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Bereich der Erfindung
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Die Erfindung betrifft die Herstellung von Nanopartikeln mit verbesserten Eigenschaften für die Isolierung von Biomolekülen sowie Nanopartikel mit verbesserten Eigenschaften. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können zur Isolierung von Biomolekülen wie Nukleinsäuren, Proteinen, Lipiden und Kohlenhydraten angewandt werden. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Nanopartikel zur Isolierung von Nukleinsäuren, ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren und einen Kit zur Isolierung von Nukleinsäuren.
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Stand der Technik
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Die Isolierung von Biomolekülen aus Medien wie Blut, Gewebe, Zellextrakten oder ähnlichem stellt insbesondere in Bereichen der Medizin, Pharmazie und Biotechnologie eine komplexe Aufgabe dar. Häufig liegen die zu isolierenden Biomoleküle in wässrigen Systemen in Kombination mit einer Vielzahl an anderen Biomolekülen, Pufferionen und Salzen vor.
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Zur Isolierung von Biomolekülen sind Nanopartikel mit einer Größe zwischen 5 Nanometer und 1 Mikrometer bekannt, die aus einem mit einer Beschichtung umhüllten Kern bestehen. Die meisten dieser Nanopartikel werden nasschemisch hergestellt, indem auf die Kerne in einem flüssigen Reaktionsmedium mit einem Überzugsmittel eine Hüllschicht aufgebracht wird. Verfahren zur Herstellung von Metall-, Halbleiter-, Magnet- oder Polymer-Kernen sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Die Beschichtung der Kerne mit Silikatisierungsmitteln, Silanen und Siloxanen als Überzugsmittel unter Ausbildung einer Hüllschicht aus Siliziumdioxid, Silikaten, Kieselsäurederivaten oder Polymeren wie Polyorganosiloxanen ist ebenfalls aus einschlägiger Fachliteratur bekannt.
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Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Biomolekülen mittels Nanopartikel sehen im Allgemeinen einen Schritt zur Bindung der Biomoleküle an die beschichteten Nanopartikel vor. Die Wechselwirkungen zwischen den Nanopartikeln und den Biomolekülen, die zur Bindung führen, können verschiedener Natur sein. Beispielsweise können die Wechselwirkungen auf der Ausbildung kovalenter Bindungen und/oder Ionenverbindungen und/oder Wasserstoffbrückenbindungen und/oder Van-der-Waals Kräften beruhen. Der Fachmann wählt hierbei in der Regel die Bedingungen derart, dass die gewünschte Biomolekül-Spezies, beispielsweise Nukleinsäuren, möglichst selektiv an die Nanopartikel bindet. In einem weiteren Schritt werden die Nanopartikel mit den gebundenen Biomolekülen abgetrennt und schließlich die Biomoleküle wieder von den Nanopartikeln abgelöst.
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Von Nachteil bei der selektiven Isolierung von bestimmten Biomolekülen mit Hilfe bekannter Nanopartikel ist jedoch, dass die Biomoleküle nach der Abtrennung noch erhebliche Verunreinigungen durch andere Biomoleküle, Salze und Fremdelektrolyte aufweisen, die die Biomoleküle für eine Charakterisierung mittels empfindlicher analytischer Methoden nur bedingt zugänglich machen.
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Aufgabe der Erfindung
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Aufgabe der Erfindung ist die Überwindung der Nachteile des Standes der Technik durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Nanopartikeln mit verbesserten Eigenschaften für die Isolierung von Biomolekülen sowie durch die Bereitstellung von verbesserten Nanopartikeln.
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Offenbarung der Erfindung
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Gelöst wird die Aufgabe durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie durch die Nanopartikel gemäß Anspruch 9. Anspruch 10 ist auf ein Kit zur Isolierung von Biomolekülen, enthaltend die Nanopartikel, und Anspruch 11 ist auf ein Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen mit Hilfe der Nanopartikel gerichtet. Anspruch 12 ist auf die Verwendung dieser Nanopartikel für die Isolierung von Nukleinsäuren gerichtet. Weitere bevorzugte Ausführungen sind in den abhängigen Unteransprüchen definiert.
