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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur optischen
Untersuchung von Proben, beispielsweise für chemische oder
biologische Analysen. Bei derartigen Verfahren und Vorrichtungen
zur optischen Untersuchung wird allgemein von einer Probe emittierte
optische Strahlung detektiert und aus den Eigenschaften der detektierten Strahlung
wie Wellenlänge oder Intensität auf Eigenschaften
der Probe rückgeschlossen. Derartige Untersuchungen werden
häufig ortsaufgelöst mittels eines Mikroskopaufbaus
durchgeführt. Beispiele hierfür sind die Fluoreszenzmikroskopie,
Mikro-Raman Untersuchungen oder ortsaufgelöste Infrarot(IR)-Spektroskopie.
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Hochauflösende
optische Mikroskopieverfahren umfassen beispielsweise die so genannte STORM(Stochastic
Optical Reconstruction Microscopy)-Mikroskopie, RESOLFT(Reversible
Switchable Optical Linear Fluorescence Transitions)-Mikroskopie
oder die SIED(Stimulated Emission Depletion)-Mikroskopie, wobei
letztere beispielsweise in der
EP 1 616 216 A2 beschrieben ist. Bei derartigen
Verfahren werden häufig so genannte Fluoreszenzmarker eingesetzt,
d. h. fluoreszierende Elemente in der Probe verwendet. Die oben
genannten Techniken erlauben eine relativ genaue Lokalisierung derartiger Fluoreszenzmarker
oder anderer Fluoreszenzzentren, können aber keine Detailinformation
hinsichtlich der Struktur der Proben geben. Zudem sind sie auf fluoreszierende
Proben oder auf mit Fluoreszenzmarkern versehene Proben eingeschränkt.
Die laterale Auflösung derartiger Verfahren ist auf ca.
15 nm begrenzt.
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Zur
Erhöhung der Auflösung unterhalb des Beugungslimits
können optische Nahfeldtechniken eingesetzt werden. Diese
sind jedoch relativ kompliziert und langsam und daher nur für
kleine Flächen geeignet und liefern nur Informationen von
der Oberfläche der Proben.
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Ein
weiteres Verfahren zur optischen Untersuchung von Proben ist in
der
EP 1 655 597 B1 beschrieben.
Bei diesem Verfahren wird eine fluoreszierende Probe optisch angeregt
und gleichzeitig mit einem Partikelstrahl, insbesondere einem Elektronenstrahl,
abgerastert. Der Elektronenstrahl führt zu einer lokalen
Zerstörung von Fluoreszenzmarkern und damit zu einer irreversiblen
Abnahme der Intensität der durch die optische Anregung
hervorgerufenen Fluoreszenz. Die Detektion der Fluoreszenz bei diesem
Verfahren erfolgt großflächig, und der Abfall
der gesamten detektierten Fluoreszenzemission wird mit der Position
des Partikelstrahls korreliert. Dieses Verfahren hat zum einen den
Nachteil, dass es destruktiv ist, da durch die Wechselwirkung des
Elektronenstrahls die Emission der einzelnen Fluoreszenzmarker irreversibel
reduziert wird. Der von dem Elektronenstrahl abgerasterte Probenbereich
ist daher irreparabel geschädigt und kann für
weitere Fluoreszenzmessungen nicht mehr verwendet werden. Zum anderen
ist bei diesem Verfahren zu bedenken, dass es auf der Messung der
irreversiblen Änderung der Leistung des emittierten Lichtes
beruht, welche einen bestimmten Schwellenwert überschreiten
muss.
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Für
eine hohe Ortsauflösung ist es dabei wünschenswert,
einen Wechselwirkungsquerschnitt A
1 zwischen
dem Partikelstrahl und der Probe möglichst klein zu halten.
In
1 ist beispielhaft ein Partikelstrahl
10 mit
Durchmesser r dargestellt. Eine Fläche A
2,
aus der optische Emission detektiert wird (Detektionsbereich), wird
entweder durch einen Anregungsspot der optischen Anregung oder durch
die von der Detektionsoptik erfassten Fläche definiert.
In beiden Fällen ist die Fläche A
2 durch
das Beugungslimit nach unten begrenzt. Sie kann beispielsweise einem
Kreis
11 mit Radius R in
1 entsprechen,
und es gilt A
2 >> A
1. Die lokale Zerstörung von Fluoreszenzmarkern
durch den Partikelstrahl
10 führt daher nur zu
einer kleinen relativen Änderung δ der gesamten,
großflächig detektierten optischen Leistung P
out gemäß
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Bei
einer Ortsauflösung des Partikelstrahls von ca. 10 nm und
einem Durchmesser 2R der Fläche 11 von 3 μm
liegt δ beispielsweise in der Größenordnung
von 10–5. Derartig kleine relative Änderungen
der optischen Leistung sind schwierig zu erfassen. Daher ist ein
derartiges Verfahren einerseits besonders anfällig gegenüber
Rauschen und Drift im Messsystem, andererseits ist aber auch das
Verhältnis von Sichtfeld und Ortsauflösung beschränkt.
Ein gleichzeitiges Verfahren (Scannen) von Partikelstrahl und Anregungsspot
bzw. Detektionsbereich ist kaum möglich, da die Leistungsschwankungen
durch die Verschiebung des Kreises 11 der optischen Detektion
um ein Vielfaches stärker sind als die durch die Auslöschung
einzelner Fluoreszenzmarker durch den Partikelstrahl 10 erzielte
Abschwächung.
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Weiterhin
ist auch ein derartiges Verfahren beschränkt auf die Detektion
der Fluoreszenzintensität einer mit Fluoreszenzmarkern
markierten Probe. Dadurch lassen sich zwar die eingebrachten Marker ortsaufgelöst
lokalisieren, weitere Informationen über die Probe bleiben
jedoch verborgen. Damit ist ein derartiges Verfahren in seinem Anwendungsbereich limitiert.
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Bei
vielen Anwendungen wäre es jedoch wünschenswert,
ohne Fluoreszenzmarker intrinsische Eigenschaften der Probe detektieren
zu können, zum Beispiel mit Hilfe von Biolumineszenz oder Autolumineszenz.
