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Die Erfindung betrifft Verfahren zur enzymatischen Synthese von aromatischen Aldehyden oder Ketonen aus mono- oder bicyclischen aromatischen Epoxiden. Weiter umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung des dabei verwendeten Enzyms Styroloxid-Isomerase aus Mikroorganismenzellen und dessen Verwendung zur enzymatischen Synthese von aromatischen Aldehyden oder Ketonen. Die Erfindung findet Anwendung in der pharmazeutischen und chemischen Industrie, insbesondere bei der Herstellung von Feinchemikalien, welche für Kosmetika, Lebensmittel oder Pharmazeutika eingesetzt werden.
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Aromatische Aldehyde und Ketone stellen aufgrund der hohen Reaktivität und vielfältigen Modifizierbarkeit der Carbonylgruppe sowie aufgrund der teilweise vorhandenen Prochiralität wichtige Synthesebausteine der chemischen und pharmazeutischen Industrie dar. Darüber hinaus finden sie als Geruchs- und Geschmacksstoffe Anwendung.
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Neben chemischen Oxidations- und Isomerisierungsverfahren kommen zur Herstellung dieser Verbindungen Verfahren der Ganzzell-Biotransformation zum Einsatz.
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Aromatische Aldehyde können mittels Biotransformation durch Oxidation von Alkoholen gewonnen werden. Molinari et al. (1999) offenbart ein Verfahren zur Biotransformation von 2-Phenylethanol zu Phenylacetaldehyd mit Essigsäurebakterien, insbesondere Acetobacter der Stämme ALEF und ALEG, im zweiphasigen System mit Wasser und Isooktan als Lösungsmittel. Das synthetisierte Phenylacetaldehyd wird aus der organischen Phase gewonnen.
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Celik et al. (2004) offenbart ein Verfahren zur Biotransformation von 2-Phenylethanol zu Phenylacetaldehyd mit Gluconobacter oxidans B-72 in einem zweiphasigen System mit Isooktan als organischem Lösungsmittel. Die Biotransformation wurde in einem Fed-Batch-Verfahren durchgeführt.
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Die vorgenannten Verfahren der Biotransformation führen trotz der hohen Spezifität der für die Umsetzung verantwortlichen Enzyme zum Teil zu unerwünschten Nebenreaktionen. Bei der Oxidation von Alkoholen werden neben den zu synthetisierenden Aldehyden bei der Biotransformation oft auch die entsprechenden Carbonsäuren gebildet, was die Aufreinigung des aromatischen Aldehyds erschweren kann (Molinari et al. 1999). Die Oxidation der Alkohole erfolgt durch eine Alkohol-Dehydrogenase, welche cofaktorabhängig ist, so dass der Einsatz des isolierten Enzyms zur Bildung aromatischer Aldehyde aus ökologischer und ökonomischer Sicht nachteilig ist.
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Neben der Anwesenheit störender Enzymaktivitäten werden Ganzzell-Biotransformationen häufig auch aufgrund limitierend wirkender Prozesse des aktiven und passiven Substrattransfers durch die Zellmembran beeinflusst. Auch sind für den Zellstoffwechsel zusätzliche Medienbestandteile wie Glucose oder Proteine notwendig, die vom Syntheseprodukt in einem nachfolgenden Verfahrensschritt aufwändig abgetrennt werden müssen.
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Weitere Verfahren der Biotransformation zur Herstellung aromatischer Aldehyde nutzen Styroloxid als Ausgangssubstrat.
KR 100289089 B1 offenbart dazu ein Verfahren zur Herstellung von Phenylacetaldehyd und 2-Phenylethanol durch Biotransformation von Styroloxid mit Pseudomonas putida (KCTC 0203BP). Pseudomonas putida exprimiert eine Styroloxid-Isomerase, die Styroloxid zu Phenylacetaldehyd umwandelt und eine Phenylacetaldehyd-Reduktase, welche das erhaltene Phenylacetaldehyd zu 2-Phenylethanol reduziert. Zur selektiven Herstellung von Phenylacetaldehyd muss die Phenylacetaldehyd-Reduktase inaktiviert werden. Dazu werden die Mikroorganismen vor der Biotransformation bei 100°C erhitzt, so dass aufgrund deren Thermostabilität die Styroloxid-Isomerase weiterhin aktiv bleibt, während anschließend keine Umwandlungsprozesse durch die Phenylacetaldehyd-Reduktase stattfinden.
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KR 100431516 B1 offenbart ein Verfahren zur Biotransformation von Styroloxid zu Phenylacetaldehyd mit Pseudomonas putida (KCTC 0203BP). Als organische Lösungsmittel des zweiphasigen Systems werden Hexan, Heptan, Oktan oder Hexadekan verwendet. Styroloxid wird mit dem mikroorganismeneigenen Enzym Styroloxid-Isomerase in Gegenwart des organischen Lösungsmittels zu Phenylacetaldehyd umgesetzt.
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Bei der Ganzzell-Biotransformation von Styroloxid wird ein Teil des durch Styroloxid-Isomerase gebildeten, reinen Phenylacetaldehyds durch die ebenfalls vorhandene Phenylacetaldehyd-Reduktase zu Phenylethanol umgesetzt. Erst das Erhitzen der Mikroorganismen auf über 100°C inaktiviert die Reduktase und ermöglicht damit die Synthese von reinem Phenylacetaldehyd über die vergleichsweise thermostabilere Styroloxid-Isomerase. Jedoch ist durch die Erhitzung auch mit einem Aktivitätsverlust der Styroloxid-Isomerase zu rechnen (Itoh et al., 1997), was sich nachteilig auf die Umsatzrate auswirkt.