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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln für die Isolierung von Nukleinsäuren, die einen Kern und eine den Kern umhüllende Beschichtung aufweisen, bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:
- a) Bereitstellen von Kernen,
- b) Bereitstellen eines Überzugsmittels zur Aufbringung der Beschichtung auf den Kernen,
- c) Herstellung einer Mischung aus den Kernen und dem Überzugsmittel in einem flüssigen Reaktionsmedium unter Ausbildung der Beschichtung auf den Kernen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt c) eine Ultraschallbehandlung der Mischung durchgeführt wird.
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Das Verfahren nutzt die Einwirkung von Ultraschall auf die Mischung aus Kernen und Überzugsmittel in einem flüssigen Reaktionsmedium, um Nanopartikel mit verbesserten Eigenschaften herzustellen. Es wird davon ausgegangen, dass Ultraschall die bei der Bildung der Beschichtung ablaufenden chemischen Reaktionen beeinflusst. Ohne hierbei einer bestimmten Theorie folgen zu wollen, wird angenommen, dass sich Beschichtungen, die unter dem Einfluss von Ultraschall ausgebildet werden, von Beschichtungen, die in Abwesenheit von Ultraschall ausgebildet werden, unterscheiden. Möglicherweise werden durch die Ultraschallbehandlung der Mischung die chemischen Eigenschaften der Beschichtung verändert und/ oder die Struktur der Beschichtung wird unter dem Einfluss von Ultraschall unregelmäßiger ausgebildet als in Abwesenheit von Ultraschall. In Versuchen zur selektiven Isolierung bestimmter Biomoleküle wurde jedenfalls überraschend festgestellt, dass die mit den erfindungsgemäß hergestellten Nanopartikeln isolierten Biomoleküle einen höheren Reinheitsgrad und weniger Verunreinigungen durch noch vorhandene, andere Biomoleküle und Salze aufweisen, als unter vergleichbaren Bedingungen mit konventionell hergestellten Nanopartikeln gereinigte Biomoleküle.
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Für die Durchführung des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Reihenfolge in der die Kerne, das Überzugsmittel und das flüssige Reaktionsmedium zur Herstellung der Mischung in Schritt c) zusammengegeben werden, sehr variabel und letztendlich den verwendeten Kernen, Überzugsmitteln und/ oder Reaktionsmedien geschuldet. Jegliche Vorgehensweisen sind nützlich, die ein Mischen der Kerne mit dem Überzugsmittel bewirken oder dieses unterstützen. Bevorzugt bewirkt die Ultraschallbehandlung im Schritt c) gleichzeitig auch die Mischung der Kerne mit dem Überzugsmittel.
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Für das Verfahren zur Herstellung der Nanopartikel sind jegliche flüssige, wässrige und nicht-wässrige Reaktionsmedien geeignet, in denen sich beim Mischen der Kerne mit dem Überzugsmittel eine Beschichtung auf den Kernen ausbilden kann.
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Jegliche Arten von Kernen sind nützlich und schließen Kerne aus oxidischen, organischen oder hybriden Materialien ein. Magnetische oder nicht-magnetische, Metall-, Metalloxid- oder Polymer-Kerne, Kerne aus Gold, Silber, Kupfer, Platin, Kerne auf der Basis von Maghemit oder Manetit sowie aus Polystyrol, können je nach konkret gewünschter Anwendung hinsichtlich ihrer Eigenschaften ausgewählt werden. Auch Kerne aus hybriden Materialien, die zwei oder mehrere der vorgenannten Materialien enthalten, können eingesetzt werden.
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Als Überzugsmittel eignet sich jegliches Überzugsmittel, das auf den Kernen eine Beschichtung ausbilden kann. Die den Kern umhüllende Beschichtung umgibt den Kern mit einem Überzug. Die Beschichtung kann insbesondere polymer, kristallin oder amorph sein. Die Beschichtung kann den Kern konzentrisch umhüllen. Die Beschichtungsdicke kann durch die Menge an Überzugsmittel bzw. durch das Wiederholen der bereits genannten Schritte gezielt eingestellt werden.
