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Technisches Gebiet
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Die Erfindung betrifft die Beobachtung der Morphologie und deren Veränderung von Thrombozyten.
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Stand der Technik
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Thrombozyten sind ein wichtiger Blutbestandteil. Aufgabe der Thrombozyten ist der Verschluss von Wunden durch Blutgerinnung. Thrombozyten sind zunächst flache, scheibenförmige Zellen, die auch als Blutplättchen bezeichnet werden. Werden die Thrombozyten aktiviert, verändern sie ihre Form: Sie bilden einen eher kugelartigen als scheibenförmigen Hof, von dessen Oberfläche nach außen weisende Ausstülpungen, sogenannte Pseudopodien, ausgebildet werden. Über diese Pseudopodien polymerisieren die Thrombozyten, was zur Blutgerinnung führt. Man spricht auch von einer Aggregation oder Agglomeration der Thrombozyten.
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Auf der einen Seite ist die Agglomeration einer wichtiger Prozess bei der Stillung von Blutungen, auf der anderen Seite kann eine unerwünschte Agglomeration, z. B. im Gehirn oder den Herzkranzgefäßen, lebensbedrohlich sein. Bisher hat man das Risiko einer unerwünschten Agglomeration sowie die Fähigkeit Wunden zu verschließen, u. a. anhand der Konzentration der Thrombozyten, der Konzentration von Botenstoffen oder Impedanzaggregometrie (auch Vollblutaggregometrie genannt) und die Lichtabsorbtionsaggregometrie (auch Lichttransmissionsaggregometrie genannt) festgemacht. Eine weit verbreitete Methode ist die Bestimmung der Kapillarverschlusszeit. Hierbei wird eine Blutprobe im Messgerät durch eine feine Kapillare gezogen, welche mit verschiedenen Agonisten beschichtet ist. Es wird die Zeit gemessen, bis die Kapillare durch einen Thrombus verstopft.
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Einen ganz anderen Ansatz verfolgen Studien von Scheid and Snegotska (Folia Clinical International Bd. 16, No. 6, S. 318–326, 1966) sowie von Xalabarder (Agressologie Bd. 14, No. 4, S. 275–279, 1973), die die Vermutung nahelegen, dass Korrelationen zwischen der Morphologie der Pseudopodien der Thrombozyten und dem Vorliegen einer Krankheit existieren. Sofern diese Vermutung bestätigt würde, könnte die Beobachtung der Morphologie ein einfaches Mittel sein, um Krankheiten zu erkennen oder auszuschließen.
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Darstellung der Erfindung
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Voraussetzung für eine Validierung der Vermutung sowie ggf. anschließend eine kostengünstige Unterstützung des Arztes bei der Diagnose von Krankheiten ist ein zumindest im Wesentlichen automatisierbares und standardisierbares Verfahren, das eine Quantifizierung der Morphologie, d. h. eine Quantifizierung relevanter morphologischer Parameter von Thrombozyten, sowie der Veränderung dieser erlaubt.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Voraussetzungen für die Quantifizierung der Morphologie von Thrombozyten bereitzustellen.
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Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
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Kern der Erfindung ist es, mittels Dunkelfeldmikroskopie und/oder Phasenkontrastmikroskopie und/oder Fluoreszenzmikroskopie und/oder Reflektionskontrastmikroskopie mindestens ein Bild mindestens eines Thrombozyts zu erzeugen und anhand dieses Bildes die Morphologie des Thrombozyts zu charakterisieren. Die genannten Verfahren bilden die Ränder, d. h. die Zellmembran, der Thrombozyten ab, obgleich die Zellmembranen der Thrombozyten bei einer sonst üblichen Hellfeldmikroskopie kaum zu erkennen sind. Die Abbildung der Zellmembran ermöglicht es, die Morphologie von Thrombozyten und/oder morphologische Veränderungen von Thrombozyten quantitativ zu erfassen. In anderen Worten: Es kann eine die Form oder Morphologie charakterisierende numerische Größe ermittelt werden. Basierend auf dieser Größe können Informationen über die Aktivierung des Thrombozyts, z. B. die Zuordnung der Aktivierung zu einer Agglomerationsphase, und/oder über die Agglomerationsfähigkeit des Thrombozyts gewonnen werden. Somit legt die Erfindung eine Grundlage für eine objektive und reproduzierbare Auswertung der Beobachtung von Thrombozyten. Natürlich werden bevorzugt möglichst viele Bilder erzeugt und wie beschrieben ausgewertet, um statistische Aussagen über die Form der beobachteten Thrombozyten zu ermöglichen.