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Die in
KR 100289089 B1 und
KR 100431516 B1 offenbarten Zweiphasen-Systeme sind besonders bei der Transformation wasserunlöslicher Verbindungen sinnvoll. Die eingesetzten Biokatalysatoren werden dabei vor inhibierenden Einflüssen von Substrat und Produkt geschützt. Die Abtötung der Zellen bei 100°C und die damit verbundene Freisetzung von Zellbestandteilen können die Phasentrennung im Zweiphasensystem erschweren und die Synthese negativ beeinflussen.
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Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur Synthese von aromatischen Aldehyden oder Ketonen bereitzustellen, bei dem eine höhere Reinheit des Syntheseproduktes und eine höhere Produktausbeute erzielt werden.
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Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von aromatischen Aldehyden oder Ketonen aus mono- oder bicyclischen aromatischen Epoxiden, bei dem die Synthese enzymkatalysiert in einem zellfreien Reaktionsgemisch durchgeführt wird. Erfindungsgemäß enthält das Reaktionsgemisch Styroloxid-Isomerase in wässriger Lösung und ein mono- oder bicyclisches aromatisches Epoxid.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren findet die Synthese von aromatischen Aldehyden oder Ketonen in Abwesenheit von Mikroorganismen oder anderen Zellen allein durch enzymkatalysierte Synthese mit der Styroloxid-Isomerase statt. Durch die Verwendung eines zellfreien Systems werden keine störenden Nebenprodukte gebildet. Es sind im Reaktionsgemisch keine weiteren Enzyme enthalten, die zur Umwandlung der eingesetzten Edukte (mono- oder bicyclische aromatische Epoxide) geeignet sind. Ebenso sind keine Enzyme enthalten, welche die synthetisierten Produkte (aromatische Aldehyde oder Ketone) umwandeln. So ist es mit dem erfindungsgemäßen Syntheseverfahren möglich, aromatische Aldehyde und Ketone mit hoher Reinheit zu erzeugen.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden aus monocyclischen aromatischen Epoxiden monocyclische aromatische Aldehyde oder Ketone synthetisiert. Aus bicyclischen aromatischen Epoxiden werden mit dem Verfahren bicyclische aromatische Ketone synthetisiert.
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Bevorzugte monocyclische aromatische Epoxide, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren zu aromatischen Aldehyden oder Ketonen umgewandelt werden, sind Epoxide der folgenden Struktur (I), wobei:
- – einer der Reste R1, R2, R3 = H, Halogen, Methyl oder Ethyl und die übrigen der Reste R1, R2, R3 = H sowie
- – R4, R5 = H, Methyl oder Ethyl entsprechen.
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Dadurch sind durch enzymkatalysierte Synthese mit Styroloxid-Isomerase aromatische Aldehyde (wenn R5 = H) oder Ketone (wenn R5 = Alkyl) der folgenden Struktur (II) mit denselben R1–R5 erhältlich. Besonders bevorzugte monocyclische aromatische Epoxide sind Styroloxid, 4-Methylstyroloxid, 3-Chlorstyroloxid, 2-Methyl-2-phenyloxiran oder 2-Ethyl-2-phenyloxiran.
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Bevorzugte bicyclische aromatische Epoxide, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren zu aromatischen Ketonen umgewandelt werden, sind Epoxide der folgenden Struktur (III), wobei:
- – n = 1 oder 2, einer der Reste R1, R2, R3, R4 = H, Halogen, Methyl oder Ethyl und die übrigen der Reste R1, R2, R3, R4 = H entsprechen und
- – R5 = H, Methyl oder Ethyl entspricht.
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Dadurch sind durch enzymkatalysierte Synthese mit Styroloxid-Isomerase aromatische Ketone der folgenden Struktur (IV) mit denselben R1–R5 erhältlich. Besonders bevorzugte bicyclische aromatische Epoxide sind Indenoxid oder 1,2-Dihydronaphthalenoxid.
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Die Synthese findet nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem flüssigkeitshaltigen Reaktionsgemisch statt. Dieses muss zumindest eine wässrige Phase enthalten. Bevorzugt wird das Verfahren in einem Zwei-Phasen-System aus einer organischen und einer wässrigen Phase durchgeführt. Dabei ist das Lösungsmittel der organischen Phase eine organische Flüssigkeit, in welcher das aromatische monocyclische oder bicylische Epoxid und das synthetisierte aromatische Aldehyd oder Keton löslich sind. In dem Zwei-Phasen-System liegen Edukt und Produkt in der organischen Phase und die Styroloxid-Isomerase in der wässrigen Phase vor. So wird das Enzym vor inhibierenden Einflüssen von Edukt oder Produkt geschützt und das Syntheseprodukt kann einfach aus der organischen Phase gewonnen werden.
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Die wässrige Losung des Reaktionsgemisches ist bevorzugt eine gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 6 bis 8. Bevorzugt werden Phosphatpuffer eingesetzt. Tris-Puffer dagegen können zu reduzierten Enzymaktivitäten führen.
