DE102013019435A1

DE102013019435A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Behandlung einer biologischen Probe, insbesondere eines Proteinkristalls

Info

Publication number: DE102013019435A1
Application number: DE102013019435.0A
Authority: DE
Inventors: Reiner Kiefersauer; Robert Huber
Original assignee: Proteros Biostructures GmbH
Current assignee: Proteros Biostructures GmbH
Priority date: 2013-11-20
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2015-05-21

Abstract

Ein Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe (1), insbesondere eines Proteinkristalls, umfasst die Schritte Positionierung der Probe (1) in einem Gasstrom (2), der eine vorbestimmte Feuchte aufweist, und Einstellung einer Probentemperatur der Probe (1), wobei die Einstellung der Probentemperatur der Probe (1) eine Bestrahlung der Probe (1) mit Licht und vorzugsweise eine Variation eines Wasseranteils in der Probe (1) umfasst. Es wird auch eine Behandlungsvorrichtung (100) für die biologische Probe (1) beschrieben, umfassend eine Halterungseinrichtung (10) zur Aufnahme der Probe und eine Gaszufuhreinrichtung (20) zur Bereitstellung eines Gasstroms, der eine vorbestimmte Feuchte aufweist, an der Halterungseinrichtung (10), wobei die Behandlungsvorrichtung (100) zur Einstellung einer Probentemperatur der Probe eingerichtet ist und eine Bestrahlungseinrichtung (30) vorgesehen ist, die zur Bestrahlung der Probe (1) mit Licht angeordnet und für die Einstellung der Probentemperatur der Probe (1) eingerichtet ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe, die biologische Makromoleküle und Wasser enthält, insbesondere ein Verfahren zur Temperierung der biologischen Probe, wie z. B. eines Proteinkristalls. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Behandlungsvorrichtung für eine biologische Probe, die biologische Makromoleküle und Wasser enthält, insbesondere eine Behandlungsvorrichtung für eine Proben-Temperierung. Anwendungen der Erfindung sind bei der Präparation biologischer Proben, insbesondere für Röntgenbeugungsuntersuchungen, und/oder bei der Untersuchung von Phasenübergängen in wässrigen biologischen Proben gegeben.
Es ist allgemein bekannt, dass biologische Makromoleküle, insbesondere Proteine, in wässriger Umgebung Partikel mit einer regelmäßigen Gitterstruktur (z. B. Proteinkristalle) bilden. Proteinkristalle können zur Strukturaufklärung der Proteine mittels Röntgenbeugungsuntersuchungen verwendet werden. Proteinkristalle, die auch als geordnete Gele bezeichnet werden können und einen Gehalt eines wässrigen Lösungsmittels im Bereich von 30% bis 90% haben, sind aufgrund der schwachen Kräfte zwischen den Proteinmolekülen empfindlich von Umgebungsbedingungen, insbesondere der Temperatur und der Feuchte abhängig. Feuchtigkeitsänderungen können eine Abnahme oder Zunahme des Anteils von Kristallwasser im Kristallvolumen bewirken und entsprechend Änderungen von Gitterparametern, bis hin zu Phasenänderungen zwischen verschiedenen Kristallzuständen, bewirken. Bei Röntgenbeugungsuntersuchungen besteht ein Interesse, den Zustand des Proteinkristalls zuverlässig und reproduzierbar einzustellen oder zu variieren.
In EP 987 543 A2 und in DE 102 32 172 A1 wird eine Halterung für einen Proteinkristall beschrieben, die einen Trägerblock mit einem integrierten Gaskanal und einer Haltekapillare umfasst. Der Proteinkristall kann am freien Ende der Haltekapillare in einem Gasstrom positioniert werden, der aus dem Gaskanal austritt. Mit dem Gasstrom wird eine lokale Atmosphäre geschaffen, mit der die Temperatur und Feuchte des Proteinkristalls einstellbar ist. Die herkömmliche Halterung erlaubt die gewünschte Einstellung des Wasseranteils im Proteinkristall für Röntgenbeugungsuntersuchungen. Dies kann jedoch einen relativ hohen Zeitaufwand erfordern, und die Geschwindigkeit dynamischer Änderungen des Proteinkristalls ist beschränkt. So muss zur Veränderung des Wasseranteils im Proteinkristall die Feuchte in der Umgebung des Proteinkristalls, d. h. die Feuchte des Gasstroms geändert werden, was einen relativ hohen gerätetechnischen Aufwand erfordert und zeitaufwändig ist. Dies ist wegen der experimentellen Anforderung besonders kritisch, dass für die Bildung eines geordneten Zustands im Proteinkristall oder für einen Phasenübergang zu einer anderen Kristallmodifikation die Feuchte und Temperatur schnell innerhalb enger Grenzen eingestellt werden sollten. Schließlich hat es sich in der Praxis als nachteilig erwiesen, dass die Wirksamkeit der Behandlung von der Art des Proteinkristalls abhängen kann.
Die Technik gemäß EP 987 543 A2 oder DE 102 32 172 A1 wurde in der Praxis so modifiziert, dass der Gasstrom nicht durch den integrierten Gaskanal, sondern durch eine separate Düse zum Proteinkristall am freien Ende der Haltekapillare geführt wird. Dadurch konnten die genannten Nachteile jedoch nicht befriedigend überwunden werden.
Von R. Weissenborn et al. wird in "Acta Crystallographica D", Bd. 61, 2005, S. 163–172, eine Bestrahlung von Proteinkristallen mit Mikrowellen beschrieben. Die Proteinkristalle werden gemeinsam mit einer Flüssigkeit in einer allseits geschlossenen Kapillare angeordnet und mit den Mikrowellen bestrahlt. Die Mikrowellen werden durch die Flüssigkeit und das Kristallwasser der Proteinkristalle absorbiert, so dass sich diese erwärmen und strukturelle Änderungen zeigen. Die Anwendung des von R. Weissenborn et al. beschriebenen Verfahrens ist auf die Untersuchung der strukturellen Änderungen ausgewählter Proben, insbesondere in der Grundlagenforschung, beschränkt. Für eine routinemäßige Präparation von Proteinkristallen für Röntgenbeugungsuntersuchungen, wie etwa mit der Technik gemäß EP 987 543 A2 , ist das Verfahren von R. Weissenborn et al. ungeeignet.
Aus der Praxis sind weitere Verfahren zur Behandlungen von Proteinkristallen bekannt, bei denen durch Laserbestrahlung z. B. Liganden dissoziiert (CO-Myoglobin), Elektronentransfer in photosynthetischen Proteinen induziert, oder Redoxreaktionen oder Isomerisierungen angeregt werden. In diesen Fällen ist die Wirkung des Lichts auf die genannten molekularen Reaktionen in den Proteinstrukturen beschränkt. Um diese mittels Röntgenbeugungsanalyse untersuchen zu können, werden kristalline Strukturänderungen ausgeschlossen.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe, die biologische Makromoleküle und Wasser enthält, wie z. B. eines Proteinkristalls bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden. Das Verfahren soll insbesondere eine Einstellung der Temperatur der Probe mit erhöhter Geschwindigkeit ermöglichen, eine vereinfachte, routinemäßige Behandlung bei verschiedenen Arten biologischer Proben erlauben und/oder neue Anwendungen der Behandlung oder Untersuchung der biologischen Probe eröffnen. Die Aufgabe der Erfindung ist es des Weiteren, eine entsprechend verbesserte Behandlungsvorrichtung für eine biologische Probe, die biologische Makromoleküle und Wasser enthält, bereitzustellen, mit der Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden.
