DE10201084A1

DE10201084A1 - Siliziumhaltige Magnetpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung der Partikel

Info

Publication number: DE10201084A1
Application number: DE10201084A
Authority: DE
Inventors: Guido Hennig; Karlheinz Hildenbrand
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2002-01-14
Filing date: 2002-01-14
Publication date: 2003-07-24
Also published as: WO2003058649A1; EP1468430B1; EP1468430A1; AU2003210151A1

Abstract

Die Erfindung betrifft superparamagnetische Partikel, bestehend aus kugelförmigen Magnetit-Kernen mit einer Oberflächenschicht aus Siliziumdioxid. Die siliziumdioxid-beschichteten Magnetit-Partikel werden für die Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt, wobei die Abtrennung mittels magnetischer Felder aus einer Probenmatrix erfolgt.

Description

Die Erfindung betrifft superparamagnetische Partikel bestehend aus kugelförmigen Magnetit-Kernen mit einer Oberflächenschicht aus Siliziumdioxid. Die mit Siliziumdioxid beschichteten Magnetit-Partikel werden für die Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt, wobei die Abtrennung mittels magnetischer Felder aus einer Probenmatrix erfolgt.

In jüngster Zeit gewinnt die Molekulare Diagnostik zunehmend an Bedeutung. Die Molekulare Diagnostik hat Eingang gefunden in die klinische Diagnostik von Erkrankungen (u. a. Nachweis von Infektionserregern, Nachweis von Mutationen des Genoms, Entdeckung von zirkulierenden Tumorzellen und Identifizierung von Risikofaktoren für die Prädisposition einer Erkrankung). Aber auch in der Veterinärmedizin, der Umweltanalytik und Nahrungsmitteltestung finden Methoden der molekularen Diagnostik mittlerweile ihre Anwendung. Ein weiteres Anwendungsgebiet stellen Untersuchungen an pathologischen/zytologischen Instituten oder im Rahmen forensischer Fragestellungen dar. Aber auch im Rahmen der Gesundheitsvorsorge (z. B. Untersuchungen von Blutkonserven auf Infektionserreger- Freiheit) wird die Gen-Diagnostik mittlerweile eingesetzt und der Gesetzgeber plant, solche Testungen per Gesetz in Zukunft anzuordnen. Methoden, die auch bei der klinischen Molekularen Diagnostik zum Einsatz kommen (wie z. B. Hybridisierungs- oder Amplifikationstechniken wie die PCR (Polymerase Chain Reaction), TMA (Transcription Mediated Amplification), LCR (Ligase Chain Reaction), bDNA (branched DNA) oder NASBA-(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)) gehören auch bei wissenschaftlichen Grundlagenarbeiten zu den Routineverfahren.

Voraussetzung für die Durchführung eines Assays in der Molekularen Diagnostik ist im Allgemeinen die Isolierung von DNA oder RNA aus der zu analysierenden Probe. Zwar gibt es Analyseverfahren, wie z. B. bDNA-basierte Tests, die es erlauben, Nukleinsäureisolierung und Nachweisreaktion gemeinsam durchzuführen, doch erfordert die PCR als die in der Molekularen Diagnostik am weitesten verbreitete molekularbiologische Methode wegen ihrer Beeinflussbarkeit durch exogene Faktoren nahezu immer die Verwendung von vorher gereinigten Nukleinsäuren.

Die klassischen Präparationsverfahren für Nukleinsäuren beruhen dabei auf einer Flüssig-Flüssig Extraktion. Als Beispiel sei hier die Phenol-Chloroform Extraktion von DNA aus Körperproben genannt. Der hohe Arbeitsaufwand und die Notwendigkeit, teilweise hochtoxische Substanzen verwenden zu müssen, hat diese Verfahren jedoch in den vergangenen Jahren stark zu Gunsten von festphasebasierten Verfahren in den Hintergrund treten lassen.

Bei der Verwendung von festphasebasierten Extraktionsverfahren von Nukleinsäuren lässt sich die Probenvorbereitung zum eigentlichen Analysengang, weitgehend unabhängig von der jeweiligen Fragestellung in vier Grundschritte unterteilen: 1. Konditionierung der festen Phase; 2. selektive oder spezifische Bindung des Analyten an die feste Phase und Entfernung der übrigen Probematrix; 3. Herauswaschen von eventuellen Verunreinigungen aus der festen Phase und 4. Elution des angereicherten und gereinigten Analyten.