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Bevorzugt ist das Überzugsmittel ausgewählt aus der Gruppe TEOS, TMOS oder APTS. Durch den Einsatz der reaktiven Silikate TEOS (Tetraethylorthosilikat), TMOS (Tetramethylorthosilikat) oder APTS (Aminopropyltrimethoxysilan) können Beschichtungen aus Siliziumdioxid mit hervorragenden Bindungskapazitäten für Nukleinsäuren erzeugt werden. Weitere Überzugsmittel können Silane, Siloxane, Silikate und Mischungen dieser umfassen, die unter den geeigneten Reaktionsbedingungen Poly(organo)siloxane, Silikonharze oder Silikonkautschuke als Beschichtungen ausbilden können.
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Vorzugsweise bestehen die Kerne aus magnetischem Eisenoxid oder enthalten dieses. Kerne auf der Basis von magnetischem Eisenoxid wie Magnetit oder Maghemit können den Nanopartikeln magnetische Eigenschaften verleihen, die eine Handhabung und den Einsatz der Nanopartikel erleichtern können.
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In einer bevorzugten Verfahrensvariante wird die Ultraschallbehandlung im Schritt c) im Wesentlichen über die gesamte Dauer der Ausbildung der Beschichtung durchgeführt, wodurch im Schritt c) eine Beschichtung mit einer Hüllschicht auf die Kerne aufgebracht wird. Bevorzugt wird die Schichtdicke der Hüllschicht auf einen Wert zwischen 1 nm und 500 nm, besonders bevorzugt auf einen Wert zwischen 1 nm und 50 nm, eingestellt. Besonders bevorzugt wird im Schritt c) des Verfahrens mit Ultraschall für 10 bis 90 Minuten, insbesondere bevorzugt für 10 bis 30 Minuten behandelt.
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In einer bevorzugten alternativen Verfahrensvariante wird die Ultraschallbehandlung im Schritt c) nicht über die gesamte Dauer der Ausbildung der Beschichtung durchgeführt. Hierbei bestehen vielzählige Optionen zum Vorgehen, von denen an dieser Stelle nur eine beispielhafte, nicht beschränkende Auswahl angegeben werden soll. Die Behandlung mit Ultraschall kann beispielsweise nach dem Beginn der Ausbildung der Beschichtung gestartet werden. Die Ultraschallbehandlung kann ein oder mehrmals unterbrochen werden. Es ist auch möglich, die Ultraschallbehandlung während der Ausbildung der Beschichtung abzubrechen. Zudem sind jegliche Kombinationen der einzelnen Optionen denkbar.
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Wird die Ultraschallbehandlung im Schritt c) nicht über die gesamte Dauer der Ausbildung der Beschichtung durchgeführt, wird hierdurch im Schritt c) eine Beschichtung mit mehreren Hüllschichten aufgebracht. Es können demnach zwei oder mehr Hüllschichten aufgebracht werden, insbesondere, indem im Schritt c) die Behandlung mit Ultraschall nach dem Beginn der Ausbildung der Beschichtung gestartet wird und/oder die Ultraschallbehandlung ein oder mehrmals unterbrochen wird und/oder die Ultraschallbehandlung während der Ausbildung der Beschichtung abgebrochen wird. Die Hüllschichtdicke kann hierbei zusätzlich durch die Dauer der Ultraschallbehandlung eingestellt werden. Bevorzugt wird die Schichtdicke der Hüllschicht auf einen Wert zwischen 1 nm und 50 nm, besonders bevorzugt auf einen Wert zwischen 1 nm und 10 nm, eingestellt. Aufgrund von unterschiedlichen Schichtdicken, deren Ausbildung auch in Abhängigkeit von verschiedenen Überzugsmitteln unterschiedlich lange dauern kann, können unterschiedlich lange Behandlungen mit Ultraschall erforderlich sein bis sich eine Beschichtung mit einer oder mehreren entsprechenden Hüllschichten ausgebildet hat. Die einzelnen, aufgebrachten Hüllschichten können hierbei jeweils von etwa gleicher Schichtdicke sein. Es ist jedoch auch möglich, mit dem Verfahren Hüllschichten unterschiedlicher Dicke zu erzeugen. Je nach geplanter Anwendung der Nanopartikel für die Isolierung bestimmter Biomoleküle, können somit Nanopartikel mit unterschiedlicher Größe erzeugt werden.