Auch ist in vielen Fällen die optische Messung weiterer
Probeneigenschaften neben der Verteilung einer Leuchtintensität,
beispielsweise von Fluoreszenzmarkern, wünschenswert, zum
Beispiel chemische Informationen, welche über die optische
Detektion inelastischer Streuprozesse des Lichts gewonnen werden
können. Zudem ist eine hohe Ortsauflösung bei
derartigen Untersuchungen wünschenswert.
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Es
ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und
Vorrichtungen zur optischen Untersuchung einer Probe bereitzustellen, welche
zumindest einen Teil der oben erwähnten wünschenswerten
Merkmale realisieren.
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Diese
Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Anspruch
1 und eine Vorrichtung gemäß Anspruch 16. Die
abhängigen Ansprüche definieren weitere Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung.
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Erfindungsgemäß wird
ein Verfahren zur optischen Untersuchung einer Probe bereitgestellt,
umfassend:
Bestrahlen der Probe mit einem charakteristisch
modulierten Partikelstrahl, wobei der Partikelstrahl derart gewählt
ist, dass er zumindest teilweise reversible Veränderungen
der Probe bewirkt,
Anregen der Probe zum Erzeugen einer optischen Emission
von der Probe, und
Detektieren der optischen Emission in Abhängigkeit von
der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls.
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Unter
einem charakteristisch modulierten Partikelstrahl wird im Rahmen
dieser Anmeldung ein Partikelstrahl verstanden, bei dem mindestens
ein Strahlparameter (z. B. Intensität, Partikelenergie)
als Funktion der Zeit in definierter, insbesondere vorgegebener,
Weise moduliert wird. Die Charakteristik der Modulation kann beispielsweise
in einer Periodizität bestehen, d. h. Intensität
und/oder Partikelenergie des Partikelstrahls werden zeitlich periodisch
moduliert.
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Durch
die Detektion der optischen Emission in Abhängigkeit von
der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls können Änderungen
der optischen Emission, welche beispielsweise von einem Verfahren
des Partikelstrahls erzeugt werden, von anderen Änderungen
der optischen Emission unterschieden werden. Hierdurch kann beispielsweise auch
ein Ort der Detektion und/oder Anregung geändert werden,
wobei die Auflösung im Wesentlichen durch die Ortsauflösung
des Partikelstrahls bestimmt wird. Zudem können durch geeignete
Wahl der Eigenschaften des Strahls, beispielsweise einer Strahlenergie,
sowie geeignete Anregung der Probe verschiedene Eigenschaften der
Probe bestimmt werden.
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Der
Partikelstrahl kann beispielsweise ein Elektronenstrahl sein, ist
jedoch nicht hierauf begrenzt, sondern kann beispielsweise auch
ein Ionenstrahl, beispielsweise ein Helium- oder Galliumionenstrahl,
sein.
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Das
Anregen der Probe kann insbesondere optisch, beispielsweise durch
einen Laser, erfolgen. Es sind jedoch auch andere Arten der Anregung,
beispielsweise elektrische oder thermische Anregung möglich.
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Das
Anregen der Probe kann zeitlich moduliert sein, wobei eine Charakteristik
der zeitlichen Modulierung der Anregung sich von einer Charakteristik der
charakteristischen Modulation des Partikelstrahls unterscheiden
kann. Das Detektieren kann dann in Abhängigkeit sowohl
von der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls als auch
in Abhängigkeit von der charakteristischen Modulation der
Anregung erfolgen. Handelt es sich bei den charakteristischen Modulationen
des Partikelstrahls und der optischen Anregung um periodische Modulationen
unterschiedlicher Frequenzen, kann das Detektieren beispielsweise
bei der entsprechenden Summen- oder Differenzfrequenz erfolgen.
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Bei
einem Ausführungsbeispiel wird die Probe zusätzlich
mit einem oder mehreren weiteren charakteristisch modulierten Partikelstrahlen
bestrahlt, wobei sich die Charakteristiken der Modulationen der weiteren
Partikelstrahlen und des Partikelstrahls unterscheiden. Durch die
unterschiedlichen Charakteristiken können die Auswirkungen
des Partikelstrahls und der weiteren Partikelstrahlen auf die optische Emission
voneinander unterschieden werden.
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Das
Detektieren kann insbesondere in Lock-in-Technik erfolgen.
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Das
Verfahren kann ein Abrastern der Probe mit dem Partikelstrahl, dem
Anregungsspot und/oder dem Detektionsbereich umfassen.
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Es
ist möglich, mit einem derartigen Verfahren auch spezielle
Marker, beispielsweise, Fluoreszenzmarker, in oder auf der Probe
zu untersuchen.
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Bei
einem Ausführungsbeispiel kann zusätzlich zum
Detektieren der optischen Emission ein Detektieren von durch den
Partikelstrahl in der Probe ausgelösten Elektronen (z.
B. Sekundär-, Rückstreu-, und/oder Transmissionselektronen)
erfolgen, so dass zusätzlich eine rasterelektronenmikroskopische
Untersuchung der Probe simultan durchgeführt werden kann.
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Eine
erfindungsgemäße Vorrichtung zur optischen Untersuchung
der Probe umfasst eine Einrichtung zum Erzeugen eines charakteristisch
modulierten Partikelstrahls mit einer Partikelstrahlquelle und einem
Modulator, wobei der Strahl so wählbar ist, dass er eine
zu untersuchende Probe zumindest teilweise reversibel modifiziert,
eine Anregungseinrichtung zum Anregen der Probe zum Erzeugen einer
optischen Emission auf der Probe, und
eine Detektionseinrichtung
zum Detektieren der optischen Emission in Abhängigkeit
von der charakteristischen Modulation des Partikelstrahls.
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Die
oben erwähnten Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen
Verfahrens können in entsprechender Weise auch auf die
erfindungsgemäße Vorrichtung angewendet werden.
