DE102009015341A1 - Verfahren und Vorrichtungen zur optischen Untersuchung von Proben - Google Patents

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Abstract

Es werden Verfahren und Vorrichtungen zur optischen Untersuchung von Proben bereitgestellt. Dabei wird eine Probe mit einem zeitlich charakteristischen modulierten Partikelstrahl bestrahlt und zudem mit einer Anregungseinrichtung beispielsweise optisch zum Erzeugen einer optischen Emission angeregt. Die optische Emission wird in Abhängigkeit von der periodischen Modulation des Partikelstrahls (35) detektiert.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur optischen Untersuchung von Proben, beispielsweise für chemische oder biologische Analysen. Bei derartigen Verfahren und Vorrichtungen zur optischen Untersuchung wird allgemein von einer Probe emittierte optische Strahlung detektiert und aus den Eigenschaften der detektierten Strahlung wie Wellenlänge oder Intensität auf Eigenschaften der Probe rückgeschlossen. Derartige Untersuchungen werden häufig ortsaufgelöst mittels eines Mikroskopaufbaus durchgeführt. Beispiele hierfür sind die Fluoreszenzmikroskopie, Mikro-Raman Untersuchungen oder ortsaufgelöste Infrarot(IR)-Spektroskopie.
  • Hochauflösende optische Mikroskopieverfahren umfassen beispielsweise die so genannte STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)-Mikroskopie, RESOLFT(Reversible Switchable Optical Linear Fluorescence Transitions)-Mikroskopie oder die SIED(Stimulated Emission Depletion)-Mikroskopie, wobei letztere beispielsweise in der EP 1 616 216 A2 beschrieben ist. Bei derartigen Verfahren werden häufig so genannte Fluoreszenzmarker eingesetzt, d. h. fluoreszierende Elemente in der Probe verwendet. Die oben genannten Techniken erlauben eine relativ genaue Lokalisierung derartiger Fluoreszenzmarker oder anderer Fluoreszenzzentren, können aber keine Detailinformation hinsichtlich der Struktur der Proben geben. Zudem sind sie auf fluoreszierende Proben oder auf mit Fluoreszenzmarkern versehene Proben eingeschränkt. Die laterale Auflösung derartiger Verfahren ist auf ca. 15 nm begrenzt.
  • Zur Erhöhung der Auflösung unterhalb des Beugungslimits können optische Nahfeldtechniken eingesetzt werden. Diese sind jedoch relativ kompliziert und langsam und daher nur für kleine Flächen geeignet und liefern nur Informationen von der Oberfläche der Proben.
  • Ein weiteres Verfahren zur optischen Untersuchung von Proben ist in der EP 1 655 597 B1 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird eine fluoreszierende Probe optisch angeregt und gleichzeitig mit einem Partikelstrahl, insbesondere einem Elektronenstrahl, abgerastert. Der Elektronenstrahl führt zu einer lokalen Zerstörung von Fluoreszenzmarkern und damit zu einer irreversiblen Abnahme der Intensität der durch die optische Anregung hervorgerufenen Fluoreszenz. Die Detektion der Fluoreszenz bei diesem Verfahren erfolgt großflächig, und der Abfall der gesamten detektierten Fluoreszenzemission wird mit der Position des Partikelstrahls korreliert. Dieses Verfahren hat zum einen den Nachteil, dass es destruktiv ist, da durch die Wechselwirkung des Elektronenstrahls die Emission der einzelnen Fluoreszenzmarker irreversibel reduziert wird. Der von dem Elektronenstrahl abgerasterte Probenbereich ist daher irreparabel geschädigt und kann für weitere Fluoreszenzmessungen nicht mehr verwendet werden. Zum anderen ist bei diesem Verfahren zu bedenken, dass es auf der Messung der irreversiblen Änderung der Leistung des emittierten Lichtes beruht, welche einen bestimmten Schwellenwert überschreiten muss.
  • Für eine hohe Ortsauflösung ist es dabei wünschenswert, einen Wechselwirkungsquerschnitt A1 zwischen dem Partikelstrahl und der Probe möglichst klein zu halten. In 1 ist beispielhaft ein Partikelstrahl 10 mit Durchmesser r dargestellt. Eine Fläche A2, aus der optische Emission detektiert wird (Detektionsbereich), wird entweder durch einen Anregungsspot der optischen Anregung oder durch die von der Detektionsoptik erfassten Fläche definiert. In beiden Fällen ist die Fläche A2 durch das Beugungslimit nach unten begrenzt. Sie kann beispielsweise einem Kreis 11 mit Radius R in 1 entsprechen, und es gilt A2 >> A1. Die lokale Zerstörung von Fluoreszenzmarkern durch den Partikelstrahl 10 führt daher nur zu einer kleinen relativen Änderung δ der gesamten, großflächig detektierten optischen Leistung Pout gemäß
    Figure 00020001
  • Bei einer Ortsauflösung des Partikelstrahls von ca. 10 nm und einem Durchmesser 2R der Fläche 11 von 3 μm liegt δ beispielsweise in der Größenordnung von 10–5. Derartig kleine relative Änderungen der optischen Leistung sind schwierig zu erfassen. Daher ist ein derartiges Verfahren einerseits besonders anfällig gegenüber Rauschen und Drift im Messsystem, andererseits ist aber auch das Verhältnis von Sichtfeld und Ortsauflösung beschränkt. Ein gleichzeitiges Verfahren (Scannen) von Partikelstrahl und Anregungsspot bzw. Detektionsbereich ist kaum möglich, da die Leistungsschwankungen durch die Verschiebung des Kreises 11 der optischen Detektion um ein Vielfaches stärker sind als die durch die Auslöschung einzelner Fluoreszenzmarker durch den Partikelstrahl 10 erzielte Abschwächung.
  • Weiterhin ist auch ein derartiges Verfahren beschränkt auf die Detektion der Fluoreszenzintensität einer mit Fluoreszenzmarkern markierten Probe. Dadurch lassen sich zwar die eingebrachten Marker ortsaufgelöst lokalisieren, weitere Informationen über die Probe bleiben jedoch verborgen. Damit ist ein derartiges Verfahren in seinem Anwendungsbereich limitiert.