Diese Aufgaben werden jeweils durch ein Verfahren und durch eine Behandlungsvorrichtung mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Gemäß einem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die genannte Aufgabe durch ein Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe gelöst, die biologische Makromoleküle und Wasser enthält, wobei die Probe in einem Gasstrom mit einer vorbestimmten Feuchte positioniert und einer Einstellung einer Probentemperatur der Probe unterzogen wird. Die Probentemperatur hängt zunächst von der Umgebungstemperatur der Probe, insbesondere der Temperatur des Gasstroms ab. Gemäß der Erfindung erfolgt eine Einstellung der Probentemperatur der Probe (Temperierung der Probe), indem die Probe mit Licht bestrahlt wird. Das Licht wird in der Probe absorbiert und in Wärmeenergie umgewandelt. Durch den unmittelbaren Wärmeeintrag in die Probe steigt die Probentemperatur, insbesondere über die Temperatur des Gasstroms. Durch eine Einstellung von Bestrahlungsparametern des Lichts kann die umgewandelte Wärmeenergie und die Gleichgewichtstemperatur der Probe gleich oder oberhalb der Temperatur des Gasstroms frei gewählt werden.
Gemäß einem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die genannte Aufgabe durch eine Behandlungsvorrichtung gelöst, die zur Behandlung einer biologischen Probe, umfassend biologische Makromoleküle und Wasser, eingerichtet ist und eine Halterungseinrichtung zur Aufnahme der biologischen Probe und eine Gaszufuhreinrichtung zur Bereitstellung eines Gasstroms am Ort der Halterung der biologischen Probe mit der Halterungseinrichtung umfasst. Gemäß der Erfindung enthält die Behandlungsvorrichtung des Weiteren eine Bestrahlungseinrichtung, die zur Bestrahlung der Probe an der Halterungseinrichtung mit Licht angeordnet und für die Einstellung einer Probentemperatur der Probe eingerichtet ist.
Die erfindungsgemäße Einstellung der Probentemperatur durch eine Bestrahlung mit Licht hat den Vorteil, dass im Gegensatz zur Technik gemäß EP 987 543 A2 die Probentemperatur verzögerungsfrei eingestellt werden kann. Abweichend von der herkömmlichen Technik, bei der die Temperatur der Probe durch die Temperatur des einhüllenden Gasstroms gegeben ist, wirkt sich die Bestrahlung der Probe mit Licht unmittelbar auf die Probentemperatur aus. Die Erfinder haben festgestellt, dass die Absorption des zur Einstellung der Probentemperatur zugeführten Lichtes instantan zu einer Temperaturerhöhung führt. Dieser Vorteil wirkt sich insbesondere bei partikelförmigen biologischen Proben aus. Mit der Erfindung wird ausgenutzt, dass sich Zustandsänderungen von biologischen Proben, umfassend biologische Makromoleküle und Wasser, insbesondere von Proteinkristallen, innerhalb von engen Temperaturdifferenzen ergeben, die kleiner als 10 K, insbesondere kleiner als 2 K, sind. Bei Bereitstellung des Gasstroms an der Halteeinrichtung, d. h. bei Einstellung der Gaszufuhreinrichtung derart, dass der Gasstrom eine Temperatur unmittelbar unterhalb einer gewünschten Behandlungstemperatur der biologischen Probe aufweist, kann die Probentemperatur einfach durch die Bestrahlung mit Licht erhöht und bei Bedarf durch eine Unterbrechung der Bestrahlung mit dem Licht verringert werden.
Mit dem Begriff ”biologische Probe” wird allgemein eine wasserhaltige Probe biologischer Makromoleküle bezeichnet, wobei die biologischen Makromoleküle z. B. Proteine, DNA- oder RNA-Moleküle oder Kohlenhydrat-Moleküle umfassen. Die biologische Probe enthält mindestens einen bio-makromolekularen Kristall, wie z. B. einen Proteinkristall. Die Probe hat vorzugsweise eine charakteristische Dimension (z. B. Probendurchmesser) unterhalb von 1 mm, insbesondere unterhalb von 500 μm, bis zu 100 μm oder 20 μm (partikelförmige Probe).
Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist es, dass die Einstellung der Probentemperatur durch die Bestrahlung mit Licht in Wellenlängenbereichen möglich ist, in denen im Gegensatz zur Anwendung von Mikrowellen (R. Weissenborn et al., siehe oben) einfach und flexibel steuerbare und sichere Lichtquellen zur Verfügung stehen. Das zur Einstellung der Probentemperatur verwendete Licht hat vorzugsweise eine Wellenlänge im Wellenlängenbereich des Infrarot (IR), insbesondere des Nahinfrarot (NIR), oder im sichtbaren Wellenlängenbereich (VIS), oder im ultravioletten Wellenbereich (UV), d. h. in einem Wellenlängenbereich von 180 nm bis 1500 nm. Die Verwendung von Licht im NIR-Bereich hat den Vorteil einer erhöhten Absorption von Wasser. Der UV-Bereich hat den Vorteil, dass biologische Makromoleküle, insbesondere Proteine und Aminosäuren, in diesem Wellenlängenbereich absorbieren und das absorbierte Licht leicht in Wärme umwandeln. Licht im VIS-Wellenlängenbereich hat den besonderen Vorteil einer erhöhten Anwendersicherheit bei der Bestrahlung der Probe.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Einstellung der Probentemperatur, welche durch die Bestrahlung der Probe mit Licht bewirkt wird, verschiedene Arten von Behandlungen biologischer Proben ermöglicht. Beispielsweise kann die Behandlung der Probe eine Temperierung zur Untersuchung von temperaturabhängigen Kristalltransformationen, insbesondere Phasenübergängen umfassen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die Behandlung der Probe simultan mit der Einstellung der Probentemperatur auch eine Variation des Wasseranteils in der Probe ein. Vorzugsweise umfasst die Behandlung eine Struktur-Transformation und/oder ein Annealing der Probe. Im Falle der Behandlung von Proteinkristallen ergibt die Variation des Wasseranteils insbesondere eine Reduzierung des Anteils von Kristallwasser im Proteinkristall (Annealing). Der Anteil des Kristallwassers im Proteinkristall stellt einen Kristallzustand dar, da mit dem Anteil an Kristallwasser potentielle Bindungen zwischen benachbarten Proteinmolekülen zugänglich gemacht oder blockiert werden.