Hinsichtlich selektiver und reversibler Bindung von Nukleinsäuren macht man sich die lange bekannte Eigenschaft von Nukleinsäuren zu nutze, unter chaotropen oder anderen Hochsalzbedingungen, d. h. bei hohen Konzentrationen von chaotropen oder anderen Salzen, spezifisch an silikathaltige Adsorbentien wie Glasmehl [Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979) 615-619, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387], diamatomeenerde [Methods Enzymol. 65 (1979) 176-182] oder native Kieselerde [J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503, EP 0 389 063 B1] zu binden. Mit Hilfe eines ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel enthaltenen Puffers, in der Regel ist das ein niederer aliphatischer Alkohol, werden dann Verunreinigungen von dem Adsorbens gewaschen, der Träger getrocknet und die adsorbierten Nukleinsäuren mit destilliertem Wasser oder einem sogenannten Niedrigsalzpuffer, d. h. Puffer mit geringer Ionenstärke, eluiert.

Im Hinblick auf Vollständige Automatisierung der Nukleinsäureisolierungsprozesse spielt die oben erwähnte Isolierung über superparamagnetische Adsorbentien eine zunehmend wichtige Rolle. WO 01/46404 beschreibt Testkits bestehend aus Metalloxiden (Magnetite), Bindungspuffern und Elutionspuffern. Der Elutionsschritt hat den Nachteil des erhöhten Zeitaufwandes und führt insbesondere bei einer Automatisierung zu erhöhten Verfahrenskosten. Ein weiterer Nachteil ist, dass beim Abtrennen des Eluats normalerweise kleine undefinierte Restvolumina mit gelöster Nukleinsäure auf der Partikeloberfläche durch hygroskopische Wechselwirkungen verbleiben und somit quantitative Nachweise im Eluat zu niedrigeren bzw. falschen Ergebnissen führen. Es wäre somit von großem Vorteil, auf diesen zusätzlichen Verfahrensschritt zu verzichten und den Nachweis der aufgereinigten Nukleinsäure auf bzw. in Gegenwart der Magnetpartikel zu führen. Dies ist aber im allgemeinen nicht möglich, weil die sehr empfindlichen, oft enzymatischen Nachweis- und Amplifikationsreaktionen, wie z. B. die PCR, nicht kompatibel sind mit der Anwesenheit der Beads und gehemmt werden. Teil der Erfindung ist, dass der quantitative PCR Nachweis auch in Gegenwart der Partikel ohne vorherigen Separationsschritt des Eluats erfolgen kann.

Bei den verwendeten Magnetpartikeln handelt es sich um magnetische Eisenoxide, die kommerziell erhältlich sind und im Magnetfeld abgetrennt werden können. Einen breiten Raum sowohl in der Literatur als auch in der Anwendung nehmen silikatisch modifizierte Adsorbentien mit superparamagnetischen Eigenschaften ein.

Unter silikatisch werden in diesem Zusammenhang Schichten aus Siliziumdioxid (SiO₂), auch Kieselsole genannt, verstanden. So lassen sich poröse Gläser mit Hilfe entsprechender Eisensalzlösungen in superparamagnetisches Glas überführen und zur DNA-Isolierung nutzen (US 0573 4020, US 0561 0274).

Die Umsetzung der Eisensalze zu magnetischem Eisenoxid ist bekannt und beispielsweise in DE 199 12 799 beschrieben.

Im überwiegenden Teil der bisher bekannten Verfahren werden die kieselgelhaltigen Magnetit-Partikel durch in-situ-Reaktionen von reaktiven Siliziumverbindungen hergestellt.

Hierzu werden überwiegend zwei verschiedene Reaktionstypen ausgenützt: Zum einen die Hydrolyse von monomeren reaktiven Siliziumverbindungen, wobei häufig Kieselsäureester, wie Tetraethylorthosilikat oder Siliziumtetrachlorid eingesetzt werden. Diese Herstellungsweise ist nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Zum anderen sind auch Verfahren beschrieben, die auf der sog. Wasserglaschemie beruhen. Wie beispielsweise in "The chemistry of Silica" P. K. Iler, John Wiley 1979 beschrieben, handelt es sich bei Wassergläsern um wasserlösliche, oligomere alkalisch eingestellte Silikatstrukturen, die beim Ansäuern zu wasserunlöslichen Kieselsolen polykondensieren.

Folgende Veröffentlichungen beziehen sich auf das Hydrolyseverfahren von monomeren, reaktiven Silikonverbindungen:
WO 96/41811 beschreibt ein Sol-Gel-Verfahren ausgehend von Tetraethylorthosilikat in Gegenwart weiterer Oxide. Durch Einarbeiten von magnetischen Materialien werden schließlich die mit Silikat modifizierten Magnet-Partikel erhalten. Auffallend bei diesen Produkten ist die relativ große Korngrößenverteilung (10-60 µm) sowie die unregelmäßigen Strukturen der entsprechenden Partikel.