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Wird das erfindungsgemäße Verfahren im Zwei-Phasen-System durchgeführt, wird bevorzugt eine organische Flüssigkeit eingesetzt, welche die Aktivität der Styroloxid-Isomerase nicht beeinträchtigt. Daher sind besonders langkettige Kohlenwasserstoffe (bevorzugt mit mindestens 12 Kohlenstoffatomen) wie Dodecan, Hexadekan oder verzweigte Phthalatester, insbesondere Bis(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP), als organische Flüssigkeiten bevorzugt. Besonders bevorzugt davon ist DEHP.
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Zur Synthese wird zunächst das Reaktionsgemisch bereitgestellt, indem das Enzym Styroloxid-Isomerase in einer wässrigen Lösung aufgenommen wird. Das aromatische Epoxid, welches als Substrat für die enzymatische Umwandlung dient, wird für den Fall, dass das Verfahren in einem Ein-Phasen-System durchgeführt wird, zur wässrigen Lösung zugegeben. Für den Fall, dass das Verfahren in einem Zwei-Phasen-System durchgeführt wird, wird die Styroloxid-Isomerase-haltige wässrige Lösung mit der organischen Flüssigkeit (2. Phase) vermischt. Nach anschließender Zugabe vom aromatischen Epoxid als Substrat wird das Reaktionsgemisch vorzugsweise durch Rühren intensiv vermischt. Die Synthese erfolgt vorzugsweise bei Temperaturen von 20–40°C. Besonders bevorzugt ist eine Synthese bei Temperaturen von 30–40°C, was die Umsatzrate nochmals um den Faktor 1,5–2,5 (im Vergleich zur Synthese bei 20–25°C) erhöht. Die Synthese wird vorzugsweise unter Rühren durchgeführt. Zur Überwachung der Umsetzung werden Proben aus dem Reaktionsgemisch gegebenenfalls mit HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysiert, so dass die Synthese bei vollständigem Umsatz abgebrochen werden kann.
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Bei der Bereitstellung des Reaktionsgemisches wird vorzugsweise zunächst die wässrige Lösung mit der Styroloxid-Isomerase vorgelegt und anschließend das Substrat zugegeben. Für Zwei-Phasen-Systeme wird vorzugsweise zunächst die organische Flüssigkeit (2. Phase) zur Styroloxid-Isomerasehaltigen, wässrigen Lösung gegeben und anschließend das Substrat zum Gemisch zugegeben.
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Charakteristisch für das erfindungsgemäße Verfahren ist es, dass im Reaktionsgemisch keine Ganzzell-Transformation stattfindet, sondern die Synthese zellfrei mit Hilfe von Styroloxid-Isomerase durchgeführt wird. Nach Beendigung der Synthese wird das gebildete aromatische Aldehyd oder Keton aus dem flüssigen Reaktionsgemisch abgetrennt.
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In Ein-Phasen-Systemen wird dafür vorzugsweise zunächst die Styroloxid-Isomerase aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt. Dies erfolgt bevorzugt durch Zentrifugation des Reaktionsgemisches bei mindestens 15.000 × g für mindestens 1 min. Die Gewinnung des aromatischen Aldehyds oder Ketons erfolgt nach Hydrolyse des nicht-umgesetzten Substrates (beispielsweise durch Ansäuerung) durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem das aromatische Aldehyd oder Keton, jedoch nicht das hydrolysierte aromatische Epoxid löslich ist. Bevorzugte Lösungsmittel für die Extraktion sind Kohlenwasserstoffe, insbesondere Hexan, Heptan, Octan oder Isooctan. Aus diesen Lösungsmitteln kann das Produkt durch Destillation gewonnen werden.
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Zur Abtrennung des gebildeten aromatischen Aldehyds oder Ketons im Zwei-Phasen-System wird die organische Phase von der wässrigen Phase abgetrennt. Das Syntheseprodukt liegt nahezu ausschließlich in der organischen Phase vor. Das Syntheseprodukt wird von dem nicht umgesetzten Substrat (aromatisches Epoxid) nach dessen Hydrolyse (beispielsweise durch Ansäuerung der gewonnen organischen Phase in Gegenwart von Wasser) vorzugsweise durch Destillation gewonnen.
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In bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wird Styroloxid-Isomerase in immobilisierter Form eingesetzt. Das Enzym ist dabei an einem Träger räumlich fixiert. Dafür liegt das Enzym insbesondere an Partikeln, Kapseln oder in umgrenzten Reaktionsräumen adsorbiert vor, was eine erleichterte Entfernung des Enzyms aus dem Reaktionsgemisch und dessen Wiederverwendung ermöglicht. Vorzugsweise ist die Styroloxid-Isomerase an Hydroxyapatit oder einem Sepharosegel immobilisiert.
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Alternativ dazu erfolgt die Immobilisierung bevorzugt durch irreversible Aggregation über eine Solubilisation des Membranproteins Styroloxid-Isomerase in Gegenwart des Detergenz CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]-2-hydroxy-1-propan-sulfonat) in Kombination mit Guanidin-Hydrochlorid. Eine weitere bevorzugte Alternative zur Immobilisierung von Styroloxid-Isomerase ist eine irreversible Präzipitation in Gegenwart von Ammoniumsulfat. Diese Formen der Immobilisierung führen zur Erhöhung der Präzipitationsneigung der ohnehin wasserunlöslichen Styroloxid-Isomerase.
