnisse des numerischen Abgleichs gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform;
9: eine graphische Darstellung der aus dem Abgleich gemäß 8 gewonnenen charakteristischen Daten;
Wie erläutert kann der Fachmann über herkömmliche mathematische, analytische und numerische Mittel eine theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) definieren, über die dann gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren der numerische Abgleich zur Ermittlung der das System bzw. die Teilchen spezifizierenden Daten möglich ist. Anhand eines Ausführungsbeispiels wird im Folgenden beispielhaft aufgezeigt, wie ein Fachmann über erfindungsgemäße Annahmen eine theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) definieren kann. Hierfür wird zugrunde gelegt, dass das Verfahren auf ein System angewandt wird, in dem Teilchen zu analysieren sind, deren lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit und deren lokale Emissionswahrscheinlichkeit über eine Poisson-Verteilung angenähert werden kann.
Bei der erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die oben erläuterte Definition des effektiven Volumens V_eff,j(τ) angewandt. Zudem wird zur Vereinfachung der Formulierung von P_sig(n, τ) die oben eingeführte mittlere detektierte Emissionsanzahl eines einzelnen Teilchens der Spezies j ϕ_1,j(τ) eingeführt.
Alleine über die Normierung der Poisson-Verteilung kann formuliert werden:
Über
kann dieser Ausdruck umgeformt werden zu:
Mit Hilfe der mathematischen Umformung einer Multiplikation dieser Gleichung mit dem Faktor
erhält man:
. Über diese Umformungen kann ein Ausdruck formuliert werden, für dessen Summanden das Volumenintegral existiert.
Insbesondere kann der Term
in einer Reihe entwickelt werden. Erfindungsgemäß wird angenommen, dass die Integration in die Summe gezogen werden kann. Der Ausdruck
kann zur Vereinfachung abgekürzt werden. An dieser Stelle kann dieser Ausdruck als effektives Volumen definiert werden, so dass gilt:
Somit gilt:
Mit Hilfe der Definition des effektiven Volumens, wonach ein jedes Teilchen, das sich in dem Volumen τV_eff,j(τ) befindet, einen Emittenden emittiert, der detektiert wird, woraus sich ergibt, dass die Wahrscheinlichkeit, dass ein Teilchen, das sich in diesem Volumen befindet, nicht emittiert, gleich 0 ist, ergibt sich für die Signalverteilung eines einzelnen Teilchens der Spezies j:
Aufgrund der Normierungseigenschaften der Poisson-Verteilung durch das effektive Volumen weist diese Signalverteilung eines einzelnen Teilchens automatisch das richtige Normierungsverhalten auf. In 1 sind die sich aus der Verteilung für ein einzelnes Teilchen der Spezies j ergebenden Wahrscheinlichkeiten als Funktion der Binzeit τ für n = 1, 2 und 3 dargestellt. Wie zu erwarten ergibt sich:
Denn jedes Teilchen, das sich in dem über das effektive Volumen definierten Volumen befindet, emittiert zumindest einen detektierten Emittend und für
also für eine gegen 0 gehende Binzeit, kann ein Teilchen keine zwei Emittenden emittieren. Mit zunehmender Binzeit τ ist ein Abfall der Wahrscheinlichkeit P_1,j(n = 1, τ) in dem Maße zu beobachten, wie die Wahrscheinlichkeiten P_1,j(n ≥ 1, τ) zunehmen. Dies ist intuitiv unmittelbar zu verstehen, da mit zunehmender Binzeit τ zu erwarten ist, dass auch mehrere von einem Teilchen emittierten Emittenden detektiert werden. Für sehr große Binzeiten weisen die einzelnen Wahrscheinlichkeiten ein stationäres Verhalten auf. Dies hängt damit zusammen, dass die Teilchen mit zunehmender Binzeit aus dem Messvolumen driften oder aus anderen Gründen, wie beispielsweise Zerfallsgründen, keine weiteren Emittenden emittieren können.
Wenn von einem Teilchen zum Zeitpunkt t₀ ein Emittend detektiert wird, besetzt es gemäß der in dem Ausführungsbeispiel eingeführten Definition des effektiven Volumens V_eff,j(τ) das Volumen τV_eff,j(τ). Somit ist die Anzahl m der Teilchen, die innerhalb der Binzeit τ das Volumen τV_eff,j(τ) besetzen, selbst ein Zufallsprozess. Gemäß der Definition von V_eff,j(τ) gilt: ω_j(τ) = c_jV_eff,j(τ)τ. Die Besetzungswahrscheinlichkeit χ_j(m, ω_j(τ)) kann somit in dem beschriebenen Ausführungsbeispiel unter Annahme einer Poisson-Verteilung für die Besetzungswahrscheinlichkeit χ angegeben werden durch:
Wie erläutert kann der Fachmann auf einfache Weise über die erfindungsgemäßen Annahmen mit Hilfe von mathematischen Umformungen und Vereinfachungen zu der Verteilung P_1,j(n, τ) gelangen, die die Wahrscheinlichkeit angibt, innerhalb einer Binzeit τ n Emissionen von einem einzigen Teilchen der Spezies j, das sich in dem fiktiven Volumen τV_eff,j(τ) befindet, zu detektieren. Ein entsprechendes P_1,j(n, τ) kann beispielsweise wie in dem gezeigten Ausführungsbeispiel ermittelt werden, selbstverständlich sind jedoch auch andere mathematische Umformungen und Vereinfachungen möglich, um zu einem möglichst einfachen und dennoch möglichst exakten Ausdruck für P_1,j(n, τ) zu gelangen.
In dem beschrieben Ausführungsbespiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) über die Bestimmung von P_1,j(n, τ) als Hilfsgröße ermittelt. Selbstverständlich sind auch andere Wege zur Bestimmung von P_sig(n, τ) möglich. Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wird P_sig(n, τ) über P_1,j(n, τ) über die Annahme definiert, dass in dem zu beobachtenden System in dem Volumen τV_eff,j(τ), von dem aus Teilchen Emittenden emittieren können, die detektiert werden können, m Teilchen enthalten sind, die während der Messung Emittenden emittieren. Unter der Voraussetzung der stochastischen Unabhängigkeit der Emissionsvorgänge der m verschiedenen Teilchen in dem Volumen τV_eff,j(τ) kann die Verteilung der Anzahl der von den m Teilchen detektierten Emittenden durch die m-fache Faltung dargestellt werden
wobei m > 1 ist.