Vorteilhafterweise erfolgt die Einstellung des Wasseranteils in der Probe durch die Einstellung der Probentemperatur. Im Gegensatz zur Erfindung wird bei der herkömmlichen Technik der Wasseranteil in der Probe durch die Feuchte in der Umgebung, insbesondere im Gasstrom, der auf die Probe trifft, eingestellt, indem sich ein Gleichgewicht mit dem umgebenden Gasstrom ausbildet. Erfindungsgemäß hingegen wird der Wasseranteil durch eine Einstellung der Probentemperatur bewirkt. Der Gasstrom, in dem die Probe angeordnet wird, hat eine vorgegebene Feuchte, die vorzugsweise der nativen Feuchte der Probe (Dampfdruck bei der Temperatur des Gasstroms) entspricht. Durch die erfindungsgemäße Einstellung der Probentemperatur kann der Dampfdruck der Probe erhöht und die Abgabe von Wassermolekülen in den umgebenden Gasstrom bewirkt werden, so dass sich der Wasseranteil in der Probe reduziert. Die Einstellung des Wasseranteils in der Probe ist reversibel. Bei Verringerung der Bestrahlung der Probe mit Licht können Wassermolekülen aus dem umgebenden Gasstrom in die Probe aufgenommen werden.
Ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Bestrahlung mit Licht mehr Freiheitsgrade bei der Einstellung der Probentemperatur und insbesondere der Einstellung des Wasseranteils in der Probe bietet als die herkömmliche Technik. Die herkömmliche Technik ist aufgrund der Trägheit der Temperatur- und Feuchteeinstellung im Gasstrom auf die Vorgabe einer Temperatur und einer Feuchte beschränkt. Die Bestrahlung mit Licht hingegen ermöglicht zahlreiche Varianten der Einstellung der Probentemperatur, welche einzeln oder in Kombination realisierbar sind und bei verschiedenen Anwendungen der Erfindung jeweils spezifische Vorteile bieten können. Gemäß einer ersten Variante erfolgt die Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge derart, dass das Licht stärker im Wasser in der Probe und weniger in nicht-wässrigen Teilen der Probe, d. h. in den biologischen Makromolekülen absorbiert wird. Vorteilhafterweise erfolgt somit die Zufuhr von Wärmeenergie über das Wasser. Eventuelle Reaktionen der biologischen Makromoleküle in der Probe werden minimiert oder vermieden. Gemäß einer zweiten Variante erfolgt die Bestrahlung mit Infrarotlicht, insbesondere Nahinfrarotlicht, mit sichtbarem Licht, oder mit Ultraviolettlicht. Vorteilhafterweise ermöglicht dies eine einfache Beeinflussung der Ausdehnung des Lichtfeldes mit refraktiven und/oder reflektiven optischen Bauteilen. Gemäß einer dritten Variante der Erfindung kann die Bestrahlung mit kontinuierlichem oder mit moduliertem, insbesondere gepulstem Licht erfolgen. Kontinuierliches Licht erlaubt eine Temperatureinstellung in Abhängigkeit von der Intensität des Lichts. Die Bestrahlung mit dem modulierten Licht ist besonders bevorzugt, da mit den Modulationseigenschaften, insbesondere der Modulationstiefe und dem Taktverhältnis des modulierten Lichts, zusätzliche Freiheitsgrade bei der Einstellung der Temperatur bereitgestellt werden. Beispielsweise können gepulste Bestrahlungen, die sich in Bezug auf die Pulsdauer und Pulsamplituden (Lichtintensitäten der Pulse) unterscheiden, verschiedene Wirkungen auf die Probe haben, selbst wenn jeweils die gleiche Energie absorbiert wird.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Bestrahlungseinrichtung für eine defokussierte Bestrahlung der Probe an der Halterungseinrichtung eingerichtet. Die defokussierte Bestrahlung hat den Vorteil, dass eine homogene Beleuchtung der Probe begünstigt wird. Es erfolgt eine isotrope Absorption im gesamten Probenvolumen. Bei einer Erhöhung der Probentemperatur wird das Kristallwasser homogen aus dem Proteinkristall abgeführt, so dass der Kristallzustand im gesamten Probenvolumen gleich ist. Des Weiteren hat die defokussierte Bestrahlung den Vorteil, dass unbeabsichtigte Zerstörungen der Probe einfacher vermieden werden.
Vorteilhafterweise sind verschiedene Lichtquellen verfügbar, die zur Erzeugung des Lichts für die Bestrahlung der Probe geeignet sind. Gemäß einer ersten Variante enthält die Bestrahlungseinrichtung der erfindungsgemäßen Behandlungsvorrichtung mindestens eine Laserdiode (LD). Laserdioden können Vorteile in Bezug auf die Bereitstellung von Licht in schmalbandigen Wellenlängenbereichen haben. Gemäß einer zweiten Variante enthält die Bestrahlungseinrichtung mindestens eine Leuchtdiode (LED), deren Vorteile sich aus der Verfügbarkeit für verschiedene Wellenlängenbereiche und den geringen Kosten ergeben können.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst die Bestrahlungseinrichtung zur Lenkung des Lichts auf die Probe an der Halterungseinrichtung eine Optik und/oder eine Faser. Die Optik, umfassend refraktive und/oder reflektive optische Bauteile, ermöglicht vorteilhafterweise die Anpassung des Lichtfeldes auf die Größe der Probe, insbesondere die Defokussierung des Lichts auf die gesamte Probe. Eine optische Faser kann so angeordnet werden, dass ein Austrittsende unmittelbar an die Probe angrenzend angeordnet ist. Dies ermöglicht eine genaue Bestrahlung ohne zusätzliche optische Bauteile. Gemäß einer weiteren Alternative können eine Optik und eine optische Faser zur Bestrahlung der Probe kombiniert werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Behandlungsvorrichtung eine Bildaufnahmeeinrichtung, mit der ein Bild der Probe an der Halterungseinrichtung erfasst werden kann. Die Bildaufnahmeeinrichtung ist konfiguriert, ein Bildsignal zu erzeugen, das für eine aktuelle Größe der Probe charakteristisch ist. Vorteilhafterweise bietet die Bildaufnahme ein einfaches Mittel, Zustandsänderungen der Probe, insbesondere Phasenübergänge, wie z. B. eine Kristallisation oder eine Umkristallisation, zu erfassen. Änderungen des Wasseranteils der Probe können durch eine Erfassung der aktuellen Größe der Probe überwacht werden.
Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform der Erfindung, bei der die Erzeugung des Bildsignals eine Erfassung einer Schattenprojektion der Probe umfasst. Die Probe wird von einer Seite mit Licht für die Bildaufnahme beleuchtet. Das Licht für die Bildaufnahme wird mit einer Lichtquelle der Bildaufnahmeeinrichtung erzeugt, kann jedoch auch bei der Einstellung der Probentemperatur durch eine Bestrahlung mit sichtbarem Licht durch die Lichtquelle der Bestrahlungseinrichtung bereitgestellt werden. Auf der entgegengesetzten Seite der Probe ist ein zweidimensionaler Bildsensor angeordnet, der zur Aufnahme der Schattenprojektion und zur Erzeugung des Bildsignals in Abhängigkeit von der Größe des erfassten Schattens der Probe eingerichtet ist. Die Erfassung der Schattenprojektion hat insbesondere Vorteile in Bezug auf eine einfache Bildverarbeitung und die Möglichkeit, für die Bildaufnahme Licht mit einer geringen, die Probe nicht beeinflussenden Intensität zu verwenden. Des Weiteren hat die Schattenprojektion den Vorteil, dass Veränderungen der Probe, insbesondere eines Proteinkristalls, umfassend z. B. ein Schrumpfen oder Dehnen in Abhängigkeit vom aktuellen Wasseranteil in der Probe, einfach erfasst werden kann. Das Bildsignal repräsentiert die Fläche des Schattens des Proteinkristalls. Phasenänderungen in der Probe können als Unstetigkeiten (sprunghafte Änderungen) im Zeitverlauf der Größe des Schattens der Probe in Abhängigkeit von der Dauer der Bestrahlung unmittelbar erfasst werden.
Des Weiteren bietet die Erzeugung des Bildsignals vorteilhafterweise die Möglichkeit, die Probentemperatur der Probe in Abhängigkeit von dem aktuellen Bildsignal zu regeln. In der Behandlungsvorrichtung kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein Regelkreis implementiert sein, der zur Einstellung der Bestrahlung der Probe in Abhängigkeit von dem Bildsignal eingerichtet ist. Vorzugsweise umfasst die Regelung eine Variation von mindestens einem Bestrahlungsparameter der Bestrahlungseinrichtung, insbesondere des Zeitmusters, der Intensität, der Pulsdauer und/oder der Pulsfrequenz des Lichts zur Bestrahlung der Probe. Beispielsweise kann die Bestrahlung der Probe mit konstanten oder sich entsprechend einem vorgegeben Protokoll ändernden Bestrahlungsparametern erfolgen, solange sich das Bildsignal nicht oder innerhalb vorgegebener Grenzen ändert. Die Bestrahlung der Probe kann ferner unterbrochen oder mit konstanten Bestrahlungsparametern fortgesetzt werden, wenn das Bildsignal eine sprunghafte Änderung zeigt. Die Regelung der Bestrahlung und somit der Probentemperatur in Abhängigkeit von dem Bildsignal hat den Vorteil, dass die Behandlung der Probe automatisiert werden kann. Der Kristallzustand eines Proteinkristalls kann unabhängig von der Handhabung der Behandlungsvorrichtung durch einen Anwender genau und reproduzierbar eingestellt werden.
Die Erzeugung eines Bildsignals, das für die Größe der Probe charakteristisch ist, bietet des Weiteren den Vorteil, die Probe in Abhängigkeit von der Zeit zu überwachen. Gemäß einer weiteren Variante der Erfindung ist die Erfassung mindestens eines Zeitverlaufs des Bildsignals vorgesehen. Beispielsweise kann das Bildsignal laufend überwacht werden, um eine sprunghafte Änderung des Bildsignals und damit eine Kristallisation oder eine Umkristallisation in der Probe zu erfassen. Wenn die sprunghafte Änderung des Bildsignals detektiert wird, kann z. B. eine Fixierung des aktuellen Zustands der Probe, insbesondere durch ein Einfrieren (Kryofixierung) vorgesehen sein. Gemäß einer weiteren Variante der Erfindung kann nach einer ersten Aufnahme eines ersten Zeitverlaufs des Bildsignals, einschließlich der Erfassung der sprunghaften Änderungen beim Auftreten eines Phasenübergangs, eine Testsubstanz der Probe zugesetzt werden. Nach einer zweiten Aufnahme eines zweiten Zeitverlaufs können beide Zeitfunktionen verglichen und die Wirkung der Testsubstanz untersucht werden.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind die Feuchte und die Temperatur des Gasstroms, der die Probe auf der Halterungseinrichtung einhüllt, während der Behandlung der Probe unverändert. Die Einstellung der Temperatur und insbesondere des Wasseranteils in der Probe wird ausschließlich durch die Bestrahlung der Probe mit Licht bzw. die Modulierung der Bestrahlung der Probe mit Licht erreicht.
Weitere Vorteile der Erfindung können sich ergeben, wenn die Probe durch Zusatzsubstanzen modifiziert ist. Beispielsweise kann die Probe eine einhüllende Ölschicht aufweisen. In diesem Fall kann durch die Bestrahlung mit Licht eine Einstellung der Probentemperatur ohne eine Änderung des Wasseranteils bewirkt werden. Die Ölschicht kann eine Verdampfung von Wasser aus der Probe unterbinden. Des Weiteren kann die Probe zusätzlich zu den biologischen Makromolekülen eine absorbierende Substanz, insbesondere einen Farbstoff enthalten. Vorzugsweise ist ein Farbstoff vorgesehen, der bei Absorption von Licht dieses nicht-strahlend in Wärmeenergie umwandelt. Diese Variante der Erfindung ermöglicht die Einstellung der Probentemperatur mit sichtbarem Licht, selbst im Falle von biologischen Makromolekülen mit einer verschwindenden Absorption im sichtbaren Wellenlängenbereich.
Vorteilhafterweise sind verschiedene Anwendungen der erfindungsgemäßen Behandlung der biologischen Probe möglich. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Behandlung der Probe, insbesondere des Proteinkristalls, Teil einer Präparation der Probe für eine Röntgenbeugungsuntersuchung. In diesem Fall ist die Behandlungsvorrichtung vorzugsweise in eine Apparatur zur Röntgenbeugungsuntersuchung, wie z. B. ein Röntgendiffraktometer, integriert.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
1: eine schematische Illustration einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Behandlungsvorrichtung;
2: eine vergrößerte Darstellung der Behandlung eines Proteinkristalls;
3: ein Flussdiagramm zur Illustration bevorzugter Merkmale erfindungsgemäßer Verfahren zur Behandlung biologischer Proben; und
4 und 5: Kurvendarstellungen zur beispielhaften Illustration praktischer Ergebnisse mit der erfindungsgemäßen Behandlung von biologischen Proben.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf die Behandlung von Proteinkristallen beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Behandlung von Proteinkristallen beschränkt, sondern in entsprechender Weise mit anderen biologischen Proben, umfassend biologische Makromoleküle und Wasser, wie z. B. DNA-Partikel, anwendbar. Die Ausführungsbeispiele werden insbesondere unter Bezug auf die Einstellung der Probentemperatur durch eine Bestrahlung mit Licht beschrieben. Einzelheiten der Präparation von Proteinkristallen und weitere Messungen an Proteinkristallen, wie z. B. Röntgenbeugungsuntersuchungen, werden nicht beschrieben, da diese an sich bekannt sind. Die Behandlungsvorrichtung wird unter Bezug auf ein Beispiel beschrieben, bei dem die Halterungseinrichtung zur Aufnahme der Probe und die Gaszufuhreinrichtung zur Bereitstellung eines Gasstroms an der Halterungseinrichtung getrennte Bauteile sind. Die Erfindung ist entsprechend mit einem integrierten Aufbau der Halterungseinrichtung und der Gaszufuhreinrichtung realisierbar, wie er beispielsweise aus EP 987 543 A2 bekannt ist.