Das kann insbesondere zu Schwierigkeiten beim Pipettieren und damit zu einer reduzierten Genauigkeit in der anschließenden PCR-Analyse führen.

In WO 01/71732 sind Verfahren beschrieben, die auf alkalischer oder saurer Hydrolyse von Tetraethoxysilan beruhen. Kommerziell erhältliche Eisenoxidpartikel werden in Alkohol suspendiert, wobei die hydrolysierten SiO₂ Strukturen auf den Eisenoxidpartikeln niederschlagen. Es werden Partikel mit einer Korngrößenverteilung von 5 bis 25 µm und einer spezifischen Oberfläche (BET) im Bereich von 190 bis 270 m²/g erhalten.

Auffallend ist, dass die Korngrößenverteilung deutlich größerer und breiter ist, als die eingesetzten Primärpartikel der Magnetoxide. So erhält man aus dem Magnetit Bayoxide 8713H, das eine enge Korngrößenverteilung im Bereich von ca. 0,1 bis 0,8 µm besitzt, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren deutlich größere Partikel (größer 5 µm) in einer Verteilung von 5 bis 10 µm. Um gute Bindungseigenschaften zu erhalten, wird hier gesagt, muss der SiO₂-Anteil im Magnetit mindestens 30% oder mehr betragen.

Das Verfahren zur Herstellung von silikatischen Magnetiten durch Ansäuern von Wassergläsern (Natriumsilikate) in Gegenwart von Eisenoxiden ist in folgenden Anmeldungen beschrieben: WO 98/31840 DE 199 12 799 sowie in der o. g. Veröffentlichung WO 01/71732

Das Gemeinsame bei allen diesen Verfahren ist, dass durch Ansäuern der Magnet- Partikel/Wasserglas-Suspension die Kieselsol-Fällung ausgelöst wird. In DE 199 12 799 und WO 01/71732 wird dazu Essigsäure verwendet. In DE 42 07 262 sind auch Mineralsäuren oder CO₂ erwähnt.

Wie in WO 01/71732 beschrieben, muss bei Verwendung von Silikat (Wasserglas) oder Silika-Nanopartikeln im Reaktionsgemisch ein pH-Wert von sechs oder kleiner eingestellt werden. Es handelt sich hierbei um einen relativ komplexen, mehrstufigen Prozess, der in alkoholischer Suspension durchgeführt wird.

Auch hierbei entstehen aus den sehr feinteiligen Magnetit-Primärpartikeln durch die Umsetzung deutlich größere Endprodukte. Diese Partikelvergrößerung ist damit zu erklären, dass beim Ansäuern der Silikatlösung wasserunlösliche Silikatgele entstehen, die magnetische Primärpartikel einschließen. So werden, wie in WO 01/7132 beschrieben, aus Magnetit-Partikeln mit Teilchengrößen < 1 µm (Magnetic Pigment 345, BASF) Endprodukte mit einem Partikeldurchmesser von 25 µm erhalten.

Detaillierte Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von SiO₂-umhüllten magnetischen Partikeln, welche sich besonders gut zur Isolierung bzw. automatisierten Aufreinigung von Nukleinsäuren, meistens aus biologischen Körperproben, ganz besonders Serum, zwecks deren Nachweis mit verschiedenen Amplifikationsmethoden, eignen. Das hier von uns beschriebene Verfahren der Aufreinigung ist dadurch gekennzeichnet, dass ein quantitativer Nachweis auch in Gegenwart der magnetischen Partikeln durchgeführt werden kann; d. h. das Partikel vor der PCR nicht abgetrennt werden müssen.

Der Ausdruck "SiO₂-umhüllte magnetische Partikel" umfasst Magnetit-Kerne, die aus mindestens 80, bevorzugt 90 Gewichtprozent Fe₃O₄ bestehen und deren Oberfläche mit Silikat beschichtet ist.

Es wurde überraschenderweise ein neues Verfahren zur Herstellung von SiO₂- beschichteten Fe₃O₄ Magnetpartikeln (Magnetit) gefunden, das die o. g. Merkmale (mehrstufiger Herstellprozeß, Ansäuern der Rezeptur und Vergrößerung der eingesetzten Partikel, schlechte Pipettierbarkeit des Reaktionsprodukts) nicht aufzeigt und dadurch gekennzeichnet ist, dass die Silikat-Abscheidung aus Wassergläsern oder Kieselsolen ohne Einstellung des Reaktionsgemisches auf saure pH Werte erfolgt.