Entsprechend kann die theoretische Signalverteilung P_sig,m(n > 0, τ), die die Signalverteilung angibt, wobei angenommen wird, dass m Teilchen in dem Volumen τV_eff,j(τ) sind und zumindest ein Photon detektiert wird, angegeben werden mit:
Für die vollständige Darstellung von P_sig(n, τ) ist zu berücksichtigen, dass sich die Anzahl m der Teilchen, die sich in dem durch das effektive Volumen bestimmten Volumen befinden und somit zu der während der Binzeit gemessenen Anzahl an Emissionen beitragen, eine statistische Größe ist, für die eine bestimmte Wahrscheinlichkeitsverteilung angenommen werden muss. Wie oben erläutert kann die mittlere Besetzungszahl, d. h. der Mittelwert für m, angegeben werden durch: ω_j(τ) = c_jV_eff,j(τ)τ. Für die festzulegende Wahrscheinlichkeitsverteilung der Besetzungszahl ist eine an das Verhalten der Teilchen in dem zu analysierenden System orientierte Auswahl einer bekannten Wahrscheinlichkeitsverteilung vorzunehmen. In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wird eine poissonische Verteilung der Besetzungsanzahl angenommen. Damit gilt für die Wahrscheinlichkeitsverteilung der Besetzungsanzahl m für Teilchen der Spezies
Damit kann die theoretische Signalverteilung für ein System mit nur einer Emittenden emittierenden Teilchenspezies j definiert werden über:
Für die vollständige Beschreibung der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) ist ferner der Wert von P_sig(n = 0, τ) zu bestimmen. Gemäß der Definition des effektiven Volumens ist die Wahrscheinlichkeit, dass in einem Messzeitraum kein Emittend detektiert wird und somit n = 0 ist, identisch mit der Wahrscheinlichkeit, dass sich kein emittierendes Teilchen während des Messzeitraums in dem Volumen τV_eff,j(τ) befindet. Somit gilt:
Damit gilt
Wie in dem beschriebenen Ausführungsbeispiel ersichtlich, erleichtert die Einführung des effektiven Volumens bei der Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) erheblich die mathematischen Umformungen, um mit Hilfe der erfindungsgemäßen Annahmen zu einem Ausdruck P_sig(n, τ) zu gelangen.
Mit Hilfe der Wahrscheinlichkeitserzeugenden Funktion kann dieser Ausdruck für die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) umgewandelt werden in eine Rekursionsformel:
Beispielhaft lassen sich hieraus die Werte für P_sig(n, τ) für n = 0, 1, 2 und 3 wie folgt berechnen:
P_sig(n, τ) stellt somit die Summe aus den kombinatorischen Möglichkeiten dar, n Emittenden zu detektieren, wobei die Beiträge der Signalverteilung für von einem einzigen Teilchen emittierte Emittenden dabei jeweils mit einem entsprechenden Produkt der Besetzungszahl gewichtet sind.
In 2 ist P_sig(n, τ) für n = 0, 1, 2 und 3 in Abhängigkeit von τ graphisch dargestellt. Aus 2 ist ersichtlich, dass mit zunehmender Binzeit die Wahrscheinlichkeit, mehr Emittenden zu detektieren, zunimmt. Entsprechend ist aus 2 ersichtlich, dass die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) mit dem zu erwartenden Messergebnis korrespondiert.
Aus der genannten Rekursionsformel für P_sig(n, τ) können auf herkömmliche Weise die Momente m sig / i (τ) von P_sig(n, τ) ermittelt werden. Eine solche herkömmliche Ermittlung der Momente m sig / i (τ) ist beispielsweise in der Dissertation „Die Einzelmolekülverteilung in Fluoreszenz-Fluktuations-Experimenten", B. Greiner, Dortmund, 2007 beschrieben. Da die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) wie jede Wahrscheinlichkeitsverteilung auf 1 normiert ist, ergibt sich für das 0 te Moment:
Über die herkömmliche Berechnung ergibt sich für die weiteren Momente:
wobei m 1 / l,j das l te Moment der Signalverteilung für ein einzelnes Teilchen der Spezies j darstellt.
Die Momente m 1 / k,j können über die charakteristische Funktion φ(t) der Signalverteilung eines einzelnen Teilchens der Spezies j P_1,j(n, τ) berechnet werden, wobei die herkömmliche Definition von φ(t) und herkömmliche mathematische Umformungen angewendet werden können. Mit
ergibt sich
Aus der charakteristischen Funktion lassen sich bekanntermaßen die Momente m 1 / k,j für beliebige Ordnungen k berechnen über
wobei S(k, l) konstante Koeffizienten darstellen, nämlich Stirling-Zahlen zweiter Art, die häufig bei kombinatorischen Problemen auftreten. Sie beschreiben die Anzahl unterschiedlicher Möglichkeiten, eine Permutation aus k Elementen in l Zyklen zu zerlegen.
Unter Berücksichtigung dieser so bestimmten Momente m 1 / k,j können die k ten Momente m sig / k werden als:
Daraus sind sämtliche Momente berechenbar. Beispielsweise können das erste und das zweite Moment angegeben werden mit m sig / 1 = c_j μ _1,jτ m sig / 2 = c_j μ _1,jτ(1 + c_j μ _1,jτ + ϕ_1,j(τ)).
Daraus lassen sich bekanntermaßen Mittelwert n und Varianz σ² berechnen über: n _sig = m sig / 1 = c_j μ _1,jτ
Dieses Ergebnis ist konform mit den Erwartungen für die Signalverteilung für ein System mit nur einer Teilchenspezies j. Der Mittelwert der Signalverteilung entspricht der über das gesamte Volumen aufsummierten Rate eines einzelnen Teilchens der Spezies j mal der Binzeit τ und der Teilchendichte c_j. Die Varianz weicht um den Faktor 1 + ϕ_1,j von dem Erwartungswert ab, so dass die Signalverteilung nicht poissionisch ist.
Die theoretische Signalfunktion lässt sich beispielsweise aus n _sig und σ 2 / sig bestimmen über die Definition der theoretischen Signalfunktion über Q_sig mit
Diese als Q_sig definierte theoretische Signalfunktion ist identisch mit dem bekannten Mandelschen Q-Faktor. Über die zu dem beschriebenen Ausführungsbeispiel eingeführte Definition von ϕ_1,j(τ) kann mit einer entsprechenden Messwertfunktion unmittelbar der numerische Abgleich zur Ermittlung von die Teilchen charakterisierenden Konstanten, insbesondere die Ermittlung von ϑ_j, c_j und μ_0,j bzw. μ _1,j ermittelt werden.
Wie an dem gezeigten Ausführungsbeispiel dargelegt lassen sich mit den erfindungsgemäßen Annahmen P_sig(n, τ) sowie die Momente m Mess / i (τ) bestimmen, woraus eine theoretische Signalfunktion für den numerischen Abgleich formuliert werden kann. In dem obengenannten Ausführungsbeispiel wurde dies für ein System, in dem nur eine Teilchenspezies j von emittierenden Teilchen erwartet wird, beispielhaft durchgeführt. Selbstverständlich sind auch andere mathematische Umformungen und Zwischenannahmen bzw. Zwischendefinitionen möglich, um zu einem Ausdruck für P_sig(n, τ) sowie m sig / i (τ) zu gelangen.