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Da einige Formen der Immobilisierung von Styroloxid-Isomerase, insbesondere die Immobilisierung mit CHAPS und Guanidin-Hydrochlorid, zu einer Reduktion der Langzeitstabilität der Styroloxid-Isomerase führen können, erfolgt die Immobilisierung bevorzugt unmittelbar vor dem Einsatz zur Synthese aromatischer Aldehyde oder Ketone.
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Styroloxid-Isomerasen (EC-Nummer 5.3.99.7, auch als „SOI” bezeichnet) sind Enzyme, welche die Umwandlung von Styroloxid zu Phenylacetaldehyd katalysieren. Sie liegen als membranständige Enzyme in der Zellmembran von Mikroorganismen vor, die auf Styrol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen können. Da Styroloxid-Isomerasen sauerstoffunabhängig sind, ist das erfindungsgemäße Verfahren sowohl in Gegenwart von Sauerstoff als auch unter Inertgasatmosphäre, insbesondere unter Stickstoff oder Argon, durchführbar.
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Ein Verfahren zur Gewinnung von Styroloxid-Isomerase aus Mikroorganismenzellen, die membranständige Styroloxid-Isomerase enthalten, ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Erfindungsgemäß umfasst das Verfahren die Schritte
- – Kultivierung der Mikroorganismen in einem Kulturmedium, welches Styrol, Styroloxid oder Phenylacetaldehyd enthält, das zur Induktion der Styroloxid-Isomerase dient,
- – Zellernte und Durchführung eines Zellaufschlusses und
- – Abtrennung der Bestandteile der Zellmembran aus den aufgeschlossenen Mikroorganismenzellen.
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Dadurch wird die in der Membranfraktion enthaltene membranständige Styroloxid-Isomerase angereichert. Gegebenenfalls enthält das Kulturmedium, welches zur Induktion der Styroloxid-Isomerase eingesetzt wird, anstelle von Styrol, Styroloxid oder Phenylacetaldehyd ggf. substituiertes Styrol oder substituiertes Styroloxid zur Induktion der Styroloxid-Isomerase.
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Zur weiteren Anreicherung der Styroloxid-Isomerase, welche ein integrales Membranprotein darstellt, werden bevorzugt in einem sich daran anschließenden Verfahrensschritt die peripheren Membranprotein aus der Membranfraktion abgetrennt.
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Bevorzugt wird die so gewonnene Styroloxid-Isomerase in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese aromatischer Aldehyde oder Ketone eingesetzt.
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Die Gewinnung der Styroloxid-Isomerase erfolgt aus Mikroorganismenzellen, insbesondere Bakterien, die dieses Enzym enthalten. Für die Gewinnung der mikroorganismeneigenen Styroloxid-Isomerase sind sowohl native (also gentechnisch unveränderte) Mikroorganismen als auch gentechnisch veränderte Mikroorganismen geeignet.
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Es sind entsprechende native Mikroorganismen aus dem Stand der Technik bekannt, die eine Styroloxid-Isomerase exprimieren. Bei Kultivierung in einem Medium mit Styrol oder im Falle einiger Mikroorganismen (insbesondere Xanthobacter sp. 124X und einige Pseudomonaden) mit Styroloxid, Phenylacetaldehyd oder substituiertem Styrol oder substituiertem Styroloxid wird die aktive Styroloxid-Isomerase exprimiert. Bevorzugt werden Stamme von Mikroorganismen der Gattungen Pseudomonas, Rhodococcus, Corynebacterium oder Xanthobacter eingesetzt. Besonders bevorzugte Mikroorganismen, die zur Gewinnung einer Styroloxid-Isomerase eingesetzt werden, sind Rhodococcus opacus 1CP (Tischler et al., 2009), Pseudomonas fluorescens ST (DSMZ Nr. 6290) und Corynebacterium sp. AC-5 (Itoh et al., 1997), Pseudomonas putida CA-3 (O'Connor et al., 1995), Pseudomonas putida S12 (Miyamoto et al., 2007) oder Xanthobacter sp. 124X (DSMZ Nr. 6696). Ganz besonders bevorzugt ist Rhodococcus opacus 1CP und Pseudomonas fluorescens ST.
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Bevorzugte gentechnisch veränderte Mikroorganismen enthalten ein rekombinantes Gen für eine Styroloxid-Isomerase. Besonders bevorzugt sind derartig veränderte Expressionsstämme von Escherichia coli. Dadurch kann eine erhöhte Proteinausbeute (bei einer bestimmten Zellzahl) bei der Gewinnung der Styroloxid-Isomerase erreicht werden. Die Spezifität der Styroloxid-Isomerase kann bei Mikroorganismen, deren Gensequenz bekannt ist (insbesondere bei Pseudomonaden), durch ungerichtete Mutagenese verändert werden. Die ungerichtete Mutagenese erfolgt vorzugsweise mittels Gen-Shuffling oder Error-Prone-PCR.
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Die Mikroorganismen werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vor dem Zellaufschluss in einem styrol-, styroloxid- oder phenylacetaldehydhaltigen Kulturmedium kultiviert, wodurch das Zielenzym Styroloxid-Isomerase in den Mikroorganismenzellen exprimiert wird. Geeignete Kulturmedien sind aus dem Stand der Technik bekannt. Bevorzugt sind wässrige Mineralmedien, die neben Styrol, Styroloxid oder Phenylacetaldehyd als Kohlenstoff- und Energiequelle auch Phosphatpuffer, Calciumionen, Magnesiumionen, Ammoniumionen und Sulfationen sowie ggf. Spurenelemente enthalten (z. B. Mineralmedium nach Dorn et al., 1974).