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Die bekannten Thrombozytenfunktionstest erlauben eine Aussage über die Thrombozytenfunktion, d. h. über die Fähigkeit von Thrombozyten zu Agglomerieren. Diese Aussage basiert aber ausschließlich auf Beobachtungen, die an einer Gesamtheit von Thrombozyten vorgenommen werden und in diesem Sinne makroskopische Messungen sind. Nach der Erfindung werden aber (bevorzugt eine Vielzahl) von Thrombozyten separat beobachtet. In diesem Sinne ist das Verfahren nach der Erfindung ein mikroskopisches Verfahren. Nach der Erfindung kann die jeweilige Morphologie der einzelnen Thrombozyten quantitativ und qualitativ bestimmt werden. Dies ermöglicht wesentlich differenziertere Aussagen über die Thrombozyten einer Probe, als dies vorher mit den makroskopischen Verfahren möglich war.
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Ein geeignetes Maß für die Aktivierung der Thrombozyten ist z. B. die Anzahl der ausgebildeten Pseudopodien pro Thrombozyt und/oder der Durchmesser der Thrombozyten und/oder die Länge der Thrombozyten, insbesondere die entsprechenden Mittelwerte einer Probe.
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Bei dem Verfahren wird zunächst ein Präparat hergestellt. Diese geschieht z. B. durch Hinzugabe eines Antikoagulanz-Stoffes, z. B. Sodium-Citrat, zu einer lebende Thrombozyten enthaltenden Flüssigkeit, z. B. Blut. Die Thrombozyten liegen nun zumindest weitgehend scheibenförmig vor. Anschließend werden die Thrombozyten bevorzugt sedimentiert, z. B. im einfachsten Fall durch Blutsenkung nach Westergreen. Alternativ ist auch eine Zentrifugation der Thrombozyten enthaltenden Flüssigkeit denkbar. Der Teil der Flüssigkeit, in dem die Thrombozyten sich abgesetzt haben, wird auch als „PRP” (engt „platelet rich plasma”) bezeichnet. Nun wird das PRP auf einen Objektträger aufgebracht und mit einem Deckglas abgedeckt. Die Fuge zwischen dem Objektträger und dem Deckglas wird bevorzugt luftdicht versiegelt, z. B. mit einem Lack. Das Präparat, z. B. der Objektträger mit dem PRP, wird für eine vorbestimmte Zeit, z. B. für 1 h, 2 h oder 3 h, kopfüber gelagert und anschließend in Normallage im Dunkelfeld mikroskopiert. Dadurch lagern sich die Thrombozyten zunächst an dem Deckglas oder in der Nähe des Deckglases ab und lassen sich anschließend leichter fokussieren, als wenn sie sich auf dem Objektträger anlagern würden. Nun wird mindestens ein Bild mindestens eines Thrombozyts mittels Dunkelfeldmikroskopie erzeugt und beobachtet, um mindestens eine die Morphologie des bzw. der Thrombozyten beschreibende Größe zu bestimmen. Dazu kann z. B. anhand des oder bevorzugt der Bilder ein Maß für die Größe des Hofs des Thrombozyts und/oder ein Maß für Größe und/oder ein Maß für Anzahl und/oder ein Maß für die Art von Pseudopodien des Thrombozyts bestimmt werden. Diese Vermessung des Thrombozyts, vorzugsweise möglichst vieler Thrombozyten des PRP, ermöglicht es, aus diesen Maßen mindestens eine numerische Größe, die die Form der Thrombozyten zumindest im Mittel charakterisiert, zu bestimmen. Aus dieser Größe kann ein Wert der für die Aktivierung der Thrombozyten und/oder deren Fähigkeit zur Agglomeration und/oder deren Agglomerationsstadium abgeleitet werden.