Die Definition gemäß dem obengenannten Ausführungsbeispiel für ein System mit nur einer Teilchenspezies j lässt sich analog für die Definition von P_sig(n, τ) für ein System mit s verschiedenen Teilchenspezies gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung weiterführen. Hierfür sind verschiedene Berechnungsmethoden anwendbar. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wird vereinfacht angenommen, dass in dem System die Teilchen der verschiedenen Spezies frei und unbeeinflusst in dem System diffundieren können, wobei die innerhalb eines Zeitraums detektierte Anzahl n von Emittenden sich zusammensetzt aus den Beiträgen n_l, die von den Teilchen der verschiedenen s Spezies herrühren. Entsprechend kann n definiert werden über:
wobei n_noise Detektionen berücksichtigt, die von dem Rauschen der Messapparatur herrühren. Das Rauschen kann beispielsweise ein Detektorrauschen und/oder ein durch eine Anregungsquelle induziertes Rauschen umfassen. In dem Ausführungsbeispiel wird angenommen, dass für jede Anzahl n_l eine Wahrscheinlichkeit gemäß der Speziessignalverteilung für die Spezies l P l / sig (n, τ) angegeben werden kann. Unter der Voraussetzung der stochastischen Unabhängigkeit kann somit die Gemisch-Wahrscheinlichkeit des Systems mit s verschiedenen Teilchenspezies durch die s-fache Faltung der s verschiedenen Signalverteilungen P l / sig (n, τ) sowie der Rauschsignalverteilung P_noise(n, τ) dargestellt werden über: P_sig(n, τ) = (P 1 / sig ⊗ ... ⊗ P s / sig ⊗ P_noise)(n, τ).
In einem ersten Ausführungsbeispiel wird das Rauschverhalten und somit der Beitrag n_noise vernachlässigt, so dass P_sig(n, τ) über die s-fache Faltung der Speziessignalverteilungen P l / sig (n, τ) definiert werden kann.
Wie zum ersten Ausführungsbeispiel betreffend ein System mit nur einer Teilchenspezies j ausgeführt können zur Berechnung von P_sig(n, τ) in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel dieselben Rechentechniken angewandt werden, wobei analog über die Wahrscheinlichkeitserzeugende Funktion φ(t) ein rekursiver Ausdruck für P_sig(n > 0, τ) angegeben werden kann, wobei die Wahrscheinlichkeit P_sig(n = 0, τ) durch das s-fache Produkt der l verschiedenen Speziessignalverteilungen P l / sig (n = 0, τ) berechnet werden kann. Somit kann P_sig(n, τ) in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel für ein System mit s verschiedenen Spezies angegeben werden über:
, wobei P_1,l(v, τ) die Wahrscheinlichkeit angibt, mit der von einem einzigen Teilchen der Spezies l in der Binzeit τ ν Emissionen detektiert werden. Beispielhaft kann für ein System mit zwei verschiedenen Spezies (s = 2) angegeben werden: P_sig(0, τ) = e^{–(ω₁(τ)+ω₂(τ))} P_sig(1, τ) = e^{–(ω₁(τ)+ω₂(τ))}(ω₁(τ)P_1,1(1, τ) + ω₂(τ)P_1,2(1, τ)), wobei ω₁(τ) bzw. ω₂(τ) die mittlere Besetzungsanzahl für die Spezies 1 bzw. 2 angibt, und wobei P_1,1 bzw. P_1,2 die Wahrscheinlichkeitsverteilung für die Anzahl der Emissionen in der Binzeit τ für ein Teilchen der Spezies 1 bzw. der Spezies 2 darstellen.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Rauschsignalverteilung berücksichtigt werden über eine Faltung der Rauschsignalverteilung mit der wie oben erläuterten Signalverteilung P_sig des Systems mit s verschiedenen Spezies. Unter Annahme eines poissonischen Rauschens, das häufig zutrifft und deshalb herkömmlicherweise oft bei der Näherung eines Rauschverhaltens angenommen wird, wobei die Rauschsignalverteilung über
gilt, kann gemäß diesem Ausführungsbeispiel für ein System mit s verschiedenen Spezies unter Berücksichtigung der Rauschsignalverteilung ebenfalls ein rekursiver Ausdruck für die Signalverteilung P_sig(n, τ) formuliert werden über:
Über diese Rekursionsformel für P_sig(n, τ) für die theoretische Signalverteilung für ein System mit s verschiedenen Spezies unter Berücksichtigung der Rauschsignalverteilung P_noise(n, τ) unter der Annahme eines poissonischen Rauschens können die Momente m sig / i (τ) analog zu der oben geschilderten Berechnung betreffend ein System mit nur einer Spezies j ermittelt werden. Über die Anwendung der genannten üblichen Rechentechniken können die Momente m sig / i angegeben werden als:
Wie auch in dem obengenannten Beispiel betreffend ein System mit nur einer Teilchenspezies j kann auch für das System mit s verschiedenen Teilchenspezies die theoretische Signalfunktion über
angegeben werden, woraus sich bei dem Einsetzen der entsprechenden Größen, wie oben dargelegt, ergibt:
Diese theoretische Signalfunktion kann somit zur Charakterisierung eines Systems mit s verschiedenen Teilchenspezies unmittelbar zum numerischen Abgleich mit einer entsprechenden Messwertfunktion herangezogen werden. Wie erläutert liegt diesem Ausführungsbeispiel die Annahme zugrunde, dass sich das Rauschen der Messapparatur als poissonisches Rauschen darstellen lässt mit der Rate λ. In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung kann das poissonische Rauschen vernachlässigt werden, indem λ = 0 gesetzt wird. Ein solches Ausführungsbeispiel kann insbesondere dann sehr gut angenäherte Ergebnisse für die zu bestimmenden Konstanten liefern, wenn das Signal-Rauschverhältnis groß ist.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird die Messwertfunktion auf den Ausdruck
festgelegt, wobei der numerische Abgleich über die Relation
durchgeführt wird, wobei σ²(τ) die Varianz und n (τ) der Mittelwert der zur Binzeit τ gemessenen Anzahl an detektierten Emissionen darstellt. Es hat sich herausgestellt, dass sich dadurch besonders einfach und besonders genau die zu ermittelnden Konstanten zur Charakterisierung der Teilchen in dem System bzw. zur Charakterisierung des Systems errechnet werden können. Die Ermittlung der entsprechenden Konstanten über die Vermessung eines Systems mit Emittenden emittierenden Teilchen und die Auswertung der Messergebnisse wird im Folgenden anhand mehrerer Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt.
Bei den beschriebenen Ausführungsbeispielen wird die Messung zur Detektion der Emissionen der Teilchen in dem zu beobachtenden System mittels einer wie in 3 dargestellten Messapparatur durchgeführt. Bei der beschriebenen Ausführungsform handelt es sich um die Quantifizierung und Charakterisierung von Teilchen in dem System, die Photonen als Emittenden emittieren. Zur Durchführung der Messung wird dabei eine Lichtquelle 2 zur Anregung der Teilchen in dem System benötigt. Die Teilchen emittieren nach ihrer Anregung Photonen, wobei die Emissionsereignisse statistisch verteilt sind. Dabei handelt es sich vorliegend um eine Messapparatur zur 1-Photonen-Anregung.
Bei der Messapparatur wird als Lichtquelle 2 ein Laser verwendet. Das von der Lichtquelle 2 emittierte Licht wird über eine Beleuchtungsoptik 3 gebündelt, über einen Anregungsfilter 4 gefiltert und über einen dichroitischen Spiegel 5 zu einem Objektiv 6 umgelenkt, wobei das Objektiv 6 das von der Lichtquelle 2 emittierte Licht in die Probenebene 100 bündelt. Die Probe 1 mit dem zu analysierenden System befindet sich dergestalt in dem Fokus des Objektivs 6 der Messapparatur, dass das von der Lichtquelle 2 emittierte Licht in der Probe 1 mit dem System auf sein in der Messapparatur kleinstes Volumen gebündelt ist. In dem dargestellten Ausführungsbeispiel beträgt das Volumen, auf das das von der Lichtquelle 2 emittierte Licht in der Probe 1 gebündelt ist, 0,5 fl.