Das neue Verfahren ist durch folgende Randbedingungen gekennzeichnet:

Bei den eingesetzten Magentiten handelt es sich vorzugsweise um hydrophile, kommerziell erhältliche Eisenoxide (Fe₃O₄), die bevorzugt in enger Korngrößenverteilung und kugelförmiger Morphologie verfügbar sind.

Derartige Produkte werden bspw. von der Fa. Bayer AG unter dem Produktnamen BAYOXIDE E hergestellt. Geeignete Typen sind unter der Bezeichnung BAYOXIDE E8706, E8707, E8709 und E8710 erhältlich.

Obwohl mit allen genannten BAYOXIDE E Produkten gute Ergebnisse erzielt werden konnten, wurde vorzugsweise der Typ E 8707 verwendet.

Dieses magnetische Pigment besitzt eine kugelförmige Morphologie bei einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,2 µm und enger Korngrössenverteilung (ca. 0,1 bis 0,7 µm). Der Oberflächen pH Wert (Bestimmung nach ISO 787 Teil 9) dieser Magnetit-Partikel liegt laut Spezifikation bei 6,5 und die spezifische Oberfläche (BET) bei 12 m²/g. Der Eisenoxidgehalt (Besimmung nach DIN 55 913) liegt laut Spezifikation bei 97%, wobei als Restbestandteil mittels ESCA Silizium ermittelt wurde. Die magnetischen Eigenschaften dieser Eisenoxid-Partikel sind durch folgende Werte charakterisiert: Coercivity (iHc): 70 Oe, Remanence (Br) 525 G, 9,1 emu/g, Saturation magnetisation (Bs) 5 100 G, 88,3 emu/g.

Ähnliche Produkte werden auch von BASF unter dem Namen "Magnetic Pigment 340" bzw. "345" vertrieben.

Als Ausgangsmaterialien zum Einführen von Slikatgruppen können sowohl Alkalisilikate (Natron- oder Kali-Wassergläser) als auch Kieselsole eingesetzt werden.

Geeignete Wassergläser, die üblicherweise sehr hohe pH Werte (13-14) besitzen, werden von verschiedenen Firmen, bspw. Merck oder Cognis angeboten.

Ein wichtiges Kriterium bei Wassergläsern ist das Verhältnis von SiO₂/Na₂O bzw. SiO₂/K₂O, charakterisiert durch den sog. MV-Wert (Molverhältnis). Je höher dieser Wert, desto weniger Säure ist erforderlich um die Wassergläser in die entsprechenden Kieselsole zu überfuhren. Überraschenderweise wurde gefunden, dass Wassergläser mit relativ hohen MV-Verhältnissen besonders vorteilhaft für das erfindungsgemäße Verfahren sind. Bevorzugt werden Alkaliwassergläser mit einem MV-Verhältnis von 3.2 oder größer.

Besonders geeignet sind bspw. das Kaliwasserglas 28/30 (MV = 3.92-4.08) sowie das Natronwasserglas HK 30 (MV = 3.82-4.02) der Fa. Cognis.

Kieselsole, die alternativ zu Wassergläsern eingesetzt werden können, werden aus Wassergläsern durch Alkalientzug, Einstellen des pH auf Werte von größer/gleich 9, und Tempern hergestellt, wobei Kieselsol Partikel mit Teilchengrößen im Bereich einiger Nanometer entstehen.

Geeignete Produkte werden von der Bayer AG unter dem Produktnamen Levasil 100, Levasil 200 und Levasil 300 hergestellt. Diese Produkte haben einen pH Wert im Bereich von 9-10 und Partikelgrößen im Bereich von 9 bis 30 nm.

Das erfindungsgemäße Verfahren besticht durch seine Einfachheit. Das zu beschichtende Material, bspw. Bayoxide E 8707, wird unter Rühren in eine verdünnte bspw. 1%ige Wasserglaslösung gegeben. Nach einer Verweilzeit von ca. 30 Minuten wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Der Oberflächen pH-Wert der Magnetpartikel liegt unterhalb des pH-Wertes der eingesetzten Silikat-Quelle (Wasserglas oder Kieselsol).

Überraschend ist, dass die Morphologie der so behandelten magnetischen Partikel sich vom Ausgangmaterial überhaupt nicht unterscheidet, d. h. eine Agglomeration der Primärpartikel kann vollkommen vermieden werden, was elektronenmikroskopisch leicht nachgewiesen werden kann. Eine Partikelvergrößerung, wie in den o. g. Anmeldungen beschrieben, wird vollkommen verhindert.