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Die
Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele näher
erläutert. Es zeigen:
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1 einen
Partikelstrahl und einen optischen Detektionsbereich,
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2 ein
Schemabild einer Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel
der Erfindung,
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3A–3G Energiediagramme
zur Veranschaulichung einer optischen Anregung und Modifikation
der optischen Anregung durch einen Partikelstrahl,
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4A einen
Zeitverlauf einer charakteristischen, hier periodischen Modulation
eines Partikelstrahls gemäß einem Ausführungsbeispiel
der Erfindung,
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4B einen
Verlauf einer detektierten optischen Emission bei einer Modulation
des Partikelstrahls wie in 4A,
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5 Beispiele
für mit einem erfindungsgemäßen Verfahren
und einer erfindungsgemäßen Vorrichtung aufnehmbare
Raman-Spektren, und
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6 Beispiele
für Anregungen gemäß Ausführungsbeispielen
der Erfindung.
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In 2 ist
eine Vorrichtung zur optischen Untersuchung von Proben gemäß einem
Ausführungsbeispiel der Erfindung schematisch dargestellt.
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Bei
dem Ausführungsbeispiel von 2 ist eine
Probe 26 in einer Vakuumkammer 34 angeordnet.
Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind Elemente,
welche zum Erzeugen eines Vakuums in der Vakuumkammer 34 dienen,
wie beispielsweise Pumpen, nicht dargestellt.
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In
der Vakuumkammer 34 ist eine Partikelstrahlquelle 20,
beispielsweise eine Elektronenstrahlquelle, angeordnet. Ein von
der Partikelstrahlquelle 20 erzeugter Partikelstrahl 35 kann
mittels einer Scanvorrichtung 22 auf der Probe 26 verfahren
werden, beispielsweise um die Probe abzurastern bzw. zu scannen.
Im Falle geladener Partikel des Partikelstrahls 35 wie
beispielsweise Elektronen oder Ionen kann die Scanvorrichtung hierbei
steuerbare Magnete zur magnetischen Ablenkung des Partikelstrahls 35 oder
Kondensatorplatten zur elektrostatischen Ablenkung des Partikelstrahls 35 umfassen.
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Des
Weiteren ist eine Modulationseinheit
21 zur zeitlichen
Modulierung des von der Partikelstrahlquelle
20 erzeugten
Partikelstrahls
35 bereitgestellt. Die Modulationseinheit
21 wird
von einer Steuerung
32 gesteuert, deren Funktion später
näher erläutert wird. Im Falle eines Elektronenstrahls
kann die Modulationseinheit
21 beispielsweise ein Gitter
umfassen, welches negativ aufladbar ist, um somit den Partikelstrahl
35 abzuschwächen.
Die Modulationseinheit kann bei einem Ausführungsbeispiel
auch einen so genannten „Beam Blanker” umfassen,
der den Partikelstrahl ein- und ausschaltet. Dies kann beispielsweise
durch Kondensatorplatten oder eine Vorrichtung wie in der
DE 3904280 C2 offenbart
geschehen, wodurch der Partikelstrahl elektrostatisch abgelenkt
wird und zu bestimmten Zeiten die Probe nicht mehr erreicht. Alternativ
kann der Strahl auch schon in der Quelle moduliert werden, indem
deren Emission z. B. mit einem gepulsten Laser und mit Hilfe von Photoemission
bzw. Photoionisation zeitlich gesteuert wird.
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Weiterhin
umfasst die Vorrichtung aus 2 eine ebenfalls
von der Steuereinheit 32 steuerbare Lichtquelle 31,
beispielweise einen Laser. Von der Lichtquelle 31 erzeugtes
Licht wird über eine optische Faser 33, beispielsweise
eine Glasfaser, zu einer Faser-Auskopplung 24 gelenkt und
dort aus der optischen Faser 33 ausgekoppelt und von einer
Optik 25, welche schematisch durch eine einzige Linse dargestellt
ist, aber eine Vielzahl von optischen Elementen wie beispielsweise
Linsen, Filter, Polarisatoren und/oder Gitter umfassen kann, auf
die Probe 26 gelenkt.
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Von
der Probe 26 emittiertes Licht wird über eine
Optik 27, welche wiederum durch eine einzige Linse symbolisiert
ist, aber eine Vielzahl von optischen Elementen wie beispielsweise
Linsen enthalten kann, zu einer Fasereinkopplung 28 gelenkt
und in eine weitere optische Faser 36 eingekoppelt. Das so
eingesammelte Licht wird von optischen Elementen 29 auf
einen Fotodetektor 30 gelenkt und so detektiert. Die optischen
Elemente 29 können Elemente wie beispielsweise
Filter oder auch ein Spektrometer umfassen, um lichtwellenlängenselektiv
in dem Photodetektor 30 detektieren zu können.
Das so detektierte Licht wird dann in der Steuereinheit 32 bzw.
einem hieran angeschlossenen Computer 33 ausgewertet.
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Bei
einem weiteren Ausführungsbeispiel können für
die optische Anregung und die Detektion gemeinsame optische Komponenten
verwendet werden. Beispielsweise kann die Detektion auch über
die Komponenten 24 und 25 erfolgen, wobei durch
ein zusätzlich in die optische Faser 33 eingebrachtes Bauelement
(z. B. Strahlteiler oder Zirkulator) Anregungs- und Detektionslicht
getrennt werden können.
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Zudem
umfasst die Vorrichtung aus 2 einen
Sekundärelektronendetektor 23. Durch diesen können
Sekundärelektronen, welche beim „Beschuss” der
Probe 26 mit dem Partikelstrahl 35 entstehen,
detektiert werden, so dass beim Abrastern der Probe mit dem Partikelstrahl 35 neben
der Untersuchung der optischen Emission, detektiert durch den Photodetektor 30,
auch ein REM(Rasterelektronenmikroskopie)-Bild aufgenommen werden
kann. Bei anderen Ausführungsbeispielen können
auch andere durch den Partikelstrahl 35 hervorgerufene Elektronen,
z. B. Rückstreu- und/oder Tranmissionselektronen, zusätzlich
oder alternativ detektiert werden.
