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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers
aus Kunststoff oder Glas, insbesondere betrifft die Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit einer gewünschten
Rauhigkeit bzw. Schichtdicke.
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Träger
mit gewünschten Oberflächeneigenschaften werden
typischerweise durch Aufbringen einer Beschichtung hergestellt.
Bei diesen Oberflächeneigenschaften kann es sich beispielsweise
im Falle der Beschichtung optischer Gläser um Reflexionseigenschaften
handeln.
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Bei
anderen Anwendungen werden Anforderungen an die Rauhigkeit der Oberfläche
gestellt, damit weitere Materialien auf den beschichteten Träger
aufgebracht werden können und dort besser haften. Ferner stellt
die Durchlässigkeit der Beschichtung eine derartige Oberflächeneigenschaft
dar, um beispielsweise das Ausgasen durch die Oberfläche
des Trägers hindurch zu verhindern.
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Träger
mit derartigen Oberflächeneigenschaften werden in vielfältigen
Anwendungen benötigt.
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Zur
Herstellung von Trägern mit bestimmten Oberflächeneigenschaften
sind vielfältige Verfahren bekannt. Oberflächen
mit hoher Rauhigkeit können beispielsweise durch mechanische
Entfernung von Oberflächenmaterial oder durch Ätzen
hergestellt werden. Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Oberflächen
mit z. B. bestimmten Rauhigkeits-, Reflexions- oder Dichtigkeitseigenschaften
besteht in der Beschichtung der Trägeroberfläche.
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Ein
bekanntes Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen stellt
die Flammenpyrolyse dar. Hierbei wird ein Bereich der Oberfläche
des zu beschichtenden Trägers mit einer Flamme überstrichen
und Material als Schicht auf der Oberfläche abgeschieden,
während die Flamme die Trägeroberfläche überstreift.
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Bei
der Flammenpyrolyse kann die Kontaktzeit zwischen Träger
und Flamme niedrig gehalten werden, so dass auch Kunststoffe oder
Gläser mit niedrigem Schmelzpunkt mittels Flammenpyrolyse
beschichtet werden können.
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Die
hier beschriebenen Träger können eingesetzt werden
für komplexe Bio Analytik: Wechselwirkung zwischen Proteinen,
Antikörpern, Zellen oder DNA Halbsträngen. Z.
B. werden im Rahmen der DNA-Microarray-Technologie Microarrays,
d. h. Probenträger benötigt. Diese Technologie
basiert auf der Hybridisierung von Nukleinsäuren (Watson
Crick-Base-Pairing). Dabei lagern sich zwei komplementäre
Nukleinsäure-Einzelstränge über Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen ihren hydrophoben Pyrin- und Pyrimidin-Basen zusammen, um
den Wasserkontakt zu minimieren. Das Prinzip mit markierten Nukleinsäuren
andere Nukleinsäuren zu analysieren nutzte erstmals Ed
Southern (Southern Blot).
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Micro-Arrays
bestehen typischerweise aus einem auf ein Glassubstrat aufgebrachten
organischen Film, auf den punktförmig (Dot mit ca. 100
bis 150 μm Durchmesser) einsträngiges DNA-Material
aufgebracht wurde. Eine erfolgreiche Anbindung der zu analysierenden,
mit Fluoreszenzfarbstoff versehenen einsträngigen DNA an
die punktförmig auf den organischen Film aufgebrachte einsträngige
DNA ist durch einen fluoreszierenden DNA-Dot nachweisbar. Statt
einer vollständigen DNA können auch kurzkettige
Moleküle (Oligos) analysiert werden.
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Eine
notwendige Voraussetzung für den erfolgreichen Einsatz
von Micro-Arrays als empfindliche Sensorsysteme ist eine hohe Detektionsempfindlichkeit
des Fluoreszenz-Lichtes. Diese Detektionsempfindlichkeit wird im
wesentlichen durch die Stärke des zu detektierenden Signals
und durch das Signal-Rausch-Verhältnis bestimmt. Ursachen
für störende Hintergrundsignale sind beispielsweise
Autofluoreszenz des Substrates, oder Verunreinigungen der im Anregungslicht
befindlichen optischen Bauteile sowie intrinsisches Rauschen im Detektor
selbst. Die Autofluoreszenz des Substrates oder der optischen Bauteile
kann dabei weitgehend durch Verwendung nicht oder nur gering fluoreszierender
Materialien eingeschränkt werden.
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Das
Glassubstrat der Micro-Arrays besteht typischerweise aus gereinigten
plättchenartigen Glassubstraten wie BF33 und D263, auf
denen funktionalisierte Silane aufgebracht sind, die einen weiteren
organischen Film (Proteine, Antikörper oder DNA) binden.