1 illustriert schematisch ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Behandlungsvorrichtung 100 mit der Halterungseinrichtung 10, der Gaszufuhreinrichtung 20, der Bestrahlungseinrichtung 30, der Bildaufnahmeeinrichtung 40 und der Steuereinrichtung 50 und eine optional vorgesehene Manipulationseinrichtung 60. Die Komponenten 10 bis 60 können komplett oder teilweise in einem Gehäuse 70 angeordnet sein. Das Gehäuse 70 umfasst lichtundurchlässige Wände, mit denen ein Anwender vor einer unbeabsichtigten Bestrahlung mit IR-Licht und die Probe vor einer störenden Belichtung aus der Umgebung der Behandlungsvorrichtung 100 geschützt wird.
Die Halterungseinrichtung 10 umfasst ein Halteelement 11, das austauschbar an einem Träger 12 angebracht ist. Der Träger 12 ist mit einem ersten Stellantrieb 13 in zwei Raumrichtungen, vorzugsweise in drei Raumrichtungen verstellbar. Der erste Stellantrieb 13 ist mit der Steuereinrichtung 50 verbunden, um die Ausrichtung des Halteelements 11 in Bezug auf die Komponenten 20, 30 und 40 (und ggf. 60) zu optimieren. Das Halteelement 11, das vergrößert in 2 dargestellt ist, umfasst z. B. eine Öse, einen Loop oder eine Kapillare, wobei das freie Ende des Halteelements 11 zur Aufnahme des Proteinkristalls 1 eingerichtet ist. Alternativ kann das Halteelement 11 eine Folie oder ein Netz (nicht dargestellt) umfassen. Der Durchmesser des Loop, z. B. gemäß 2, beträgt z. B. 200 μm, um einen Proteinkristall 1 mit einer Ausdehnung von z. B. 100 μm zu tragen.
Die Gaszufuhreinrichtung 20 umfasst eine Zufuhrleitung 21, die mit einer Versorgungseinheit 22 verbunden ist. Ein freies Ende der Zufuhrleitung 21 weist derart zum Proteinkristall 1 auf dem Halteelement 11, dass ein durch die Zufuhrleitung 21 strömender Gasstrom den Proteinkristall 1 einhüllt. Das freie Ende der Zufuhrleitung 21 kann mit einer Düse ausgestattet sein. Der Abstand vom freien Ende der Zufuhrleitung 21 (Düsenöffnung) vom Proteinkristall 1 beträgt z. B. 7 mm.
Die Versorgungseinheit 22 umfasst allgemein ein Gasreservoir, z. B. ein Stickstoff-Reservoir, das über ein steuerbares Stellventil (nicht dargestellt) mit der Zufuhrleitung 21 verbunden ist, eine Temperierungseinheit (nicht dargestellt) zur Einstellung der Temperatur des zum Proteinkristall 1 geleiteten Gasstroms und eine Befeuchtungseinheit (nicht dargestellt) zur Beaufschlagung des Gasstroms mit Wasserdampf. Mit der Versorgungseinheit 22 werden die Temperatur und die relative Feuchte des Gasstroms eingestellt. Das Gasreservoir, die Temperierungseinheit und die Befeuchtungseinheit können ausgeführt sein, wie dies von herkömmlichen Gaszufuhreinrichtungen für die Einstellung der Temperatur und Feuchte von Proteinkristallen, insbesondere aus EP 987 543 A2 , bekannt ist. Die Versorgungseinheit 22 ist mit der Steuereinrichtung 50 verbunden, mit der insbesondere die Temperierungseinheit, die Befeuchtungseinheit und das Stellventil des Gasreservoirs steuerbar sind.
Die Bestrahlungseinrichtung 30 umfasst eine Laserdiode 31 und eine Optik 32. Die Position und Bestrahlungsrichtung der Bestrahlungseinrichtung 30 ist mit einem zweiten Stellantrieb 33 einstellbar. Die Laserdiode 31 und der zweite Stellantrieb 33 sind mit einer Bestrahlungs-Steuereinheit 52 verbunden, mit der Betriebszustände der Laserdiode 31 und die Position und Strahlrichtung der Bestrahlungseinrichtung 30 steuerbar sind. Die Bestrahlungs-Steuereinheit 52 ist mit der Steuereinrichtung 50 verbunden.
Die Laserdiode 31 ist z. B. eine IR-Laserdiode mit einer Emissionswellenlänge von 938 nm und einer optischen Leistung im Bereich von 0,5 bis 30 W (Typ LS453, Hersteller Amtron GmbH, Deutschland). Die Emission der Laserdiode 31 wird direkt oder über eine Faseroptik (nicht dargestellt, Länge z. B. 3 m, Kerndurchmesser z. B. 200 μm) zu der Optik 32 geleitet. Im Fokus der Optik 32 hat der IR-Strahl der Laserdiode 31 einen Durchmesser von z. B. 200 μm. Der Abstand des Fokus von der Optik 32 beträgt z. B. 40 mm. Die Bestrahlungseinrichtung 30, insbesondere die Optik 32, ist so angeordnet, dass der IR-Strahl der Laserdiode 31 am Proteinkristall 1 defokussiert ist, d. h. der Abstand der Optik 32 von der Probe ist ungleich der Fokalentfernung der Optik 32. Alternativ zur Illustration in 1 können die Laserdiode 31 und die Bestrahlungs-Steuereinheit 52 als integrale Einheit außerhalb des Gehäuses 70 angeordnet sein, und die Emission der Laserdiode 31 kann in das Gehäuse 70 über eine biegsame Faser zur Optik 32 geleitet werden. In diesem Fall ist der zweite Stellantrieb 33 nicht mit der Laserdiode 31, sondern mit der Optik 32 verbunden.
Die ersten und zweiten Stellantriebe 13 und 33 umfassen z. B. einen xyz-Mikromanipulatoren (Typ W3-30, Hersteller Narishige, Japan). Alternativ zu der illustrierten Einstellung des zweiten Stellantriebs 33 mit der Bestrahlungs-Steuereinheit 52 kann eine manuelle Einstellung des zweiten Stellantriebs 33 vorgesehen sein.
Die Bestrahlungs-Steuereinheit 52 ist z. B. für die Erzeugung eines analogen Eingangssignals für die Laserdiode 31 eingerichtet. Mit dem analogen Eingangssignal wird der Betriebszustand der Laserdiode 31, insbesondere der EIN- oder AUS-Zustand und/oder das Zeitprofil der Emission der Laserdiode 31, gesteuert. Alternativ kann eine Steuerung mit einem digitalen Eingangssignal vorgesehen sein. Beispielsweise kann eine kontinuierliche Emission oder ein gepulste Emission mit einer Pulsdauer von z. B. 10 μs eingestellt werden.