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Im
Folgenden wird zunächst die prinzipielle Funktionsweise
der Vorrichtung von 2 erläutert und dann
anhand von Beispielen und weiteren Figuren detaillierter beschrieben.
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Zur
Durchführung einer optischen Untersuchung wird die Probe 26 mit
von der Lichtquelle 31 erzeugtem Licht bestrahlt und damit
angeregt. Durch die Anregung erzeugte optische Emission wird über den
Photodetektor 30 detektiert. Die vorliegende Erfindung
ist dabei nicht auf eine spezielle Art der Emission beschränkt,
es kann sich beispielsweise um eine Detektion inelastischer oder
elastischer Streuprozesse des Anregungslichtes, beispielsweise Detektion von
Raman-Streuung, oder auch um Lumineszenz wie Fluoreszenz, Autolumineszenz
oder Biolumineszenz handeln.
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Gleichzeitig
wird die Probe innerhalb eines Anregungsspots des Anregungslichtes
mit dem Partikelstrahl 35 bestrahlt, wobei der Partikelstrahl über die
Modulationseinheit 21 in definierter, insbesondere vorgegebener
Weise zeitlich charakteristisch, beispielsweise periodisch, moduliert
wird. Die Energie des Partikelstrahls wird dabei derart gewählt,
dass die Probe 26 durch den Partikelstrahl zumindest teilweise
reversibel modifiziert wird, was die Eigenschaften des emittierten
und von dem Photodetektor 30 detektierten Lichts mit einer
entsprechenden zeitlichen Modulation verändert. Diese Veränderungen können
aufgrund der charakteristischen zeitlichen Modulation, welche durch
die Steuereinheit 32 gesteuert wird, beispielsweise mit
der so genannten Lock-in-Technik in der Steuereinheit 32 oder
einem Computer 37 detektiert werden. Bei anderen Ausführungsbeispielen
kann zur Detektion ein separater so genannter Lock-in-Verstärker
verwendet werden.
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Um
zu erreichen, dass die Modifikation der Probe 26 durch
den Partikelstrahl 35 zumindest teilweise, bevorzugt vollständig
reversibel abläuft, kann beispielsweise eine Energie und/oder
ein Fluss, beispielsweise die Anzahl Partikel pro Fläche
und Zeiteinheit auf der Probe, des Partikelstrahls 35 entsprechend
in Abhängigkeit von der Art der Probe 26 gewählt
werden.
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Bei
einem derartigen Verfahren kann – je nach Art des Partikelstrahls – das
partikelstrahlmodifizierte Wechselwirkungsvolumen zwischen der Anregungsstrahlung
und der Probe deutlich unterhalb der optischen Beugungsbegrenzung
liegen. Bei einem Elektronenstrahl ist dieses Wechselwirkungsvolumen
typischerweise birnenförmig, wobei die Größe des
Wechselwirkungsvolumens von der Partikelenergie abhängt.
Die Energie der Partikel nimmt vom Auftreffpunkt des Partikelstrahls
auf die Probe zum Rand des Wechselwirkungsvolumens hin kontinuierlich
ab, so dass verschiedene Prozesse in der Probe, beispielsweise auch
reversible und irreversible Prozesse, parallel ablaufen können.
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Die
Modifikation der durch den Photodetektor 30 detektierten
Emission durch den Partikelstrahl 35 wird nunmehr unter
Bezugnahme auf 3 näher erläutert.
Dabei zeigt 3A ein beispielhaftes System
mit drei Energieniveaus E0, E2 und
E1 zunächst ohne Beeinflussung
durch einen Partikelstrahl. Durch einfallendes Licht, beispielsweise
von der Lichtquelle 31 in 2 erzeugtes
Licht, mit einer Absorptionsfrequenz vab,
d. h. Energie h·vab, wird das System
vom Energieniveau E0 in das Energieniveau
E1 gebracht. Beispielsweise können
die dargestellten Energieniveaus Energieniveaus von Elektronen sein,
wobei in diesem Fall ein Elektron vom Energieniveau E0 zum Energieniveau
E1 angeregt wird. Grundsätzlich
ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch auch die Untersuchung
anderer Energieniveaus, beispielsweise Energieniveaus, welche mit
Schwingungszuständen verknüpft sind, möglich.
Im Folgenden werden elektronische Energieniveaus als Beispiel in
der Beschreibung verwendet.
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In
das Energieniveau E1 angeregte Elektronen
fallen bei dem dargestellten Beispiel nichtstrahlend, beispielsweise
durch Streuprozesse in einem Festkörper, auf das Energieniveau
E2 und dann strahlend wie durch einen Pfeil 42 angedeutet
unter Emission von Strahlung mit der Frequenz vem zurück auf
das Energieniveau E0.
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In
derartigen Systemen sind verschiedene Modifikationen der emittierten
Strahlung durch Einwirkung eines Partikelstrahls denkbar. Verschiedene Möglichkeiten
werden in Folge unter Bezugnahme auf die 3B bis 3F erläutert.
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Beispielsweise
können wie in 3B gezeigt Elektronen von den
Energieniveaus E0, E1 und/oder
E2 wie durch Pfeile 43, 44 und 45 symbolisiert,
durch die Einwirkung der Partikelstrahlung auf ein weiteres Energieniveau
E3 angehoben werden und von dort, wie durch
einen Pfeil 60 angedeutet, nichtstrahlend wieder auf das
Energieniveau E0 zurückfallen.
Die so aus den Energieniveaus E0, E1 und/oder E2 angeregten
Elektronen stehen nicht mehr für den strahlenden Übergang
von E2 auf E0 zur Verfügung.
Daher wird bei einem derartigen Prozess die Intensität
des mit der Frequenz vem emittierten Lichtes
verringert. Bei einer zeitlich charakteristischen Modulation des
Partikelstrahls, wie unter Bezugnahme auf 2 erläutert,
ist auch diese Abschwächung charakteristisch moduliert.