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Da größere Mengen Styrol, Styroloxid und auch Phenylacetaldehyd für zahlreiche Mikroorganismen toxisch wirken, erfolgt vor der Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Styrol, Styroloxid oder Phenylacetaldehyd vorzugsweise zunächst eine Anzucht der Biomasse auf eine gewünschte Zellzahl in einem styrol-, styroloxid- und phenylacetaldehydfreien Medium mit einer anderen Kohlenstoffquelle. Das styrol-, styroloxid- und phenylacetaldehydfreie Medium ist vorzugsweise ein oben beschriebenes Mineralmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, bevorzugt Phenylessigsäure oder Glukose, enthält. Gegebenenfalls wird dem styrol-, styroloxid- und phenylacetaldehydfreien Medium zum Anwachsen der Mikroorganismen einmalig Hefeextrakt (vorzugsweise 0,05–0,1% (w/v)) zugesetzt. Sobald die gewünschte Zellzahl erreicht wurde, erfolgt bevorzugt eine Zugabe von Styrol, Styroloxid oder Phenylacetaldehyd zum Medium, so dass nach vollständigem Verbrauch der zur Anzucht der Biomasse eingesetzten Kohlenstoffquelle lediglich Styrol, Styroloxid oder Phenylacetaldehyd als Kohlenstoffquelle im Medium enthalten ist. Durch diese zweiphasige Anzucht wird die Erzeugung hoher Mengen an Biomasse beschleunigt. Die zugesetzte Menge von Styrol, Styroloxid oder Phenylacetaldehyd richtet sich nach den eingesetzten Mikroorganismen, der Zusammensetzung des Kulturmediums und den Kultivierungsbedingungen. Styrol, Styroloxid und Phenylacetaldehyd sind schlecht wasserlösliche Flüssigkeiten, so dass eine einmalige Gabe des Substrates zur Bildung einer separaten Styrol-, Styroloxid- bzw. Phenylacetaldehyd-Phase im Kulturmedium führen kann. Insofern erfolgt die Zugabe von Styrol, Styroloxid oder Phenylacetaldehyd in mehreren Dosen, die über die Kultivierungszeit verteilt zugegeben werden. Ebenso ist zu berücksichtigen, dass Styrol, Styroloxid oder Phenylacetaldehyd in einer geringen Menge zugeführt wird, die für die Mikroorganismen selbst nicht toxisch ist.
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Entsprechende Kulturbedingungen sind dem Fachmann für die jeweils eingesetzten Mikroorganismen bekannt und der Fachmann ist in der Lage, die geeigneten Kulturbedingungen für die Anzucht der Styroloxid-Isomerase-exprimierenden Mikroorganismen einzustellen. Bei Kultivierung im Flüssigmedium ist bei einer Substratfütterung ein Zusatz von 5 μl/l bis 50 μl/l Styrol, Styroloxid oder Phenylacetaldehyd bevorzugt (bezogen auf das Volumen des Kulturmediums). Dies gilt insbesondere für Kultivierungen in Flüssigmedium mit Volumina von 2 bis 5 Liter Kulturmedium, wobei die Mikroorganismen bevorzugt bei einer OD546 von 8 bis 10 kultiviert werden.
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Nach der Kultivierung werden die Mikroorganismenzellen geerntet und von den Bestandteilen des Kulturmediums befreit. Anschließend werden die Zellen durch mechanische Methoden, insbesondere durch eine Frenchpresse, Ultraschall oder eine Schwingmühle, aufgeschlossen. Vorzugsweise werden der Zellaufschluss und die sich daran anschließenden Verfahrensschritte bei einer Temperatur von 2 bis 4°C durchgeführt.
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Anschließend erfolgt eine Gewinnung der Bestandteile der Zellmembran aus der Präparation mit den aufgeschlossenen Mikroorganismenzellen. Dazu werden Zelltrümmer und cytosolische Bestandteile der aufgeschlossenen Mikroorganismenzellen abgetrennt, wodurch eine Anreicherung der Membranfraktion erfolgt.
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Von den aufgeschlossenen Zellen werden die Bestandteile der Zellmembran vorzugsweise zunächst von ganzen Zellen und Zelltrümmern durch Zentrifugation bei 20.000 × g abgetrennt. Anschließend werden die Bestandteile der Zellmembran vorzugsweise durch Ultrazentrifugation (Zentrifugalbeschleunigung > 100.000 × g) von den löslichen Cytoplasmabestandteilen getrennt. Im dadurch erhältlichen Sediment liegen die angereicherten Bestandteile der Zellmembran vor, welche die Styroloxid-Isomerase enthalten.
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In diesem Sediment sind noch weitere Zellmembranproteine enthalten (periphere Proteine), die vorzugsweise in einem weiteren Verfahrensschritt abgetrennt werden. Dies wird bevorzugt durch wechselnden Kontakt der Fraktion mit den Bestandteilen der Zellmembran mit Puffern unterschiedlicher Ionenstärke bewerkstelligt.
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Die gewonnene und angereicherte Styroloxid-Isomerase wird bevorzugt bei maximal –20°C gelagert. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Styroloxid-Isomerase ist hochaktiv (etwa 100 Enzym-Units pro mg) und bei –20°C für mehrere Monate ohne signifikanten Aktivitätsverlust lagerfähig.