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Die Bilder werden bevorzugt mit einer Kamera, insbesondere bevorzugt mit einer elektronischen Kamera, z. B. einer CCD-Kamera erfasst. Dadurch können sehr viele Bilder erfasst und computergestützt ausgewertet werden.
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Zur Charakterisierung der Morphologie eines oder mehrerer Thrombozyten wird bevozugt mindestens ein Gradient mindestens einer Eigenschaft mindestens eines Bildpunktes, bei elektronischen Bildern also mindestens einer Pixeleigenschaft, bestimmt. Beispielsweise kann der Gradient der Helligkeit für das Bild bestimmt werden. Man erhält somit ein Gradientenfeld, das die Veränderungen der Helligkeit der Bildpunkte (= Pixel) in dem Bild beschreibt. Anhand dieses Gradienten kann man die Pixel des Bildes bestimmen, auf die die Zellmembran des Thrombozyten abgebildet wird.
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Beispielsweise kann die Form der Thrombozyten insbesondere anhand der Anzahl der Pseudopodien, die vorzugsweise auf die Anzahl der beobachteten Thrombozyten bezogen bzw. normiert ist, charakterisiert werden. Der entsprechende Wert kann ein Maß für die Aktivierung und/oder Agglomerationsfähigkeit sein. Bei der Beobachtung mehrerer Thrombozyten kann es insbesondere der Quotient aus der Anzahl der Pseudopodien der beobachteten Thrombozyten zur Anzahl der beobachteten Thrombozyten sein. Geeignet ist insbesondere jede Abbildung vom Raum der Paare, die sich aus den möglichen Anzahlen der Pseudopodien und den möglichen Anzahlen der beobachteten Thrombozyten in einen metrischen, bevorzugt 1-dimensionalen Raum. Die Abbildung kann selbst eine Metrik in Bezug auf ein Bezugspaar z. B. (0,1) sein.
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Beispielsweise kann die Form der Thrombozyten insbesondere anhand des Quotienten aus der Querschnittsfläche des Hofs des Thrombozyts und der Summe der Quer- oder Längsschnittflächen der Pseudopodien charakterisiert werden. Auch dieser Wert kann ein Maß für den Fortschritt der Agglomeration sein. Alternativ oder zusätzlich könnte man z. B. den Quotienten der Volumina von Hof und/oder den Pseudopodien betrachten. Auch hier ist insbesondere jede Abbildung vom Raum der entsprechenden n-Tupel in einen metrischen Raum geeignet. Besonders bevorzugt ist die Abbildung selbst eine Metrik.
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Derzeit ist noch unklar, warum sich schwertförmige, schlegelförmige, filiforme oder anders geformte Pseudopodien ausbilden. Zur Untersuchung dieser Frage kann es sinnvoll sein, als die Form charakterisierende Größe den Quotienten aus der Anzahl der schwertförmigen und der Anzahl der schlegelförmigen Pseudopodien zu bilden und mit Parametern und/oder Maßen z. B. für die Aktivierung und/oder Agglomeration zu korrelieren, d. h. die entsprechenden Korrelationen zu bestimmen und zu untersuchen.
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Zur Bestimmung eines die Morphologie charakterisierenden Wertes und/oder eines der Maße wird bevorzugt anhand eines oder mehrerer Bilder mindestens eine geometrische Größe des bzw. der Thrombozyten bestimmt. Die geometrische Größe ist durch mindestens zwei Punkte auf der Zellmembran bestimmt. Auf der Zellmembran meint hier, dass die Punkte im Querschnittsbild zur Zellmembran gehören. Punkte können insbesondere auf der äußeren Mantelfläche, der inneren Mantelfläche und/oder einer Schnittfläche der Zellmembran sein. Insbesondere kann die geometrische Größe beispielsweise der maximale und/oder minimale Durchmesser des Hofs und/oder der mittlere Durchmesser eines Hof bzw. vieler Höfe sein. Alternative oder optionale Größen sind die Volumina des Hofes bzw. der Pseudopodien, sowie deren Längs- und/oder Querschnittsflächen.