Hierbei besteht zunächst das Problem der Haftung zwischen
den Glasplättchen und den funktionalisierten Silanen. Je
rauher die Oberfläche des Trägers ist, desto besser
haften die funktionalisierten Silane auf dem Glas.
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Es
ist daher eine Aufgabe der Erfindung, Gläser mit hoher
Rauhigkeit der Oberfläche für die Herstellung
von Protein- oder DNA-Microarray-Probenträgern bereit zustellen.
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Es
ist bekannt, zur Versiegelung der Oberflächen von Gegenständen
Barriere- oder Sperrbeschichtungen einzusetzen. Derartige Barriereschichten
werden zum Beispiel bei Lebensmittelverpackungen eingesetzt, um
eine möglichst hermetische Versiegelung der verpackten
Nahrungsmittel und eine Verlängerung der Haltbarkeit zu
erreichen.
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Kunststoffe
mit geringer Gasdurchlässigkeit sind verfügbar,
aber teuer und werden für hochspezialisierte Anwendungen
produziert.
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Eine
solche hochspezialisierte Anwendung stellt die Lagerung der erwähnten
Probenträgern im Zusammenhang mit der Protein oder DNA
Microarray Technologie dar. Die Probenträger werden hierbei
in Kunststoffboxen gelagert. In diesem Fall führt das Ausgasen
des Kunststofffs der Boxen zu organischen Ablagerungen auf dem in
der Kunststoffbox befindlichen Probenträger, was zu unerwünschten Änderungen
der Fluoreszenz und der Oberflächenenergie des Probenträgers
führt. Diese unerwünschten Änderungen
der Fluoreszenzeigenschaften des Probenträgers verursachen
insbesondere ein höheres Hintergrundrauschen bei der späteren
Verwendung des Probenträgers, d. h. das Signal-Rausch-Verhältnis
während späterer Messungen wird negativ beeinflusst.
Die Veränderungen der Oberflächenenergie führen
zu einer Vergrößerung des sogenannten Kontaktwinkels
mit Wasser, was die Benetzungseigenschaften des Probenträgers
negativ beeinflusst. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es daher,
in kostengünstiger Weise Kunststoffboxen mit einer Barriereschicht zur
Verhinderung des Ausgasens des Boxenmaterials während der
Lagerung von Protein oder DNA Probenträgern zur Verfügung
zu stellen.
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Diese
Aufgaben werden bereits in höchst überraschend
einfacher Weise durch ein Verfahren gemäß Anspruch
1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen
sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche.
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Demgemäß ist
ein Beschichtungsverfahren bei der Herstellung von Probenträgern
mit folgenden Schritten vorgesehen:
- a) Bereitstellen
von Glasplättchen mit einer Objektseite;
- b) Flammen-pyrolytisches Auftragen von SiOx auf
die Objektseite des Glasplättchens zur Erzeugung einer metalloxidischen
Rauhigkeitsschicht, vorzugsweise einer Rauhigkeitsschicht aus SiOx, beziehungsweise SiOx enthaltend;
- c) Aufbringen einer organischen Schicht auf die Rauhigkeitsschicht;
- d) Aufbringen von cDNA Arrays auf die organische Haftschicht
des Glasplättchens zum Erhalt von cDNA-Microarray-Probenträgern.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren sieht also das Bereitstellen
eines Trägers mit einer zumindest teilweise flachen Oberfläche
vor, auf der mittels Flammenpyrolyse eine SiOx Schicht,
vorzugsweise eine SiO2- oder SiO2-artige Schicht aufgebracht wird, bis eine
gewünschte Rauhigkeit oder Schichtdicke erreicht wird.
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In
einer ersten Ausführungsform des Verfahrens werden Glasplättchen,
die eine glatte Oberfläche aufweisen, mittels Flammenpyrolyse
mit einer SiOx Schicht versehen. Insbesondere kann hierbei SiO2 verwendet werden. Statt SiOx können
auch andere Metalloxide verwendet werden, sofern diese eine ähnliche
Topologie der Beschichtung ausbilden. Zwar ist Silizium streng genommen
kein Metall, aber SiOx als Metalloxid zu bezeichnen, stellt einen
in der speziellen Chemie des vorliegenden Gebietes üblichen
Sprachgebrauch dar. Abhängig von den Ablagerungsparametern
wie Temperatur und Einwirkungszeit der Flamme, ergibt sich eine
rauhe Oberfläche, die von wenigen, weit verstreuten, tröpfchenförmigen
Teilchen oder von vielen Teilchen verursacht werden, wobei die Größe
der Teilchen bis zu einer Nanostruktur reicht. Die sich an der Oberfläche
ablagernden Teilchen haben eine Größe von etwa
10–100 nm Durchmesser. Größere Strukturen
(bis 500 nm) können sich durch die Zusammenlagerung kleinerer
Teilchen ergeben.
