DE102010023837A1

DE102010023837A1 - Isolierung von mesenchymalen Stammzellen

Info

Publication number: DE102010023837A1
Application number: DE102010023837A
Authority: DE
Inventors: Dr. Aicher Wilhelm; Dr. Angres Brigitte
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Landesstiftung Baden Wuerttemberg gGmbH; NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Baden-Wuerttemberg Stiftung Ggmbh De; Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2010-06-07
Filing date: 2010-06-07
Publication date: 2011-12-08
Also published as: EP2576771A2; WO2011154403A3; WO2011154403A2; US20130156819A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Peptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Laminin-1, Kollagen-1, Kollagen-3, Kollagen-4, Tenascin, Thrombospondin-1, Osteopontin, Fibronectin, Vitronectin, oder Fragmente oder Mischungen davon, zur Isolierung, Identifizierung, Kultivierung und/oder Aktivierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC). Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Peptide zur Herstellung eines Arzneimittels.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung, Identifizierung und/oder Aktivierung von mesenchymalen Stammzellen mit Proteinen bzw. daraus abgeleiteten Peptiden.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind pluripotente Zellen und können sich unter geeigneten in vitro- und in vivo-Bedingungen in verschiedene mesenchymale Gewebe differenzieren, wie bspw. in Knochengewebe, Fettgewebe, Muskeln, Knorpel. MSCs haben die Eigenschaft, stabil und schnell auf Plasitk- oder Glasoberflächen zu adhärieren, und weisen einen fibroblastoiden Phänotyp auf. MSCs lassen sich zwar gut von hämatopoetischen Stammzellen unterscheiden, da sie keine spezifischen hämatopoetischen Oberflächenmarker exprimieren. Allerdings ist im Stand der Technik für MSCs noch kein spezifisches Oberflächenantigen bekannt; die von ihnen exprimierten Oberflächenmoleküle sind auch auf Oberflächen von endothelialen, mesenchymalen und epithelialen Zellen, sowie Muskelzellen zu finden.
Der Begriff „mesenchymale Stammzellen” (MSC) ist in der Literatur nicht ganz einheitlich definiert. Grundsätzlich können zwei Zelltypen unterschieden werden: MSC, die direkt aus nicht-hämatopoetischem Primärgewebe isoliert werden (z. B. Knochenmark, Fettgewebe, Plazenta) und Zellen, die kultiviert werden, und die sich aus in Kultur aus diesen Primärzellen zu adhärenten, fibroblastoiden Zellen differenzieren. Dort exprimieren sie Zelloberflächenmarker wie CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, sind jedoch negativ für den hämatopoetischen Stammzellmarker CD34 und den Pan-Leukozytenmarker CD45. Im Allgemeinen werden die in Kultur generierten Zellen als mesenchymale Stammzellen bezeichnet, da sie selbst nach diesem Verfahren noch eine multipotente Differenzierungskapazität besitzen.
Aufgrund ihrer Multipotenz, d. h. ihrer Eigenschaft, unter geeigneten in vitro- und in vivo-Bedingungen in verschiedene mesenchymale Gewebe (wie bspw. Knochen, Fett, Muskel, Knorpel, etc.) differenzieren zu können, werden mesenchymale Stammzellen bereits für den therapeutischen Einsatz verwendet. So können bspw. aus Plazenta, Knochenmark und Fettgewebe isolierte differenzierungsfähige MSCs in vitro expandiert, zu Osteoblasten, Chondrozyten und Myozyten differenziert werden, und anschließend in vivo wieder eingesetzt werden, bspw. zur Regeneration von Knochen, Knorpel, Sehnen, Muskeln, Fettgewebe sowie Stroma.
Stand der Technik ist einerseits, dass mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark mittels Antikörpern, die gegen den niedrig-affinen Rezeptor für den Nervenwachstumsfaktor („low affinity nerve growth factor receptor” = CD271) gerichtet sind, isoliert werden können (Quirici et al., „Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies", Exp. Hematol., 2002, 30(7): 783–791). Weiterhin wurde beschrieben, dass MSC über Antikörper gegen SH2 (CD105), SH3 (CD73) und SH4 (CD73) isoliert werden können (siehe Barry F, et al., „The SH-3 and SH-4 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells", Biochem Biophys Res Commun. 2001; 289: 519–24; und Pittenger MF, et al., "Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells", Science. 1999; 284: 143–7). Der Nachteil der bisherigen Marker ist jedoch, dass sie alle nicht spezifisch für MSC sind, sondern noch weitere Zellpopulationen im Knochenmark erkennen.
Der Zelloberflächenmarker CD271 ist der bisher spezifischste Zelloberflächenmarker für die Isolierung von mesenchymalen Stammzellen, der kommerziell erhältlich ist. So werden bspw. monoklonale Antikörper gegen diesen Marker von den Firmen BD PharMingen, San Diego, USA, und Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland, vertrieben. Allerdings hat sich herausgestellt, dass dieser Marker nicht selektiv für MSC ist, sondern auch auf weiteren CD45-positiven hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. Dadurch werden bei einem Isolationsverfahren mit anti-CD271-Antikörpern nicht nur mesenchymale Zellen, sondern auch hämatopoetische Zellen isoliert.