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Wenn die Maße durch eine Bildverarbeitungssoftware bestimmt werden, kann in kurzer Zeit eine große Anzahl Thrombozyten vermessen werden. Dadurch wird eine statistische Auswertung der Maße auf Basis einer vergleichsweise großen Datenmenge möglich. Zudem kann die Bilderfassung weitgehend automatisiert werden, was die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöht.
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Bevorzugt ermittelt die Bildverarbeitungssoftware zumindest die Anzahl schwertförmiger und/oder schlegelförmiger Pseudopodien.
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Wenn mindestens zwei Bilder mittels Dunkelfeldmikroskopie erzeugt werden, kann die Anzahl der beobachteten und/oder vermessenen Thrombozyten erhöht werden. Zudem ist die zeitliche Veränderung der Morphologie der Thrombozyten erfassbar und quantifizierbar. Dazu sollten natürlich die Bilder bevorzugt immer den gleichen Thrombozyten zeigen. Besonders bevorzugt natürlich mindestens zwei oder noch besser möglichst viele gleiche Thrombozyten. Alternativ oder optional können die Bilder auch so viele Thrombozyten zeigen, dass man deren die Form charakterisierende(n) Größe(n) statistisch auswerten und mit entsprechenden Vergleichsgrößen vergleichen kann, die anhand anderer zu anderen Zeitpunkten entstandener Bilder ermittelt wurden. Deshalb wird bevorzugt eine ganze Reihe von zeitlich aufeinanderfolgenden Bildern erzeugt.
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Wenn mindestens zwei der Bilder unterschiedlich fokussiert sind, kann man die Form der Thrombozyten in 3D vermessen und/oder Bewegungen der Thrombozyten in dem PRP ausgleichen. Besonders bevorzugt wird der Fokus oszilliert. Zusammen mit einem automatisch verstellbaren Kreuztisch kann dann eine Probe vollautomatisch in 3D z. B. mit einer CCD-Kamera gescannt werden. Die in den jeweiligen Bildern zu vermessenden Strukturen der Thrombozyten können durch dadurch gewählt werden, dass sie eine gegebene Linienschärfe nicht unterschreiten. Die Linienschärfe lässt sich einfach anhand der Anzahl aufeinander folgender Pixel bestimmen, bei denen der Helligkeitswert der Pixel kontinuierlich zu- bzw. abnimmt. Vozugsweise wird die Linienschärfe anhand des Gradienten der Helligkeit der Bildpunkte (= Pixel) bestimmt. Natürlich kann man auch die Anzahl der aufeinander folgenden Pixel bestimmen, bei denen der Helligkeitswert zunächst von einem Minimumwert zu einem Maximumwert zunimmt und dann wieder auf einen ggf. anderen Minimumwert abnimmt. Der Abstand der Pixel zwischen den beiden Pixeln mit den Minimumwerten ist dann ein Maß für die Breite einer Linie, der maximale Gradient der Helligkeit ist ein Maß für die Linienschärfe, d. h. dafür, ob oder wie gut der entsprechende Bereich fokussiert ist.
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Zum Einstellen des Fokus kann man insbesondere einen Piezoaktor, z. B. einen Piezokristall verwenden, an den eine Steuerspannung angelegt wird, über welche die Fokussierung des Mikroskops eingestellt wird.
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Natürlich haben die meisten Mikroskope eine feste Brennweite (Fokus), so dass mit Verändern der Fokussierung in diesem Fall gemeint ist, den Abstand des Präparates zum Objektiv zu verändern.
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Das Verfahren ermöglicht es erstmals die Auswirkungen von Umwelteinflüssen, z. B. einer Menge einer Substanz auf die Vernetzungseigenschaften der Thrombozyten, quantitativ zu untersuchen. Beispielsweise können eine oder mehrere Substanzen, die die Gerinnung hindern oder fördern, zum PRP oder zum Blut gegeben werden und ihre Wirkung auf die Aktivierbarkeit der Thrombozyten kann quantifiziert werden. Natürlich können auch verschiedene Mengen einer Substanz und/oder mehrere Substanzen zu dem Blut gegeben werden, z. B. um eine optimale Dosierung der Substanz(en) zu bestimmen. Beispielsweise indem die bestimmten Maße und/oder davon abgeleitete Werte bzw. Größen mit einem und/oder mehreren Referenzwerten verglichen werden.