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Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden vor dem Schritt a) und/oder nach dem Schritt c) eine oder mehrere weitere Hüllschichten aufgebracht. Eine oder mehrere weitere Hüllschichten können durch das Wiederholen der bereits genannten Schritte erzielt werden, wobei das Überzugsmittel variiert wird und/oder Schritt c) ohne Ultraschallbehandlung durchgeführt wird. Die einzelnen, aufgebrachten Hüllschichten können hierbei jeweils von etwa gleicher oder unterschiedlicher Schichtdicke sein. Durch eine Variation an Überzugsmitteln kann mit dem Verfahren eine Beschichtung mit Hüllschichten aus unterschiedlichen Überzugsmitteln hergestellt werden.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden im Wechsel eine Hüllschicht mit Ultraschallbehandlung und eine Hüllschicht ohne Ultraschallbehandlung aufgebracht. Bevorzugt erfolgt hierbei die Ausbildung einer ersten Hüllschicht durch Mischen der Kerne mit dem Überzugsmittel in einem flüssigen Reaktionsmedium mit Ultraschallbehandlung, während die Ausbildung einer zweiten, zu der ersten benachbarten Hüllschicht ohne Ultraschallbehandlung erfolgt. Ebenso bevorzugt ist die Ausbildung einer ersten Hüllschicht ohne Ultraschallbehandlung und die Ausbildung einer zweiten Hüllschicht mit Ultraschallbehandlung. Durch die alternierende Aufbringung der Hüllschichten können Nanopartikel erhalten werden, die in der Anwendung zur Isolierung von Biomolekülen wie Nukleinsäuren besonders positive Eigenschaften aufweisen. Die optimale Dicke der jeweiligen Hüllschicht kann durch den Fachmann, auf den jeweiligen Anwendungszweck bezogen, ermittelt werden.
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Bevorzugt wird die Ultraschallbehandlung mit einer Frequenz durchgeführt, bei der in dem flüssigen Reaktionsmedium eine hydrodynamische Kavitation verursacht wird. Unter Verwendung einer Ultraschallquelle, die in dem flüssigen Reaktionsmedium Schallwellen mit einer Frequenz oberhalb von etwa 20 kHz erzeugt, kann über die hierdurch gebildeten Ultraschallschwingungen in dem Reaktionsmedium eine hydrodynamische Kavitation verursacht werden, die für sonochemische Prozesse in wässrigen und nicht-wässrigen flüssigen Reaktionsmedien genutzt werden kann. Die Kavitation bewirkt, dass während der Ausbildung der Beschichtung wiederholt winzige Bläschen gebildet werden, die anschwellen und implosionsartig kollabieren. Hierdurch werden lokal große Druck- und Temperaturunterschiede verursacht. Dies ist von Vorteil, da sich die Zeit zur Ausbildung einer Hüllschicht verkürzen kann. Zusätzlich oder alternativ zur hydrodynamisch erzeugten Kavitation, kann eine Kavitation in dem flüssigen Reaktionsmedium durch geeignete Strömungsbedingungen erzeugt werden. Dies ist beispielsweise möglich, über Umlenkungen der Strömungsrichtung eines bewegten Reaktionsmediums.
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Weiterhin umfasst die Erfindung Nanopartikel für die Isolierung von Biomolekülen, die einen Kern und eine den Kern umhüllende Beschichtung mit einer oder mehreren Hüllschichten aufweisen, und die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind. Die Nanopartikel zeichnen sich dadurch aus, dass die eine Hüllschicht oder mindestens eine von mehreren Hüllschichten unter Einwirkung von Ultraschall aufgebracht wurde. Die Nanopartikel eignen sich insbesondere für die Isolierung von Nukleinsäuren. Bei den zu isolierenden Nukleinsäuren kann es sich um natürliche oder synthetische Nukleinsäuren, um pro- oder eukaryotische, virale oder plastidäre Nukleinsäuren oder Nukleinsäuren von Bakteriophagen, um DNA, RNA, Oligonukleotide, Plasmide etc. handeln. Bei der die Nukleinsäuren enthaltenden Fraktion kann es sich um biologische Ausgangsmaterialien wie Blutplasma oder Serum sowie Zellen in Blutproben oder Gewebe und Abstrichen handeln. Auch andere Ausgangsmaterialien wie Zell-Lysate, Lösungen, die aus Aufreinigungs-, Analyse-, oder Amplifikationsprozessen stammen, wie beispielsweise PCR-Lösungen, können als Nukleinsäuren enthaltende Fraktion dienen. Durch die dem Fachmann bekannte Wahl von geeigneten Bedingungen, kann die Art der vornehmlich mit den Nanopartikeln isolierten Nukleinsäuren, wie beispielsweise RNA oder DNA, gesteuert werden. Mit den erfindungsgemäßen Nanopartikeln isolierte Nukleinsäuren liegen in hoher Reinheit vor und enthalten lediglich geringe Verunreinigungen an anderen Biomolekülen wie Proteinen sowie geringe Verunreinigungen an Salzen und weiteren Fremdelektrolyten.