Darüber hinaus ist die Herstellung von monoklonalen Antikörpern sehr zeit- und kostenaufwändig.
Vor dem Hintergrund der aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile, ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Möglichkeiten bereitzustellen, um mesenchymale Stammzellen (MSC) möglichst rein zu isolieren, und von kontaminierenden Zellen, wie beispielsweise Fibroblasten abzutrennen. Fibroblasten exprimieren zwar die von Dominici und Kollegen definierten Einschluss- und Ausschlusskriterien (Cytotherapy, 2006; 8: 315–7), und lassen sich mikroskopisch von MSC nicht unterscheiden. Sie sind aber keinesfalls Differenzierungskompetent. Daher ist eine Separation der MSC von Fibroblasten sehr wichtig.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass für die Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen ein Protein oder ein daraus abgeleitetes Peptid eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Laminin-1, Kollagen-1, Kollagen-3, Kollagen-4, Tenascin, Thrombospondin-1, Osteopontin, Fibronectin, Vitronectin, oder Fragmente davon, die an MSC binden können, oder Mischungen davon.
Insbesondere ist bevorzugt, wenn das Protein eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den SEQ ID Nr. 1 bis 7, und noch bevorzugter, wenn das daraus abgeleitete Peptid eine der SEQ ID Nrn. 8 bis 31 des beigefügten Sequenzprotokolls besitzt.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Die bereitgestellten Proteine bzw. die daraus abgeleiteten Peptide binden spezifisch und präferentiell an mesenchymale Stammzellen, wodurch es möglich ist mesenchymale Stammzellen von kontaminierenden Zellen wie beispielsweise Fibroblasten zu isolieren und für weitere Anwendungen einzusetzen.
Der Einsatz der offenbarten Proteine bzw. daraus abgeleiteten Peptide für die Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen ist bisher im Stand der Technik nicht beschrieben oder nahe gelegt worden.
Unter „daraus abgeleitete Peptide” oder „daraus abgeleitetes Peptid” wird vorliegend jedes Peptid verstanden, das in den aufgeführten Proteinen enthalten ist, und das daher eine Folge zusammenhängender Aminosäuren aufweist, die als solche, d. h. mit der gleichen Abfolge der Aminosäuren, in dem Protein enthalten ist; die Sequenz weist dabei Bindungseigenschaften an MSC auf, vorzugsweise die gleichen oder ähnliche wie das Gesamt-Protein. In diesem Zusammenhang versteht sich, dass mit „Protein” jeweils ein als solches identifizierte Gesamt-Protein mit bestimmten Funktionen und Strukturen gemeint ist, und mit „Peptid” ein Teil, bzw. eine Teilsequenz daraus.
Laminin ist ein vor allem in der Basallamina von Epithelien und Endothelien vorkommendes Glykoprotein mit einem 14%igen Kohlenhydratanteil. Das Lamininmolekül besteht aus einer α-, einer β- und einer γ-Proteinkette, die sich in heterotrimerer Form zum jeweiligen Lamininmolekül zusammensetzen. Gegenwärtig sind 15 verschiedene Lamininisoformen bekannt.
Kollagen ist ein zu den Skleroproteinen zählendes, wasserunlösliches, faserig aufgebautes, Protein der extrazellulären Matrix, das besonders am Aufbau von Bindegeweben, z. B. der Haut, Blutgefäße, Bänder, Sehnen und Knorpel, sowie am Aufbau von Knochen und Zähnen (Dentin) beteiligt ist. Zur Zeit sind ca. 28 verschiedene Kollagentypen bekannt (Typ I bis XXVIII), die sämtlich den Aufbau aus drei Polypeptidketten gemein haben, die man als Kollagen-Helices bezeichnet und die in Form einer Tripelhelix umeinander gewunden sind. Dabei zählen Kollagen-1 und Kollagen-3, neben Kollagen-2, -9 und -11, zu den fibrillären Kollagenen. Kollagen-1, ein Trimer, besteht dabei aus [α1(I)₂α2(I)] (Alpha-1 Typ I Kollagen) oder 3 [α1(I)] Ketten; Kollagen-3 ist ein Homotrimer aus 3 [α1(III)] Ketten.
Tenascin schließlich ist ein oligomeres Glykoprotein der extrazellulären Matrix, das an Wechselwirkungen zwischen epithelialen und mesenchymatischen Zellen beteiligt ist. In Wirbeltieren wurden bislang 3 verschiedene Typen von Tenascin beschrieben (Tenascin-R, -C und -X), die sich u. a. in der Anzahl bestimmter Domänen, nämlich der EGF- (epidermal growth factor) und Fibronektin-Typ-III-ähnlichen Domänen, unterscheiden. Tenascin ist in die Regeneration von Nervengewebe im adulten Organismus involviert. In der adulten Haut wird Tenascin während der Wundheilung induziert. Tenascin lenkt die Migration von Zellen in diesen Prozessen, wobei es die Zelladhäsion über verschiedene Proteindomänen stimulieren oder hemmen kann.