Somit ist der Einfluss des Partikelstrahls auf die Emission durch die
charakteristische Modulation von anderen Einflüssen unterscheidbar,
beispielsweise bei einer zeitlich periodischen Modulation der Anregung
mittels Lock-in-Technik detektierbar.
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Eine
andere Möglichkeit ist in 3C dargestellt. Ähnlich
wie in 3B werden hier durch Einwirkung
des Partikelstrahls, wie durch Pfeile 43, 44 und 45 symbolisiert,
Elektronen aus den Energieniveaus E0, E1 und/oder E2 auf
ein weiteres Energieniveau E4 angehoben.
Wie durch einen Pfeil 46 symbolisiert, können
diese Elektronen unter Aussendung mit von Strahlung mit einer Frequnez
vem2, welche in dem dargestellten Beispiel
kleiner ist als die Frequenzen vab und vem, wieder auf das Energieniveau E0 zurückfallen. Bei einem derartigen
Prozess wird – wie bei 3B – die
Intensität der emittierten Strahlung bei der Frequenz vem abgeschwächt, und es tritt zusätzlich
Strahlung mit einer Frequenz vem2 auf. Diese Phänomene
sind bei einer reversiblen Anregung durch den Partikelstrahl entsprechend
der zeitlichen Modulation des Partikelstrahls zeitlich moduliert.
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Eine
weitere Möglichkeit ist in 3D dargestellt.
Bei dem Beispiel der 3D werden durch den Partikelstrahl,
wie durch Pfeile 47, 48 und 49 dargestellt,
Elektronen aus den Energieniveaus E0, E1 und/oder E2 auf
das Vakuumniveau E angehoben, also gleichsam aus dem Material herausgeschossen. Auch
diese Elektronen stehen für den strahlenden Übergang
von E2 auf E0 nicht
mehr zur Verfügung, so dass auch in diesem Fall eine Abschwächung
der emittierten Strahlung auftritt.
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Eine
weitere Möglichkeit ist in 3E dargestellt.
In diesem Beispiel werden nicht nur durch die Anregungsstrahlung,
sondern auch den Partikelstrahl, wie durch einen Pfeil 50 symbolisiert,
Elektronen vom Energieniveau E0 auf das
Energieniveau E1 gebracht. In einem derartigen
Fall ergibt sich eine Verstärkung der Emission bei der
Frequenz vem.
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Noch
eine andere Möglichkeit ist in 3F gezeigt.
Durch den Einfluss des Partikelstrahls können die Energieniveaus
in der Probe auch verschoben werden. Bei dem in 3F schematisch
dargestellten Beispiel werden, wie durch Pfeile 54 angedeutet,
das Energieniveau E1 auf ein Niveau E11 und/oder das Energieniveau E2 auf
ein Niveau E22 verschoben. Hierdurch wird
zum einen, wie durch einen Pfeil 51 symbolisiert, zur Anregung
eine geringfügig höhere Energie benötigt,
zum anderen sinkt bei dem dargestellten Beispiel die Energiedifferenz
des strahlenden Übergangs (dann E22 zu
E0), der durch einen Pfeil 53 symbolisiert
wird, so dass eine entsprechende Emissionsfrequenz vem3 kleiner
wird.
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Die
Energieniveaus der 3A bis 3F dienen
lediglich als Beispiel und hängen von der Art der Probe
ab. Auch Systeme mit mehr oder weniger Energieniveaus sind im Rahmen
der vorliegenden Erfindung möglich. Als Beispiel zeigt 3G einen Quantenpunkt,
welcher beispielsweise ebenfalls als Marker im Rahmen der Erfindung
dienen kann. Quantenpunkte weisen ein Valenzband mit einer maximalen
Energie EV und ein Leitungsband mit einer minimalen
Energie EL auf, d. h. EV ist
die Energie einer Oberkante des Valenzbandes und EL die
Energie einer Unterkante des Leistungsbandes. Elektronen können
vom Valenzband in das Leitungsband angeregt werden, wobei bei einer
derartigen Anregung ein so genanntes Loch im Valenzband zurückbleibt.
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Wie
durch einen Pfeil 56 in 3G angedeutet,
kann eine derartige Anregung durch Strahlung mit einer Photonenenergie,
welche größer oder gleich EL-EV ist, beispielsweise bei der Frequenz vab, erfolgen. Ein derartiges erzeugtes Elektron-Loch-Paar
kann, wie durch einen Pfeil 57 angedeutet, strahlend rekombinieren,
wobei eine Energie h·vem eines
emittierten Photons gleich EL–EV ist. Auch bei einem derartigen Quantenpunkt
kann die Emission durch den Partikelstrahl reversibel modifiziert
werden, indem die Zustände der Ladungsträger durch den
Partikelstrahl geändert werden. Beispielsweise kann, wie
durch einen Pfeil 55 angedeutet, auch der Partikelstrahl
Elektronen vom Valenzband ins Leitungsband anregen, was die Emission
verstärkt. Auch aus anderen Energieniveaus kann der Partikelstrahl,
wie durch einen Pfeil 58 angedeutet Elektronen in das Valenzband
bringen. Auf der anderen Seite kann ein Partikelstrahl bei entsprechender
Energie auch, wie durch einen Pfeil 59 angedeutet, Elektronen
aus dem Valenzband entfernen, beispielsweise auf ein Vakuumniveau
E∞ (vgl. 3D) bringen,
was die Emission abschwächt.
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Die
in 3A bis 3G dargestellten
Prozesse sind lediglich als einfache Beispiele zu verstehen, wie
durch einen Partikelstrahl eine detektierte Emission reversibel
verändert werden kann. Welche Prozesse eine detektierte
Emission wie verändern hängt von dem emittierenden
Material sowie Energie und Fluss des Partikelstrahls ab. Zu bemerken
ist auch, dass sich die verschiedenen Prozesse beispielsweise in 3A bis 3F nicht
gegenseitig ausschließen, sondern mehrere dieser Prozesse
parallel stattfinden können.