Auffallend ist auch, dass die elektonenmikroskopischen Untesrsuchungen zeigen, dass die Partikeloberfläche glatt, also weitgehend porenfrei ist. Dies äußert sich auch in der Tatsache, dass die PCR quantitativ auch in Anwesenheit der Partikel läuft. Offensichtlich können die Nukleinsäuren wegen der Ermangelung von Poren der Partikel nicht in solche diffundieren, wo die Zugänglichkeit und die Effektivität der Polymerase eingeschränkt ist.

Diese siliziumbeschichteten Magnetpartikel können für die effiziente und quantitative Aufreinigung von Nukleinsäuren eingesetzt werden (s. Beispiele).

Der Ausdruck "Isolierung" umfasst die Aufreinigung der Nukleinsäure aus einer biologischen Probe unter Verwendung der oben genannten siliziumbeschichteten Magnetpartikel und teilt sich im wesentlichen in folgende Einzelschritte auf:

a) Aufschließen der Probe in einem Reaktionsgefäß mit einem Lyse- und Bindungspuffer, welcher vorzugsweise sogenannte chaotrope Salze, besonders bevorzugt Guanidin(ium)isothiocyanat, in hoher Molarität enthält
b) Zugabe von silikatbeschichteten Magnetpartikeln
c) Inkubation bei einer Temperatur, bei der die Nukleinsäure an die Magnetpartikel bindet
d) Entfernung nicht gebundener Bestandteile aus dem Reaktionsansatz durch Anlegen eines Magnetfeldes, welches die Magnetpartikel von der umliegenden Flüssigkeit abtrennt
e) Mehrmaliges Zugeben eines Waschpuffers mit anschließender Entnahme desgleichen bei Magnetisierung der Partikel zur Reinigung der Nukleinsäure von unspezifisch gebundenen Molekülen
f) Zugabe eines Elutionspuffers unter Bedingungen, wo die Nukleinsäure von dem Magnetpartikel getrennt wird
g) Abtrennen des Eluats mit der Nukleinsäure nach erneutem Anlegen eines Magnetfeldes.

Überraschenderweise haben die Erfinder die Beobachtung gemacht, dass der zuletzt genannte Schritt der Aufreinigung (g) weggelassen werden kann und der quantitative Nachweis mit der PCR auch in Anwesenheit der Magnetpartikel erfolgen kann, da diese die Nachweisreaktion nicht negativ beinflussen und alle Nukleinsäuren der PCR Reaktion zur Verfügung stehen (s. Beispiel 4).

Der Ausdruck "automatisierte Aufreinigung" umfasst Varianten dieses Verfahren, in denen die manuelle Arbeitskraft von menschlichem Personal ganz oder auch nur in Teilschritten ersetzt und insbesondere bei den Schritten der Aufschließung der biologischen Körperprobe mit einem speziellen Puffer, der Zugabe von magnetischen Partikeln, der Inkubation bei einer bestimmten Temperatur, der Entfernung nicht absorbierter Probenbestandteile, den Waschschritten, der Elution gebundener Nukleinsäuren von den Partikeln bei einer bestimmten Temperatur und dem Abtrennen des Eluats von der Partikelsuspension Anwendung findet.

Der Ausdruck "Nukleinsäuren" umfasst oligomere und polymere Ribonukleotide bzw. 2'-Desoxyribonukleotide mit einer Kettenlänge von mehr als 10 Monomereinheiten. Die Monomereinheiten in Nukleinsäuren sind über Phosphorsäurediesterbindungen zwischen 3'- und 5'-Hydroxylgruppe benachbarter Monomereinheiten verknüpft und an das 1'-Atom der jeweiligen Kohlenhydratkomponente ist glykosidisch eine heterocyclische Base gebunden. Nukleinsäuren können durch Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen Doppel- und Dreifachstränge ausbilden.

Ebenso sind Protein-/Nukleinsäurekomplexe sowie Nukleinsäuren mit synthetischen Nukleotiden, wie Morpholinos oder PNA's (peptide nucleic acids), gemeint.

Der Ausdruck "biologische Körperprobe" umfasst nukleinsäurehaltiges, biologisches Material, wie z. B. Gesamtblut, Blutserum oder Blutplasma, insbesondere virushaltiges Serum oder Plasma, dabei ganz besonders HIV und HCV infizierte Serumproben, "Buffy Coat" (= weiße Blutkörperchenfraktion des Blutes), Faeces, Ascites, Abstriche, Sputum, Organpunktate, Biopsien, Sekrete, Liquor, Galle, Lymphflüssigkeit, Urin, Stuhl, Sperma, Zellen und Zellkulturen. Ebenso kann es sich um Nukleinsäuren handeln, welche aus biochemischen Prozessenstammen und anschließend aufgereinigt werden sollen.