Osteopopntin ist ein Glykoprotein in allen höheren Säugetieren, das an der Erhaltung der Knochensubstanz und einigen Immunprozessen beteiligt ist. Es bindet Hydroxylapatit und bildet die Grundstruktur für Knochen. Synonyme Bezeichnungen des Proteins sind Sialoprotein I und 44K BPP (bone phosphoprotein).
Thrombospondin-1 gehört zu einer Familie von Proteinen, die an unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt sind. Die Protein-Familie besteht aus Thrombospondin-1 bis -5, wobei Untergruppen unterschieden werden: Die Untergruppe A besteht aus TSP1 und TSP2, die Homotrimere darstellen; die Untergruppe B besteht aus TSP3, TSP4 und TSP5. TSP1 ist an vielen unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt, wie der Angiogenese, der Apoptose, der Aktivierung des Gewebshormons TGF- und der Immunregulation.
Fibronektin (von lateinisch: fibra für „Faser”; nexus für „Verknüpfung”) ist ein extrazelluläres Glykoprotein, das in vielen physiologischen Abläufen eine wichtige Rolle spielt. Es ist ein Heterodimer aus zwei stabförmigen Polypeptidketten, die nahe am C-terminalen Ende durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden. Bisher wurden mehr als 20 verschiedene Isoformen gefunden, die durch alternatives Spleißen der mRNA eines einzigen Gens erzeugt werden. Eine einzelne Fibronektin-Polypeptidkette (~ 230 kDa) besteht aus einer Vielzahl von Domänen (ca. 40–90 Aminosäuren), die aufgrund ihrer Homologie in die Strukturtypen I, II, und III eingeteilt werden.
Vitronectin ist ein im Serum und der extrazellulären Matrix vorkommendes Glykoprotein, und stellt ein sekretiertes Protein da, das entweder in Form einer Einzelkette vorliegt, oder einer durch eine Disulfidbrücke verbundene Doppelkette. Die Referenz-Nummer für dieses Protein in der NCBI (National Center for Biotechnology Information) Datenbank (GenBank^®) lautet NP_000629).
Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn das Protein bzw. das daraus abgeleitete Peptid eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den SEQ ID Nr. 1 bis 31 des beigefügten Sequenzprotokolls, bzw. das einer darin enthaltenen, bindungsrelevanten Sequenz.
Die Sequenz mit der ID-Nr. 1 stellt die Sequenz der alpha-1-Kette von humanem Laminin-1 dar und ist bspw. in der GenBank^® des National Center for Biotechnology Information unter der Nummer NP_005550 aufgeführt; die Sequenz mit der ID-Nr. 2 ist die Sequenz der beta-1-Kette von humanem Laminin-1 (GenBank^® Nr. NP_002282), die Sequenz mit der ID-Nr. 3 die Sequenz der gamma-1-Kette von humanem Laminin-1 (GenBank^® Nr. NP_00284).
Ähnlich stellt die mit der SEQ ID-Nr. 4 dargestellte Sequenz die Sequenz der alpha-1(I)-Kette des humanen Kollagen dar (GenBank^® Nr. P02452), die Sequenz mit der ID-Nr. 5 die Sequenz der alpha-2(I)-Kette des humanen Kollagens (GenBank^® Nr. P08123), und die Sequenz mit der ID-Nr. 6 die Sequenz der alpha-1-(III)-Kette des humanen Kollagens (GenBank^® Nr. P02461). Die drei Sequenzen mit dem SEQ ID-Nr. 4, 5 und 6 repräsentieren daher Sequenzen für das Trimer Kollagen-1. Die Sequenz mit der SEQ ID-Nr. 6 ist darüber hinaus auch Bestandteil des Homotrimers Kollagen-3.
Die Sequenz mit der ID-Nr. 7 stellt die Sequenz des humanen Tenascin-C dar, und besitzt in der GenBank^® die Identifizierung CAA55309.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wird bei der erfindungsgemäßen Verwendung eines der folgenden bindungsspezifischen Peptid-Fragmente eingesetzt:

a) ein Peptid, das eine der in dem Sequenzprotokoll aufgeführten SEQ ID Nummern SEQ ID Nr. 8 bis 31 besitzt, oder
b) Fragmente der Sequenzen gemäß a), die eine im Wesentlichen gleiche biologische Aktivität des Peptids gemäß a) in einem Test betreffend die Bindung von mesenchymalen Stammzellen besitzen,
c) ein Peptid-Fragment mit einer Sequenz, die mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens zu zwischen 80% und 99%, identisch ist mit einer der in a) und b) aufgeführten Sequenzen.

Die Sequenzen mit den SEQ ID Nrn. 8 bis 31 stellen bevorzugte Peptide dar, mit denen mesenchymale Stammzellen spezifisch gebunden werden können. Dabei sind die Peptide mit den SEQ ID Nrn. 8 (GF-Orn-GER; enthält Ornithin an Position 3) und 9 (GEFYFDLRLKGDK) von Kollagen-1 und -4 abgeleitet, die SEQ ID Nrn. 10 bis 13 von Laminin (LRE, Laminin; AASIKAVAVSADR, Laminin alpha1 Kette; LAIKNDNLVYVY, Laminin alpha4-Kette; RYVVLPRPVLFEK, Laminin beta1 Kette), die SEQ ID Nrn. 14 und 15 von Thrombospondin (ELTGAARKGSGRRLVKGPD, Thrombospondin-1; MKKTRGTLLALERKDHS, Thrombospondin-1), die SEQ ID Nr. 16 von Osteopontin (SVVYGLR), und die SEQ ID Nrn. 17 bis 20 von Fibronectin (YIIR; GSKS; TYSSPEDGIHE; WQPPRARITGY).