Durch das Licht der Lichtquelle 2 werden die Teilchen in der Probe 1 zur Emission von Photonen angeregt. Die von den Teilchen in der Probe 1 emittierten Photonen werden von dem Objektiv 6 gebündelt und gelangen durch den dichroitischen Spiegel 5 und einen Emissionsfilter 7, der Laserlicht aus dem Strahlengang herausfiltert, zur Tubuslinse 8. Die Tubuslinse 8 bündelt den durch die emittierten Photonen gebildeten Lichtstrahl, der durch ein extrem kleines Pinhole 9 zur Detektionseinheit 10 gelangt. Die beschriebene Messapparatur ist so ausgebildet, dass sie die Detektion einzelner, von den Teilchen in der Probe 1 emittierter Photonen ermöglicht. Die an die Detektionseinheit 10 angeschlossene Daten-Sampling-Einheit 11 gewährleistet eine zeitaufgelöste Detektion. Dies bedeutet, dass mittels der Daten-Sampling-Einheit 11 aufgenommen wird, zu welchem Zeitpunkt Photonen in der Detektionseinheit jeweils detektiert wurden. Ein Rechner 12 ermöglicht dann die Auswertung der über die Daten-Sampling-Einheit 11 über die Zeit skaliert erfassten Detektionen von Photonen.
Die Detektionseinheit 10 umfasst ein Zählwerk, das zur Detektion einzelner Photonen geeignet ist. In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel werden hierfür Avalanche-Photodioden eingesetzt. Bei Detektion eines Photons wird von der Detektionseinheit 10 ein Ausgangsimpuls an die Daten-Sampling-Einheit 11 ausgegeben, der dort mit einem Zeitstempel versehen wird und auf einem Datenträger in dem Rechner 12 gespeichert wird. In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel umfasst die Daten-Sampling-Einheit eine FPGA-Karte, die die zeitaufgelöste Speicherung der Photonendetektionen ermöglicht.
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wird die Messung während eines Messzeitraums T durchgeführt. In dem Rechner 12 werden die detektierten Emissionen über den gesamten Messzeitraum T zeitaufgelöst gespeichert. Danach werden zur Auswertung verschiedene Intervallbreiten τ festgelegt. Für jede Binzeit τ wird der Messzeitraum T in A = T / τ mit A ∊ |N eingeteilt. Für jede Binzeit τ wird für jedes der A Zeitintervalle die Anzahl n der in dem Zeitintervall detektierten Photonen ermittelt. Aus der Anzahl der Intervalle a(n), die n Photonen enthalten, werden die relativen Häufigkeiten p_τ(n, τ) = a(n) / A für jede Binzeit τ als Funktion von n bestimmt. Diese relativen Häufigkeiten können bei Annahme eines hinreichend großen A als Wahrscheinlichkeiten interpretiert werden, n Photonen innerhalb der Binzeit τ zu detektieren. Aus diesen p_τ(n) können dann die Momente m Mess / i (τ) ermittelt werden. In dem Ausführungsbeispiel geschieht dies über:
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wird als Messwertfunktion die Funktion
Der numerische Abgleich erfolgt in dem dargestellten Ausführungsbeispiel über die Relation
Somit erfolgt der numerische Abgleich über eine theoretische Signalfunktion und eine Messwertfunktion, die jeweils entsprechend dieselben Momente mit jeweils derselben funktionalen Relation zueinander umfassen. In den 4 und 5 ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Analyse eines Systems dargestellt, in dem die Teilchen einem fluidischen Massentransport unterliegen. In 4 sind die Ergebnisse von Messung und Auswertung zu einem System dargestellt, in dem sich nur Teilchen einer Spezies befinden. In 4 sind Messpunkte von zwei verschiedenen Messungen dargestellt. Bei beiden Messungen war die chemische Zusammensetzung des Systems jeweils identisch. Die beiden Messungen unterscheiden sich in der Geschwindigkeit des fluidischen Massentransports, dem die Teilchen in dem System während der Messung unterlagen. In 4 sind die durch die Messung ermittelten Messwerte von μ(τ) als Messpunkte eingezeichnet. Die Messpunkte mit quadratischer Form resultieren aus der ersten Messung, während der eine fluidische Transportgeschwindigkeit ν₁ in dem System vorherrschte. Die Messpunkte mit Kreisform resultieren aus einer zweiten Messung, während der eine fluidische Transportgeschwindigkeit ν₂ in dem System vorherrschte. Über die jeweiligen Messwerte der ersten Messung bzw. der zweiten Messung werden die Funktionen μ(τ) für die erste bzw. für die zweite Messung gebildet. Die durchgezogenen Linien in 4 stellen die theoretische Signalfunktionen dar, nachdem über den numerischen Abgleich zwischen der genannten Relation die Konstanten der theoretischen Signalfunktion bestimmt wurden. Aus 4 ist deutlich erkennbar, dass der Verlauf der theoretischen Signalfunktion sehr gut mit dem Verlauf der Messwerte für μ(τ) übereinstimmt.
Die Kostanten der theoretischen Signalfunktion wurden in dem dargestellten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens über einen numerischen Abgleich ermittelt, dem folgende Überlegung zugrunde liegt: Für die lokale Detektionsrate μ_j(r →) der in dem System enthaltenen Spezies j wurde eine Ortsabhängigkeit angenommen gemäß einer zentralsymmetrischen Gaußfunktion über:
Daraus ergibt sich für
Bei der Einführung der oben beschriebenen mittleren Photonenanzahl ϕ_1,j(τ) eines einzelnen Teilchens ergibt sich für ϕ_1,j(τ) im Falle des vorliegenden deterministischen, fluidischen Transports:
Dabei wurde angenommen, dass sich das betrachtete Teilchen der Spezies j in dem System zum Zeitpunkt t = t₀ am Ort r → = r →₀ befindet, so dass die Aufenthaltswahrscheinlichkeit für das Teilchen mit der Diracschen-Delta-Funktion δ(r → – r →₀) angegeben werden konnte. Zudem wurde die Zerfallszeit ϑ_j mit
eingeführt. Außerdem wurde angenommen, dass der fluidische Fluss in z Richtung erfolgt, so dass ein Transport der Teilchen nur in z Richtung angenommen wird. Während das Integral über den unbegrenzten Raum über x₀ und y₀ ausgeführt werden konnte, ist das Integral über z₀ analytisch nicht ausführbar. Dies wird in dem gezeigten Ausführungsbeispiel über eine numerische Rechnung bei dem numerischen Abgleich direkt durchgeführt. Beruhend auf den genannten Annahmen und Umformungen wird in dem dargestellten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel der numerische Abgleich über die Relation
durchgeführt.
Aus der bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendeten theoretischen Signalfunktion ist erkennbar, dass in der theoretischen Signalfunktion bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein System mit nur einer emittierenden Spezies j die Konzentration c_j der Spezies in dem System nicht als Konstante enthalten ist. Die einzigen Konstanten, die bei dem numerischen Abgleich zu ermitteln sind, sind μ₀, ν und a, wobei ϑ_j wie oben ausgeführt in Abhängigkeit von a und ν ausgedrückt werden kann.