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Eine bevorzugte Ausführungsform der Nanopartikel weist eine Beschichtung mit einer Hüllschicht auf. Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Nanopartikel weist eine Beschichtung mit mehreren Hüllschichten auf. Durch die Aufbringung von mehreren Hüllschichten können Nanopartikel bereitgestellt werden, die einen kontrollierten, anwendungsspezifischen Aufbau und/oder eine bestimmte Größe aufweisen. Die Beschichtung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Nanopartikel kann insbesondere mit und ohne die Einwirkung von Ultraschall aufgebrachte Hüllschichten aufweisen. Hierdurch können die Nanopartikel eine den Kern umhüllende, mehrere unterschiedliche Hüllschichten aufweisende, Beschichtung enthalten.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Nanopartikel weist die Beschichtung zwei Hüllschichten auf, mit einer den Kern unmittelbar oder mittelbar umgebenden ersten Hüllschicht und mit einer die erste Hüllschicht umgebenden zweiten Hüllschicht, wobei eine der beiden Hüllschichten unter Einwirkung von Ultraschall aufgebracht wurde. Eine Variante der Nanopartikel sieht vor, dass die erste Hüllschicht unter Einwirkung von Ultraschall aufgebracht wurde. Eine andere Variante der Nanopartikel sieht vor, dass die zweite Hüllschicht unter Einwirkung von Ultraschall aufgebracht wurde. Die Schichtdicke der ersten und der zweiten Hüllschicht kann hierbei etwa gleich sein. Zwischen erster Hüllschicht und Kern können weitere Hüllschichten aufgebracht sein. Die zweite Hüllschicht kann eine die Nanopartikel nach außen abgrenzende Oberfläche enthalten. Die Oberfläche der Nanopartikel kann zusätzlich durch Liganden modifiziert sein. Für die Oberflächenmodifikation eignen sich beispielsweise Carboxylgruppen als Liganden.
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Vorzugsweise weisen die Nanopartikel einen Partikeldurchmesser von 50 nm bis 1.000 nm, besonders bevorzugt von 150 nm bis 300 nm, auf. Bevorzugt weisen die Kerne der Nanopartikel einen Partikeldurchmesser von 3 nm bis 100 nm, besonders bevorzugt von 20 nm bis 50 nm, auf.
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Ebenfalls von der Erfindung umfasst ist ein Kit zur Isolierung von Biomolekülen, enthaltend Nanopartikel, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden.
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Bei einem weiteren Aspekt enthält die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen, umfassend den Schritt Mischen der erfindungsgemäß hergestellten Nanopartikel mit einer die Biomoleküle enthaltenden Fraktion. Durch ein solches Verfahren gelingt das Abtrennen und/oder die Anreicherung von Biomolekülen mit einer sehr hohen Selektivität. Hierbei können die erfindungsgemäß hergestellten Nanopartikel mit der die Biomoleküle enthaltenden Fraktion unter Bedingungen inkubiert werden, die es bestimmten Biomolekülen ermöglichen, unmittelbar oder mittelbar an die Nanopartikel zu binden, während andere Biomoleküle, Salze und weitere Verunreinigungen nicht oder lediglich in einem geringen Umfang gebunden werden. Optional schließt das Verfahren einen separaten Schritt zum Aufschluss der Fraktion unter Freisetzung der Biomoleküle ein. Dies kann beispielsweise bei Zellen oder Geweben sinnvoll sein. Anschließend können die Nanopartikel zusammen mit den gebundenen Biomolekülen abgetrennt und die Biomoleküle von den Nanopartikeln abgelöst werden.