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Die
mittlere Schichtdicke der Rauhigkeitsschicht beträgt 10
nm bis 5 nm und besteht aus tröpfchenförmigen
Partikeln.
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Zusätzlich
kann ein optisch wirksames anorganisches Schichtsystem, z. B. ein
Inteferenzschichtsystem auf dem Probeträger aufgebracht
werden. Dieses Interferenzschichtsystem kann insbesondere so ausgelegt
werden, dass das Quadrat der Feldamplitude im Bereich der aufgebrachten
cDNA durch Überlagerung des einfallenden und des an den
einzelnen Schichten reflektierten Lichts maximal oder zumindest
fast maximal ist. Vorzugsweise befindet sich dabei die cDNA in einem
Bereich, in welchem das Quadrat der Feldamplitude zumindest 75%
des Maximalwerts beträgt.
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Vor
der Aufbringung der funktionalisierten Silane in dem von Schott/Nexterion
verwendeten Beschichtungsprozess wird das Glas vor der Aufbringung
der organischen Schichten (Silane) gereinigt. Ein hierbei von der
Anmelderin typischerweise verwendete Reinigungsprozess hier genannt ”V22” ist äußerst
aggressiv, was die Oberfläche des Glases angreift und Teile
der Oberfläche wegätzt. Auch die mittels Flammenpyrolyse
aufgebrachte Schicht wird angeätzt und teilweise entfernt,
was die Rauhigkeit wieder reduziert.
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Wurde
zuvor eine anorganische Interferenzschicht aufgebracht, so wird
diese während des Renigungsprozesses durch die Rauhigkeitsschicht
geschützt.
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Die
durch den Reinigungsprozess verursachte Minderung der Rauhigkeit
der Oberflächenstruktur stellt ein Problem dar, das durch
vorheriges Aufbringen einer äußerst rauhen Oberfläche
gelöst wird. Dies stellt sicher, dass nach dem Reinigen
trotz des damit verbundenen Entfernens von Oberflächenstruktur
eine hinreichend raue Oberfläche übrig bleibt.
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In
einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die durch
Flammenpyrolse erzeugte Beschichtung mittels einer Hitzebehandlung
stabilisiert, d. h. die Beschichtung wird getempert.
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Erfindungsgemäß liegt
die Tempertemperatur vorzugsweise im Bereich von 400°C
bis 600°C und die Temperzeit vorzugsweise im Bereich von
10 Minuten bis 120 Minuten.
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In
einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung wird
die mit der Rauhigkeitsschicht beschichtete und mit organischen
Schichten funktionalisierte Oberfläche mit cDNA oder Proteinen
beschichtet. Die derart beschichtete Oberfläche kann anschließend
hybridisiert oder Proteinreaktionen ausgesetzt werden.
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In
einer dritten Ausführungsform der Erfindung besteht der
bereitgestellte Träger aus einer ausgasdicht verschließbaren
Kunststoffbox. Auf die Innenseite dieses Trägers wird mittels
Flammenpyrolyse ein Metalloxid, vorzugsweise SiOx wie
SiO2, aufgebracht. Hierbei ist die Kontaktzeit
zwischen Flamme und Kunststoffträger kurz, um ein Schmelzen
des Kunststoffs zu verhindern.
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Der
Beschichtungsvorgang kann mehrfach wiederholt werden, um verbesserte
Barriereschichten auf dem Kunststoff aufzubringen. Hierbei können
Abkühlzeiten vorgesehen werden, um Hitzestau im Kunststoffträger
zu verhindern.
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Es
hat sich gezeigt, dass der Kunststoffträger nicht von flacher
Geometrie sein braucht, sondern dass auch komplexe Geometrien mit
Einbuchtungen und Ecken mittels des erfindungsgemäßen
Verfahrens mit einer Sperrschicht gegen Ausgasen versehen werden
können. Somit können auch geformte Kunststoffteile
beschichtet werden.
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Experimentell
wurde nachgewiesen, dass sehr viele verschiedene Kunststoffarten
auf die erfindungsgemäße Weise beschichtet werden
können.
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In
Abhängigkeit von den Beschichtungsparametern wurden Beschichtungen
verschiedener Dicke hergestellt. Hierbei betrug die mittlere Beschichtungsdicke
der Innenseite der Kunststoffbox an der dicksten Stelle 20 nm bis
zu 100 nm und an den Seitenwänden 5 nm bis zu 40 nm. Die
lokale Rauhigkeit der beschichteten Oberfläche lag im Bereich
10 nm bis 200 nm. Im Falle einer ”dünnen” Beschichtung
betrug die mittlere Dicke der Beschichtung ungefähr 20
nm bis 100 nm im dicksten Bereich und war auf den Seitenwänden
der Boxen nicht nachweisbar. Im Falle einer ”dicken” Beschichtung
betrug die mittlere Schichtdicke ca. 20–100 nm in einigen
Bereichen und ungefähr 5 nm bis 40 nm auf den Seitenwänden
der Boxen.