Die Bildaufnahmeeinrichtung 40 umfasst eine Lichtquelle 41, eine Mikroskopoptik 42 und einen 2D-Bilddetektor 43. Die Bildaufnahmeeinrichtung 40 ist für die Erfassung einer Schattenprojektion des Proteinkristalls 1 eingerichtet. Vorteilhafterweise ist es daher ausreichend, wenn die Lichtquelle 41 lediglich für eine einfache, unstrukturierte Beleuchtung des Proteinkristalls 1 von einer Seite entgegengesetzt zur Mikroskopoptik 42 und dem Bilddetektor 43 konfiguriert ist. Die Lichtquelle 41 umfasst z. B. einen von einer oder mehreren Leuchtdioden beleuchteten Leuchtschirm. Die Mikroskopoptik 42 und der Bilddetektor 43 werden vorzugsweise durch ein kommerziell verfügbares, optisches Mikroskop bereitgestellt. Die Bildaufnahmeeinrichtung 40 ist so positioniert, dass sich der Proteinkristall 1 in der Bildebene der Mikroskopoptik 42 befindet.
Optional kann die Bildaufnahmeeinrichtung 40 mit einer Hilfskamera 44 ausgestattet sein, die entgegengesetzt zur Bestrahlungseinrichtung 30 zur Bildaufnahme am Proteinkristall 1 entlang der Bestrahlungsrichtung mit dem IR-Strahl der Laserdiode 31 angeordnet ist. Mit der Hilfskamera 44 kann die Ausrichtung der Optik 32 in Bezug auf den Proteinkristall 1 überwacht werden. Die Erfinder haben festgestellt, dass selbst bei Verwendung von IR-Licht bei Bestrahlung des Proteinkristalls 1 und/oder des Halteelements 11 eine mit der Hilfskamera 44 erfassbare Lichterscheinung im sichtbaren Spektralbereich detektierbar ist.
In 1 ist illustriert, dass die Lichtquelle 41 mit der Steuereinrichtung 50 verbunden ist. Diese Verbindung hat den Vorteil, wenn ein Intervallbetrieb der Lichtquelle 41, z. B. ein Blitzbetrieb, vorgesehen ist, um die Lichtquelle 41 zu triggern. Alternativ kann die Verbindung der Lichtquelle 41 mit der Steuereinrichtung 50 jedoch weggelassen werden, wobei die Lichtquelle 41 in diesem Fall mit einer separaten Stromversorgung verbunden ist (nicht dargestellt). Der Bilddetektor 43 ist mit einer Bildverarbeitungs-Einheit 53 verbunden, die mit der Steuereinrichtung 50 verbunden ist. Wenn die Hilfskamera 44 vorgesehen ist, so ist diese ebenfalls mit der Steuereinrichtung 50 verbunden.
Die Steuereinrichtung 50 umfasst einen Hauptrechner mit mehreren Schnittstellen, die mit einzelnen Komponenten, wie z. B. 10 oder 20, direkt oder mit weiteren Komponenten, wie z. B. 30 oder 40, über die Bestrahlungs-Steuereinheit 52 oder die Bildverarbeitungs-Einheit 53 verbunden sind. In der Steuereinrichtung 50 laufen Programme zur Steuerung der genannten Komponenten und insbesondere zur Auswahl geeigneter Temperatur- und Feuchte-Bedingungen für den Proteinkristall 1. Die Steuereinrichtung 50 ist mit einer Nutzer-Schnittstelle zur Eingabe von Nutzerdaten, einer Anzeigeeinrichtung, insbesondere zur Bereitstellung eines aktuellen Bildes des Proteinkristalls 1, und/oder zur Ausgabe von Messergebnissen oder anderen Daten, ausgestattet. Die Behandlungsvorrichtung 100 gemäß 1 ist vollständig oder in Teilen automatisierbar. Vorzugsweise ist ein Regelkreis 51 vorgesehen, in dem in Abhängigkeit von einem Bildsignal der Bildverarbeitungs-Einheit 53 mit der Bestrahlungs-Steuereinheit 52 die Laserdiode 31 und/oder der zweite Stellantrieb 33 und optional der erste Stellantrieb 13 der Halteeinrichtung 10 und die Gaszufuhreinrichtung 20 steuerbar sind. Das von der Bildverarbeitungs-Einheit 53 gelieferte Bildsignal ist für die Größe des Proteinkristalls 1 charakteristisch. In Abhängigkeit von der Größe des Proteinkristalls 1 kann die Laserleistung automatisch und verzögerungsfrei geregelt werden. Mit der Bestrahlungs-Steuereinheit 52 wird vorzugsweise eine PID-Regelung realisiert. Die Regelparameter der PID-Regelung können vom Anwender in Abhängigkeit von den konkreten Probeneigenschaften eingestellt werden. Alternativ zur Laserleistung kann beispielsweise die Pulsdauer von Strahlungspulsen der Laserdiode 31 mit der Bestrahlungs-Steuereinheit 52 gesteuert werden.
Die Implementierung des Regelkreises 51 ist jedoch nicht zwingend erforderlich. Alternativ ist möglich, dass der Anwender die Halteeinrichtung 10, die Gaszufuhreinrichtung 20 und die Bestrahlungseinrichtung 30 in Abhängigkeit von einer Beobachtung des Proteinkristalls 1 mit dem Mikroskop manuell betätigt.
Die Manipulationseinrichtung 60 kann eine oder mehrere Komponenten zur Konditionierung des Proteinkristalls 1 umfassen. Als Manipulationseinrichtung 60 kann z. B. eine Mikropipetteneinrichtung zur Zufuhr oder zum Absaugen von einhüllendem Wasser in der Umgebung des Proteinkristalls 1 und/oder eine Gefriereinrichtung zum Schockgefrieren des Proteinkristalls 1 durch Zufuhr kalten Stickstoffgases vorgesehen sein. Die Manipulationseinrichtung 60 ist ebenfalls mit der Steuereinrichtung 50 verbunden.
3 zeigt Merkmale bevorzugter Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens am Beispiel der Behandlung (Transformation und Annealing) eines Proteinkristalls. Der Proteinkristall wird durch ein Wachstumsverfahren in einer wässrigen Umgebung bereitgestellt, wie es an sich aus dem Stand der Technik bekannt ist. Bei Schritt S1 wird der Proteinkristall 1 auf dem Halteelement 11 (siehe 1, 2) positioniert. Beispielsweise wird mit einer Pipette auf dem Halteelement 11 ein Tropfen abgesetzt, der den Proteinkristall 1 enthält. Durch die Manipulationseinrichtung 60 wird überschüssige Flüssigkeit vom Tropfen abgesaugt, der den Proteinkristall umgibt. Die Gaszufuhreinrichtung 20 wird so gesteuert, dass der Gasstrom, der den Proteinkristall 1 umgibt, eine relative Feuchte aufweist, die dem Sättigungsdampfdruck des Proteinkristalls 1 bei der Behandlungstemperatur in der Behandlungsvorrichtung 100, z. B. Raumtemperatur, entspricht (”native Feuchte”). Die relative Feuchte kann durch Vorbereitungsexperimente bekannt sein oder unter Verwendung der Bildaufnahmeeinrichtung 40 gewählt werden. Wenn die relative Feuchte des Gasstroms zu gering ist, schrumpfen der Proteinkristall 1 und die ihn gegebenenfalls noch umgebende Restflüssigkeit. Ist die relative Feuchte des Gasstroms hingegen zu hoch, so wachsen der Proteinkristall 1 und ggf. ein umgebender Tropfen. Die relative Feuchte des Gasstroms wird so eingestellt, dass die Größe des Proteinkristalls 1 oder des diesen gegebenenfalls umgebenden Tropfens von Restflüssigkeit konstant ist. Die relative Feuchte im Gasstrom beträgt z. B. 96%.