Der numerische Abgleich kann durch eine Grenzwertbetrachtung vereinfacht werden. Bei der Grenzwertbetrachten
ergibt sich:
Über die beschriebene Limes-Betrachtung und den beschriebenen numerischen Abgleich kann aus 4 mit Hilfe der genannten Relation zwischen der Messwertfunktion μ(τ) und der genannten theoretischen Signalfunktion μ_0,j, a, ν₁ und ν₂ mit folgenden Werten ermittelt werden: μ_0,j = 50 kcps (kilo counts per second) a = 1·10^–6 m ν₁ = 0,042 m/s ν₂ = 0,021 m/s.
Aus 4 ist ersichtlich, dass die Messwertfunktion für beide Messungen zu demselben Grenzwert
verlaufen.
Dies ergibt sich aus dem obengenannten daraus, dass der Grenzwert von der Geschwindigkeit des fluidischen Massentransports der Teilchen in dem System während der Messung unabhängig ist. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand von Systemen, die mit vorbekannten Parametern, insbesondere einer vorbekannten Geschwindigkeit und einer vorbekannten Detektionsrate der Teilchen vorbereitet wurden, hat gezeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren mit verhältnismäßig geringem Rechenaufwand sehr präzise Angaben zur Charakterisierung der Teilchen (in Bezug auf μ_0,j) und in Bezug auf das zeitabhängige Verhalten der Teilchen in dem System (ν, ϑ_j) liefert.
Insbesondere ist aus 4 erkennbar, dass die theoretische Signalfunktion sehr gut mit der Messwertfunktion übereinstimmt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann wie in dem vorangegangenen Ausführungsbeispiel zum fluidischen Massentransport in einem System mit nur einer emittierenden Teilchenspezies j analog auf ein System mit Teilchen verschiedener Spezies angewandt werden, wie in 5 dargestellt. In 5 sind analog zu 4 Messwerte aus fünf verschiedenen Messungen sowie die über den numerischen Abgleich modellierten theoretischen Signalfunktionen zu den entsprechenden fünf verschiedenen Messungen graphisch dargestellt. Wie in 4, so ist auch in 5 die Detektionsrate μ(τ) als Messwertfunktion über einzelne Messpunkte der jeweiligen Messungen dargestellt. Bei den Messungen unterlagen die Teilchen jeweils derselben Geschwindigkeit des fluidischen Transports. Bei sämtlichen Messungen enthält das analysierte System Teilchen von eine oder zwei von zwei für sämtliche Messungen festgelegten Spezies. Zwischen den jeweiligen Messungen unterscheidet sich das System in der Zusammensetzung bzw. in den Konzentrationen der Teilchenspezies. Jede der Teilchenspezies weist eine unterschiedliche charakteristische Detektionshelligkeit μ_0,j auf. Analog zu dem in 4 dargestellten Ausführungsbeispiel wurde die theoretische Signalverteilung zum numerischen Abgleich gemäß 5 gebildet durch die Funktion
wobei, wie oben ausgeführt, über die Vernachlässigung des Rauschens diese Funktion in dem Ausführungsbeispiel definiert wurde als
mit den Teilchenspezies 1 und 2. Die Berechnung bzw. die Ausführung dieser Gleichung wird mathematisch wie oben zu dem Ausführungsbeispiel gemäß 4 durchgeführt. Dabei wird für den numerischen Abgleich angesetzt:
mit
Über den numerischen Abgleich lassen sich die Konstanten μ_0,1, μ_0,2, ν und a (und hierüber
wie folgt bestimmen:
Für sämtliche Messungen wurde μ_0,1 = 1·10⁴ kcps, μ_0,2 = 3·10⁴ kcps, a = 1·10^–6 m und ν = 0,42 m/s ermittelt. Weiter wurde ermittelt:
erste Messung: c₁ = 5·10^–10 M; c₂ = 0
zweite Messung: c₂ = 5·10^–10 M; c₁ = 0
dritte Messung: c₁ = 5·10^–10 M; c₂ = 1,0·10^–9 M
vierte Messung: c₁ = 5·10^–10 M; c₂ = 5·10^–10 M
fünfte Messung: c₁ = 5·10¹⁰ M; c₂ = 2,5·10^–10 M.
In den 6 bis 9 werden Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand weiterer Ausführungsbeispiele für die Anwendung auf Systeme beschrieben, bei denen die Teilchen in dem System einem Diffusionstransport unterliegen. Beispielhaft wird bei den gezeigten Ausführungsbeispielen jeweils von denselben oben demonstrierten mathematischen Umformungen und Definitionen ausgegangen. Selbstverständlich kann ein entsprechender numerischer Abgleich zwischen Messwertfunktion und Signalfunktion auch über andere mathematische Wege erfolgen.
Wie bei den Beispielen zu 4 und 5 ist auch zu den Beispielen gemäß den 6 bis 9 die lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit ψ(r →, t|r →₀, t₀) zu ermitteln. Im Fall des fluidischen Transports bei 4 und 5 wurde diese Wahrscheinlichkeitsverteilung mit der Diracschen Deltafunktion angenähert. Diese Annäherung ist für den Fall eines Diffusionstransports nicht anwendbar. Stattdessen wird in dem gezeigten Ausführungsbeispiel die Aufenthaltswahrscheinlichkeit ψ(r →, t|r →₀, t₀) definiert durch: ∂ / ∂t ψ(r →, t|r →₀, t₀) = DΔψ(r →, t|r →₀t₀). Bekanntermaßen stellt diese Gleichung die Einstein-Diffusionsgleichung dar. Weiterhin ist bekanntermaßen die Greensche Funktion
eine Lösung dieser Gleichung mit den Anfangs- und Randbedingungen ψ(r →, t → t₀|r →₀, t₀) = δ(r → – r →₀), ψ(|r →| → ∞, t|r →₀, t₀) = 0. Somit wird dieser Ausdruck für die lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit ψ(r →, t|r →₀, t₀) für die Spezies j angenommen.
In einem graphisch nicht dargestellten Ausführungsbeispiel kann von einer sphärischen Messsymmetrie, d. h. von einer sphärischen Symmetrie der räumlichen Detektionsratenabhängigkeit im Messvolumen ausgegangen werden. Bei dem Ausführungsbeispiel wird ein System mit nur einer emittierenden Spezies j, die Photonen emittiert, analysiert. Dabei wird eine Ortsabhängigkeit der Detektionsrate μ(r →₀) wie in dem in 4 und 5 beschriebenen Ausführungsbeispiel angenommen mit
Über die lokale Aufenthaltswahrscheinlichkeit ψ_j(r →, t|r →₀, t₀) kann somit analog die Funktion ϕ_1,j(τ) angegeben werden mit:

woraus sich über
der numerische Abgleich durchführen lässt.