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Beschreibung der Zeichnungen
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Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen exemplarisch beschrieben.
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1 zeigt eine Skizze einer Dunkelfeldaufnahme von PRP.
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2 zeigt eine Skizze einer weiteren Dunkelfeldaufnahme von PRP
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3 zeigt eine Skizze einer weiteren Dunkelfeldaufnahme von PRP
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4 zeigt eine Skizze einer weiteren Dunkelfeldaufnahme eines nicht aktivierten Thrombozyts
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5 zeigt eine Skizze einer weiteren Dunkelfeldaufnahme eines aktivierten Thrombozyts.
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6 zeigt eine Skizze einer weiteren Dunkelfeldaufnahme eines aktivierten Thrombozyts und
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7 zeigt eine Skizze einer weiteren Dunkelfeldaufnahme eines aktivierten Thrombozyts.
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Die Dunkelfeldaufnahmen in 1 bis 3 zeigen je eine Dunkelfeldaufnahme eines Thrombozyten-Präparates. Zur Herstellung des Präparates wurde eine Blutprobe entnommen. Der Blutprobe wurde Sodium-Citrat (3,2% gepufferte 0,105 molare Sodium-Citrat Lösung) hinzugegeben, um die Blutgerinnung zu hemmen. Durch Blutsenkung nach Westergreen wurde anschließend PRP hergestellt. Ein Tropfen (ca. 20 μl, möglich zwischen etwa 2 μl und etwa 100 μl, je nach Größe von Objektträger und Deckglas) PRP wurde auf einen Objektträger aufgebracht und mit einem Deckglas abgedeckt. Vorzugsweise wird das Volumen des Tropfens so bemessen, dass sich zwischen Objektträger und Deckglas nur eine Thrombozytenschicht, ausbildet. Eine Thrombozytenschicht bedeutet, die Thrombozyten zumindest im wesentliche nebeneinander und zumindest etwa parallel zum Objektträger angeordnet sind. Der Spalt zwischen dem Deckglas und dem Objektträger wurde mit einem Lack versiegelt. Gut geeignet ist handelsüblicher bevorzugt farbiger Lack, z. B. Nagellack. Der farbige Lack verhindert nicht nur den Kontakt des PRP mit Luft, sondern erleichtert das Mikroskopieren der Probe ganz erheblich, weil die Mikroskopeinstellung, insbesondere die Fokussierung, wesentlich einfacher wird. Die farbige Kante ermöglich selbst bei fast völliger Abblendung eine sehr einfache und somit schnelle Erstfokussierung. Anschließend wurde der Objektträger in Kopflage, d. h. mit dem Deckglas nach unten etwa 1 h gelagert (möglich zwischen etwa 0,25 h und etwa 96 h). Bei der Kopflagerung sinken die Thrombozyten des PRP auf das Deckglas und werden vermutlich durch den Kontakt mit dem Deckglas aktiviert. Nach etwa 4 Tagen wurden die Thromobozyten nahezu vollständig aktiviert. Sie bilden dabei zunächst zweidimensional polymerisierte Ebenen. Diese Ebenen polymerisieren anschließend miteinander zu einem 3D-vernetzen Festkörper.
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Nach der Lagerung wurden die Präparate mittels Dunkelfeldmikroskopie mikroskopiert, d. h. es wurden Dunkelfeldbilder von den Thrombozyten erzeugt. Ein solches Dunkelfeldbild ist jeweils in den 1 bis 7 abgebildet. 1 zeigt bei etwa 63 facher Vergrößerung (1) eine ganz Reihe von Thrombozyten. Ein Teil der Thrombozyten ist nicht aktiviert, diese sind kompakt und im Wesentlichen scheibenförmig. Einige nicht aktivierte Thrombozyten sind dem Bezugszeichen 10 gekennzeichnet. Die aktivierten Thrombozyten 100 hingegen bilden Pseudopodien 110 aus (vgl. auch 2 und 3). Erhöht man die Vergrößerung auf etwa 100-fache Vergrößerung, dann erhält man Bilder wie das in 5.