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Eine Erhöhung der Enzymaktivität ist durch eine thermische Behandlung möglich, welche vor dem Einsatz der gewonnenen Styroloxid-Isomerase durchgeführt wird. Eine durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnene Styroloxid-Isomerase wird dazu bevorzugt bei 25–45°C, besonders bevorzugt bei 30–40°C für mehrere Minuten erhitzt. Ganz besonders bevorzugt erfolgt die Hitzebehandlung für 20–40 Minuten.
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Bevorzugt wird eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren gewonnene Styroloxid-Isomerase immobilisiert. Dies erfolgt bevorzugt unmittelbar vor der Anwendung des Enzyms. Die Immobilisierung bietet bei der Verwendung des Enzyms (insbesondere in einem erfindungsgemäßen Syntheseverfahren) den Vorteil, dass dieses auf einfache Weise aus einem Reaktionsgemisch wiedergewonnen werden kann. Zusätzlich wirkt sich auch die Reduktion der Enzymempfindlichkeit gegenüber organischen Flüssigkeiten vorteilhaft auf die Anwendung in Zwei-Phasen-Systemen aus. Styroloxid-Isomerase kann auch in immobilisierter Form zur Erhöhung der Enzymaktivität thermisch behandelt werden.
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Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von Styroloxid-Isomerase zur zellfreien, enzymatischen Synthese von aromatischen Aldehyden oder Ketonen aus mono- oder bicyclischen aromatischen Epoxiden. Bevorzugt ist dabei die Synthese der aromatischen Aldehyde oder Ketone der Strukturen (II) und (IV) aus monocyclischen Epoxiden der Struktur (I) oder bicylischen Epoxiden der Struktur (III). Für die erfindungsgemäße Verwendung wird die Styroloxid-Isomerase bevorzugt durch ein oben beschriebenes Verfahren aus Mikroorganismenzellen, welche membranständige Styroloxid-Isomerase enthalten, gewonnen. Die Synthese erfolgt dabei bevorzugt mit einem erfindungsgemäßen Verfahren in einem wässrigen Ein-Phasen-System oder einem Zwei-Phasen-System aus wässriger und organischer Phase.
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Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, mit dem hochaktive Styroloxid-Isomerase gewonnen wird, die über lange Zeiträume lagerstabil ist. Durch die thermische Aktivierung der Styroloxid-Isomerase wird eine weitere Aktivitätssteigerung erzielt. Durch die Immobilisierung ist die Styroloxid-Isomerase aus einem abreagierten Reaktionsgemisch wiederzugewinnen und im Zwei-Phasen-System aus wässriger und organischer Phase anwendbar. Die so isolierte Styroloxid-Isomerase ist zur zellfreien enzymatischen Synthese von aromatischen Aldehyden oder Ketonen geeignet.
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Die Synthese kann im Zwei-Phasen-System (wässrig/organisch), beispielsweise mit Phthalatestern als organischer Phase, oder auch im wässrigen Ein-Phasen-System stattfinden. Das Verfahren ist besonders geeignet, Epoxide der Strukturen der hierin bezeichneten Formeln (I) und (III) umzuwandeln. Die Reaktion findet dabei in einer Stufe ohne nötige Hilfsstoffe (Cofaktoren, Cosubstrate oder dergleichen) innerhalb der gepufferten wässrigen Phase statt.
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Ein weiterer Vorteil der Erfindung gegenüber chemischen Syntheseverfahren liegt in der hohen Selektivität der Styroloxid-Isomerase, welche diejenige chemischer Katalysatoren im Rahmen dieser Anwendung übertrifft. Phenylacetaldehyd kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren je nach Reaktionsführung in Ausbeuten > 99% d. Th. erhalten werden. Geringere Ausbeuten beruhen lediglich auf unvollständiger Umsetzung des Eduktes, nicht aber auf der Bildung unerwünschter Nebenprodukte.
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Die Synthesebedingungen der Styroloxid-Isomerase-katalysierten Reaktionen liegen in physiologischen Bereichen, so dass keine energieaufwändigen Prozessschritte im Rahmen der Synthese stattfinden.
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Trotz der hohen Regiospezifität der Isomerase weisen Styroloxid-Isomerasen ein breites Substratspektrum auf, was unter variablen Umsatzraten die Herstellung einer Vielzahl verschieden substituierter Aldehyde und Ketone mit Hilfe eines einzigen Katalysators erlaubt. Über ungerichtete Mutagenese können Enzyme signifikant in ihrer Spezifität verändert werden, was weiteren Optimierungen einen großen Spielraum lässt.
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Die von der Styroloxid-Isomerase katalysierte Isomerisierungsreaktion ist sauerstoffunabhängig, so dass eine Durchführung des Prozesses in Inertatmosphäre möglich ist. Dies trägt durch Verhinderung einer Autooxidation empfindlicher Aldehyde ebenfalls zur Produktreinheit bei. Das Ausbleiben solcher Nebenreaktionen vereinfacht auch die Isolation des Produktes in Hinblick auf dessen weitere Anwendung in der Lebensmittelindustrie und pharmazeutischen Industrie.