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Bevorzugt enthält das Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen einen oder mehrere Waschschritte, mit der die Zahl der Verunreinigungen weiter reduziert werden kann.
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Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Nanopartikel zur Isolierung von Nukleinsäuren.
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Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand verschiedener Beispiele weiter beschrieben. Diese Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sind nicht als einschränkend für die vorliegende Erfindung zu verstehen.
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Herstellungsbeispiele für Nanopartikel
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Beispiel 1:
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Herstellung von magnetischen Nanopartikeln mit einer eine Hüllschicht aus Siliziumdioxid enthaltenden Beschichtung
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Zur Herstellung magnetischer Nanopartikel mit einer Hüllschicht aus Siliziumdioxid werden zunächst Kerne aus magnetischem Eisenoxid in Ethanol dispergiert. Der Dispersion wird anschließend eine Ammoniaklösung sowie eine bestimmte Menge Wasser als hydrolysierendes Agens zugemischt. Dazu wird TEOS gegeben und der Reaktionsansatz wird mindestens 15 Minuten mit Ultraschall unter Ausbildung einer Hüllschicht behandelt. Die entstehenden Nanopartikel werden mehrmals mit Ethanol und anschließend mit Wasser gewaschen.
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Beispiel 2:
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Herstellung von magnetischen Nanopartikeln mit einer aus mehreren Hüllschichten aus Siliziumdioxid bestehenden Beschichtung
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Kerne aus magnetischem Eisenoxid werden in Ethanol dispergiert. Der Dispersion wird anschließend eine Ammoniaklösung sowie eine bestimmte Menge Wasser als hydrolysierendes Agens zugemischt. Dazu wird TEOS gegeben und der Reaktionsansatz wird etwa 15 Minuten mit Ultraschall unter Ausbildung einer ersten Hüllschicht behandelt. Erneute Zugabe von TEOS und Rühren des Ansatzes für eine gewisse Zeit unter Wärmebehandlung ohne die Behandlung mit Ultraschall führt zur Ausbildung einer zweiten Hüllschicht.
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Auf die Synthese der beiden Hüllschichten können entweder Waschschritte oder die Synthese von weiteren Hüllschichten, wiederum gefolgt von Waschschritten, folgen. Es ist auch möglich, bereits beschichtete und gegebenenfalls gewaschene Nanopartikel erneut zu beschichten.
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Verwendungsbeispiele der Nanopartikel zur Isolierung von Nukleinsäuren
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Beispiel 3:
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Pufferzusammensetzungen für die Isolierung von Nukleinsäuren:
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- Start-Puffer:
1,3% Triton
3,25 M Guanidinthiocyanat
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
20 mM EDTA
- Lyse- und Bindungspuffer:
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
1 M NaCl
60% Ethanol
- Waschpuffer 1:
2М Guanidinthiocyanat
50mM Tris-HCl, pH 7,5
250 mM NaCl
60% Ethanol
- Waschpuffer 2:
50mM Tris-HCl, pH 7,5
50 mM NaCl
60% Ethanol
- Waschpuffer 3:
50mM Tris-HCl, pH 7,5
75% Ethanol
- Wasch- und Lagerungspuffer:
100% Ethanol
- Elutionspuffer (TE-Puffer):
10 mM Tris-HCl, pH 7,5
1mM EDTA
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Beispiel 3.1:
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magnetische Nanopartikel für die Isolierung von RNA
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Zur Isolation von RNA werden entweder magnetische Nanopartikel eingesetzt, die gemäß Beispiel 1 oder gemäß Beispiel 2 unter Aufbringung einer oder mehrerer Hüllschichten aus Siliziumdioxid hergestellt worden sind. Nanopartikel für die Isolierung von RNA mit mehreren Hüllschichten weisen eine erste, unter Einwirkung von Ultraschall aufgebrachte Hüllschicht, eine zweite, ohne Ultraschall aufgebrachte Hüllschicht, sowie eine dritte, wiederum unter Einwirkung von Ultraschall aufgebrachte Hüllschicht und schließlich eine vierte, ohne Ultraschall aufgebrachte Hüllschicht auf. Die Schichtdicken der dritten und vierten Hüllschicht sind jeweils etwa gleich. Die Schichtdicken der ersten und der zweiten Hüllschicht sind ebenfalls etwa gleich groß und betragen die Hälfte der Schichtdicken der dritten und vierten Hüllschicht.