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4 zeigt einen nicht aktivierten Thrombozyten. Deutlich zu erkennen ist der Hof 12 und der Kern 13. Pseudopodien sind noch nicht ausgebildet. Sobald diese ausgebildet werden, spricht man von aktivierten Thrombozyten.
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5 zeigt ein Thrombozyt 100 mit zwei schwertförmigen Pseudopodien 110 und weiteren Pseudopodien 115 in der Entstehung. Deutlich zu erkennen ist auch der sogenannte Hof 120. Damit bezeichnet man den Teil der Thrombozyten, der verbleibt, wenn man sich die Pseudopodien wegdenkt. In dem Hof 120 ist ein heller Fleck, der sogenannte Kern 130, der kein Zellkern im eigentlichen Sinne ist. Durch das Verfahren nach der Erfindung wird mindestens ein Maß für die Größe des Hofs des Thromobozyts und/oder ein Maß für Größe und/oder ein Maß für Anzahl und/oder ein Maß für die Art von Pseudopodien des Thrombozyts bestimmt. Im vorliegenden Beispiel wurden die Typen der Pseudopodien bestimmt (2× schwertförmig), die Längen und Durchmesser der Pseudopodien vermessen (Länge 3 μm bzw. 3,5 μm), deren Anzahl (2 Stück) und der Querschnittsflächeninhalt des Hofs bestimmt. Diese Vermessungen bzw. Bestimmungen werden bevorzugt automatisiert durchgeführt, z. B. indem die Begrenzungslinie der Thrombozyten zumindest teilweise aufgrund der Veränderung der Helligkeit der Pixel des Bildes erfasst wird. Teile der Begrenzungslinie können dann mit standardisierten Formen verglichen werden, z. B. um den Typ von Pseudopodien zu bestimmen. Zudem kann die Krümmung der Begrenzungslinie insbesondere hierzu ausgewertet werden.
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6 und 7 zeigen je einen weiteren aktivierten Thrombozyten 100. Auch dieser haben je einen Hof 120, von dem eine Vielzahl (11) von Pseudopodien 110, 112 abgehen. Dies Pseudopodien 112 haben die Form von Keulen, weil sie im Gegensatz zu den spitz zulaufenden schwertförmigen Pseudopodien 110 in ihrem distalen Endbereich keulenförmig erweitert sind. Anhand des Bildes wurde zumindest ein Maß für die Größe des Hofs des Thromobozyts und/oder ein Maß für Größe und/oder ein Maß für Anzahl und/oder ein Maß für die Art von Pseudopodien des Thrombozyts bestimmt. Dazu wurde anhand der Helligkeitswerte der Pixel des Bildes die Begrenzungslinie des Thrombozytes in dem Bild bestimmt. Durch Abstandsmessung zwischen den Pixeln lassen sich die meisten der oben genannten Maße bestimmen, insbesondere die Länge der Pseudopodien, deren Querschnittsflächen, die Querschnittsfläche des Hofs ebenso wie der minimale und/oder der maximale Durchmesser des Hofs. Die Anzahl der Pseudopodien lässt sich anhand der Krümmung der Begrenzungslinie bestimmen, gleiches gilt für die Charakterisierung der Pseudopodien nach ihrem jeweiligen Typ (schwert- bzw. keulenförmig).
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Bezugszeichenliste
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- 10
- nicht aktivierte Thrombozyten,
- 12
- Hof nicht aktivierter Thrombozyten,
- 13
- Kern nicht aktivierter Thrombozyten,
- 100
- aktivierte Thrombozyten,
- 110
- Pseudopodien (meist schwertförmig)
- 112
- Pseudopodien (keulenförmig)
- 115
- Pseudopodien in der Entstehung
- 120
- Hof aktivierter Thrombozyten,
- 130
- Kern aktivierter Thrombozyten.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Scheid and Snegotska (Folia Clinical International Bd. 16, No. 6, S. 318–326, 1966) [0004]
- Xalabarder (Agressologie Bd. 14, No. 4, S. 275–279, 1973) [0004]