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Ein weiterer Vorteil der Erfindung gegenüber bekannten biotechnologischen Techniken besteht insbesondere darin, dass es sich bei Styroloxid-Isomerase um ein Cofaktor-unabhängiges Enzym handelt, so dass dieses zum Einsatz in isolierter Form geeignet ist. Die Vermeidung des Einsatzes ganzer Zellen trägt zur Reinheit des Produktes durch das Ausbleiben von Nebenreaktionen bei und verhindert auch die Einschleppung von Verunreinigungen.
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Styroloxid-Isomerasen sind membrangebundene Proteine, was eine hochgradige Anreicherung und die Abtrennung von mengenmäßig dominierenden Proteinen der cytosolischen Fraktion ermöglicht. Durch die Membranlokalisation ergibt sich ferner eine hohe Stabilität des Enzyms, was die Langzeitstabilität von Umsätzen fördert. Darüber hinaus sind die Präparationen des Enzyms über Monate hinweg sehr gut lagerfähig (eingeschränkte Lagerfähigkeit allerdings bei einigen Immobilisaten, wie nach Behandlung mit CHAPS und Guanidin-Hydrochlorid). Die hydrophobe Struktur der membranintegralen Styroloxid-Isomerase bewirkt eine Wasserunlöslichkeit, was eine Wiedergewinnung und Rückhaltung aus Syntheseansätzen erleichtert.
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Styroloxid-Isomerase ist zudem ein katalytisch sehr effektives Enzym, da kein zweites Substrat für den Umsatz erforderlich ist, was eine schnelle Reaktion vermuten lässt. Durch kurzzeitige Temperaturerhöhung kann außerdem eine dauerhafte Steigerung der spezifischen Aktivität bewirkt werden.
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Alle bislang bekannten Bakterien mit Styroloxid-Isomerase-Aktivität entsprechen laut Listen der ZKBS (Zentralen Kommission für die Biologische Sicherheit) der Risikoklasse 1, sind also für Mensch und Tier nicht pathogen.
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Anhand folgender Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
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Ausführungsbeispiel 1: Gewinnung von Styroloxid-Isomerase aus Rhodococcus opacus 1CP
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Rhodococcus opacus 1CP wurde im Bioreaktor in Gegenwart von Mineralmedium (pH 7,0, Dorn et al. 1974) mit Phenylessigsäure als Kohlenstoffquelle (bei jeder Fütterung in einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben) auf OD546-Werte von 8–9 herangezogen.
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Das Medium setzte sich je Liter (aufgefüllt mit entionisiertem Wasser) aus folgenden, einzeln autoklavierten Stammlösungen zusammen:
100 ml 20 × Phosphatpuffer (Zusammensetzung 70 g Na2HPO4·2H2O, 20 g KH2PO4 auf 1 l H2O), 20 ml 50 × Salzlösung (Zusammensetzung 3 g Ca(NO3)2·4H2O, 0,5 g Fe(III)NH4-citrat, 10 g MgSO4·7H2O, 50 g (NH4)2SO4, 50 ml 1000 × Spurenelementlösung 6 [nach Pfennig & Lippert, 1966] auf 1 l H2O) und Phenylessigsäure in einer Endkonzentration von 5 mM.
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Zudem wurde zum besseren Anwachsen im Flüssigmedium Hefeextrakt in einer Endkonzentration von 0,07 bis 0,1% (w/v) zugegeben.
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Die Kultivierung im Flüssigmedium erfolgte bei einer Rührgeschwindigkeit von 600 rpm, einem Lufteintrag von 2 slpm im Gasraum, einer Temperatur von 30°C sowie einem pH-Wert von 7,0–7,5. Der Substratverbrauch und die damit verbundene Fütterung konnte anhand der Sauerstoffsättigung abgeschätzt werden. Anschließend wurde die Fütterung schrittweise auf Styrol als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle umgestellt und die Fütterung mit Phenylessigsäure langsam eingestellt. Der Lufteintrag wurde während der Styrolfütterungen (pro Fütterung ca. 25–100 μl reines Styrol bei 4 l Kultur) reduziert, um ein Ausgasen des Substrates zu verringern. Nach weiteren 2–3 Tagen unter Styrolinkubation wurden die Zellen geerntet.
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Nachfolgend wurde die Biomasse geerntet und in einer French-Presse aufgeschlossen (2500 Psi). Der Zellaufschluss und alle weiteren Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Aus dem erhaltenen Extrakt wurde die Membranfraktion durch differenzielle Zentrifugation von Zelltrümmern (20.000 × g, 20 min) und von cytosolischen Proteinen abgetrennt (100.000 × g, mindestens 12 h).
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Aus der Membranfraktion mit der membrangebundenen Styroloxid-Isomerase wurden die peripheren Proteine durch Waschen mit Puffern unterschiedlicher Ionenstärke (Hochsalzpuffer = 25 mM Phosphatpuffer + 1 M NaCl; Niedrigsalzpuffer = 12 mM Phosphatpuffer) abgetrennt. Dazu wurde das Sediment mit den Membranbestandteilen für eine Stunde erst in Gegenwart von Hochsalzpuffer inkubiert und nachfolgend abzentrifugiert (100.000 × g, 1–1,5 h). Das nach diesem Schritt gewonnene Sediment wurde anschließend mit Niedrigsalzpuffer gewaschen, erneut eine Stunde inkubiert und abzentrifugiert (100.000 × g, 1–1,5 h). Das so gewonnene Sediment wurde anschließend in wenig 25 mM Phosphatpuffer resuspendiert.