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Bei
den dargestellten Beispielen wird durch den Einfluss des Partikelstrahls
eine Emissionsintensität und/oder eine Emissionsenergie
(d. h. Frequenz) verändert. Bei anderen Ausführungsbeispielen
können zusätzlich oder alternativ auch andere
Eigenschaften des emittierten Lichts, beispielsweise eine Polarisation
oder eine Phase des detektierten Lichts, durch den Partikelstrahl
zumindest teilweise reversibel verändert werden und dann
entsprechend detektiert werden.
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Auch
die Energieniveaus in 3 sind lediglich
als Beispiel zu verstehen, und die relative Lage der Energieniveaus
kann auch anders als dargestellt sein.
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Wie
bereits erläutert wird der Partikelstrahl zeitlich charakteristisch
moduliert, und die Detektion erfolgt entsprechend der zeitlichen
Modulation. Ein Beispiel für eine derartige Modulation
des Partikelstrahls, beispielsweise eines Elektronenstrahls, ist
in 4A dargestellt. Bei dem Beispiel in 4A wird der
Partikelstrahl im Wesentlichen periodisch an- und ausgeschaltet
oder anders ausgedrückt mit einem periodischen Rechtecksignal
moduliert. Zu beachten ist, dass in der Praxis unter Umständen
ein exaktes Rechtecksignal nicht erreicht wird, sondern die Flanken
mehr oder weniger steil sind, was jedoch am Prinzip der Erfindung
nichts ändert. Ein Beispiel für eine durch eine
derartige Modulation des Partikelstrahls hervorgerufene periodische
Modulation der detektierten Emission ist in 4B dargestellt.
Durch die gesteuerte Modulation des Partikelstrahls kann die Emission
mit einem entsprechenden auf die Signalform angepassten Verfahren
detektiert werden, beispielsweise Lock-in-Detektion des emittierten
Signals, so genannte Matched Filter – Detektion oder so genanntes
Boxcar-Integrationsverfahren. Die Analyse des durch den Photodetektor 30 aus 2 oder einen
anderen Detektor erzeugten elektrischen Signals kann daher in einem
rauscharmen Spektralbereich erfolgen, beispielsweise um eine von
Null verschiedene Mittenfrequenz herum, bei welcher ein 1/f-Rauschen
des Detektionssystems bereits sehr viel schwächer ist als
in der Nähe des Nullpunkts. Eine statische Änderung
der Fluoreszenzleistung, welche nicht auf einer zumindest teilweise
reversiblen Modifikation durch einen Partikelstrahl beruht, beruht
dagegen auf einer Messung in der Nähe des Nullpunkts, welche
stärker rauschbehaftet ist.
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Es
ist zu bemerken, dass die in 4A und 4B dargestellten
Signalverläufe lediglich beispielhaft zu betrachten sind,
und auch andere charakteristische Modulationen eines Partikelstrahls möglich
sind, beispielsweise eine sinusförmige oder dreieckförmige
Modulation. Auch kann bei einer derartigen Modulation die Intensität
des Partikelstrahls zu allen Zeiten von 0 verschieden sein. Auch
nichtperiodische charakteristische Modulationen, wie z. B. ein harmonisches
Signal mit ansteigender oder abfallender Frequenz (Frequenzsweep)
sind möglich.
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Bei
manchen Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung
kann zusätzlich zum Partikelstrahl auch eine Anregung,
beispielsweise das von der Lichtquelle 31 aus 2 erzeugte
Licht, zeitlich charakteristisch, z. B. periodisch moduliert werden. Die
Detektion des emittierten Lichtes kann dann angepasst auf das entstehende
Mischsignal erfolgen. Beispielsweise können der Partikelstrahl
und ein anregender Lichtstrahl mit verschiedenen Frequenzen sinusförmig
moduliert werden, und die Detektion kann dann mit einem Lock-in-Verfahren
bei der Summenfrequenz und/oder der Differenzfrequenz der Anregungsfrequenzen
erfolgen (sogenannte heterodyne Mischtechnik).
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Wie
bereits erwähnt kann bei dem Ausführungsbeispiel
von 2 durch die Scanvorrichtung 22 der Partikelstrahl 35 über
die Probe gefahren werden, so dass eine größere
Probenfläche untersucht werden kann. Bei manchen Ausführungsbeispielen kann
zudem auch der Anregungsspot des Anregungslichtes, d. h. der durch
die Optik 25 mit dem von der Lichtquelle 31 erzeugten
Lichtstrahl beleuchtete Fläche, auf der Probe verfahren
werden. In gleicher Weise kann auch der Detektionsbereich verfahren werden.
Hierdurch ist eine Untersuchung von Probenflächen, welche
größer sind als der Anregungsspot bzw. Detektionsbereich,
möglich. Da die Detektion wie oben erläutert in
Abhängigkeit von der Modulation des Partikelstrahls erfolgt,
beeinflussen Änderungen, welche nur von dem Verfahren des
Anregungsspots bzw. Detektionsbereichs auf der Probe herrühren,
die Messung nicht bzw. können durch geeignete Detektionstechniken
wie Lock-in-Technik herausgefiltert werden.
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Bei
dem Ausführungsbeispiel von 2 erfolgt
eine optische Anregung mit von der Lichtquelle 31 erzeugtem
Licht. Es sind bei anderen Ausführungsbeispielen zusätzlich
oder alternativ jedoch auch andere Mechanismen zur Anregung der
Probe möglich, beispielsweise eine elektrische Anregung, z.
B. durch Anlegen einer Spannung an der Probe, oder eine thermische
Anregung durch (lokales) Erwärmen der Probe.
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Im
Folgenden sollen nunmehr Beispiele für mögliche
Materialsysteme erläutert werden.
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Beispielsweise
kann als Fluoreszenzmarker in einer Probe so genanntes Green Fluorescent
Protein (GFP) verwendet werden. Die Wellenlänge, bei der
dieses Molekül durch einen Lichtstrahl anregbar ist, liegt
bei 395 nm bzw. 475 nm, was Energien von 3,1 eV bzw. 2,6 eV entspricht.