Dem Fachmann wird dabei klar sein, dass außer den genannten Proteinen/Peptiden auch Proteine/Peptide zum Zwecke der erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzt werden können, die bspw. aufgrund von Sequenzhomologien funktionell gleich sind mit den offenbarten Peptiden, so dass bspw. auch Proteine eingesetzt werden können, die im Vergleich zu den genannten Proteinen/Peptiden Deletionen, Substitutionen, Insertionen, etc. möglich sein können, die aber dennoch die gleiche Funktion wie die genannten Proteine/Peptide aufweisen. So können bspw. auch lediglich bindungsrelevante Fragmente der genannten Proteine/Peptide eingesetzt werden.
In diesem Zusammenhang bedeutet „eine im Wesentlichen gleiche biologische Aktivität (eines Peptids) in einem Test betreffend die Bindung von mesenchymalen Stammzellen”, dass auch Varianten bzw. Derivate der Peptide mit den SEQ ID Nrn. 8 bis 31 im Rahmen der vorliegenden Erfindung für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet sind, mit denen eine ähnlich effektive und spezifische Bindung von mesenchymalen Stammzellen erreicht wird. Es versteht sich in diesem Zusammenhang, dass mit „im Wesentlichen” eine Aktivität gemeint ist, die nahezu gleich ist mit den Werten für die konkret mit Ihren Sequenzen offenbarten Peptide. Dem Fachmann wird hier klar sein bzw. ihm wird anhand der offenbarten Sequenzen durch zumutbare, einfache Versuche offenbar werden, welche Sequenz-Varianten noch möglich sind, um eine solch ähnliche Bindungsspezifität und -effektivität zu erreichen.
Der Begriff ”Hybridisierung unter stringenten Bedingungen” bedeutet im Zusammenhang dieser Erfindung, dass die Hybridisierung in vitro unter Bedingungen durchgeführt wird, die stringent genug sind, um eine spezifische Hybridisierung zu gewährleisten. Der Begriff ”spezifische Hybridisierung” bezieht sich auf den Umstand, dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferentiell an eine bestimmte Nukleinsäuresequenz, die Zielsequenz, bindet, wenn diese Teil einer komplexen Mischung- von z. B. DNA- oder RNA-Molekülen ist, aber nicht oder zumindest wesentlich reduziert an andere Sequenzen. Die genauen Bedingungen für eine Stringenz hängen von entsprechenden Umständen, bspw. hinsichtlich des verwendeten Materials, ab. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen eine Hybridisierung zwischen den genannten Nukleotidsequenzen unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der genannten Nukleotidsequenzen stattfindet. Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind bspw. solche, bei denen eine Lösung aus 5 × oder 6 × SSPE (oder SSC), 1% oder 0,5% SDS, 1 × Denhardts-Lösung verwendet wird, und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2 × SSC, 1% SDS und danach mit 0,2 ×/0,1 × SSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)).
Der Begriff ”Sequenzhomologie” oder ”Sequenzidentiät” bezeichnet den Anteil der zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen übereinstimmenden Basen oder den Anteil der zwischen zwei Aminosäuresequenzen übereinstimmenden Aminosäuren. Wenn die Sequenzhomologie als Prozentsatz ausgedrückt wird, z. B. 90%, bezeichnet der Prozentsatz den Anteil der Übereinstimmungen über die Länge der Sequenz, die mit einer anderen Sequenz verglichen wird.
Es versteht sich ferner, dass einerseits Proteine/daraus abgeleitete Peptide humanen Ursprungs eingesetzt werden können, dass aber andererseits auch funktionell und strukturell ähnliche/identische Proteine aus anderen Säugetieren verwendet werden können, ebenso wie künstlich synthetisierte oder rekombinant hergestellte Peptide/Proteine, die die Sequenz der genannten Proteine/Peptide – oder Teile davon – aufweisen.
Mit den genannten Peptiden konnte gezeigt werden, dass eine spezifische Bindung von mesenchymalen Stammzellen möglich ist.
Mit der erfindungsgemäßen Verwendung ist es bspw. möglich, Kulturflaschenböden mit den Proteinen bzw. den daraus abgeleiteten Peptiden zu beschichten und die daran bindenden MSC im undifferenzierten Zustand zu halten, wodurch größere Chargen an differenzierungskompetenten MSC erzeugt werden können.
Auf der anderen Seite besteht die Möglichkeit, die Proteine bzw. die daraus abgeleiteten Peptide auch zur direkten Isolierung von MSC aus Primärgewebe einzusetzen, wie bspw. aus Knochenmark, Nabelschnurblut, etc.
Darüber hinaus können die Proteine bzw. die daraus abgeleiteten Peptide dazu eingesetzt werden, die spezifische Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen in die reifen mesenchymalen Zelltypen, wie Chondrozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Myozyten zu modifizieren oder zu stabilisieren.