  • Bei vielen Anwendungen wäre es jedoch wünschenswert, ohne Fluoreszenzmarker intrinsische Eigenschaften der Probe detektieren zu können, zum Beispiel mit Hilfe von Biolumineszenz oder Autolumineszenz. Auch ist in vielen Fällen die optische Messung weiterer Probeneigenschaften neben der Verteilung einer Leuchtintensität, beispielsweise von Fluoreszenzmarkern, wünschenswert, zum Beispiel chemische Informationen, welche über die optische Detektion inelastischer Streuprozesse des Lichts gewonnen werden können. Zudem ist eine hohe Ortsauflösung bei derartigen Untersuchungen wünschenswert.
  • Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Vorrichtungen zur optischen Untersuchung einer Probe bereitzustellen, welche zumindest einen Teil der oben erwähnten wünschenswerten Merkmale realisieren.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 und eine Vorrichtung gemäß Anspruch 16. Die abhängigen Ansprüche definieren weitere Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur optischen Untersuchung einer Probe bereitgestellt, umfassend:
    Bestrahlen der Probe mit einem charakteristisch modulierten Partikelstrahl, wobei der Partikelstrahl derart gewählt ist, dass er zumindest teilweise reversible Veränderungen der Probe bewirkt,
    Anregen der Probe zum Erzeugen einer optischen Emission von der Probe, und
    Detektieren der optischen Emission in Abhängigkeit von der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls.
  • Unter einem charakteristisch modulierten Partikelstrahl wird im Rahmen dieser Anmeldung ein Partikelstrahl verstanden, bei dem mindestens ein Strahlparameter (z. B. Intensität, Partikelenergie) als Funktion der Zeit in definierter, insbesondere vorgegebener, Weise moduliert wird. Die Charakteristik der Modulation kann beispielsweise in einer Periodizität bestehen, d. h. Intensität und/oder Partikelenergie des Partikelstrahls werden zeitlich periodisch moduliert.
  • Durch die Detektion der optischen Emission in Abhängigkeit von der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls können Änderungen der optischen Emission, welche beispielsweise von einem Verfahren des Partikelstrahls erzeugt werden, von anderen Änderungen der optischen Emission unterschieden werden. Hierdurch kann beispielsweise auch ein Ort der Detektion und/oder Anregung geändert werden, wobei die Auflösung im Wesentlichen durch die Ortsauflösung des Partikelstrahls bestimmt wird. Zudem können durch geeignete Wahl der Eigenschaften des Strahls, beispielsweise einer Strahlenergie, sowie geeignete Anregung der Probe verschiedene Eigenschaften der Probe bestimmt werden.
  • Der Partikelstrahl kann beispielsweise ein Elektronenstrahl sein, ist jedoch nicht hierauf begrenzt, sondern kann beispielsweise auch ein Ionenstrahl, beispielsweise ein Helium- oder Galliumionenstrahl, sein.
  • Das Anregen der Probe kann insbesondere optisch, beispielsweise durch einen Laser, erfolgen. Es sind jedoch auch andere Arten der Anregung, beispielsweise elektrische oder thermische Anregung möglich.
  • Das Anregen der Probe kann zeitlich moduliert sein, wobei eine Charakteristik der zeitlichen Modulierung der Anregung sich von einer Charakteristik der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls unterscheiden kann. Das Detektieren kann dann in Abhängigkeit sowohl von der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls als auch in Abhängigkeit von der charakteristischen Modulation der Anregung erfolgen. Handelt es sich bei den charakteristischen Modulationen des Partikelstrahls und der optischen Anregung um periodische Modulationen unterschiedlicher Frequenzen, kann das Detektieren beispielsweise bei der entsprechenden Summen- oder Differenzfrequenz erfolgen.
  • Bei einem Ausführungsbeispiel wird die Probe zusätzlich mit einem oder mehreren weiteren charakteristisch modulierten Partikelstrahlen bestrahlt, wobei sich die Charakteristiken der Modulationen der weiteren Partikelstrahlen und des Partikelstrahls unterscheiden. Durch die unterschiedlichen Charakteristiken können die Auswirkungen des Partikelstrahls und der weiteren Partikelstrahlen auf die optische Emission voneinander unterschieden werden.
  • Das Detektieren kann insbesondere in Lock-in-Technik erfolgen.
  • Das Verfahren kann ein Abrastern der Probe mit dem Partikelstrahl, dem Anregungsspot und/oder dem Detektionsbereich umfassen.
  • Es ist möglich, mit einem derartigen Verfahren auch spezielle Marker, beispielsweise, Fluoreszenzmarker, in oder auf der Probe zu untersuchen.
  • Bei einem Ausführungsbeispiel kann zusätzlich zum Detektieren der optischen Emission ein Detektieren von durch den Partikelstrahl in der Probe ausgelösten Elektronen (z. B. Sekundär-, Rückstreu-, und/oder Transmissionselektronen) erfolgen, so dass zusätzlich eine rasterelektronenmikroskopische Untersuchung der Probe simultan durchgeführt werden kann.
  • Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur optischen Untersuchung der Probe umfasst eine Einrichtung zum Erzeugen eines charakteristisch modulierten Partikelstrahls mit einer Partikelstrahlquelle und einem Modulator, wobei der Strahl so wählbar ist, dass er eine zu untersuchende Probe zumindest teilweise reversibel modifiziert, eine Anregungseinrichtung zum Anregen der Probe zum Erzeugen einer optischen Emission auf der Probe, und
    eine Detektionseinrichtung zum Detektieren der optischen Emission in Abhängigkeit von der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls.
  • Die oben erwähnten Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens können in entsprechender Weise auch auf die erfindungsgemäße Vorrichtung angewendet werden.
  • Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele näher erläutert. Es zeigen:
  • 1 einen Partikelstrahl und einen optischen Detektionsbereich,
  • 2 ein Schemabild einer Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung,
  • 3A–3G Energiediagramme zur Veranschaulichung einer optischen Anregung und Modifikation der optischen Anregung durch einen Partikelstrahl,
  • 4A einen Zeitverlauf einer charakteristischen, hier periodischen Modulation eines Partikelstrahls gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung,
  • 4B einen Verlauf einer detektierten optischen Emission bei einer Modulation des Partikelstrahls wie in 4A,
  • 5 Beispiele für mit einem erfindungsgemäßen Verfahren und einer erfindungsgemäßen Vorrichtung aufnehmbare Raman-Spektren, und
  • 6 Beispiele für Anregungen gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung.