Eine durch diese Anregung hervorgerufene Fluoreszenzemission erfolgt dann
bei einer Wellenlänge von 509 nm entsprechend 2,4 eV. Als
Partikelstrahl kann bei einem derartigen Ausführungsbeispiel
ein Elektronenstrahl eines Niederspannungsrasterelektronenmikroskops (Low
Voltage Scanning Electron Microscope) verwendet werden. Die Parameter
des Elektronenstrahls werden dabei so gewählt, dass es
durch die Wechselwirkung der Elektronen mit dem Fluoreszenzmarker
zu einer Abschwächung der Fluoreszenzemission bei 409 nm
kommt, ohne dass dabei der Fluoreszenzmarker zerstört wird.
In anderen Worten werden die Parameter des Elektronenstrahls so
gewählt, dass die Abschwächung der Emission reversibel
ist.
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Experimente
an mit GFP markierten biologischen Proben haben gezeigt, dass bei
einem Beschuss mit Elektronen mit Partikelenergien von mehr als
15 keV und Dosen von 5000 Elektronen pro nm2 ein
vollständiges irreversibles Auslöschen der optischen
Emission eintritt. In anderen Worten wird bei derartigen Energien
und Dosen das GFP irreversibel zerstört bzw. verändert.
Für Elektronen von weniger als 3 keV und Dosen von 100
Elektronen pro nm2 bleibt die optische Emission
hingegen weitgehend erhalten. Um eine irreversible Schädigung
des Probenmaterials zu vermeiden, wird bei einem Ausführungsbeispiel
die Energie der Elektronen (oder ggf. anderer Partikel) kleiner
als 10 keV, bevorzugt kleiner als 5 keV oder kleiner als 2 keV gewählt.
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Ein
derartiges Verfahren erlaubt also die gezielte rauscharme Detektion
der relevanten, d. h. durch den Partikelstrahl modifizierten, Signalanteile mit
sehr hohem Dynamikbereich (z. B. 100 dB dynamischen Bereich bei
entsprechenden kommerziell erhältlichen Lock-in-Verstärkern).
Auch können langsame Driftbewegungen des Gesamtsystems
ausgeblendet werden. Durch den erhöhten Dynamikbereich
kann auch das Verhältnis von Sichtfeld und Ortsauflösung
gegenüber dem Stand der Technik vergrößert
werden. Der Elektronenstrahl kann über eine größere
Fläche abgerastert werden, ohne dass der Bereich, in dem
die emittierte optische Leistung erfasst wird, also der Detektionsbereich,
bewegt wird. Umgekehrt kann auch bei gleicher Fläche des Detektionsbereichs
die Ortsauflösung verbessert werden.
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Die
Modulationsgeschwindigkeit des Partikelstrahls und die Modulationsform
kann dabei an einen zu detektierenden Emitter, beispielsweise einen Fluoreszenzmarker,
angepasst werden. Insbesondere kann die Modulationsfrequenz in Abhängigkeit
von einer Lebensdauer eines betrachteten strahlenden Übergangs
gewählt werden. Beispielsweise weist Rhodamin-6G, welches
in Ausführungsbeispielen der Erfindung als Fluoreszenzmarker
bzw. Farbstoff verwendet werden kann, eine Fluoreszenzlebensdauer
von 4,3 ns auf. Bei einem derartigen Beispiel wird die Modulationsfrequenz
dann beispielsweise kleiner als 100 MHz gewählt werden.
Die Ladungsträgerlebensdauer in lichtemittierenden Quantenpunkten,
wie in 3G gezeigt, beträgt
oft beispielsweise typischerweise wenige Pikosekunden. Bei derartigen Systemen
können dann Modulationsgeschwindigkeiten bzw. Modulationsfrequenzen
von mehreren GHz gewählt werden. Die Modulationsfrequenz
kann auch in Abhängigkeit von systemtechnischen Aspekten, wie
Eigenschaften der zur Detektion verwendeten Geräte, dem
gewünschten Aufwand für die Signalverarbeitung
oder der Messempfindlichkeit gewählt werden.
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Wie
bereits erwähnt ist die Anwendung der Erfindung nicht auf
die Detektion von Fluoreszenzmarkern beschränkt, sondern
kann insbesondere auch zur Detektion intrinsischer Probeneigenschaften,
z. B. mit Hilfe von Bio- oder Autolumineszenz, eingesetzt werden.
Das Verfahren ist ferner, wie ebenfalls bereits erwähnt,
nicht auf die Manipulation und Detektion von Lumineszenz emittierter
Strahlung beschränkt, sondern es können allgemein
spektroskopische Analyseverfahren, wie z. B. Raman-Spektroskopie
oder optisch nicht-lineare Spektroskopie zur räumlich hochaufgelösten
Messung und Charakterisierung von Proben verwendet werden. Vorraussetzung
ist lediglich, dass die detektierte Emission durch einen Partikelstrahl
zumindest teilweise reversibel modifizierbar ist. Diese Modifizierung
kann sich beispielsweise auf die Intensität, Phase, Frequenz oder
auch den Polarisationszustand der emittierenden Strahlung auswirken.
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Ein
Beispiel für eine Raman-spektroskopische Untersuchung ist
in 5 dargestellt (Quelle: A. Weiss, G. Haran;
J. Phys. Chem. B 2001 105 12348–12354). 5 zeigt
die Intensität in Abhängigkeit von der Raman-Verschiebung
für verschiedene Zeiten in Folge des Ladungsträgeraustausches des
Moleküls mit seiner Umgebung für das bereits erwähnte
Rhodamin-6G. Dieser Ladungsträgeraustausch kann beispielsweise
mit einem Partikelstrahl beeinflusst werden.