Der Ausdruck "Nachweis mit verschiedenen Amplifikationsmethoden" umfasst die Vervielfältigung der aufgereinigten Nukleinsäuren mit Hilfe verschiedener molekularbiologischer Technologien, insbesondere der PCR, der transkriptionsmediierten Amplifikation (TMA), LCA oder auch NASBA und die anschließende oder simultane Detektion der Amplifikationsprodukte. Ebenso ist der Nachweis mit Signalamplifikationsmethoden, wie z. B. der bDNA, also ohne Nukleinsäureamplifikation gemeint. Die Detektion insbesondere der PCR kann durch die Anwendung kinetischer Verfahren mit Hilfe der Fluoreszenztechnologie auch unter "real-time" Bedingungen durchgeführt werden oder auf einem klassischen Agarose- Gel erfolgen. Insbesondere die "real-time" PCR ermöglicht eine sehr gute quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren unter Verwendung von entsprechenden Kalibratoren. Kritisch und limitierend für die klinische Sensitivität (Vermeidung von falsch negativen Ergebnissen) ist dabei die effiziente Aufreinigung der Nukleinsäuren, d. h. effiziente Bindung an das Magnetpartikel und reversible Freisetzung unter PCR kompatiblen Bedingungen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, das folgende Bestandteile enthält:

a) Reagenzien zum Aufschließen der Probe
b) Siliziumhaltige Magnetpartikel oder eine Suspension von siliziumhaltigen Magnetpartikeln
c) Waschpuffer
d) Elutionspuffer.

Für die einzelnen Komponenten des Kits gelten die vorstehenden Ausführungen und nachfolgenden Beispiele. Einzelne oder mehrere Komponenten des Kits können auch in veränderter Form Verwendung finden.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, aufgrund der Verwendung von speziell hergestellten siliziumbeschichteten Magnetpartikeln besonders effizient und quantitativ Nukleinsäuren aus biologischen Körperproben, insbesondere virushaltiges Serum oder Plasma aufzureinigen und mit entsprechenden Amplifikationstechniken nachzuweisen.

Somit stellt die vorliegende Erfindung einen wichtigen Beitrag für die Nukleinsäurediagnostik dar.

Beispiele

Nachfolgend werden beispielhaft Protokolle zur Durchführung der beschriebenen Erfindung gegeben. In diesen Beispielen werden exakte Reaktionsbedingungen für die jeweilige aufzureinigende Nukleinsäure angegeben, allerdings können verschiedene Parameter, wie z. B. Magnetpartikelmenge, Inkubations- und Waschtemperatur, Inkubations- und Waschzeiten sowie die Konzentration von Lysispuffer, Waschpuffer und Elutionspuffer, in Abhängigkeit von der jeweiligen auzureinigenden Nukleinsäure variiert werden.

Beispiel 1

Herstellen von silikatbeschichteten Magnetit-Partikeln

Beispiel 1.a

0,25%ige Wasserglaslösung

In 1000 ml einer wässrigen 0,25%igen Wasserglaslösung (HK 30; Cognis) wurden unter Rühren 50 g Bayoxide E 8707 gegeben, anschließend wurde noch 30 Min. bei RT nachgerührt.
Die Partikel wurden abfiltriert, 5mal mit Wasser und einmal mit Ethanol gewaschen und anschließend 5 Std. bei 80°C getrocknet.

Beispiel 1.b

20%ige Wasserglaslösung

Der Versuch erfolgte analog zu 1.a. nur dass anstelle der 0,25%igen eine 20%ige wässrige Wasserglaslösung eingesetzt wurde.
Durch die Wasserglasbeschichtung wurden bei den Eisenoxid-Magnetiten die folgenden Eigenschaftsveränderungen erzielt:

Beispiel 2

Aufreinigung von DNA Plasmid aus Serum

In einem Eppendorf-Reaktionsgefäß werden zu 100 µl fötalem Kälberserum (GIBCO) 0,45 ng (in 5 µl H₂O) eines pCR II-TOPO Plasmids (Invitrogen), welches ein kloniertes 100 bp Fragment mit einer Teilsequenz aus dem Pseudorabies Virus (Seq ID No: 1) enthält, hinzugegeben. Dies entspricht 10⁸ Plasmidkopien. Desweiteren werden Ansätze mit 10⁶, 10⁴ und 10² Kopien in jeweils 5 µl vorbereitet. Anschließend werden 400 µl des Bindungspuffers (5 M Guanidiniumisothiocyanat, 10 mM TrisHCl, 20% Triton, pH 8,8) sowie 2 mg der beschriebenen siliziumbeschichteten Magnetpartikel aus Beispiel 1a hinzugegeben. Die Ansätze wird dann 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer 5436) inkubiert. Danach werden die Magnetpartikel durch Anlegen eines Magnetfeldes (1 min) an die Gefäßwand gezogen und der Überstand sauber abpipettiert. Anschließend werden die Magnetpartikel insgesamt zweimal mit einem Waschpuffer (50% Äthanol, 20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) unter jeweiligem Anlegen des Magnetfeldes gewaschen und 5 min bei 37°C getrocknet. Zur Elution der gebundenen Nukleinsäure werden 50 µl TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,0) zu den Partikeln gegeben und 10 min bei 90°C inkubiert. Zuletzt wird nochmals ein Magnetfeld angelegt und das Eluat der Ansätze von den Partikeln abpipettiert.

Beispiel 3

Quantitativer Nachweis des Plasmids mit kinetischer PCR

Der quantitative Nachweis der aufgereinigten Nukleinsäuren erfolgt mit Hilfe des qPCR-Analysegerätes 7700 der Firma ABI.
5 µl der verschiedenen Eluate werden mit 45 µl PCR Mastermix (Endkonzentration: 300 nM Primer A (Seq ID No. 2), 300 nM Primer B (SeqID No. 3), 150 nM Taqman Sonde (Seq ID No. 4), angesetzt mit Taqman Mastermix von ABI, Best.Nr. 58004008-O 1) in eine 96well Mikrotiterplatte (ABI) gegeben und nach Verschließen ins Analysegerät gestellt. Als Standards für die Eichkurve wird eine absteigende Verdünnungsreihe von 10⁸, 10⁷ bis 10¹ Kopien pro 5 µl pipettiert. Die anschließende PCR erfolgt unter folgenden Bedingungen: 2 min 50°C, 10 min 95°C, 45 Zyklen mit 15 Sekunden 95°C, 1 min bei 60°C.
Nach dem Lauf wird mit Hilfe der Gerätesoftware bei einem gewählten Basiswert (Fluoreszenzintensität) im exponentiellen Amplifikationsbereich der Signalkurven jedem Standard und unbekannter Probe ein individueller C_t-Wert (Zykluszahl, wo der gewählte Basiswert die Amplifikationskurve schneidet) zugeordnet und damit eine Eichkurve erstellt. Mit dieser Eichkurve lässt sich die Plasmidkopienzahl der Eluate bestimmen und sich die Aufreinigungsausbeute in % der eingesetzten Kopien ausdrücken: Tabelle

Beispiel 4

Quantitativer Nachweis von aufgereinigtem Plasmid in Gegenwart der magnetischen Partikel

Es wurden 3 Ansätze mit je 0,5 mg Magnetpartikeln und 10⁸ Plasmidkopien nach Beispiel 2 aus Serum aufgereinigt. Nach dem Trocknen des Magnetpartikel-Pellets werden zu allen Ansätzen wiederum 50 µl TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,0) zu den Partikeln gegeben. Bei Ansatz 1 (Suspension 1) werden 5 µl in der PCR vermessen. Beim zweiten Ansatz werden die Partikel (Suspension 2) 10 min bei 90°C inkubiert und wiederum 5 µl in der PCR vermessen. Mit dem 3. Ansatz wird wie in Beispiel 2 verfahren, d. h. 10 min bei 90°C inkubiert und das Eluat abpipettiert. Nun gibt man wiederum 50 µl TE-Puffer zu den eluierten Magnetpartikeln (Suspension 3). Es werden sowohl 5 µl davon als auch vom Eluat vermessen und die Wiederfindungsrate von allen Ansätzen in % ausgedrückt.

Beispiel 5

Aufreinigung genomischer DNA aus Blut

In einem Eppendorf-Reaktionsgefäß werden zu 10 µl Blut 400 µl des Bindungspuffers (5M Guanidiniumisothiocyanat, 10 mM TrisHCl, 20% Triton, pH 8,8) sowie 1 mg des beschriebenen siliziumbeschichteten Magnetpartikels aus Beispiel 1a hinzugegeben. Der Ansatz wird dann 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer 5436) inkubiert. Danach werden die Magnetpartikel durch Anlegen eines Magnetfeldes (1 min) an die Gefäßwand gezogen und der Überstand sauber abpipettiert. Anschließend werden die Magnetpartikel insgesamt zweimal mit einem Waschpuffer (50% Äthanol, 20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) unter jeweiligem Anlegen des Magnetfeldes gewaschen und 5 min bei 37°C getrocknet. Zur Elution der gebundenen Nukleinsäure werden 50 µl TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) zu den Partikeln gegeben und 10 min bei 90°C inkubiert. Zuletzt wird nochmals ein Magnetfeld angelegt und das Eluat des Ansatzes von den Partikeln abpipettiert.