Dabei wurde zur mathematischen Umformung β(t) eingeführt mit
Über entsprechende Grenzwertbetrachtung lässt sich wieder bilden:
und
Bei der Anwendung des Verfahrens in den Ausführungsform gemäß den 6 bis 9 wird eine rotationsellipsoidische Symmetrie der räumlichen Detektionsratenabhängigkeit im Messvolumen vorausgesetzt. Entsprechend muss eine andere Ortsabhängigkeit bei der lokalen Detektionsrate μ_j(r →) zugrunde gelegt werden. In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel, bei dem ein System mittels einer 1-Photonenanregung angeregt wird, kann hierfür die Ortsabhängigkeit über eine Gaußfunktion nach
berücksichtigt werden. Zur Bestimmung von ϕ_1,j(τ) lässt sich mit dieser Annahme bestimmen:
mit den charakteristischen Zerfallszeiten
und
Ferner kann μ _1,j angegeben werden mit:
Daraus ergibt sich durch Einsetzen:
Für die weiteren Schritte zur Ermittlung von ϕ_1,j(τ) ist eine Fallunterscheidung durchzuführen.
Für den ϑ_xy > ϑ_z ergibt sich durch rein mathematische Umformung:
Für den Fall ϑ_z > ϑ_xy ergibt sich durch rein mathematische Umformung:
gilt, wobei γ einen Geräteparameter beschreibt.
Bei dem genannten Ausführungsbeispiel betreffend die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein System mit der Spezies j, in dem die Teilchen der Spezies j einem Diffusionstransport unterliegen, wird jeweils der numerische Abgleich über die Relation
durchgeführt, wobei μ(τ) die Messwertfunktion darstellt und
die theoretische Signalfunktion darstellt.
Bei den beschriebenen Ausführungsbeispielen wird jeweils das Rauschverhalten der Messapparatur vernachlässigt, damit der numerische Abgleich leichter erfolgen kann. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bietet sich dabei ein Vorgehen wie in den Ausführungsbeispielen gemäß den 6 bis 9 dargestellt an.
In 6a ist die Messwertfunktion μ(τ), die sich wie oben beschrieben aus den gemessenen Daten ergibt, über einzelne Messpunkte dargestellt. Aus 6a ist erkennbar, dass die Messwertfunktion μ(τ) für kleine τ stark ansteigt. Dieser anomale Verlauf von μ(τ) beruht auf dem Verhalten der Detektionseinheit 10, wie etwa dem Rauschen oder der Totzeit des Detektors. Um diesen Effekt zu korrigieren, muss die Messwertfunktion des Detektorrauschens alleine ermittelt werden und anschließend von der Messwertfunktion μ(τ) der gemessenen Daten gemäß 6a abgezogen werden. In 6b ist die Messwertfunktion μ(τ) von dem Detektorrauschen bereinigt dargestellt. Bei dem zu 6 bis 10 beschriebenen Verfahren wird somit als Zwischenschritt vor der numerischen Abgleich das Detektorrauschen experimentell ermittelt und von der gemessenen Messwertfunktion μ(τ) abgezogen, wodurch eine bereinigte Messwertfunktion μ(τ) erzeugt wird. Diese bereinigte Messwertfunktion μ(τ) dient dann dem numerischen Abgleich mit der theoretischen Signalfunktion, die wie oben beschrieben für die Anwendung des Verfahrens auf ein System, in dem die Teilchen einem Diffusionstransport unterliegen, angewendet. Allgemein wird in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform die Messwertfunktion durch Abzug des Rauschens der Messapparatur bereinigt. Dadurch kann das Rauschen der Messapparatur bei der Definition der theoretischen Signalfunktion vernachlässigt werden, wobei gleichzeitig präzise Ergebnisse über den numerischen Abgleich und ein einfacher numerischer Abgleich dank einer einfachen Formulierung der theoretischen Signalfunktion möglich ist.
In 6c ist die theoretische Signalfunktion abgebildet, nachdem die Konstanten der theoretischen Signalfunktion ermittelt wurden. Die Konstanten wurden durch numerischen Abgleich ermittelt, wobei bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 6 und 7 eine rotationsellipsoidische Symmetrie angenommen wird und der numerische Abgleich über die Relation:
durchgeführt wird. In 6d ist die Überlagerung der Messwertfunktion μ(τ) mit der theoretischen Signalfunktion, die in 6c alleine dargestellt ist und sich aus dem numerischen Abgleich ergibt, dargestellt. Aus 6d ist ersichtlich, dass über das erfindungsgemäße Verfahren eine hervorragende Übereinstimmung der theoretischen Signalfunktion mit der Messwertfunktion μ(τ) erreicht werden kann. Dies beruht auf den erfindungsgemäßen Annahmen, mit denen die theoretische Signalfunktion und die Messwertfunktion so ausgedrückt werden können, dass ein einfacher und damit auch präziser numerischer Abgleich mit geringem Rechenaufwand möglich ist. Dazu tragen insbesondere auch die oben erläuterten Annahmen und Umformungen, die auf das in 6 und 7 beschriebene Ausführungsbeispiel angewandt wurden, bei.
In 7 ist ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, bei dem eine Messung sowie ein numerischer Abgleich analog zu dem Ausführungsbeispiel gemäß 6 durchgeführt wurde zur Charakterisierung eines Systems, in dem sich Teilchen von nur einer emittierenden Spezies j befinden. In 7 sind die Ergebnisse von insgesamt zwölf Messungen dargestellt. Bei den ersten drei Messungen wurde eine erste Konzentration c₁ der Spezies in dem System bei der Präparation des Systems eingestellt, bei der vierten bis sechsten Messung eine Konzentration c₂, bei der siebten bis neunten Messung eine Konzentration c₃ und bei der zehnten bis zwölften Messung eine Konzentration c₄.
In 7a sind die Werte für die charakteristische Detektionshelligkeit der Teilchen der Spezies j in dem System für sämtliche zwölf Messungen angegeben. Wie zu erwarten ändert sich der Wert für die charakteristische Detektionshelligkeit μ_0,j der Spezies j nicht in Abhängigkeit von der angesetzten Konzentration der Spezies in dem System. Der Abfall des Wertes für μ₀ während einer jeden Messreihe umfassend drei Versuche zu einer jeden Konzentration c₁, c₂, c₃ bzw. c₄ beruht auf dem sogenannten „bleaching” der Teilchen während der Messreihe, wodurch die charakteristische Helligkeit der Teilchen sinkt. Entsprechend steigt die charakteristische Detektionshelligkeit μ₀ mit dem Verlauf der Messreihe. Aus 7a ist ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Verfahren reproduzierbare Ergebnisse in Bezug auf die charakteristische Eigenschaft der Teilchen der charakteristischen Detektionshelligkeit der Teilchen liefert.
In 7b ist der Geräteparameter γ angegeben, der über
aus dem numerischen Abgleich berechnet wird. Da ϑ_z und ϑ_xy in dem vorliegenden Fall durch die Messapparatur dergestalt festgelegt sind, dass ϑ_z, ϑ_xy die Durchtrittszeit durch das Messvolumen charakterisieren, ist zu erwarten, dass in dem gezeigten Ausführungsbeispiel der Geräteparameter γ für alle Konzentrationen der Spezies in dem System konstant ist. Denn in dem gezeigten Ausführungsbeispiel unterliegen die Teilchen der Spezies j in dem System keinem Zerfall, sondern die Teilchen tragen solange zur detektierten Rate bei, wie sie sich innerhalb des Messvolumens befinden. Die Tatsache, dass der Geräteparameter γ über den numerischen Abgleich des erfindungsgemäßen Verfahrens als konstant bestimmt wird, bestätigt die Präzision des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Analyse von Systemen mit emittierenden Teilchen.