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Ein
anderes Beispiel ist eine so genannte Zweiphotonenanregung, in 6 durch
Pfeile 61 und 62 symbolisiert, d. h. hier erfolgt
eine Anregung über einen Prozess mit zwei Photonen der
Frequenzen va1 und va2,
was einer Gesamtanregung, wie durch einen Pfeil 60 angedeutet,
einer Frequenz vA entspricht. Fluoreszenzübergänge
sind durch Pfeile 64 und 65 markiert, zusätzlich
kann auch ein strahlender Übergang von einem Niveau S1 auf ein Niveau S0,
wie durch einen Pfeil 63 angedeutet, erfolgen. Diese Übergänge
können in ähnlicher Weise, wie unter Bezugnahme
auf 3A bis 3G erläutert,
durch einen Partikelstrahl modifiziert werden.
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Es
ist zu bemerken, dass die Erfindung nicht auf Einsatz einer einzigen
Art von Fluoreszenzmarkern oder dergleichen beschränkt
ist, sondern es können auch verschiedenartige Marker oder
verschiedene Übergänge bei verschiedenen Frequenzen
detektiert werden. Auch weitere Modifikationen und Varianten sind
möglich. Beispielsweise kann die Anregung der Probe, beispielsweise
durch Licht wie oben beschrieben, zeitlich verändert werden,
um dynamische Eigenschaften der Lichtemission, beispielsweise mit
so genannten Pump-Probe-Messungen, zu bestimmen. Der zeitliche Verlauf
der emittierten Leistung kann untersucht werden, um dynamische Eigenschaften
des Licht emittierenden Prozesses bzw. Materials zu untersuchen.
Beispielsweise kann der verwendete Partikelstrahl mit abstimmbarer Frequenz
periodisch moduliert und die jeweilige Amplituden- und Phasenlage
der zugehörigen Variation der emittierten optischen Strahlung
registriert werden.
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Da
die Anregung durch den Partikelstrahl zumindest teilweise reversibel
erfolgt, kann die örtliche Bewegung eines Partikels nachverfolgt
werden, sofern die Abrastergeschwindigkeit des Partikelstrahls hoch
genug ist.
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Wie
bereits erwähnt kann durch den Sekundärelektronendetektor 23 in 2 oder
eine andere entsprechende Vorrichtung zur Detektion von Elektronen
(z. B. Rückstreu- oder Transmissionselektronendetektor)
gleichzeitig mit der optischen Messung ein Rasterelektronenmikroskopbild
aufgenommen werden. Da die Erfassung gleichzeitig mit der Erfassung
der optischen Emission erfolgt, kann das so entstehende Rasterelektronenmikroskopbild
mit den erfassten optischen Eigenschaften korreliert werden.
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Bei
dem dargestellten Beispiel wird der Partikelstrahl 35 durch
die Scanvorrichtung 22 über die Probe gerastert.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel kann der Partikelstrahl
auch stationär bleiben und die Probe entsprechend bewegt
werden. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann sowieso
sowohl der Partikelstrahl als auch die Probe bewegt werden.
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Bei
einem anderen Ausführungsbeispiel wird nicht nur ein Partikelstrahl,
sondern eine Vielzahl von Partikelstrahlen verwendet. Die Partikelstrahlen
können verschiedene Strahleigenschaften, z. B. verschiedene
Energien, aufweisen, um die Emission der Probe in verschiedenen
Weisen zu beeinflussen. Es ist jedoch auch möglich, mehrere
Partikelstrahlen mit gleichen Strahleigenschaften zu verwenden,
welche beispielsweise verschiedene Gebiete des Anregungsspots bzw.
Detektionsbereichs abrastern, um somit ein schnelleres Erfassen
der gesamten zu untersuchenden Fläche durch Parallelisierung
der Messung zu ermöglichen. Die Partikelstrahlen können
mit verschiedenen Charakteristiken charakteristisch moduliert sein,
beispielsweise mit verschiedenen Frequenzen periodisch moduliert
sein. Hierdurch können bei der Detektion die Einflüsse
der verschiedenen Partikelstrahlen voneinander getrennt werden. Ein
Beispiel ist die Verwendung eines parallelen Multi-Elektronenstrahls,
bei dem die einzelnen Strahlen mit unterschiedlichen Frequenzen
moduliert werden. Die Detektion erfolgt dann parallel bei den jeweiligen Modulationsfrequenzen.
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Bei
wieder anderen Ausführungsbeispielen werden nicht spezielle
Marker, sondern direkt Zustände der Probe untersucht.
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Beispielsweise
kann ein Ausführungsbeispiel der Erfindung dazu verwendet
werden, Gitterverspannung bei Halbleiterstrukturen mit hoher räumlicher
Auflösung zu detektieren. Dazu wird die Oberfläche
der Halbleiterstruktur mit Laserlicht, z. B. aus der Lichtquelle 31 aus 2,
bestrahlt und das inelastisch gestreute Licht spektral aufgelöst
detektiert, d. h. ein Raman-Spektrum aufgenommen. Verspannte Bereiche
führen zu charakteristischen Linien im Raman-Spektrum.
Durch das Abrastern mit einem modulierten Partikelstrahl wird die
Raman-Streuung lokal beeinflusst; dies kann durch eine Änderung
der entsprechenden Spektrallinien signalangepasst detektiert werden.
Durch polarisationsabhängige Messungen lässt sich
die Ansisotropie der Verspannung (Verspannungstensor) bestimmen.
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Bei
einem anderen Ausführungsbeispiel werden die spektroskopischen
Eigenschaften individueller, auf einer Oberfläche isoliert
präparierter Moleküle ermittelt (Einzelmolekülspektroskopie).
Bei sehr großen Molekülen ist eine gezielte spektroskopische
Untersuchung von einzelnen Molekülabschnitten möglich.
Dies kann beispielsweise zur Sequenzierung von DNA verwendet werden.
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Wie
aus dem obigen ersichtlich sind eine Vielzahl von Modifikationen
und Varianten möglich, und die vorliegende Erfindung ist
daher nicht auf die dargestellten Ausführungsbeispiele
begrenzt.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - EP 1616216
A2 [0002]
- - EP 1655597 B1 [0004]
- - DE 3904280 C2 [0035]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - A. Weiss,
G. Haran; J. Phys. Chem. B 2001 105 12348–12354 [0069]