  • In 2 ist eine Vorrichtung zur optischen Untersuchung von Proben gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung schematisch dargestellt.
  • Bei dem Ausführungsbeispiel von 2 ist eine Probe 26 in einer Vakuumkammer 34 angeordnet. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind Elemente, welche zum Erzeugen eines Vakuums in der Vakuumkammer 34 dienen, wie beispielsweise Pumpen, nicht dargestellt.
  • In der Vakuumkammer 34 ist eine Partikelstrahlquelle 20, beispielsweise eine Elektronenstrahlquelle, angeordnet. Ein von der Partikelstrahlquelle 20 erzeugter Partikelstrahl 35 kann mittels einer Scanvorrichtung 22 auf der Probe 26 verfahren werden, beispielsweise um die Probe abzurastern bzw. zu scannen. Im Falle geladener Partikel des Partikelstrahls 35 wie beispielsweise Elektronen oder Ionen kann die Scanvorrichtung hierbei steuerbare Magnete zur magnetischen Ablenkung des Partikelstrahls 35 oder Kondensatorplatten zur elektrostatischen Ablenkung des Partikelstrahls 35 umfassen.
  • Des Weiteren ist eine Modulationseinheit 21 zur zeitlichen Modulierung des von der Partikelstrahlquelle 20 erzeugten Partikelstrahls 35 bereitgestellt. Die Modulationseinheit 21 wird von einer Steuerung 32 gesteuert, deren Funktion später näher erläutert wird. Im Falle eines Elektronenstrahls kann die Modulationseinheit 21 beispielsweise ein Gitter umfassen, welches negativ aufladbar ist, um somit den Partikelstrahl 35 abzuschwächen. Die Modulationseinheit kann bei einem Ausführungsbeispiel auch einen so genannten „Beam Blanker” umfassen, der den Partikelstrahl ein- und ausschaltet. Dies kann beispielsweise durch Kondensatorplatten oder eine Vorrichtung wie in der DE 3904280 C2 offenbart geschehen, wodurch der Partikelstrahl elektrostatisch abgelenkt wird und zu bestimmten Zeiten die Probe nicht mehr erreicht. Alternativ kann der Strahl auch schon in der Quelle moduliert werden, indem deren Emission z. B. mit einem gepulsten Laser und mit Hilfe von Photoemission bzw. Photoionisation zeitlich gesteuert wird.
  • Weiterhin umfasst die Vorrichtung aus 2 eine ebenfalls von der Steuereinheit 32 steuerbare Lichtquelle 31, beispielweise einen Laser. Von der Lichtquelle 31 erzeugtes Licht wird über eine optische Faser 33, beispielsweise eine Glasfaser, zu einer Faser-Auskopplung 24 gelenkt und dort aus der optischen Faser 33 ausgekoppelt und von einer Optik 25, welche schematisch durch eine einzige Linse dargestellt ist, aber eine Vielzahl von optischen Elementen wie beispielsweise Linsen, Filter, Polarisatoren und/oder Gitter umfassen kann, auf die Probe 26 gelenkt.
  • Von der Probe 26 emittiertes Licht wird über eine Optik 27, welche wiederum durch eine einzige Linse symbolisiert ist, aber eine Vielzahl von optischen Elementen wie beispielsweise Linsen enthalten kann, zu einer Fasereinkopplung 28 gelenkt und in eine weitere optische Faser 36 eingekoppelt. Das so eingesammelte Licht wird von optischen Elementen 29 auf einen Fotodetektor 30 gelenkt und so detektiert. Die optischen Elemente 29 können Elemente wie beispielsweise Filter oder auch ein Spektrometer umfassen, um lichtwellenlängenselektiv in dem Photodetektor 30 detektieren zu können. Das so detektierte Licht wird dann in der Steuereinheit 32 bzw. einem hieran angeschlossenen Computer 33 ausgewertet.
  • Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel können für die optische Anregung und die Detektion gemeinsame optische Komponenten verwendet werden. Beispielsweise kann die Detektion auch über die Komponenten 24 und 25 erfolgen, wobei durch ein zusätzlich in die optische Faser 33 eingebrachtes Bauelement (z. B. Strahlteiler oder Zirkulator) Anregungs- und Detektionslicht getrennt werden können.
  • Zudem umfasst die Vorrichtung aus 2 einen Sekundärelektronendetektor 23. Durch diesen können Sekundärelektronen, welche beim „Beschuss” der Probe 26 mit dem Partikelstrahl 35 entstehen, detektiert werden, so dass beim Abrastern der Probe mit dem Partikelstrahl 35 neben der Untersuchung der optischen Emission, detektiert durch den Photodetektor 30, auch ein REM(Rasterelektronenmikroskopie)-Bild aufgenommen werden kann. Bei anderen Ausführungsbeispielen können auch andere durch den Partikelstrahl 35 hervorgerufene Elektronen, z. B. Rückstreu- und/oder Tranmissionselektronen, zusätzlich oder alternativ detektiert werden.
  • Im Folgenden wird zunächst die prinzipielle Funktionsweise der Vorrichtung von 2 erläutert und dann anhand von Beispielen und weiteren Figuren detaillierter beschrieben.
  • Zur Durchführung einer optischen Untersuchung wird die Probe 26 mit von der Lichtquelle 31 erzeugtem Licht bestrahlt und damit angeregt. Durch die Anregung erzeugte optische Emission wird über den Photodetektor 30 detektiert. Die vorliegende Erfindung ist dabei nicht auf eine spezielle Art der Emission beschränkt, es kann sich beispielsweise um eine Detektion inelastischer oder elastischer Streuprozesse des Anregungslichtes, beispielsweise Detektion von Raman-Streuung, oder auch um Lumineszenz wie Fluoreszenz, Autolumineszenz oder Biolumineszenz handeln.