Darüber hinaus sind die Proteine bzw. die daraus abgeleiteten Peptide auch für in situ-Anwendungen geeignet: So können bspw. Trägerstrukturen wie Implantate oder Stents o. ä. mit den Peptiden beschichtet werden. Die MSC binden über diese Peptide an die Trägerstrukturen, wodurch die MSC lokal an den Trägermaterialien konzentriert werden. Durch eine Differenzierung der so konzentrierten mesenchymalen Stammzellen in das entsprechende Gewebe kann bspw. verletztes oder geschädigtes Gewebe regeneriert oder neues Gewebe an der Stelle der Trägerstruktur gebildet werden. Vorteilhafterweise sind die Peptide humanen Ursprungs, so dass keine Immunreaktionen auftreten.
In einer weiteren Ausführungsform ist bevorzugt, wenn die Proteine bzw. die daraus abgeleiteten Peptide zur Selektion von MSC aus einer Probe eingesetzt werden, welche MSC und andere Zelltypen enthält.
So können bspw., wie bereits weiter oben erwähnt, mittels des Einsatzes der offenbarten Proteine bzw. der daraus abgeleiteten Peptide MSC direkt aus einer Primärkultur isoliert werden, oder aber aus einer bereits kultivierten Zellpopulation.
Ferner kann bei einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung das Peptid zur Markierung von MSC eingesetzt werden.
Bei dieser Ausführungsform kann das einzusetzende Protein bzw. das daraus abgeleitete Peptid modifiziert bzw. markiert sein, bspw. durch fluoreszierende Gruppen, so dass nach Bindung des Proteins/Peptids an die MSC diese aufgrund der Markierung einfach und schnell identifiziert werden können.
Bei einer anderen Ausführungsform ist bevorzugt, wenn das Protein bzw. das daraus abgeleitete Peptid zu Anreicherung von MSC eingesetzt wird. Hierbei kann bspw. eine Anreicherung in vitro oder in situ erreicht werden, bspw. durch eine Beschichtung geeigneter Materialien/Strukturen mit den Peptiden, wie weiter oben erwähnt.
Ferner ist in einer anderen Ausführungsform bevorzugt, wenn das Protein bzw. das daraus abgeleitete Peptid zur Induktion der Proliferation oder Differenzierung von MSC eingesetzt wird.
Die Proteine bzw. die daraus abgeleiteten Peptide können bei dieser Ausführungsform gezielt dazu eingesetzt werden, die Differenzierung der MSC bspw. in Osteoblasten, Chondrozyten, Adipozyten, etc. zu modifizieren.
Bei einer noch weiteren Ausführungsform ist bevorzugt, wenn das Protein bzw. das daraus abgeleitete Peptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Laminin-1, Kollagen-1, Kollagen-3, Kollagen-4, Tenascin, Thrombospondin-1, Osteopontin, Fibronectin, oder bindungsspezifische Fragmente oder Mischungen davon, zur Behandlung von Wunden, Verletzungen und/oder von degeneriertem Gewebe eingesetzt wird.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass auf Protein/Peptid-Strukturen zurückgegriffen werden kann, die humanen Ursprungs sind, und daher keine oder kaum Immunreaktionen hervorrufen, wenn sie, bspw. im Zusammenhang mit einer Trägerstruktur, auf der sie immobilisiert sind, in den Körper eines Patienten eingebracht werden.
Das zu behandelnde Gewebe kann dabei jedes Knochen-, Knorpel und/oder Muskelgewebe sein, vorzugsweise des Menschen.
Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn das Arzneimittel ein mit zumindest einem Peptid beschichtetes Implantat, insbesondere ein Stent ist.
Ein Stent ist eine Endoprothese, verschiedenen Materialien, die allgemein der Offenhaltung von Körpergefäßen dienen, und die röhrenartig und/oder als Maschengeflecht mit oder ohne Mantel ausgebildet sind. Stents werden in komprimierter Form über ein geeignetes Einführsystem in die Gefäße eingeführt und am Bestimmungsort zum dortigen Verbleib entfaltet. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist vorgesehen, dass der einzusetzende Stent mit dem Protein bzw. dem daraus abgeleiteten Peptid beschichtet wird und anschließend in das zu behandelnde Gefäß eingeführt wird.
Andererseits können auch Implantate, bspw. zum Haut-, Knorpel- oder Knochenersatz oder -regeneration, mit den Peptiden beschichtet und in die zu behandelnde Körperregion implantiert werden. Beispielhaft sollen hier Implantate zur Behandlung von Knie- und Bandscheibenschäden genannt werden, wobei dem Fachmann klar sein wird, dass auch jedes andere Implantat, das zur Regeneration oder zum Ersatz von Gewebe in einen Körper implantiert wird, entsprechend beschichtet werden kann. Nach Implantation in die zu behandelnde Stelle im Körper eines Patienten werden die MSC über die auf dem Träger vorliegenden Peptide dort konzentriert, wodurch eine Art „Wundpflaster” geschaffen wird.