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Die Dicke der Beschichtung der nach Beispiel 2 hergestellten Nanopartikel zur Isolierung von RNA mit vier Hüllschichten entspricht in der Summe der Dicke der Beschichtung der nach Beispiel 1 hergestellten Nanopartikel zur Isolierung von RNA mit einer Hüllschicht.
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Beispiel 3.2:
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magnetische Nanopartikel für die Isolierung von DNA
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Zur Isolation von DNA werden entweder magnetische Nanopartikel eingesetzt, die gemäß Beispiel 1 oder gemäß Beispiel 2 unter Aufbringung einer oder mehrerer Hüllschichten aus Siliziumdioxid hergestellt worden sind. Nanopartikel für die Isolierung von DNA mit mehreren Hüllschichten weisen im Unterschied zu den unter 3.1 aufgeführten Nanopartikeln eine weitere, fünfte Hüllschicht auf, die unter Einwirkung von Ultraschall aufgebracht worden ist. Die Schichtdicke der fünften Hüllschicht entspricht in etwa der Schichtdicke der vierten Hüllschicht.
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Die Dicke der Beschichtung der nach Beispiel 2 hergestellten Nanopartikel zur Isolierung von DNA mit fünf Hüllschichten entspricht in der Summe der Dicke der Beschichtung der nach Beispiel 1 hergestellten Nanopartikel zur Isolierung von DNA mit einer Hüllschicht.
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Beispiel 3.3:
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RNA-enthaltende Fraktion
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Als Fraktion zur Demonstration der Effektivität der Nanopartikel für die Isolierung von RNA wird eine Probe, enthaltend MS2-Bakteriophagen in menschlichem Blutplasma, verwendet.
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Beispiel 3.4:
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DNA-enthaltende Fraktion
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Als Fraktion zur Demonstration der Effektivität der Nanopartikel für die Isolierung von DNA wird eine Probe, enthaltend pUC19-Plasmide in menschlichem Blutplasma verwendet.
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Beispiel 3.5:
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RNA/DNA-Aufreinigung aus menschlichem Blutplasma
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Zu 100 µl Blutplasma werden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß 130 µl Startpuffer gegeben und gut gemischt. Der Ansatz wird zwischen 5 und 15 Minuten inkubiert. Anschließend wird eine Dispersion aus magnetischen Nanopartikeln in 400 µl Lyse- und Bindungspuffer zum Ansatz gegeben, wieder gut gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Anlegen eines Magnetfeldes werden die magnetischen Nanopartikel mit den daran gebundenen Nukleinsäuren an der Reaktionsgefäßwand gesammelt und der Überstand abgenommen und verworfen. Anschließend wird der Ansatz ohne den Einfluss eines Magnetfelds mit 600 µl Waschpuffer 1 gewaschen. Die Schritte des magnetischen Separierens der Nanopartikel, Abnahme des Überstands und Waschens werden mit Waschpuffern 2 und 3 wiederholt. Schließlich werden 600 µl Wasch- und Lagerungspuffer zugegeben und der Ansatz erneut gut gemischt. Die an die Nanopartikel gebundene RNA/DNA kann in dem Wasch- und Lagerungspuffer für eine lange Zeit gelagert werden. Zum Ablösen der Nukleinsäuren von den Nanopartikeln werden die Nanopartikel mit der RNA/DNA wieder magnetisch vom Überstand separiert und der Überstand verworfen. Die gesammelten Nanopartikel werden für etwa 10 Minuten bei 60°C getrocknet und in 50 bis 100 µl Elutionspuffer resuspendiert. Durch Inkubation bei 60°C für etwa 10 Minuten werden die Nukleinsäuren von den Nanopartikeln abgelöst. Mit Hilfe des erneuten Anlegens eines Magnetfeldes, können die Nanopartikel wieder separiert und der Überstand abgenommen werden. Der Überstand wird photometrisch mittels den Absorptionsquotienten 260 nm:280 nm (A(260/280)) bzw. 260 nm:230 nm (A(260/230)) auf die Reinheit der Nukleinsäuren hinsichtlich Verunreinigungen durch Proteine bzw. durch Salze untersucht.