  • Gleichzeitig wird die Probe innerhalb eines Anregungsspots des Anregungslichtes mit dem Partikelstrahl 35 bestrahlt, wobei der Partikelstrahl über die Modulationseinheit 21 in definierter, insbesondere vorgegebener Weise zeitlich charakteristisch, beispielsweise periodisch, moduliert wird. Die Energie des Partikelstrahls wird dabei derart gewählt, dass die Probe 26 durch den Partikelstrahl zumindest teilweise reversibel modifiziert wird, was die Eigenschaften des emittierten und von dem Photodetektor 30 detektierten Lichts mit einer entsprechenden zeitlichen Modulation verändert. Diese Veränderungen können aufgrund der charakteristischen zeitlichen Modulation, welche durch die Steuereinheit 32 gesteuert wird, beispielsweise mit der so genannten Lock-in-Technik in der Steuereinheit 32 oder einem Computer 37 detektiert werden. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann zur Detektion ein separater so genannter Lock-in-Verstärker verwendet werden.
  • Um zu erreichen, dass die Modifikation der Probe 26 durch den Partikelstrahl 35 zumindest teilweise, bevorzugt vollständig reversibel abläuft, kann beispielsweise eine Energie und/oder ein Fluss, beispielsweise die Anzahl Partikel pro Fläche und Zeiteinheit auf der Probe, des Partikelstrahls 35 entsprechend in Abhängigkeit von der Art der Probe 26 gewählt werden.
  • Bei einem derartigen Verfahren kann – je nach Art des Partikelstrahls – das partikelstrahlmodifizierte Wechselwirkungsvolumen zwischen der Anregungsstrahlung und der Probe deutlich unterhalb der optischen Beugungsbegrenzung liegen. Bei einem Elektronenstrahl ist dieses Wechselwirkungsvolumen typischerweise birnenförmig, wobei die Größe des Wechselwirkungsvolumens von der Partikelenergie abhängt. Die Energie der Partikel nimmt vom Auftreffpunkt des Partikelstrahls auf die Probe zum Rand des Wechselwirkungsvolumens hin kontinuierlich ab, so dass verschiedene Prozesse in der Probe, beispielsweise auch reversible und irreversible Prozesse, parallel ablaufen können.
  • Die Modifikation der durch den Photodetektor 30 detektierten Emission durch den Partikelstrahl 35 wird nunmehr unter Bezugnahme auf 3 näher erläutert. Dabei zeigt 3A ein beispielhaftes System mit drei Energieniveaus E0, E2 und E1 zunächst ohne Beeinflussung durch einen Partikelstrahl. Durch einfallendes Licht, beispielsweise von der Lichtquelle 31 in 2 erzeugtes Licht, mit einer Absorptionsfrequenz vab, d. h. Energie h·vab, wird das System vom Energieniveau E0 in das Energieniveau E1 gebracht. Beispielsweise können die dargestellten Energieniveaus Energieniveaus von Elektronen sein, wobei in diesem Fall ein Elektron vom Energieniveau E0 zum Energieniveau E1 angeregt wird. Grundsätzlich ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch auch die Untersuchung anderer Energieniveaus, beispielsweise Energieniveaus, welche mit Schwingungszuständen verknüpft sind, möglich. Im Folgenden werden elektronische Energieniveaus als Beispiel in der Beschreibung verwendet.
  • In das Energieniveau E1 angeregte Elektronen fallen bei dem dargestellten Beispiel nichtstrahlend, beispielsweise durch Streuprozesse in einem Festkörper, auf das Energieniveau E2 und dann strahlend wie durch einen Pfeil 42 angedeutet unter Emission von Strahlung mit der Frequenz vem zurück auf das Energieniveau E0.
  • In derartigen Systemen sind verschiedene Modifikationen der emittierten Strahlung durch Einwirkung eines Partikelstrahls denkbar. Verschiedene Möglichkeiten werden in Folge unter Bezugnahme auf die 3B bis 3F erläutert.
  • Beispielsweise können wie in 3B gezeigt Elektronen von den Energieniveaus E0, E1 und/oder E2 wie durch Pfeile 43, 44 und 45 symbolisiert, durch die Einwirkung der Partikelstrahlung auf ein weiteres Energieniveau E3 angehoben werden und von dort, wie durch einen Pfeil 60 angedeutet, nichtstrahlend wieder auf das Energieniveau E0 zurückfallen. Die so aus den Energieniveaus E0, E1 und/oder E2 angeregten Elektronen stehen nicht mehr für den strahlenden Übergang von E2 auf E0 zur Verfügung. Daher wird bei einem derartigen Prozess die Intensität des mit der Frequenz vem emittierten Lichtes verringert. Bei einer zeitlich charakteristischen Modulation des Partikelstrahls, wie unter Bezugnahme auf 2 erläutert, ist auch diese Abschwächung charakteristisch moduliert. Somit ist der Einfluss des Partikelstrahls auf die Emission durch die charakteristische Modulation von anderen Einflüssen unterscheidbar, beispielsweise bei einer zeitlich periodischen Modulation der Anregung mittels Lock-in-Technik detektierbar.
  • Eine andere Möglichkeit ist in 3C dargestellt. Ähnlich wie in 3B werden hier durch Einwirkung des Partikelstrahls, wie durch Pfeile 43, 44 und 45 symbolisiert, Elektronen aus den Energieniveaus E0, E1 und/oder E2 auf ein weiteres Energieniveau E4 angehoben. Wie durch einen Pfeil 46 symbolisiert, können diese Elektronen unter Aussendung mit von Strahlung mit einer Frequnez vem2, welche in dem dargestellten Beispiel kleiner ist als die Frequenzen vab und vem, wieder auf das Energieniveau E0 zurückfallen. Bei einem derartigen Prozess wird – wie bei 3B – die Intensität der emittierten Strahlung bei der Frequenz vem abgeschwächt, und es tritt zusätzlich Strahlung mit einer Frequenz vem2 auf. Diese Phänomene sind bei einer reversiblen Anregung durch den Partikelstrahl entsprechend der zeitlichen Modulation des Partikelstrahls zeitlich moduliert.
  • Eine weitere Möglichkeit ist in 3D dargestellt. Bei dem Beispiel der 3D werden durch den Partikelstrahl, wie durch Pfeile 47, 48 und 49 dargestellt, Elektronen aus den Energieniveaus E0, E1 und/oder E2 auf das Vakuumniveau E angehoben, also gleichsam aus dem Material herausgeschossen. Auch diese Elektronen stehen für den strahlenden Übergang von E2 auf E0 nicht mehr zur Verfügung, so dass auch in diesem Fall eine Abschwächung der emittierten Strahlung auftritt.