In 7c ist die transversale Zerfallszeit ϑ_xy für die zwölf Messungen angegeben. Aus 7c ist ersichtlich, dass von Messfehlern abgesehen eine konstante Zerfallszeit ϑ_xy für die Teilchen der Spezies j in dem System ermittelt wird. Die Zerfallszeit ϑ_xy ist zu interpretieren als die Durchtrittszeit der Teilchen durch das Messvolumen in der xy-Ebene.
7d gibt die relativen Konzentrationen c₁:c₂:c₃:c₄ an. Die Konzentration der Teilchen bei den ersten drei Messungen (c₁) wird willkürlich auf 1 gesetzt, als Ausgangspunkt für die relativen Konzentrationen in Bezug auf c₁. Die relativen Konzentrationen aus 7d wurden gemäß dem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens über das Verhältnis der mittleren detektierten Photonenanzahl n _j der Messungen ermittelt. Dabei wurde die Relation verwendet: n _j = c_j μ _1,jτ. μ _1,j kann über die theoretische Signalfunktion ermittelt werden, n _j entspricht der Anzahl der detektierten Photonen, so dass c_j für jede Messung ermittelt werden kann. An dieser Stelle wird ein wichtiger, allgemeiner und grundlegender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens deutlich: Da der Messwertdatensatz, der erfindungsgemäß verwendet wird, die über den Messzeitraum T zeitlich aufgelöst aufgenommene Anzahl n der detektierten Emissionen umfasst, sind diese quantitativen Messwerte bei der Auswertung verwendbar, wodurch die Auswertung umfassend erfolgen kann. Eine andere Möglichkeit, die Relation der Konzentrationen zwischen den einzelnen Messungen zu ermitteln, ist die Besetzungsanzahl ω_j(τ) direkt über die Wahrscheinlichkeit der 0-Ereignisse zu ermitteln, da gilt:
für n = 0. Entsprechend können die Verhältnisse der Konzentrationen über die Verhältnisse der mittleren Besetzungsanzahl ω_j(τ) ermittelt werden.
In den 8 und 9 sind die Ergebnisse eines weiteren Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens in Anwendung auf ein System mit einer Teilchenspezies j dargestellt. In 8a ist -analog zu 6a- die gemessene Messwertfunktion μ(τ) dargestellt. In 8b ist μ(τ) von dem Detektorrauschen bereinigt. In 8c ist die theoretische Signalfunktion, die über den numerischen Abgleich mit der bereinigten Messwertfunktion μ(τ) aus 8b ermittelt wurde, dargestellt. In 8d ist die Überlappung der Graphen von 8b und 8c dargestellt. Aus 8d ist ersichtlich, dass über das erfindungsgemäße Verfahren eine hervorragende Angleichung der theoretischen Signalfunktion an die Messwertfunktion zum Übermitteln der das System bzw. die Teilchen charakterisierenden Konstanten möglich ist.
Für den numerischen Abgleich wurde wie bei dem Ausführungsbeispiel gemäß den 6 und 7 die Gleichung
angewandt.
In 9 sind die in der theoretischen Signalfunktion zu bestimmenden Konstanten angegeben. Bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 9 wurden drei Messungen durchgeführt, wobei die Probe jeweils an drei verschiedenen Stellen vermessen wurde. In 9 sind die Ergebnisse der drei Messungen für die charakteristische Detektionshelligkeit μ_0,j der Spezies j dargestellt, in 9b die Ergebnisse für den Geräteparameter γ, in 9c die Ergebnisse für die transversale Zerfallszeit ϑ_xy und in 9d die relative Konzentration, die bei den jeweiligen Messungen zueinander ermittelt wurden. Die Konzentrationen wurden wie oben zu 7 erläutert ermittelt, wobei c₃, also die Konzentration bei der dritten Messung, gleich 1 gesetzt wurde. Die Ermittlung der Werte erfolgt wie an dem Beispiel zu 6 und 7 erläutert analog bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 8 und 9.
Über das Verhältnis
kann über das Verfahren gemäß 6 und 7 oder das Verfahren gemäß den 8 und 9, bei denen jeweils die Zerfallszeit ϑ_xy experimentell bestimmt wird, bei Kenntnis einer der Größen a_xy oder D die andere der beiden Größen a_xy oder D bestimmt werden. Entsprechend ist dies auch bei einer Bestimmung von ϑ_z für a_z bzw. D möglich.
In dem Ausführungsbeispiel gemäß den 6 und 7 wurde bei der Präparation des Systems als emittierende Teilchen der Standardfluorophor Alexa 488 als Spezies j verwendet. Für diesen Farbstoff ist die Diffusionskonstante D sehr genau bestimmt (nach Schwille). Nach Schwille beträgt die Diffusionskonstante für Alexa 488 in wässriger Lösung, wie dies bei dem bei dem Ausführungsbeispiel nach 6 und 7 verwendeten System der Fall ist, D = 4,35·10^–10m²/s. Über die in 7c ermittelte Zerfallszeit ϑ_xy, die nach 7c auf ϑ_xy = 6,9·10^–4 s ermittelt wurde, kann daraus der Paramater a_xy, der unabhängig von den Teilcheneigenschaften ist und von der Messapparatur vorgegeben ist, auf a_xy = 1,55·10^–6 m ermittelt werden.
Bei dem Ausführungsbeispiel nach 8 und 9 wurde die gleiche Messapparatur verwendet, so dass von dem gleichen a_xy ausgegangen werden kann. Das System, das bei dem Ausführungsbeispiel gemäß den 8 und 9 analysiert wurde, enthält als emittierende Teilchen monodisperse Nanopartikel. Über die Kenntnis von a_xy = 1,55·10^–6 m kann über die aus 9c ermittelte Zerfallszeit ϑ_xy = 2,9·10^–2 s die Diffusionskonstante als D = 1,04·10^–11 m²/s ermittelt werden. Die Diffusionskonstante kann alternativ nach Einstein bestimmt werden über
Mit R₀ = 20 nm (R₀ ist für die monodispersen Nanopartikel bekannt) und η = 1,0 (das für das System verwendete Lösungsmittel ist H₂O bei 20°C), sowie T = 20°C und der Boltzmannkonstanten k_B erhält man durch Einsetzen einen Wert für D von D = 1,074·10^–11 m²/s. Dieser Wert stimmt sehr gut mit dem über das erfindungsgemäße Verfahren ermittelten Wert überein. Auch daraus ist erkennbar, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die zu ermittelnden Konstanten präzise, insbesondere dank des über die erfindungsgemäßen Annahmen geringen Rechenaufwands, ermittelt werden können. Außerdem ist ersichtlich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine umfassende Auswertung möglich ist. Insbesondere können über eine Eichmessung Konstanten betreffend die Messapparatur bestimmt werden, wie etwa a_xy oder a_z oder, im Fall sphärischer Symmetrie, a, wodurch der numerische Abgleich bei nachfolgenden Auswertungen vereinfacht und/oder präziser erfolgen kann zur präziseren Bestimmung der das System bzw. die Teilchen charakterisierenden Konstanten.