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Die
Auswirkungen der Beschichtung der Innenseiten der Kunststoffboxen
wurde auf Basis der Hintergrundfluoreszenz der in den Boxen gelagerten
Probenträger gemessen. Die ”dicke” Beschichtung
zeigte in allen Fällen eine deutliche Verbesserung der
Reduzierung der Hintergrundfluoreszenz der Probenträger.
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Die
Oberflächenfluoreszenz konnte um bis zu einem Faktor 2
reduziert werden.
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Im
Falle der ”dünnen” Beschichtung konnte
ein derartiger Effekt nicht nachgewiesen werden, da hier die Seitenwände
der Kunststoffbox nicht beschichtet waren.
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Die
Auswirkung der Beschichtung der Innenseiten der Kunststoffboxen
wurde auch mittels des Kontaktwinkels von Wasser auf dem im Inneren
der Kunststoffbox gelagerten DNA Probenträger gemessen.
Unter dem Kontaktwinkel wird derjenige Winkel verstanden, den ein
Flüssigkeitstropfen auf der Oberfläche eines festen
Stoffes zu dieser Oberfläche bildet. Im Falle von ”dicken” Beschichtungen
konnte ein lediglich kleiner Anstieg des Kontaktwinkels nachgewiesen
werden.
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Im
folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen
und unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert,
wobei gleiche und ähnliche Elemente mit gleichen Bezugszeichen
versehen sind und die Merkmale verschiedener Ausführungsbeispiele
miteinander kombiniert werden können.
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Die
Erfindung wird im folgenden an Hand von Ausführungsbeispielen
näher beschrieben. Es zeigen dazu:
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1 die
schematische Darstellung eines Micro-Arrays, beziehungsweise eines
Micro-Array-Probenträgers
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2 die
Zunahme der Rauhigkeit der Oberfläche eines Microarrays
während des Beschichtungsvorgangs,
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3 einen
Vergleich der Veränderung der Oberflächenbeschaffenheit
eines Microarrays, ausgehend von der Beschaffenheit nach der Beschichtung,
zwischen einem vor dem Reinigungsprozess hitzebehandelten und einem
vor dem Reinigungsprozess nicht hitzebehandelten Slide,
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4a,
b Diagramme zu Messungen der Intensität des Hintergrundsignals
vor und nach der Hybridisierung sowie des Kontaktwinkels verschiedener
Slides,
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5 ein
Diagramm zu Messungen der normalisierten Signalintensität
von Slides mit verschieden behandelten Oberflächen,
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6 die
Oberflächenbeschaffenheit verschiedener Stellen einer SiOx-beschichteten Kunststoffbox,
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7 Ergebnisse
der Analyse der Oberflächenbeschaffenheit verschiedener
Stellen einer beschichteten Kunststoffbox,
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8a–d
Diagramme der Messung der Hintergrundfluoreszenz nach Lagerung der
Slides in beschichteten Kunststoffboxen für zwei Monate
bei Raumtemperatur,
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9a–d
Diagramme der Messung der Hintergrundfluoreszenz nach Lagerung verschiedener
Typen von Slides in beschichteten Kunststoffboxen für 100
Stunden bei 60°C,
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10 ein
Diagramm des Kontaktwinkels mit Wasser nach Lagerung gereinigter
Slides in beschichteten Kunststoffboxen für 100 Stunden
bei 60°C,
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Die
erste beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens betrifft ein Micro-Array, beispielsweise für
DNA-Analysen. Die typische Größe eines derartigen
sogenannten Slides beträgt 2,5 cm mal 7,5 cm.
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1 zeigt
einen schematischen, nicht maßstäblichen Aufbau
eines zur DNA-Analyse verwendeten, als Ganzes mit
10 bezeichneten
Micro-Arrays, beziehungsweise Micro-Array-Probenträgers.
Das Micro-Array
10 besteht aus einem Substrat
1 aus
Glas, einem Interferenzschichtsystem
2, welches als fluoreszenzverstärkende
Beschichtung wirkt, und fluoreszenzfähigem Material, welches
auf der Oberfläche
7 der fluoreszenzverstärkenden
Beschichtung, beziehungsweise dem Interferenzschichtsystem
2 aufgebracht
ist und welches typischerweise aus einer ca. 2 nm dicken organischen
Haftschicht
3 und punktförmig aufgebrachten ca.