Dementsprechend betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines Proteins bzw. eines daraus abgeleiteten Peptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Laminin-1, Kollagen-1, Kollagen-3, Kollagen-4, Tenascin, Thrombospondin-1, Osteopontin, Fibronectin, oder bindungsspezifische Fragmente oder Mischungen davon, zur Herstellung eines Implantats.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Isolierung, Identifizierung, Kultivierung und Aktivierung von mesenchymalen Stammzellen, umfassend den Schritt der Selektion der Stammzellen aus einer Stammzellen enthaltenden Probe mit einem Protein bzw. daraus abgeleiteten Peptid, das ausgewählt ist aus Laminin-1, Kollagen-1, Kollagen-3, Kollagen-4, Tenascin, Thrombospondin-1, Osteopontin, Fibronectin, oder bindungsspezifische Fragmente oder Mischungen davon, insbesondere mit einem Peptid der SEQ ID Nr. 1 bis 31.
Die mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Stammzellen, die ebenfalls von der Erfindung umfasst sind, können wiederum, wie weiter oben erwähnt, zur Behandlung von bspw. degeneriertem oder verletzten Gewebe eingesetzt werden, bspw. zur Behandlung von Knochen, Knorpeln und/oder Muskeln.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen, die gemäß einem der erfindungsgemäßen Verfahren isoliert, identifiziert, kultiviert oder aktiviert wurden, oder die gemäß der erfindungsgemäßen Verwendung angereichert wurden, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Wunden, Verletzungen und/oder von degeneriertem Gewebe, insbesondere von Knorpel, Knochen, Muskeln, Gefäßen, oder zu immuntherapeutischen Zwecken, als trophische Zellen, wobei sie dann nicht notwendigerweise im Reparaturgewebe nachweisbar sein müssen, oder als Vehikel für die rekombinante (Gen-)Therapie.
Die Erfindung betrifft ferner ein synthetisches, isoliertes oder rekombinantes Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 8 bis 31,
b) Fragmenten der Sequenzen gemäß a), die die biologische Aktivität des Peptids gemäß a) in einem Test betreffend die Bindung von mesenchymalen Stammzellen besitzen,
c) Fragmenten mit einer Sequenz, die mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens zu zwischen 80% und 99%, identisch ist mit einer der in a) und b) aufgeführten Sequenzen.

Diese Peptide binden, wie die Versuche der Erfinder gezeigt haben, spezifisch mesenchymale Stammzellen. Damit wird durch die Peptide ein Mittel bereitgestellt, mesenchymale Stammzellen zu isolieren und/oder anzureichern.
Die Peptide können auch über gentechnologische Verfahren zur Expression gebracht und als Strukturen sowohl membranständig auf Zellen, als auch in gelöster Form und in Kombination mit anderen proteinen zur Expression gebracht werden. (z. B. als Peptid + Kollagen-1 Faser für augmentiertes Biomaterial)
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Peptide damit auch direkt zur Behandlung von Wunden, Verletzungen und/oder von degeneriertem Gewebe eingesetzt werden.
Daher betrifft die Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die zumindest eines der erfindungsgemäßen Peptide und einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger aufweisen.
„Pharmazeutisch akzeptierbarer Träger” bedeutet vorliegend ein nicht-toxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität der aktiven Substanz in der Zusammensetzung nicht beeinträchtigt.
Es versteht sich ferner, dass die pharmazeutische Zusammensetzung in einer weiteren Ausführungsform weitere therapeutisch und/oder pharmazeutisch aktive Substanzen enthält, die in Abhängigkeit der zu behandelnden Krankheit(en) zusätzlich in der pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht wird.
Die zu behandelnde Krankheit ist dabei vorzugsweise eine Krankheit des Menschen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann systemisch verabreicht werden, d. h. bspw. oral, subkutan, intravenös, rektal, parenteral, intramuskulär, interperitoneal, transdermal, oder topisch, wobei die Verabreichungsart von der Art der Erkrankung dem Krankheitsbild, sowie der Zustand der Patienten abhängen wird. Ebenso kann die Verabreichung wiederholt oder einmalig stattfinden, wobei die Verabreichung im ersteren Fall einmal oder mehrmals am Tag, und/oder über einen längeren Zeitraum hinweg erfolgen kann.
Zusätzlich zu den aktiven Substanzen kann die pharmazeutische Zusammensetzung auch noch Puffer, Verdünnungsmittel und/oder Additive enthalten. Geeignete Puffer schließen bspw. Tris-HCl, Glycin und Phosphat mit ein, und geeignete Verdünnungsmittel bspw. wässrige NaCl-Lösungen, Lactose oder Mannitol. Geeignete Additive schließen bspw. Detergentien, Lösungsmittel, Antioxidantien und Konservierungsstoffe mit ein. Eine Übersicht über solche zusätzlichen Inhaltsstoffe findet sich bspw. in A. Kibbe.: „Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.
Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und der beigefügten Zeichnung.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird in Bezug auf diese nachstehend näher beschrieben. Es zeigt:
1 eine vergleichende Analyse der Adhärenz von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC; Proben 5, 6, rote/blaue Säulen, rechts) im Vergleich zu humanen Fibroblasten (Proben 1 bis 4, grüne/gelbe Säulen, links-Mitte).