  • Eine weitere Möglichkeit ist in 3E dargestellt. In diesem Beispiel werden nicht nur durch die Anregungsstrahlung, sondern auch den Partikelstrahl, wie durch einen Pfeil 50 symbolisiert, Elektronen vom Energieniveau E0 auf das Energieniveau E1 gebracht. In einem derartigen Fall ergibt sich eine Verstärkung der Emission bei der Frequenz vem.
  • Noch eine andere Möglichkeit ist in 3F gezeigt. Durch den Einfluss des Partikelstrahls können die Energieniveaus in der Probe auch verschoben werden. Bei dem in 3F schematisch dargestellten Beispiel werden, wie durch Pfeile 54 angedeutet, das Energieniveau E1 auf ein Niveau E11 und/oder das Energieniveau E2 auf ein Niveau E22 verschoben. Hierdurch wird zum einen, wie durch einen Pfeil 51 symbolisiert, zur Anregung eine geringfügig höhere Energie benötigt, zum anderen sinkt bei dem dargestellten Beispiel die Energiedifferenz des strahlenden Übergangs (dann E22 zu E0), der durch einen Pfeil 53 symbolisiert wird, so dass eine entsprechende Emissionsfrequenz vem3 kleiner wird.
  • Die Energieniveaus der 3A bis 3F dienen lediglich als Beispiel und hängen von der Art der Probe ab. Auch Systeme mit mehr oder weniger Energieniveaus sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich. Als Beispiel zeigt 3G einen Quantenpunkt, welcher beispielsweise ebenfalls als Marker im Rahmen der Erfindung dienen kann. Quantenpunkte weisen ein Valenzband mit einer maximalen Energie EV und ein Leitungsband mit einer minimalen Energie EL auf, d. h. EV ist die Energie einer Oberkante des Valenzbandes und EL die Energie einer Unterkante des Leistungsbandes. Elektronen können vom Valenzband in das Leitungsband angeregt werden, wobei bei einer derartigen Anregung ein so genanntes Loch im Valenzband zurückbleibt.
  • Wie durch einen Pfeil 56 in 3G angedeutet, kann eine derartige Anregung durch Strahlung mit einer Photonenenergie, welche größer oder gleich EL-EV ist, beispielsweise bei der Frequenz vab, erfolgen. Ein derartiges erzeugtes Elektron-Loch-Paar kann, wie durch einen Pfeil 57 angedeutet, strahlend rekombinieren, wobei eine Energie h·vem eines emittierten Photons gleich EL–EV ist. Auch bei einem derartigen Quantenpunkt kann die Emission durch den Partikelstrahl reversibel modifiziert werden, indem die Zustände der Ladungsträger durch den Partikelstrahl geändert werden. Beispielsweise kann, wie durch einen Pfeil 55 angedeutet, auch der Partikelstrahl Elektronen vom Valenzband ins Leitungsband anregen, was die Emission verstärkt. Auch aus anderen Energieniveaus kann der Partikelstrahl, wie durch einen Pfeil 58 angedeutet Elektronen in das Valenzband bringen. Auf der anderen Seite kann ein Partikelstrahl bei entsprechender Energie auch, wie durch einen Pfeil 59 angedeutet, Elektronen aus dem Valenzband entfernen, beispielsweise auf ein Vakuumniveau E∞ (vgl. 3D) bringen, was die Emission abschwächt.
  • Die in 3A bis 3G dargestellten Prozesse sind lediglich als einfache Beispiele zu verstehen, wie durch einen Partikelstrahl eine detektierte Emission reversibel verändert werden kann. Welche Prozesse eine detektierte Emission wie verändern hängt von dem emittierenden Material sowie Energie und Fluss des Partikelstrahls ab. Zu bemerken ist auch, dass sich die verschiedenen Prozesse beispielsweise in 3A bis 3F nicht gegenseitig ausschließen, sondern mehrere dieser Prozesse parallel stattfinden können.
  • Bei den dargestellten Beispielen wird durch den Einfluss des Partikelstrahls eine Emissionsintensität und/oder eine Emissionsenergie (d. h. Frequenz) verändert. Bei anderen Ausführungsbeispielen können zusätzlich oder alternativ auch andere Eigenschaften des emittierten Lichts, beispielsweise eine Polarisation oder eine Phase des detektierten Lichts, durch den Partikelstrahl zumindest teilweise reversibel verändert werden und dann entsprechend detektiert werden.
  • Auch die Energieniveaus in 3 sind lediglich als Beispiel zu verstehen, und die relative Lage der Energieniveaus kann auch anders als dargestellt sein.
  • Wie bereits erläutert wird der Partikelstrahl zeitlich charakteristisch moduliert, und die Detektion erfolgt entsprechend der zeitlichen Modulation. Ein Beispiel für eine derartige Modulation des Partikelstrahls, beispielsweise eines Elektronenstrahls, ist in 4A dargestellt. Bei dem Beispiel in 4A wird der Partikelstrahl im Wesentlichen periodisch an- und ausgeschaltet oder anders ausgedrückt mit einem periodischen Rechtecksignal moduliert. Zu beachten ist, dass in der Praxis unter Umständen ein exaktes Rechtecksignal nicht erreicht wird, sondern die Flanken mehr oder weniger steil sind, was jedoch am Prinzip der Erfindung nichts ändert. Ein Beispiel für eine durch eine derartige Modulation des Partikelstrahls hervorgerufene periodische Modulation der detektierten Emission ist in 4B dargestellt. Durch die gesteuerte Modulation des Partikelstrahls kann die Emission mit einem entsprechenden auf die Signalform angepassten Verfahren detektiert werden, beispielsweise Lock-in-Detektion des emittierten Signals, so genannte Matched Filter – Detektion oder so genanntes Boxcar-Integrationsverfahren. Die Analyse des durch den Photodetektor 30 aus 2 oder einen anderen Detektor erzeugten elektrischen Signals kann daher in einem rauscharmen Spektralbereich erfolgen, beispielsweise um eine von Null verschiedene Mittenfrequenz herum, bei welcher ein 1/f-Rauschen des Detektionssystems bereits sehr viel schwächer ist als in der Nähe des Nullpunkts. Eine statische Änderung der Fluoreszenzleistung, welche nicht auf einer zumindest teilweise reversiblen Modifikation durch einen Partikelstrahl beruht, beruht dagegen auf einer Messung in der Nähe des Nullpunkts, welche stärker rauschbehaftet ist.