40 nm dickem DNA-Halbstrang-Material mit angehängtem Fluoreszenzmolekül
4,
beispielsweise Cy3, besteht. Bei dem Interferenzschichtsystem
2 kann
es sich beispielsweise um Interferenzschichten handeln, wie sie
in der
EP 1591773 B1 beschrieben
werden. Ein solches Interferenzschichtsystem umfasst hoch- und niedrigbrechende
dielektrische Schichten.
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Alternativ
kann auch das Interferenzschichtsystem weggelassen werden oder es
kann das aufgebrachte DNA-Halbstrang-Material ungelabelt sein und
das zu analysierende DNA Halbstrang Material das Fluoreszenz Label
tragen.
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Bei
den hierbei entstehenden Substraten handelt es sich um die von Schott
Nexterion produzierten Probenträger Slide E, Slide A, Slide
A+ und Slide AL.
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Gemäß dem
erfindungsgemäßen Verfahren wird nach Bereitstellung
eines Probenträgers oder Slides mit dem prinzipiellen Aufbau
gemäß 1 dieser Probenträger
flammenpyrolytisch mit SiOx beschichtet.
Die Flammenpyrolyse wird unter Verwendung von Silanen durchgeführt.
Durch Veränderung der Beschichtungsparameter, wie Temperatur
und Dauer des Beschichtungsvorgangs kann die Menge der auf der Oberfläche des
Probenträgers abgelagerten Oxidpartikel gesteuert werden.
Die Ablagerung einer zunehmenden Menge von Oxidpartikel wird in 2 gezeigt.
Die in 2 gezeigten Slides weisen von rechts oben nach
links unten eine zunehmende Menge von abgelagerten Oxidpartikeln
auf. Der Mengenbereich reicht von wenigen auf der Oberfläche
des Probenträgers 20 verstreuten Partikeln bis
hin zu größeren Ansammlungen von Partikeln auf dem
Probenträger 24, wobei diese Ansammlungen oder
Cluster einen Durchmesser im Bereich von ca. 20 nm bis 500 nm aufweisen.
Die Probenträger 21 bis 23 weisen eine
steigende Anzahl von angelagerten Partikeln auf ihrer Oberfläche
auf. Mit steigender Anzahl der auf der Oberfläche der Slides
abgelagerten Partikel steigt die Rauhigkeit dieser Oberfläche.
Diese Rauhigkeit variiert von einer vergleichsweise glatten Oberfläche
im Falle der Ablagerung nur weniger Partikel bis hin zu einer ziemlich
rauhen Oberfläche mit einer Nanostruktur im Falle der Ablagerung
von Partikelclustern.
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Nach
ihrer Beschichtung werden die Slides gereinigt. Ein von Schott Nexterion
eingesetzter Reinigungsprozess (hier V22), ist hochagressiv und
greift die Glasoberfläche des Probenträgers an.
Auch die zuvor aufgebrachte Siliziumoxidschicht wird durch diesen
Reinigungsprozess angegriffen und daher teilweise wieder entfernt.
Dies reduziert die Rauhigkeitseigenschaften der Oberfläche
des Probenträgers. Möchte man als Endprodukt Slides
mit einer bestimmten Rauhigkeit haben, so besteht eine Möglichkeit
zur Erreichung dieses Ziels darin, während des Beschichtungsvorgangs
dafür zu sorgen, dass sehr viele Partikel abgelagert werden.
Dies hat zur Folge, dass nach Abschluss des Reinigungsvorgangs eine
für die gewünschte Rauhigkeit ausreichende Partikelmenge
auf der Oberfläche des Probenträgers verblieben
ist.
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Auf ähnliche
Weise kann auch das gegebenenfalls unter der Rauhigkeitsschicht
befindliche Interferenzschichtsystem gegen aggressive Reinigungsprozesse
geschützt werden. Ein Teil der Rauhigkeitsschicht wird
während des aggressiven Reinigungsprozesses ”geopfert” und
schützt so das darunter befindliche Interferenzschichtsystem.
Eine weitere Möglichkeit zur Verringerung der Sensitivität
der Slides gegenüber dem Reinigungsprozess besteht darin,
im Anschluss an die Flammen pyrolytische Beschichtung der Slides
die Beschichtung in der Flamme ohne Zugabe von Silanen durch thermische
Behandlung zu stabilisieren. Mittels dieses Ansatzes wurden eine
erhöhte Resistenz der Oberflächenbeschichtung
gegenüber dem Reinigungsprozess erreicht.
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Gemäß den
Untersuchungsergebnissen der Erfinder besteht eine dritte Möglichkeit
zum Erhalt einer gewünschten Rauhigkeit der Oberfläche
des Slides darin, die Probenträger nach Abschluss des Beschichtungsvorgangs
und vor Beginn des Reinigungsprozesses ohne Verwendung der Flamme
des Pyrolysevorgangs einer Hitzebehandlung zu unterziehen. Hierzu
wurden die Probenträger für 30 Minuten auf 500°C
erhitzt. Eine derartige Hitzebehandlung wird auch als Tempern der
Probeträger bezeichnet.