2 Messbeispiele für die aus Laminin, Kollagen-1 und Kollagen-4 (A), Fibro-nectin (B) oder Osteopontin (C) abgeleiteten Peptide im Vergleich zur positiven Kontrolle (PLL in A) zur negativen Kontrolle (Mal-BSA in A) oder andere Peptiden mit MSC.
3 Messbeispiele für die aus Laminin, Kollagen-1 und Kollagen-4 (A), Fibro-nectin (B) oder Osteopontin (C) abgeleiteten Peptide im Vergleich zur positiven Kontrolle (PLL in A) zur negativen Kontrolle (Mal-BSA in A) oder andere Peptiden mit Fibroblasten als Kontrollen.
Beispiel 1
In einem vergleichenden Versuch wurde die Adhärenz humaner mesenchymaler Stammzellen (MSC, Proben 5 und 6 in 1) und humaner Fibroblasten (Proben 1 bis 4 in 1) auf Matrixproteinen untersucht. Die Untersuchung erfolgte unter Einsatz eines Chips (Multiple Substrate Array (MSA^®)), auf welchem die Proteine immobilisiert wurden. Vorgegangen wurde hierbei wie in Kuschel et al., „Cell adhesion profiling using extracellular matrix protein microarrays", Biotechniques 40: 523–531 (2006).
MSC wurden aus Knochenmark durch Dichtegradientenzentrifugation angereichert, in MSC-Expansionsmedium als adhärente Population kultiviert und geerntet. Das Differenzierungspotential wurde an einem Aliquot geprüft und adipogene, chondrogene und osteogene Differenzierung bestätigt. Damit erfüllen die Zellen die physiologischen Anforderungen an MSC (M. Dominici et al. 2006, Cytotherapy, 8: 315 ff). Es versteht sich, dass auch MSC aus anderen Geweben eingesetzt werden können, wie bspw. Fettgewebe oder jedes andere Gewebe, in welchem MSC vorliegen.
Fibroblasten wurden aus der Synovialmembran isoliert und expandiert wie beschrieben (Aicher et al. 1994 J. Immunol. 152: 5940 ff). Die Zellen wurden geerntet, gewaschen, ausgezählt und jeweils 20000/Testkammer wurden mittels MSA^TM-Chiptechnologie auf Adhärenz zu Proteinen untersucht. Kurz zusammengefasst wurden die Zellen je auf einem Mikroarray von 12 unterschiedlichen Proteinen in einer Kammer zunächst zur gleichmäßigen Verteilung unter Schütteln (zwei Stunden), dann ohne Schütteln (zwei Stunden) unter üblichen Kulturbedingungen inkubiert. Nicht adhärente Zellen wurden nach dieser Inkubation durch Spülen der Arrays abgewaschen. An die Proteine haftende Zellen wurden chemisch fixiert und ihre Zellkerne mit Farbstoff markiert, um die Zahl der anhaftenden Zellen pro Mikrospot Protein quantitativ zu erfassen. Anstelle der hier verwendeten Fibroblasten können auch bspw. Hautfibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten, Meniskuszellen, o. a. Zellen eingesetzt werden.
Die Ergebnisse dieses Versuches sind in 1 gezeigt, wobei die Adhärenz an die Proteine Laminin-1 (LN EHS), Kollagen-3 (CIII) und Kollagen-1 (CI) sowie Tenascin-C (TN) mit dem achten, zehnten, elften bzw. zwölften Protein in dem Diagramm in 1 gezeigt ist. Die anderen getesteten Proteine waren: Fibronectin (FN hulps), Kollagen-6 (CVI), Vitronektin (VN), Kollagen-4 (CIV EHS), sowie Laminin-10 (LN huplc).
Als Positiv-Kontrolle diente das Protein Poly-L-Lysin (PLL), als Negativ-Kontrolle Rinderserumalbumin (BSA). Beide Populationen, also MSC und Fibroblasten binden darüber hinaus nicht an Thrombospondin.
Den in 1 gezeigten Ergebnissen ist zu entnehmen, dass die Bindung der MSC an Laminin-1, Kollagen-1 und Kollagen-3 sowie Tenascin-C fester war als die Bindung von Fibroblasten an diese Proteine. Daher sind diese Proteine für die vorliegenden erfindungsgemäßen Verwendungen besonders geeignet.
Beispiel 2
Die Haftung von Zellen an Peptide wurde ebenfalls mittels der MSA^TM Technologie (siehe Kuschel et al., 2006) wie oben in Beispiel 1 gemessen. Anstelle der extrazellulären Matrixproteine wurden jedoch an Rinderserumalbumin gekoppelte Peptide in Form von Mikroarrays (8 × 8 Mikrospots) auf die Nitrozellulose-Schicht gedruckt, und danach die restliche Oberfläche versiegelt. Zur Inkubation mit Zellen wurden kleine Silikonkammern auf den beschichteten Objektträger gelegt, und mit MSC oder Fibroblasten inkubiert. Nach zwei Stunden Inkubation wurden die Zellen, die nicht anhafteten, abgespült.