  • Es ist zu bemerken, dass die in 4A und 4B dargestellten Signalverläufe lediglich beispielhaft zu betrachten sind, und auch andere charakteristische Modulationen eines Partikelstrahls möglich sind, beispielsweise eine sinusförmige oder dreieckförmige Modulation. Auch kann bei einer derartigen Modulation die Intensität des Partikelstrahls zu allen Zeiten von 0 verschieden sein. Auch nichtperiodische charakteristische Modulationen, wie z. B. ein harmonisches Signal mit ansteigender oder abfallender Frequenz (Frequenzsweep) sind möglich.
  • Bei manchen Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich zum Partikelstrahl auch eine Anregung, beispielsweise das von der Lichtquelle 31 aus 2 erzeugte Licht, zeitlich charakteristisch, z. B. periodisch moduliert werden. Die Detektion des emittierten Lichtes kann dann angepasst auf das entstehende Mischsignal erfolgen. Beispielsweise können der Partikelstrahl und ein anregender Lichtstrahl mit verschiedenen Frequenzen sinusförmig moduliert werden, und die Detektion kann dann mit einem Lock-in-Verfahren bei der Summenfrequenz und/oder der Differenzfrequenz der Anregungsfrequenzen erfolgen (sogenannte heterodyne Mischtechnik).
  • Wie bereits erwähnt kann bei dem Ausführungsbeispiel von 2 durch die Scanvorrichtung 22 der Partikelstrahl 35 über die Probe gefahren werden, so dass eine größere Probenfläche untersucht werden kann. Bei manchen Ausführungsbeispielen kann zudem auch der Anregungsspot des Anregungslichtes, d. h. der durch die Optik 25 mit dem von der Lichtquelle 31 erzeugten Lichtstrahl beleuchtete Fläche, auf der Probe verfahren werden. In gleicher Weise kann auch der Detektionsbereich verfahren werden. Hierdurch ist eine Untersuchung von Probenflächen, welche größer sind als der Anregungsspot bzw. Detektionsbereich, möglich. Da die Detektion wie oben erläutert in Abhängigkeit von der Modulation des Partikelstrahls erfolgt, beeinflussen Änderungen, welche nur von dem Verfahren des Anregungsspots bzw. Detektionsbereichs auf der Probe herrühren, die Messung nicht bzw. können durch geeignete Detektionstechniken wie Lock-in-Technik herausgefiltert werden.
  • Bei dem Ausführungsbeispiel von 2 erfolgt eine optische Anregung mit von der Lichtquelle 31 erzeugtem Licht. Es sind bei anderen Ausführungsbeispielen zusätzlich oder alternativ jedoch auch andere Mechanismen zur Anregung der Probe möglich, beispielsweise eine elektrische Anregung, z. B. durch Anlegen einer Spannung an der Probe, oder eine thermische Anregung durch (lokales) Erwärmen der Probe.
  • Im Folgenden sollen nunmehr Beispiele für mögliche Materialsysteme erläutert werden.
  • Beispielsweise kann als Fluoreszenzmarker in einer Probe so genanntes Green Fluorescent Protein (GFP) verwendet werden. Die Wellenlänge, bei der dieses Molekül durch einen Lichtstrahl anregbar ist, liegt bei 395 nm bzw. 475 nm, was Energien von 3,1 eV bzw. 2,6 eV entspricht. Eine durch diese Anregung hervorgerufene Fluoreszenzemission erfolgt dann bei einer Wellenlänge von 509 nm entsprechend 2,4 eV. Als Partikelstrahl kann bei einem derartigen Ausführungsbeispiel ein Elektronenstrahl eines Niederspannungsrasterelektronenmikroskops (Low Voltage Scanning Electron Microscope) verwendet werden. Die Parameter des Elektronenstrahls werden dabei so gewählt, dass es durch die Wechselwirkung der Elektronen mit dem Fluoreszenzmarker zu einer Abschwächung der Fluoreszenzemission bei 409 nm kommt, ohne dass dabei der Fluoreszenzmarker zerstört wird. In anderen Worten werden die Parameter des Elektronenstrahls so gewählt, dass die Abschwächung der Emission reversibel ist.
  • Experimente an mit GFP markierten biologischen Proben haben gezeigt, dass bei einem Beschuss mit Elektronen mit Partikelenergien von mehr als 15 keV und Dosen von 5000 Elektronen pro nm2 ein vollständiges irreversibles Auslöschen der optischen Emission eintritt. In anderen Worten wird bei derartigen Energien und Dosen das GFP irreversibel zerstört bzw. verändert. Für Elektronen von weniger als 3 keV und Dosen von 100 Elektronen pro nm2 bleibt die optische Emission hingegen weitgehend erhalten. Um eine irreversible Schädigung des Probenmaterials zu vermeiden, wird bei einem Ausführungsbeispiel die Energie der Elektronen (oder ggf. anderer Partikel) kleiner als 10 keV, bevorzugt kleiner als 5 keV oder kleiner als 2 keV gewählt.
  • Ein derartiges Verfahren erlaubt also die gezielte rauscharme Detektion der relevanten, d. h. durch den Partikelstrahl modifizierten, Signalanteile mit sehr hohem Dynamikbereich (z. B. 100 dB dynamischen Bereich bei entsprechenden kommerziell erhältlichen Lock-in-Verstärkern). Auch können langsame Driftbewegungen des Gesamtsystems ausgeblendet werden. Durch den erhöhten Dynamikbereich kann auch das Verhältnis von Sichtfeld und Ortsauflösung gegenüber dem Stand der Technik vergrößert werden. Der Elektronenstrahl kann über eine größere Fläche abgerastert werden, ohne dass der Bereich, in dem die emittierte optische Leistung erfasst wird, also der Detektionsbereich, bewegt wird. Umgekehrt kann auch bei gleicher Fläche des Detektionsbereichs die Ortsauflösung verbessert werden.