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3 zeigt
einen Probenträger 30 nach Abschluss des flammenpyrolytischen
Beschichtungsvorgangs. Die Slides 31 und 32 stellen
Probenträger nach dem Reinigungsprozess dar, wobei der
Probenträger 31 vor der Reinigung keiner zusätzlichen
Hitzebehandlung unterzogen wurde. Der Probenträger 32 wurde
vor dem Reinigungsprozess für 30 Minuten auf 500°C
erhitzt. Im Vergleich zum Probenträger 31 weist
der Probenträger 32 nach Abschluss des Reinigungsprozesses
eine deutlich höhere Anzahl von Partikeln, also eine deutlich
höhere Rauhigkeit seiner Oberfläche auf. Die Hitzebehandlung
ist also geeignet, die flammenpyrolytisch aufgebrachte Beschichtung
gegenüber dem Reinigungsprozess zu stabilisieren.
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Zur
Untersuchung der Eigenschaften der Slides für die spätere
Anwendung wurde der von Schott Nexterion hergestellte Slidetyp E
vor der Epoxyfunktionalisierung in verschiedener Weise behandelt.
Hierzu wurden zunächst reine Glassides aus Gläsern
der Typen BF33 und D263 mit einer rauen SiO
2 Beschichtung
versehen und anschließend gemäß folgender
Matrix weiter behandelt.
Nummer | Slide | | SiO2 Beschichtung | Hitzebehandlung | Reinigung |
1 | D263, | BF33 | rauh | 500°C,
30 min | V22 |
2 | D263, | BF33 | rauh | keine | V22 |
3 | D263, | BF33 | rauh | keine | keine |
4 | D263, | BF33 | rauh | keine | V22 |
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Um
die derart behandelten Slides hinsichtlich ihrer Eigenschaften unter
Anwendungsbedingungen zu untersuchen, wurde sie nach ihrer Epoxy-Funktionalisierung
einer Oligo-Oligo Hybridisierung unterzogen.
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Als
Proben wurden Moleküle mit 48 Teilchen, sogenannte 48mere,
mit einem NH2 Link (Operon 20 μm) in
einem Nexterion Spot H50 verwendet. Als Target wurde ein Oligo 3a
(16mer) verwendet, an das Cy3 als Fluoreszenzmolekül angehängt
war. Die Hybridisierung erfolgte mittel einer Tecan Hybridisierungsstation HS4800,
einem Nexterion Hybridisierungspuffer bei einer Targetkonzentration
von 1 nM und 60 pmol von jedem Dye-Präparat pro Slide.
Das Scanning wurde durchführt mittels einer Tecan LS400.
Die Signalscans fanden statt bei 95 und 117 PMT (Photo Multiplier
Tube).
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Die
Versuchsergebnisse waren wie folgt:
Sofern die Slides nicht
flammenpyrolytisch beschichtet waren, lag eine blanke Glasoberfläche
ohne zusätzliche Struktur auf der Oberfläche vor.
In diesem Fall waren, nach Aufbringen von cDNA-Arrays auf die Oberfläche
der Probenträger, die Spots klein und die Intensitäten
bei der Fluoereszenzuntersuchung vergleichsweise schwach.
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Sofern
die Slides flammenpyrolytisch beschichtet waren und nach der Beschichtung
ohne zusätzliche Hitzebehandlung mit dem V22 Prozess gereinigt
wurden, waren die Spots, nach Aufbringen von cDNA-Arrays auf die
Oberfläche des Probenträgers, immer noch vergleichsweise
klein, aber die Intensitäten höher. Für
die 48mere waren die Spots klar sichtbar. Dies wird damit erklärt,
dass sich nach dem Reinigungsprozess noch eine sehr dünne,
aktive SiO2 Schicht auf der Slideoberfläche
befindet.
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Im
Falle von Slides, die nach der Beschichtung und vor dem Reinigungsprozess
einer Hitzebehandlung unterzogen wurden, verbleibt eine signifikante
Oberflächenstruktur auf den Slides. Die Spots sind in diesem
Fall etwas größer und weisen eine höhere
Intensität auf, als bei Slides, die vor dem Reinigungsprozess keiner
Hitzebehandlung unterzogen worden Ware. Alle Spots waren sehr gut
sichtbar. Das für verschiedene Slides berechnete Signal
zu Hintergrund Verhältnis zeigt an, dass bei hitzebehandelten
Slides eine Steigerung der Empfindlichkeit um einen Faktor 2 möglich
ist. Auch erscheint es möglich, die Größe
der Spots durch eine Änderung der Oberflächenstruktur
der Slides, z. B. durch eine Änderung der Beschichtungsparameter,
zu verändern.