Anhaftende Zellen wurden durch Coomassie-Blaufärbung auf der weißen Nitrozellulose-Folie sichtbar gemacht und in einem motorisierten Photomikroskop ausgewertet: die Anzahl blauer Zellen bzw. die Farbintensität pro Spot wird gemessen und zur Auswertung auf Tabellen übertragen.
Die Auswertung solcher Arrays mittels des halbautomatischen Fotomikroskop ergab die auf PLL (auf 100% normiert, positive Kontrolle) und BSA (auf 0% normiert, negative Kontrolle) relative Bindungsstärke für die jeweils getesteten Peptide.
2 zeigt die mit unterschiedlichen Peptiden und MSC erzielten Ergebnisse. Die in 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass aus Laminin abgeleiteten Peptide Nr. 9, #9-COOH (SEQ ID Nr. 10), Nr. 15 und Nr. 16, die aus Kollagen abgeleiteten Peptide Nr. 1 und Nr. 5 (SEQ ID Nrn. 8 und 9), das von Vitronectin abgeleitete Peptid Nr. 37b, und die von Fibronektin abgeleiteten Peptide Nr. 11, Nr. 20, Nr. 21, NR. 21-COOH, Nr. 22, Nr. 22-COOH, Nr. 34, Nr. 34-COOH, und Nr. 30 die Haftung von MSC ermöglichen (2) nicht jedoch die von Fibroblasten (3). Die Sequenzen der MSC-bindenden Peptide sind Tabelle 1 zu entnehmen: Tabelle 1
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verwendung eines Peptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Laminin-1, Kollagen-1, Kollagen-3, Kollagen-4, Tenascin, Thrombospondin-1, Osteopontin, Fibronectin, Vitronectin oder Peptid-Fragmente, die dazu in der Lage sind, an mesenchymale Stammzellen zu binden, oder Mischungen davon, zur Isolierung, Identifizierung, Kultivierung und/oder Aktivierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC).
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den SEQ ID Nr. 1 bis 7 des beigefügten Sequenzprotokolls.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eines der folgenden Peptid-Fragmente eingesetzt wird: a) ein Peptid, das eine der in dem Sequenzprotokoll aufgeführten SEQ ID Nummern SEQ ID Nr. 8 bis 31 besitzt, oder b) Fragmente der Sequenzen gemäß a), die eine im Wesentlichen gleiche biologische Aktivität des Peptids gemäß a) in einem Test betreffend die Bindung von mesenchymalen Stammzellen besitzen, c) ein Peptid-Fragment mit einer Sequenz, die mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens zu zwischen 80% und 99%, identisch ist mit einer der in a) und b) aufgeführten Sequenzen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid zur Selektion von MSC aus einer Probe eingesetzt wird, welche MSC und andere Zelltypen enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid zur Markierung von MSC eingesetzt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid zu Anreicherung von MSC eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Anreicherung in vivo, in situ oder in vitro ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid zur Differenzierung von MSC eingesetzt wird.
Verwendung eines Peptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Laminin-1, Kollagen-1, Kollagen-3, Kollagen-4, Tenascin, Thrombospondin-1, Osteopontin, Fibronectin, oder Fragmente oder Mischungen davon, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Wunden, Verletzungen und/oder von degenerierten Knochen, Knorpeln oder Geweben.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel ein mit zumindest einem Peptid beschichtetes Implantat oder Stent ist.
Verwendung eines Peptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Laminin-1, Kollagen-1, Kollagen-3, Kollagen-4, Tenascin, Thrombospondin-1, Osteopontin, Fibronectin, oder Fragmente oder Mischungen davon, zur Herstellung eines Implantats.
Verfahren zur Isolierung, Identifizierung, Kultivierung und/oder Aktivierung von mesenchymalen Stammzellen, umfassend den Schritt der Selektion der Stammzellen aus einer Stammzellen enthaltenden Probe mit einem Peptid, das ausgewählt ist aus Laminin-1, Kollagen-1, Kollagen-3, Kollagen-4, Tenascin, Thrombospondin-1, Osteopontin, Fibronectin, oder bindungsspezifische Fragmente oder Mischungen davon.
Verwendung von mesenchymalen Stammzellen, die gemäß einem Verfahren nach Anspruch 12 isoliert, identifiziert, kultiviert oder aktiviert wurden, oder die gemäß einer Verwendung nach Anspruch 6 angereichert wurden, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Wunden, Verletzungen und/oder von degeneriertem Gewebe.
Verwendung nach Anspruch 9 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe ausgewählt ist aus Knorpel, Knochen, Muskeln.
Synthetisches, isoliertes oder rekombinantes Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 8 bis 31, b) Fragmenten der Sequenzen gemäß a), die die biologische Aktivität des Peptids gemäß a) in einem Test betreffend die Bindung von mesenchymalen Stammzellen besitzen, c) Fragmenten mit einer Sequenz, die mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens zu zwischen 80% und 99%, identisch ist mit einer der in a) und b) aufgeführten Sequenzen.
Peptid nach Anspruch 15 zur Verwendung in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Wunden, Verletzungen und/oder von degeneriertem Gewebe.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die zumindest ein Peptid nach Anspruch 15 oder 16 und einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger aufweist.