Bezugszeichenliste

1: Probe
2: Lichtquelle
3: Beleuchtungsoptik
4: Anregungsfilter
5: Dichroitischer Spiegel
6: Objektiv
7: Emissionsfilter
8: Tubuslinse
9: Pinhole
10: Detektionseinheit
11: Daten-Sampling-Einheit
12: Rechner
100: Probenebene

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 0679251 B1 [0003]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Chen Y. et al., The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy, Biophysical Journal, 77, 553–567, 1999 [0006]
Chen Y. et al., Biophysical Journal, 77, 553–567, 1999 [0027]
„Die Einzelmolekülverteilung in Fluoreszenz-Fluktuations-Experimenten”, B. Greiner, Dortmund, 2007 [0078]

Claims

Verfahren zur Quantifizierung von Teilchen, die bestimmte Emittenden emittieren, und zur Charakterisierung des zeitabhängigen Verhaltens der Teilchen in einem System, das Teilchen zumindest einer Spezies j, insbesondere verschiedener Spezies umfasst, wobei in einer Messung Emissionen der Teilchen in einem Messzeitraum detektiert werden und in einer Auswertung die Anzahl n der Emissionen ermittelt und gespeichert wird, die in einem Zeitintervall mit einer vorbestimmten Intervallbreite innerhalb des Messzeitraums detektiert wurden, wobei die Auswertung insbesondere für mehrere Zeitintervalle mit derselben Intervallbreite durchgeführt wird, wobei eine Verteilungsfunktion p(n) der Anzahl n der detektierten Emissionen bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, dass a) für die Intervallbreite unterschiedliche Binzeiten τ festgelegt werden und für jede Binzeit τ die Auswertung durchgeführt und eine Verteilungsfunktion p_τ(n) ermittelt wird, wobei für jede Binzeit τ Momente m Mess / i,τ der Verteilungsfunktion p_τ(n) ermittelt werden, woraus binzeitabhängige Momentenfunktionen m Mess / i (τ) dargestellt werden, b) aus einem numerischen Abgleich einer theoretischen Signalfunktion umfassend Momente m sig / i (τ) einer theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ), die eine über theoretische Funktionen ermittelte, zu erwartende Signalverteilung angibt, mit einer Messwertfunktion umfassend die Momentenfunktionen m Mess / i (τ) Konstanten ermittelt werden, die die Teilchen in dem System charakterisieren.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der theoretischen Signalfunktion eine Definition der theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) zugrunde gelegt wird, die auf der Annahme einer bestimmten lokalen Detektionsrate μ_j(r →) = μ_0,jf(r →) für ein Teilchen der Spezies j beruht, wobei μ_0,j eine charakteristische Detektionshelligkeit eines Teilchens darstellt, auf der Annahme einer bestimmten lokalen Aufenthaltswahrscheinlichkeit und einer bestimmten lokalen Emissionswahrscheinlichkeit der Teilchen der Spezies j und der Annahme eines bestimmten Messvolumens V, in dem sich die Teilchen befinden müssen, damit Emissionen der Teilchen detektiert werden können, wobei P_sig(n, τ) als binzeitunabhängige Parameter die lokale Detektionsrate μ_j(r →), eine Partialkonzentration c_j und eine Zerfallszeit ϑ_j der Teilchenspezies j sowie das Rauschverhalten der Messapparatur umfasst, und wobei die Konstanten zumindest die Parameter μ_0,j, und insbesondere c_j betreffen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei Anwendung des Verfahrens auf ein System mit s verschiedenen Teilchenspezies für jede Teilchenspezies eine theoretische Speziessignalverteilung P j / sig (n, τ) zugrunde gelegt wird, wobei die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) des Systems durch die s + 1-fache Faltung der s verschiedenen Signalverteilungen P j / sig (n, τ) der s verschiedenen Spezies und einer Rauschsignalverteilung P_noise(n, τ) bestimmt ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das für die Definition von P_sig(n, τ) verwendete Messvolumen V über ein binzeitabhängiges, fiktiv eingeführtes effektives Volumen V_eff,j(τ) definiert wird, wobei per Definition von jedem Teilchen der Spezies j, das sich in dem Volumen τV_eff,j(τ) befindet, in der Binzeit τ zumindest eine Emission detektiert wird und das Teilchen τV_eff,j(τ) während der Binzeit τ nicht verlässt, wobei per Definition die mittlere Anzahl der Teilchen der Spezies j in V_eff,j(τ) durch eine mittlere Besetzungsanzahl ω_j(τ) mit ω_j(τ) = c_jV_eff,j(τ)τ bestimmt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass für die Verteilung der Besetzungsanzahl eine Poisson-Verteilung angenommen wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Bestimmung der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) angenommen wird, dass die lokale Emissionswahrscheinlichkeit der Teilchen gemäß einer Poisson-Verteilung verteilt ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der binzeitabhängige Mittelwert n (τ) und die binzeitabhängige Varianz σ²(τ) aus den Verteilungsfunktionen p_τ(n) für jede Binzeit τ ermittelt werden und die Messwertfunktion n (τ) und σ²(τ) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Messwertfunktion
festgelegt wird, wobei der numerische Abgleich über die Relation
durchgeführt wird, wobei m sig / 1 (τ) das erste Moment und m sig / 2 (τ) das zweite Moment von P_sig(n, τ) darstellt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine mittlere lokale Detektionsrate μ _1,j der Spezies j über das Integral
über einen, insbesondere unbegrenzten Raum R festgelegt und als binzeitunabhängiger Parameter in die theoretische Signalverteilung P_sig(n, τ) eingeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eine mittlere detektierte Emissionsanzahl eines einzelnen Teilchens der Spezies j festgelegt wird auf
für die Anwendung des Verfahrens auf einen stochastischen Transport der Teilchen, und auf
für die Anwendung des Verfahrens auf einen deterministischen Transport der Teilchen, wobei R insbesondere einen unbegrenzten Raum darstellt.
Verfahren nach den Ansprüchen 3, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Messwertfunktion
angesrtzt wird und der numerische Abgleich über die Relation
erfolgt, wobei in dem System von s verschiedenen Teilchenspezies ausgegangen wird und λ eine Rauschkonstante darstellt.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass für die Anwendung des Verfahrens auf ein System mit nur der Teilchenspezies j als einziges die Emittenden emittierender Spezies der numerische Abgleich über die Relation Q(τ) = ϕ_1,j(τ) erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die lokale Detektionsrate μ_j(r →) eine Gaußfunktion mit
mit den Konstanten a_x,y und a_z angenommen wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Anwendung des Verfahrens auf einen fluidischen Transport der Teilchen mit der Transportgeschwindigkeit ν für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eine mittlere detektierte Emissionsanzahl eines einzelnen Teilchens der Spezies j festgelegt wird auf
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass für die Anwendung des Verfahrens auf einen Diffusionstransport der Teilchen mit sphärischer Messsymmetrie für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eine mittlere detektierte Emissionsanzahl eines einzelnen Teilchens der Spezies j festgelegt wird auf
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass für die Anwendung des Verfahrens auf einen Diffusionstransport der Teilchen mit rotationsellipsoidischer Messsymmetrie für die Definition der theoretischen Signalverteilung P_sig(n, τ) eine mittlere detektierte Emissionsanzahl eines einzelnen Teilchens der Spezies j festgelegt wird auf
mit den Zerfallszeiten ϑ_j,xy und ϑ_j,z für Teilchen der Spezies j.