  • Die Modulationsgeschwindigkeit des Partikelstrahls und die Modulationsform kann dabei an einen zu detektierenden Emitter, beispielsweise einen Fluoreszenzmarker, angepasst werden. Insbesondere kann die Modulationsfrequenz in Abhängigkeit von einer Lebensdauer eines betrachteten strahlenden Übergangs gewählt werden. Beispielsweise weist Rhodamin-6G, welches in Ausführungsbeispielen der Erfindung als Fluoreszenzmarker bzw. Farbstoff verwendet werden kann, eine Fluoreszenzlebensdauer von 4,3 ns auf. Bei einem derartigen Beispiel wird die Modulationsfrequenz dann beispielsweise kleiner als 100 MHz gewählt werden. Die Ladungsträgerlebensdauer in lichtemittierenden Quantenpunkten, wie in 3G gezeigt, beträgt oft beispielsweise typischerweise wenige Pikosekunden. Bei derartigen Systemen können dann Modulationsgeschwindigkeiten bzw. Modulationsfrequenzen von mehreren GHz gewählt werden. Die Modulationsfrequenz kann auch in Abhängigkeit von systemtechnischen Aspekten, wie Eigenschaften der zur Detektion verwendeten Geräte, dem gewünschten Aufwand für die Signalverarbeitung oder der Messempfindlichkeit gewählt werden.
  • Wie bereits erwähnt ist die Anwendung der Erfindung nicht auf die Detektion von Fluoreszenzmarkern beschränkt, sondern kann insbesondere auch zur Detektion intrinsischer Probeneigenschaften, z. B. mit Hilfe von Bio- oder Autolumineszenz, eingesetzt werden. Das Verfahren ist ferner, wie ebenfalls bereits erwähnt, nicht auf die Manipulation und Detektion von Lumineszenz emittierter Strahlung beschränkt, sondern es können allgemein spektroskopische Analyseverfahren, wie z. B. Raman-Spektroskopie oder optisch nicht-lineare Spektroskopie zur räumlich hochaufgelösten Messung und Charakterisierung von Proben verwendet werden. Vorraussetzung ist lediglich, dass die detektierte Emission durch einen Partikelstrahl zumindest teilweise reversibel modifizierbar ist. Diese Modifizierung kann sich beispielsweise auf die Intensität, Phase, Frequenz oder auch den Polarisationszustand der emittierenden Strahlung auswirken.
  • Ein Beispiel für eine Raman-spektroskopische Untersuchung ist in 5 dargestellt (Quelle: A. Weiss, G. Haran; J. Phys. Chem. B 2001 105 12348–12354). 5 zeigt die Intensität in Abhängigkeit von der Raman-Verschiebung für verschiedene Zeiten in Folge des Ladungsträgeraustausches des Moleküls mit seiner Umgebung für das bereits erwähnte Rhodamin-6G. Dieser Ladungsträgeraustausch kann beispielsweise mit einem Partikelstrahl beeinflusst werden.
  • Ein anderes Beispiel ist eine so genannte Zweiphotonenanregung, in 6 durch Pfeile 61 und 62 symbolisiert, d. h. hier erfolgt eine Anregung über einen Prozess mit zwei Photonen der Frequenzen va1 und va2, was einer Gesamtanregung, wie durch einen Pfeil 60 angedeutet, einer Frequenz vA entspricht. Fluoreszenzübergänge sind durch Pfeile 64 und 65 markiert, zusätzlich kann auch ein strahlender Übergang von einem Niveau S1 auf ein Niveau S0, wie durch einen Pfeil 63 angedeutet, erfolgen. Diese Übergänge können in ähnlicher Weise, wie unter Bezugnahme auf 3A bis 3G erläutert, durch einen Partikelstrahl modifiziert werden.
  • Es ist zu bemerken, dass die Erfindung nicht auf Einsatz einer einzigen Art von Fluoreszenzmarkern oder dergleichen beschränkt ist, sondern es können auch verschiedenartige Marker oder verschiedene Übergänge bei verschiedenen Frequenzen detektiert werden. Auch weitere Modifikationen und Varianten sind möglich. Beispielsweise kann die Anregung der Probe, beispielsweise durch Licht wie oben beschrieben, zeitlich verändert werden, um dynamische Eigenschaften der Lichtemission, beispielsweise mit so genannten Pump-Probe-Messungen, zu bestimmen. Der zeitliche Verlauf der emittierten Leistung kann untersucht werden, um dynamische Eigenschaften des Licht emittierenden Prozesses bzw. Materials zu untersuchen. Beispielsweise kann der verwendete Partikelstrahl mit abstimmbarer Frequenz periodisch moduliert und die jeweilige Amplituden- und Phasenlage der zugehörigen Variation der emittierten optischen Strahlung registriert werden.
  • Da die Anregung durch den Partikelstrahl zumindest teilweise reversibel erfolgt, kann die örtliche Bewegung eines Partikels nachverfolgt werden, sofern die Abrastergeschwindigkeit des Partikelstrahls hoch genug ist.
  • Wie bereits erwähnt kann durch den Sekundärelektronendetektor 23 in 2 oder eine andere entsprechende Vorrichtung zur Detektion von Elektronen (z. B. Rückstreu- oder Transmissionselektronendetektor) gleichzeitig mit der optischen Messung ein Rasterelektronenmikroskopbild aufgenommen werden. Da die Erfassung gleichzeitig mit der Erfassung der optischen Emission erfolgt, kann das so entstehende Rasterelektronenmikroskopbild mit den erfassten optischen Eigenschaften korreliert werden.
  • Bei dem dargestellten Beispiel wird der Partikelstrahl 35 durch die Scanvorrichtung 22 über die Probe gerastert. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel kann der Partikelstrahl auch stationär bleiben und die Probe entsprechend bewegt werden. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann sowieso sowohl der Partikelstrahl als auch die Probe bewegt werden.
  • Bei einem anderen Ausführungsbeispiel wird nicht nur ein Partikelstrahl, sondern eine Vielzahl von Partikelstrahlen verwendet. Die Partikelstrahlen können verschiedene Strahleigenschaften, z. B. verschiedene Energien, aufweisen, um die Emission der Probe in verschiedenen Weisen zu beeinflussen. Es ist jedoch auch möglich, mehrere Partikelstrahlen mit gleichen Strahleigenschaften zu verwenden, welche beispielsweise verschiedene Gebiete des Anregungsspots bzw. Detektionsbereichs abrastern, um somit ein schnelleres Erfassen der gesamten zu untersuchenden Fläche durch Parallelisierung der Messung zu ermöglichen. Die Partikelstrahlen können mit verschiedenen Charakteristiken charakteristisch moduliert sein, beispielsweise mit verschiedenen Frequenzen periodisch moduliert sein. Hierdurch können bei der Detektion die Einflüsse der verschiedenen Partikelstrahlen voneinander getrennt werden. Ein Beispiel ist die Verwendung eines parallelen Multi-Elektronenstrahls, bei dem die einzelnen Strahlen mit unterschiedlichen Frequenzen moduliert werden. Die Detektion erfolgt dann parallel bei den jeweiligen Modulationsfrequenzen.