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4a zeigt
von links nach rechts jeweils paarweise die Intensitäten
des Hintergrundrauschens vor und nach der Hybridisierung der Slides
für auf verschiedene Weise behandelte Slides.
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Das
linke Paar von Balken zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes
Slide, das vor dem Reinigungsprozess getempert wurde. Das zweite
Balkenpaar von links zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes
Slide, das vor dem Reinigungsprozess keiner Hitzebehandlung unterzogen
wurde. Das von links dritte Balkenpaar zeigt die Ergebnisse für
ein beschichtetes, aber nicht gereinigtes Slide, während
das rechte Balkenpaar die Ergebnisse für ein Referenzslide
darstellt.
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4b zeigt
von links nach rechts den Kontaktwinkel mit Wasser der Slides für
auf verschiedene Weise behandelte Slides. Gleichzeitig zeigt dieses 4b die
Spotgrößen.
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Das
linke Paar von Balken zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes
Slide, das vor dem Reinigungsprozess getempert wurde.
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Diese
Hitzebehandlung der beschichteten Slides erfolgt bei einer Temperatur
im Bereich von 400°c bis 600°C für eine
Zeitdauer im Bereich von 120 bis 10 Minuten. Bei den von den Erfindern
durchgeführten Untersuchungen erfolgte das Tempern der
Slides bei einer Temperatur von 500°C für die
Dauer von 30 Minuten.
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Das
zweite Balkenpaar von links zeigt die Ergebnisse für ein
beschichtetes Slide, das vor dem Reinigungsprozess keiner Hitzebehandlung
unterzogen wurde. Das von links dritte Balkenpaar zeigt die Ergebnisse für
ein beschichtetes, aber nicht gereinigtes Slide, während
das rechte Balkenpaar die Ergebnisse für ein Referenzslide
darstellt.
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5 zeigt
die Versuchsergebnisse in Form eines Diagramms. Dieses Diagramm
stellt von links nach rechts jeweils paarweise die normalisierten
Signalintensitäten und das Signal-Hintergrund-Verhältnis
für auf verschiedene Weise behandelte Slides dar.
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Das
linke Paar von Balken zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes
Slide, das vor dem Reinigungsprozess getempert wurde.
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Diese
Hitzebehandlung der beschichteten Slides erfolgt bei einer Temperatur
im Bereich von 400°c bis 600°C für eine
Zeitdauer im Bereich von 120 bis 10 Minuten. Bei den von den Erfindern
durchgeführten Untersuchungen erfolgte das Tempern der
Slides bei einer Temperatur von 500°C für die
Dauer von 30 Minuten.
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Das
zweite Balkenpaar von links zeigt die Ergebnisse für ein
beschichtetes Slide, das vor dem Reinigungsprozess keiner Hitzebehandlung
unterzogen wurde. Das von links dritte Balkenpaar zeigt die Ergebnisse für
ein beschichtetes, aber nicht gereinigtes Slide, während
das rechte Balkenpaar die Ergebnisse für ein Referenzslide
darstellt.
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Die
zweite beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens betrifft Kunststoffboxen für die Aufbewahrung
von Probeträgern, wie beispielsweise DNA-Microarrays. Diese
Kunstoffboxen können bis zu 25 Slides aufnehmen.
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Der
für die Kunststoffboxen verwendete Kunststoff gibt Gase
ab, was als ”Ausgasen” bezeichnet wird.
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Werden
derartige Probeträger oder Slides längere Zeit
in Kunststoffboxen gelagert, so verunreinigen die Ausgasungen die
Slideoberfläche mit organischen Ablagerungen, was zu einer
Verschlechterung der Oberflächeneigenschaften der Slides
führt. Zu den für die Anwendung der Slides relevanten
Oberflächeneigenschaften zählen insbesondere die
Fluoreszenzeigenschaften, gemessen als Signal-Hintergrund-Verhältnis,
und der Kontaktwinkel mit Wasser.
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Um
das Ausgasen der Kunststoffbox an ihrer Innenseite zu verhindern,
wird diese Innenseite mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren flammenpyrolytisch SiOx beschichtet.
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Die
Erfinder haben herausgefunden, dass sich die Innenseite der für
die Lagerung und den Transport von Slides vorgesehenen Kunststoffboxen
flammenpyrolytisch mit SiOx beschichten lässt, ohne dass
der Kunststoff während des Beschichtungsvorgangs thermisch
angegriffen wird.
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Es
ergibt sich eine zwar nicht ganz einheitliche, aber fortlaufende
Beschichtung des größten Teils der Innenseite
der Kunststoffboxen. 6 zeigt die Oberfläche 61 einer
Kunststoffbox im mittleren Bereich der Box, sowie die Oberfläche 62 in
der Ecke einer Kunststoffbox. Die Oberfläche 61 weist
eine Schichtdicke von etwa 100 nm auf,. Die Oberfläche 62 hat
eine Schichtdicke von etwa 40 nm.