Beispiel 6

Quantifizierung der aufgereinigten genomischen DNA mit PCR

Der quantitative Nachweis der aufgereinigten Nukleinsäuren erfolgt mit Hilfe des qPCR-Analysegerätes 7700 der Firma ABI. Dazu wird ein Teil des β-Actin Gens mit Komponenten des "TaqMan DNA Template Reagents" Kits der Firma Applied Biosystems (Best. Nr. 401970) amplifiziert, das u. a. den β-Aktin-forward Primer, den β-Aktin-reverse Primer und die β-Aktin-Probe beinhaltet.
5 µl des verschiedenen Eluates werden mit 45 µl PCR Master-Reaktionsmix, bestehend aus 300 nM β-Aktin-Forward Primer, 300 nM β-Aktin-reverse Primer, 200 nM β-Aktin-Probe und lx Taqman Mastermix von ABI, Best.Nr. 58004008-01, in eine 96well Mikrotiterplatte (ABI) gegeben und nach verschließen ins Analysegerät gestellt. Als Standards für die Eichkurve wird eine absteigende 10-fach Verdünnungsreihe von 100 ng - 0,1 ng pro 5 µl humaner Placenta DNA der Firma Sigma (Best. Nr. D-3287) pipettiert. Die anschließende PCR erfolgt unter folgenden Bedingungen: 2 min 50°C, 10 min 95°C, 45 Zyklen mit 15 Sekunden 95°C, 1 min bei 60°C.
Nach dem Lauf wird mit Hilfe der Gerätesoftware bei einem gewählten Basiswert Fluoreszenzintensität) im exponentiellen Amplifikationsbereich der Signalkurven jeder Probe ein individueller Ct-Wert (Zykluszahl, wo der gewählte Basiswert die Amplifikationskurve schneidet) zugeordnet. Mit Hilfe der Standards wird aus diesen Werten eine Eichkurve erstellt. Anhand dieser Eichkurve ermittelt die Gerätesoftware mit den gemessenen Ct-Werten der Eluatproben die darin enthaltene DNA-Menge. In 2 unabhängigen Experimenten aus der gleichen Blutprobe wurden jeweils 51 bzw. 80 ng aus 10 µl Blut isoliert.

SEQUENCE LISTING

Claims

1. Siliziumbeschichtete Magnetpartikel, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Silizium bezogen auf das Gesamtgewicht weniger als 20% beträgt.

2. Siliziumbeschichtete Magnetpartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Material Eisenoxid ist, das ggf. SiO₂ in Konzentrationen von 7 oder weniger Gewichtsprozent enthalten kann.

3. Siliziumbeschichtete Magnetpartikel nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Korngrößenverteilung zwischen 0,1 und 1 µm liegt

4. Verfahren zur Herstellung von Partikeln nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Silikatabscheidung aus Wasserglas oder Kieselsol auf den Eisenoxidpartikeln ohne Einstellung des Reaktionsgemisches auf saure pH-Werte erfolgt.

5. Verfahren zur Herstellung von Partikeln nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein SiO₂-haltiges, hydrophiles Eisenoxid- Pigment mit einem pH Wert von 7,0 oder weniger mit einer Alkalisilikatlösung mit einem pH Wert von 10 oder höher umgesetzt wird.

6. Verfahren zur Herstellung von Partikeln nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein SiO₂-haltiges, hydrophiles Eisenoxid-Pigment mit einem pH Wert von 7,0 oder weniger mit einem Kieselsol eines pH Wertes von 8 oder höher umgesetzt wird.

7. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus biologischen Körperproben unter Verwendung von Magnetpartikeln nach den Ansprüchen 1 bis 3.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Prozess ganz oder in Teilschritten automatisierbar ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass der quantitative Nachweis der isolierten Nukleinsäure mit PCR in Anwesenheit der Magnetpartikel erfolgen kann ohne vorherigen Trennschritt.

10. Verfahren nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Nukleinsäure um RNA oder DNA handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um virale RNA handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich RNA von HCV oder HIV handelt.