Bei Schritt S2 erfolgt zu Beginn des Verfahrens die Einstellung der Bestrahlung, insbesondere die Ausrichtung der Bestrahlungseinrichtung 40 in Bezug auf den Proteinkristall 1 und die Einstellung von Bestrahlungsparametern, und im weiteren Verlauf des Verfahrens die Variation von Bestrahlungsparametern. Die Ausrichtung der Bestrahlungseinrichtung 40 und des Proteinkristalls 1 relativ zueinander erfolgt z. B. mit einem sichtbaren Justierstrahl von einer Justier-Laserdiode (nicht dargestellt) über die Optik 32 zum Proteinkristall 1. Alternativ wird mit der Hilfskamera 44 die Position und Intensität einer sichtbaren Leuchterscheinung (Halo) beobachtet, um die Ausrichtung der Bestrahlung auf dem Proteinkristall 1 zu optimieren. Als weitere Option könnte die Hilfskamera 44 eine thermographische Kamera umfassen, welche den IR-Strahl am Proteinkristall 1 direkt erfasst.
Die Bestrahlungsparameter werden zunächst in Abhängigkeit von einer Abschätzung ermittelt. Die Abschätzung liefert eine erste Annäherung geeigneter Bestrahlungsparameter (insbesondere Strahlungsleistung am Proteinkristall 1). Für die Abschätzung wird beispielsweise angenommen, dass der Proteinkristall 1 ein Quader aus Wasser mit einer Kantenlänge von 100 μm ist. Da der Absorptionskoeffizient des Proteins und des Wassers bekannt ist, kann die Eindringtiefe des IR-Strahls in dem Quader abgeschätzt werden. Mit der bekannten spezifischen Wärmekapazität des Wassers, der Dichte des Wassers und der Masse des Proteinkristalls 1 kann die Temperaturänderung in Abhängigkeit von der Strahlungsleistung abgeschätzt werden. Beispielsweise würde eine Strahlungsleistung von 1 W für 1 ms einer Temperaturänderung von 0,38 K entsprechen. Die Bestrahlungsparameter werden z. B. so gewählt, dass bei Bestrahlung des Proteinkristalls 1 dessen Temperatur erhöht und Wasseranteil abgesenkt werden, um eine Phasenänderung im Proteinkristall 1 beobachten zu können.
Bei Schritt S3 erfolgt die Bestrahlung des Proteinkristalls 1 mit den aktuellen Bestrahlungsparametern. Gleichzeitig wird bei Schritt S4 mit der Bildaufnahmeeinrichtung 40 ein aktuelles Bild (Schattenprojektion) des Proteinkristalls 1 aufgenommen, wobei mit der Bildverarbeitungs-Einheit 53 die Größe des Bildes des Proteinkristalls 1 erfasst und ein Bildsignal erzeugt wird, das für die Größe des Proteinkristalls 1 charakteristisch ist.
Bei Schritt S5 wird das aktuelle Bildsignal mit Bildsignalen vorhergehender Bildaufnahmen verglichen. In Abhängigkeit vom laufenden Programm in der Steuereinrichtung 50 wird bei Schritt S6 entschieden, ob die Bestrahlung variiert werden soll. Wenn beispielsweise die Größe des Proteinkristalls 1 unverändert geblieben ist oder sich kontinuierlich vermindert hat, wird bei Schritt S6 entschieden, die Bestrahlung mit variierten Bestrahlungsparametern fortzusetzen. Wenn der Vergleich der Bildsignale bei Schritt S5 ergeben hat, dass eine sprunghafte Änderung der Größe des Proteinkristalls 1 aufgetreten ist, erfolgt in Abhängigkeit von der Dynamik der Probenveränderung keine weitere Variation der Bestrahlung oder eine Einstellung der Bestrahlung derart, dass das Bildsignal, welches das Ende des Sprungs markiert, und mit diesem der aktuelle Kristallzustand und die Kristallgröße fixiert werden.
Wenn eine sprunghafte Änderung der Größe des Proteinkristalls 1 erfasst wurde, kann optional bei Schritt S7 entschieden werden, ob eine Modifizierung des Proteinkristalls 1 vorgesehen ist. In Abhängigkeit von der konkreten Anwendung des Verfahrens kann z. B. vorgesehen sein, bei Schritt S9 dem Proteinkristall 1 eine Testsubstanz zuzusetzen, um die Bestrahlung und Variation des Wasseranteils im Proteinkristall 1 zu wiederholen. Andernfalls folgt bei Schritt S8 eine Fixierung des Proteinkristalls, z. B. durch ein Einfrieren mit der Manipulationseinrichtung 60. Alternativ oder zusätzlich ist eine Ausgabe der Messergebnisse und/oder eine weitere Messung vorgesehen. Beispielsweise kann sich eine Röntgenbeugungsuntersuchung in einem Röntgendiffraktometer anschließen.
Praktische Tests des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden mit CODH-Proteinkristallen (CODH: Kohlenmonoxid-Dehydrogenase) und mit CLK2-Proteinkristallen (CLK2: Protein-Kinase) durchgeführt. 4 illustriert beispielhaft eine Schrumpfungskurve eines CODH-Proteinkristalls (prozentualer Flächenverlust dA in Abhängigkeit von der Zeit t) bei Bestrahlung mit einem IR-Strahl (Leistung 1,5 W). Mit zunehmender Dauer der Bestrahlung verringert sich die Größe des Proteinkristalls. Nach Beendigung der Bestrahlung expandiert der Proteinkristall zurück in die ursprüngliche Größe. Der im Bildausschnitt vergrößert gezeigte Abschnitt der Kurve A wurde als der Kristallzustand identifiziert, der am besten für eine nachfolgende Röntgenbeugungsuntersuchung geeignet ist. Erfindungsgemäß kann die Bestrahlung so eingestellt werden, dass der gewünschte Kristallzustand des Proteinkristalls für die Dauer der Röntgenbeugungsuntersuchung oder ein anschließendes Einfrieren erhalten bleibt.