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Durch
Variation der Beschichtungsparameter können verschiedene
Schichtdicken erreicht werden. Zur Untersuchung der Einwirkungen
derart behandelter Kunststoffboxen auf in ihnen gelagerte Slides
wurden zum Einen Kunststoffboxen verwendet, bei denen die flammenpyrolytisch
aufgebrachte Beschichtung an ihrer dicksten Stelle, d. h. im mittleren
Bereich der Oberfläche, etwa 20 nm betrug und an den Seitenwänden
in einigen Fällen nicht nachweisbar (siehe 71 in 7, ”dünne
Beschichtung”). Zum Anderen wurden Kunststoffboxen untersucht,
bei denen die flammenpyrolytisch aufgebrachte Beschichtung an ihrer
dicksten Stelle, d. h. im mittleren Bereich der Oberfläche,
etwa 40 nm und an den Seitenwänden in einigen Fällen
etwa 20 nm betrug (siehe 72 in 7, ”dicke
Beschichtung”). Als Referenzbox wurde eine gereinigte,
nicht beschichtete Standardbox verwendet.
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Als
Slides wurden die von Schott Nexterion produzierten Slidetypen E,
A+, A und AL verwendet. Diese Slides wurden jeweils bei Raumtemperatur
für zwei Monate und für 100 Stunden bei 60°C
in Kunststoffboxen mit dünner, mit dicker und ohne Beschichtung
gelagert. Die zweite Testreihe mit der Lagerung der Slide bei erhöhter
Temperatur stellt einen ”beschleunigten” Versuchsaufbau
dar.
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Die 8a bis 8d zeigen
für die Slidetypen E (8a), A+
(8b), A (8c) und
AL (8d) für eine Lagerung bei Raumtemperatur
für die Dauer von zwei Monaten die Stärke des
Hintergrundrauschens, d. h. der Eigenfluoreszenz der Slideoberflächen.
Jedes der Diagramme zeigt drei waagrechte Balken, wobei der obere
Balken die Werte für eine Lagerung der Slides in einer
unbeschichteten Kunststoffbox, der mittlere Balken die Werte für
eine Lagerung der Slides in einer Kunststoffbox mit dicker Beschichtung
und der untere Balken die Werte für eine Lagerung der Slides
in einer Kunststoffbox mit dünner Beschichtung repräsentiert.
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Die 9a bis 9d zeigen
für die Slidetypen E (9a), A+
(9b), A (9c) und
AL (9d) für eine Lagerung der Slides bei
einer Temperatur von 60°C für eine Dauer von 100
Stunden die Stärke des Hintergrundrauschens, d. h. der
Eigenfluoreszenz der Slideoberflächen. Jedes der Diagramme
zeigt drei waagrechte Balken, wobei der obere Balken die Werte für
eine Lagerung der Slides in einer unbeschichteten Kunststoffbox,
der mittlere Balken die Werte für eine Lagerung der Slides
in einer Kunststoffbox mit dicker Beschichtung und der untere Balken
die Werte für eine Lagerung der Slides in einer Kunststoffbox
mit dünner Beschichtung repräsentiert. Die senkrechten
Balken in jeder der 10a–10d geben die Hintergrundfluoreszenz der
bei Raumtemperatur gelagerten Referenzslides an.
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Es
zeigt sich, dass in allen Fällen die Kunstoffboxen mit
einer „dicken” Beschichtung zu einer signifikanten
Verbesserung hinsichtlich der Reduktion der Eigenfluoreszenz der
Slideoberflächen führten. Die Reduktion der Fluoreszenz
ging bis zu einem Faktor von über zwei. Das Ergebnis, dass
eine ”dünne” Beschichtung nicht zu einem
derartigen Effekt führte, ist darin begründet,
dass im Falle einer dünnen Beschichtung diese nicht die
gesamte Innenfläche der Kunststoffbox bedeckt.
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10 zeigt
den Kontaktwinkel mit Wasser für gereinigte Slides, die
bei 60°C für eine Dauer von 100 Stunden in unbeschichteten
Kunststoffboxen (oberer Balken), in Kunststoffboxen mit dicker Beschichtung (mittlerer
Balken) und in Kunststoffboxen mit dünner Beschichtung
(unterer Balken) gelagert wurden. Der senkrechte Balken in 10 gibt
den Kontaktwinkel der bei Raumtemperatur gelagerten Referenzslides
an.
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Auch
diese Untersuchungen ergaben einen eindeutigen positiven Effekt
im Falle der ”dicken” Beschichtung der Innenseiten
der Kunststoffboxen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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