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Vergleich der erfindungsgemäß hergestellten Nanopartikel mit herkömmlich syntetisierten Nanopartikeln
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Als Vergleich zu den erfindungsgemäß hergestellten Nanopartikeln werden Nanopartikel verwendet, die mit Hilfe der gleichen Kerne und des gleichen Überzugmittels, jedoch herkömmlich und ohne die Einwirkung von Ultraschall bzw. Kavitation, unter Ausbildung einer Hüllschicht hergestellt worden sind. Die Vergleichspartikel weisen jeweils vergleichbare Größen zu den in den Versuchen eingesetzten erfindungsgemäßen Nanopartikeln auf und werden in den gleichen Mengen und Konzentrationen wie die erfindungsgemäß hergestellten Nanopartikel eingesetzt.
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In gleicher Weise wird die oben beschiebene Isolierung von Nukleinsäuren gemäß Beispiel 3.5 für RNA mit Nanopartikeln gemäß Beispiel 3.1 mit einer Hüllschicht (RNA-NP-HS1) und mit Nanopartikeln mit einer Beschichtung aus 4 Hüllschichten (RNA-NP-HS4) sowie den Vergleichspartikeln (RNA-VP-HS1) durchgeführt. Die RNA wird aus einer Fraktion gemäß Beispiel 3.3 isoliert. Ebenso wird die Isolierung von DNA mit Nanopartikeln gemäß Beispiel 3.2 mit einer Hüllschicht (DNA-NP-HS1) und mit Nanopartikeln mit einer Beschichtung aus 5 Hüllschichten (DNA-NP-HS5) sowie den Vergleichspartikeln (DNA-VP-HS1) durchgeführt. Die DNA wird aus einer Fraktion gemäß Beispiel 3.4 isoliert. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
| Probe | Nanopartikel | A(260/280) | A(260/230) |
| 1 | RNA-VP-HS1 | 1,1 | 0,2 |
| 2 | RNA-NP-HS1 | 1,4 | 0,8 |
| 3 | RNA-NP-HS4 | 2,0 | 2,0 |
| 4 | DNA-VP-HS1 | 1,4 | 0,4 |
| 5 | DNA-NP-HS1 | 1,6 | 1,2 |
| 6 | DNA-NP-HS5 | 2,0 | >2 |
RNA-VP-HS1: Vergleichspartikel
RNA-NP-HS1: magetische Nanopartikel mit einer Hüllschicht aus Siliziumdioxd hergestellt nach Beispiel 3.1
RNA-NP-HS4: magetische Nanopartikel mit vier Hüllschichten aus Siliziumdioxd hergestellt nach Beispiel 3.1
DNA-VP-HS1: Vergleichspartikel
DNA-NP-HS1: magetische Nanopartikel mit einer Hüllschicht aus Siliziumdioxd hergestellt nach Beispiel 3.2
DNA-NP-HS5: magetische Nanopartikel mit fünf Hüllschichten aus Siliziumdioxd hergestellt nach Beispiel 3.2
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In der Tabelle zeigen die Proben 2 und 3 sowie 5 und 6 gegenüber den Vergleichsproben 1 und 4 einen deutlich gesteigerten Reinheitsgrad, was auf eine geringere Verunreinigung der Nukleinsäuren mit Proteinen und Salzen und damit auf eine höhere Reinigungswirkung der erfindungsgemäß hergestellten Nanopartikel gegenüber den konventionell hergestellten Nanopartikeln hinweist. Zudem ist in den Proben 3 und 6 nochmals eine verbesserte Reinigungswirkung durch den Einsatz von mehrfach umhüllten Nanopartikeln zu beobachten.
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Sämtliche Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein. Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind den Ansprüchen zu entnehmen.