  • Bei wieder anderen Ausführungsbeispielen werden nicht spezielle Marker, sondern direkt Zustände der Probe untersucht.
  • Beispielsweise kann ein Ausführungsbeispiel der Erfindung dazu verwendet werden, Gitterverspannung bei Halbleiterstrukturen mit hoher räumlicher Auflösung zu detektieren. Dazu wird die Oberfläche der Halbleiterstruktur mit Laserlicht, z. B. aus der Lichtquelle 31 aus 2, bestrahlt und das inelastisch gestreute Licht spektral aufgelöst detektiert, d. h. ein Raman-Spektrum aufgenommen. Verspannte Bereiche führen zu charakteristischen Linien im Raman-Spektrum. Durch das Abrastern mit einem modulierten Partikelstrahl wird die Raman-Streuung lokal beeinflusst; dies kann durch eine Änderung der entsprechenden Spektrallinien signalangepasst detektiert werden. Durch polarisationsabhängige Messungen lässt sich die Ansisotropie der Verspannung (Verspannungstensor) bestimmen.
  • Bei einem anderen Ausführungsbeispiel werden die spektroskopischen Eigenschaften individueller, auf einer Oberfläche isoliert präparierter Moleküle ermittelt (Einzelmolekülspektroskopie). Bei sehr großen Molekülen ist eine gezielte spektroskopische Untersuchung von einzelnen Molekülabschnitten möglich. Dies kann beispielsweise zur Sequenzierung von DNA verwendet werden.
  • Wie aus dem obigen ersichtlich sind eine Vielzahl von Modifikationen und Varianten möglich, und die vorliegende Erfindung ist daher nicht auf die dargestellten Ausführungsbeispiele begrenzt.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
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    • - EP 1655597 B1 [0004]
    • - DE 3904280 C2 [0035]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - A. Weiss, G. Haran; J. Phys. Chem. B 2001 105 12348–12354 [0069]

Claims (22)

  1. Verfahren zur optischen Untersuchung einer Probe, umfassend: Bestrahlen einer Probe (26) mit einem zeitlich charakteristisch modulierten Partikelstrahl (35), wobei der Partikelstrahl (35) so gewählt ist, dass er die Probe (26) zumindest teilweise reversibel modifiziert, Anregen der Probe (26) zum Erzeugen einer optischen Emission von der Probe (26), und Detektieren der optischen Emission von der Probe in Abhängigkeit von der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls (35).
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Anregen ein Anregen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus optischem Anregen, elektrischem Anregen und thermischem Anregen umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Bestrahlen der Probe ein Abrastern der Probe mit dem Partikelstrahl (35) umfasst.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die charakteristische Modulation des Partikelstrahls eine zeitlich periodische Modulation ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Detektieren ein Detektieren in Lock-in-Technik umfasst.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Anregen der Probe ein Anregen der Probe an einem Anregungsort und ein Verfahren des Anregungsortes auf der Probe umfasst.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Detektieren der optischen Emission ein Detektieren der optischen Emission von der Probe in einem Detektionsbereich und ein Verfahren des Detektionsbereiches auf der Probe umfasst.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Partikelstrahl (35) ein Elektronenstrahl ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Anregen ein zeitlich charakteristisch moduliertes Anregen der Probe (26) umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das zeitlich charakteristisch modulierte Anregen ein periodisch moduliertes Anregen der Probe (26) ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die charakteristische Modulation de Partikelstrahls (35) eine periodische Modulation des Partikelstrahls (35) mit einer ersten Frequenz ist und die periodische Modulation der Anregung mit einer von der ersten Frequenz verschiedenen zweiten Frequenz erfolgt.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Detektieren der optischen Emission ein Detektieren bei einer Summe der ersten Frequenz und der zweiten Frequenz und/oder eine Detektieren bei einer Differenz der ersten Frequenz und der zweiten Frequenz umfasst.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Detektieren der optischen Emission ein Detektieren einer optischen Emission von in der Probe (26) vorhandenen Markern umfasst.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, weiter umfassend: Detektieren von in der Probe gestreuten oder durch den Partikelstrahl (35) ausgelösten Elektronen.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, weiter umfassend: Bestrahlen der Probe mit mindestens einem weiteren zeitlich charakteristisch modulierten Partikelstrahl, wobei sich eine Charakteristik der Modulation des weiteren Partikelstrahls von einer Charakteristik der Modulation des Partikelstrahls (35) unterscheidet, und wobei das Detektieren der optischen Emission in Abhängigkeit von der charakteristischen Modulation des weiteren Partikelstrahls erfolgt.
  16. Vorrichtung zur optischen Untersuchung einer Probe, umfassend: eine Partikelstrahlquelle (20) zum Bestrahlen einer Probe (26) mit einem Partikelstrahl (35), wobei die Partikelstrahlquelle (20) derart ansteuerbar ist, dass der Partikelstrahl die Probe zumindest teilweise reversibel modifiziert, einen Modulator (21) zur charakteristischen Modulation des Partikelstrahls (35), eine Anregungseinrichtung (31, 24, 25) zum Anregen der Probe zum Erzeugen einer optischen Emission, und eine Detektionseinrichtung (27, 28, 36, 29, 30, 32) zum Detektieren der optischen Emission in Abhängigkeit von der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls.
  17. Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Anregungseinrichtung und die Detektionseinrichtung zumindest teilweise gemeinsame Komponenten umfassen.
  18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Anregungseinrichtung eine Lichtquelle (31) umfasst.
  19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Detektionseinrichtung (27, 28, 36, 29, 30, 32) einen Lock-in-Detektor (32) umfasst.
  20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die Partikelstrahlquelle eine Elektronenstrahlquelle (20) umfasst.
  21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei die Vorrichtung einen Elektronendetektor (23) umfasst.
  22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei die Probe zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 ausgestaltet ist.
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