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Die auf diese Weise gewonnene, angereicherte Styroloxid-Isomerase war über mehrere Monate bei –20°C lagerungsfähig. Selbst bei einer Lagerung bei 2°C wurde nur ein Aktivitätsverlust von Ca. 30% nach 9–10 wöchiger Lagerung festgestellt. Die spezifische Aktivität der gewonnen Styroloxid-Isomerase lag bei 100 U/mg. Dazu wurde die Menge des gebildeten Syntheseproduktes nach Hydrolyse des Substrates Styroloxid durch Zugabe von 85%-iger (v/v) Phosphorsäure mittels Gaschromatographie bestimmt.
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Nach 30-minütiger Inkubation der Styroloxid-Isomerase bei 35°C wurde eine Erhöhung der Aktivität der Styroloxid-Isomerase um 60% auf 160 U/mg festgestellt.
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Ausführungsbeispiel 2: Immobilisierung der Styroloxid-Isomerase in Gegenwart von CHAPS/Guanidin-Hydrochlorid
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Die in Ausführungsbeispiel 1 gewonnene und nicht thermisch behandelte Styroloxid-Isomerase wurde in Gegenwart von CHAPS/Guanidin-Hydrochlorid immobilisiert. Dazu erfolgte eine einstündige Inkubation der Styroloxid-Isomerase in Gegenwart von 1% (w/v) CHAPS und 3,5 M Guanidin-Hydrochlorid sowie eine nachfolgende Zentrifugation (100.000 × g, 4 h). Dies führte zu einer weiteren Anreicherung des Katalysators und zu dessen verstärkter Präzipitation.
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Die immobilisierte Styroloxid-Isomerase zeigte eine spezifische Aktivität von 370 U/mg (ohne zusätzliche Hitzeaktivierung).
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Ausführungsbeispiel 3: Immobilisierung der Styroloxid-Isomerase in Gegenwart von Ammoniumsulfat
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Die in Ausführungsbeispiel 1 gewonnene und nicht thermisch behandelte Styroloxid-Isomerase wurde in Gegenwart von 50% (w/v) Ammoniumsulfat irreversibel gefällt. In dieser Form ist die Styroloxid-Isomerase für eine Wiedergewinnung aus dem Reaktionsgemisch der Synthese durch Zentrifugation hervorragend geeignet.
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Ausführungsbeispiel 4: Herstellung von 4-Methylphenylacetaldehyd im wässrigen Ein-Phasen-System
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Eine wässrige Lösung (25 mM Phosphatpuffer) wurde mit der immobilisierten Styroloxid-Isomerase aus Ausführungsbeispiel 3 versetzt (65 Units, 10 ml Ansatzgröße). Anschließend wurde das monocyclische Epoxid 4-Methylstyroloxid als Substrat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 45–60 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Synthese wurde die immobilisierte Styroloxid-Isomerase durch Zentrifugation für 1–2 min bei 16.000 × g aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt. Das im Reaktionsgemisch verbliebene Substrat 4-Methylstyroloxid wurde vor der anschließenden Extraktion durch Ansäuerung zum polareren Diol hydrolysiert, was die Aufreinigung des Syntheseproduktes 4-Methylphenylacetaldehyd vereinfacht. Durch Extraktion mittels Hexan wurde das 4-Methylphenylacetaldehyd anschließend aus dem Reaktionsansatz extrahiert und vom hydrolysierten Substrat abgetrennt. Aus dem Extrakt wurde 4-Methylphenylacetaldehyd anschließend durch Destillation gewonnen.
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Ausführungsbeispiel 5: Herstellung von Phenylacetaldehyd im Zwei-Phasen-System (Wasser/Bis(2-ethylhexyl)phthalat)
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Immobilisierte Styroloxid-Isomerase aus Ausführungsbeispiel 3 wurde in 25 mM Phosphatpuffer aufgenommen (100 Units, 20 ml Ansatzgröße). Die wässrige Lösung wurde mit dem organischen Lösungsmittel Bis(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) überschichtet. Das Verhältnis von wässriger Unterphase und organischer Oberphase betrug 2:1. Der Reaktionsansatz wurde mit Styroloxid versetzt und bei Raumtemperatur für 2–3 h gerührt. Nachfolgend wurde die organische Phase abgenommen. Durch Ansäuerung in Gegenwart von Wasser wurde das restliche Styroloxid in der organischen Phase hydrolysiert Phenylacetaldehyd wurde anschließend durch Destillation von der organischen Phase abgetrennt.
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Ausführungsbeispiel 6: Wiederverwendung der Styroloxid-Isomerase aus dem Zwei-Phasen-System
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Die Styroloxid-Isomerase-haltige, wässrige Phase des Reaktionsgemisches aus Ausführungsbeispiel 5 wurde nach Abnahme der organischen Phase erneut mit DEHP überschichtet und mit Styroloxid versetzt. Phenylacetaldehyd wurde wie in Ausführungsbeispiel 5 abgetrennt.
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Ausführungsbeispiel 7: Wiedergewinnung der Styroloxid-Isomerase aus dem Zwei-Phasen-System
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Die Styroloxid-Isomerase-haltige, wässrige Phase des Reaktionsgemisches aus Ausführungsbeispiel 5 wurde nach Abnahme der organischen Phase für 2 Minuten bei 16.000 g zentrifugiert. Das erhaltene Sediment enthält die Styroloxid-Isomerase und ist für weitere Synthesen geeignet.
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Zitierte Nichtpatentliteratur
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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