Plättchenförmige CLK2-Proteinkristalle mit einer Dimension von 100·50 μm³, die 25% Glycerol als Kryoprotektivum enthalten, wurden einer Annealing-Behandlung unterzogen. 5 zeigt eine Schrumpfungskurve bei Bestrahlung eines CLK2-Proteinkristalls mit einem Laserpuls der Leistung 1 W bei 98% relativer Feuchte des einhüllenden Gasstromes. Der vergrößerte Ausschnitt zeigt eine sprunghafte Änderung des Anstiegs der Schrumpfungskurve, was auf eine Kristalltransformation hinweist. Untersuchungen mit weiteren CLK2-Proteinkristallen zeigten, dass verschiedene Kristalle verschiedene Schrumpfungskurven in Abhängigkeit von der Orientierung relativ zur Bildaufnahmeeinrichtung 40 haben können. Des Weiteren wurde festgestellt, dass die geschrumpften Proteinkristalle verbesserte Ergebnisse der Röntgenbeugungsuntersuchungen im Vergleich zu Proteinkristallen lieferten, die mit den herkömmlichen Verfahren behandelt wurden. Es wurde eine Verbesserung der kristallinen Ordnung von 3,6 Ǻ bis 1,7 Ǻ erreicht.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

EP 987543 A2 [0003, 0004, 0005, 0011, 0033, 0037]
DE 10232172 A1 [0003, 0004]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

R. Weissenborn et al. wird in ”Acta Crystallographica D”, Bd. 61, 2005, S. 163–172 [0005]
R. Weissenborn et al. [0013]

Claims

Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe (1), die biologische Makromoleküle und Wasser enthält, mit den Schritten – Positionierung der Probe (1) in einem Gasstrom (2), der eine vorbestimmte Feuchte aufweist, und – Einstellung einer Probentemperatur der Probe (1), dadurch gekennzeichnet, dass – die Einstellung der Probentemperatur der Probe (1) eine Bestrahlung der Probe (1) mit Licht umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem – die Einstellung der Probentemperatur der Probe (1) eine Variation eines Wasseranteils in der Probe (1) umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Bestrahlung mit Licht mindestens eines der folgenden Merkmale umfasst – die Bestrahlung erfolgt bei einer Wellenlänge derart, dass der Anteil des Lichts, der in nicht-wässrigen Teilen der Probe (1) absorbiert wird, kleiner ist als der Anteil des Lichts, der im Wasser der Probe (1) absorbiert wird, – die Bestrahlung erfolgt mit Infrarotlicht, insbesondere Nahinfrarotlicht, oder mit sichtbarem Licht, und – die Bestrahlung erfolgt mit moduliertem Licht.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Bestrahlung mit Licht mindestens eines der folgenden Merkmale umfasst – die Bestrahlung erfolgt derart, dass das Licht an der Probe (1) defokussiert ist, – die Bestrahlung erfolgt mit einer Laserdiode (31) oder einer Leuchtdiode, und – die Bestrahlung erfolgt derart, dass das Licht mit einer Optik und/oder einer Faser auf die Probe (1) gelenkt wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, mit dem Schritt – Erzeugung eines Bildsignals, das für eine aktuelle Größe der Probe (1) charakteristisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem – die Erzeugung des Bildsignals eine Erfassung einer Schattenprojektion der Probe (1) umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 6, mit dem Schritt – Regelung der Probentemperatur in Abhängigkeit von dem Bildsignal.
Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem – die Regelung eine Variation mindestens eines der Bestrahlungsparameter enthält, die ein Zeitmuster, eine Intensität, eine Pulsdauer und eine Pulsfrequenz des Lichts umfassen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8, mit dem Schritt – Erfassung eines Zeitverlaufs des Bildsignals.
Verfahren gemäß Anspruch 9, mit dem Schritt – Fixierung des aktuellen Zustands der Probe, wenn eine sprunghafte Änderung des Bildsignals erfasst wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9, mit den Schritten – Aufnahme eines ersten Zeitverlaufs des Bildsignals, – Zusatz einer Testsubstanz zu der Probe, – Aufnahme eines zweiten Zeitverlaufs des Bildsignals, und – Vergleich des ersten Zeitverlaufs und des zweiten Zeitverlaufs des Bildsignals.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, mit mindestens einem der Merkmale – die Feuchte des Gasstroms (2) ist größer oder gleich einem nativen Dampfdruck der Probe (1) bei der Temperatur des Gasstroms (2) gewählt, – die Feuchte und die Temperatur des Gasstroms (2) sind während der Behandlung der biologischen Probe (1) unverändert, – die Probe (1) umfasst einen Kristallpartikel, der aus den biologischen Makromolekülen hergestellt ist, insbesondere einen Proteinkristall, – die Probe (1) weist eine einhüllende Ölschicht auf, und – die Probe (1) enthält zusätzlich eine absorbierende Substanz, insbesondere einen Farbstoff.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Behandlung der biologischen Probe (1) eine Präparation der Probe (1) für eine Röntgenbeugungsmessung umfasst.
Behandlungsvorrichtung (100) für eine biologische Probe (1), die biologische Makromoleküle und Wasser enthält, umfassend: – eine Halterungseinrichtung (10) zur Aufnahme der Probe, und – eine Gaszufuhreinrichtung (20) zur Bereitstellung eines Gasstroms, der eine vorbestimmte Feuchte aufweist, an der Halterungseinrichtung (10), wobei – die Behandlungsvorrichtung (100) zur Einstellung einer Probentemperatur der Probe eingerichtet ist, gekennzeichnet durch – eine Bestrahlungseinrichtung (30), die zur Bestrahlung der Probe (1) mit Licht angeordnet und für die Einstellung der Probentemperatur der Probe (1) eingerichtet ist.
Behandlungsvorrichtung gemäß Anspruch 14, bei der die Bestrahlungseinrichtung (30) mindestens eines der Merkmale aufweist: – die Bestrahlungseinrichtung (30) ist für die Bestrahlung mit Infrarotlicht, insbesondere Nahinfrarotlicht, oder mit sichtbarem Licht eingerichtet, – die Bestrahlungseinrichtung (30) ist für die Bestrahlung mit moduliertem Licht eingerichtet, – die Bestrahlungseinrichtung (30) ist für eine defokussierte Bestrahlung der Probe (1) an der Halterungseinrichtung angeordnet, – die Bestrahlungseinrichtung (30) umfasst eine Laserdiode (31) oder eine Leuchtdiode, und – die Bestrahlungseinrichtung (30) umfasst eine Optik (32) und/oder eine Faser.
Behandlungsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 15, umfassend – eine Bildaufnahmeeinrichtung (40), mit der ein Bildsignal erzeugt werden kann, das für eine aktuelle Größe der Probe (1) charakteristisch ist.
Behandlungsvorrichtung gemäß Anspruch 16, bei der – die Bildaufnahmeeinrichtung (40) für die Erfassung einer Schattenprojektion der Probe (1) eingerichtet ist.
Behandlungsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 17, umfassend – einen Regelkreis (51), der zur Einstellung der Bestrahlung mit Licht in Abhängigkeit von dem Bildsignal eingerichtet ist.
Behandlungsvorrichtung gemäß Anspruch 18, bei der – der Regelkreis (51) für eine Variation von mindestens einem der Bestrahlungsparameter eingerichtet ist, die ein Zeitmuster, eine Intensität, eine Pulsdauer und eine Pulsfrequenz des Lichts umfassen.
Behandlungsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, bei der – die Halterungseinrichtung (10) eine Öse, einen Loop, eine Folie, ein Netz oder eine Kapillare umfasst.