DE102009008963A1

DE102009008963A1 - Beschichtungsverfahren zur Herstellung eines cDNA-Microarray-Probenträgers

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Publication number: DE102009008963A1
Application number: DE200910008963
Authority: DE
Inventors: Otmar Dr. Becker; Niko Dr. Schultz; Todd Dr. Morton Grove Gudgel; Katherine Dr. Morton Grove Gudgel
Original assignee: Schott AG
Current assignee: Schott AG
Priority date: 2009-02-13
Filing date: 2009-02-13
Publication date: 2010-08-19

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Beschichtungsverfahren bei der Herstellung von biologisch funktionellen Probeträgern oder ausgasarmen Kunststoffboxen mit folgenden Schritten: a) Bereitstellen von Glasplättchen mit einer Objektseite oder Kunststoffboxen, b) Flammen-pyrolytisches Auftragen von SiOauf die Objektseite des Glasplättchens oder die Oberfläche der Kunststoffbox zur Erzeugung einer Rauigkeitsschicht aus SiOund c) Aufbringen von organischen Schichten auf die Rauigkeitsschicht des Glasplättchens und d) Aufbringen von funktionellen organischen Schichten zum Erhalt von biologisch funktionellen Probeträgern oder Lagerung von funktionellen organischen Probeträgern in den Kunststoffboxen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers aus Kunststoff oder Glas, insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit einer gewünschten Rauhigkeit bzw. Schichtdicke.
Träger mit gewünschten Oberflächeneigenschaften werden typischerweise durch Aufbringen einer Beschichtung hergestellt. Bei diesen Oberflächeneigenschaften kann es sich beispielsweise im Falle der Beschichtung optischer Gläser um Reflexionseigenschaften handeln.
Bei anderen Anwendungen werden Anforderungen an die Rauhigkeit der Oberfläche gestellt, damit weitere Materialien auf den beschichteten Träger aufgebracht werden können und dort besser haften. Ferner stellt die Durchlässigkeit der Beschichtung eine derartige Oberflächeneigenschaft dar, um beispielsweise das Ausgasen durch die Oberfläche des Trägers hindurch zu verhindern.
Träger mit derartigen Oberflächeneigenschaften werden in vielfältigen Anwendungen benötigt.
Zur Herstellung von Trägern mit bestimmten Oberflächeneigenschaften sind vielfältige Verfahren bekannt. Oberflächen mit hoher Rauhigkeit können beispielsweise durch mechanische Entfernung von Oberflächenmaterial oder durch Ätzen hergestellt werden. Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Oberflächen mit z. B. bestimmten Rauhigkeits-, Reflexions- oder Dichtigkeitseigenschaften besteht in der Beschichtung der Trägeroberfläche.
Ein bekanntes Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen stellt die Flammenpyrolyse dar. Hierbei wird ein Bereich der Oberfläche des zu beschichtenden Trägers mit einer Flamme überstrichen und Material als Schicht auf der Oberfläche abgeschieden, während die Flamme die Trägeroberfläche überstreift.
Bei der Flammenpyrolyse kann die Kontaktzeit zwischen Träger und Flamme niedrig gehalten werden, so dass auch Kunststoffe oder Gläser mit niedrigem Schmelzpunkt mittels Flammenpyrolyse beschichtet werden können.
Die hier beschriebenen Träger können eingesetzt werden für komplexe Bio Analytik: Wechselwirkung zwischen Proteinen, Antikörpern, Zellen oder DNA Halbsträngen. Z. B. werden im Rahmen der DNA-Microarray-Technologie Microarrays, d. h. Probenträger benötigt. Diese Technologie basiert auf der Hybridisierung von Nukleinsäuren (Watson Crick-Base-Pairing). Dabei lagern sich zwei komplementäre Nukleinsäure-Einzelstränge über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen ihren hydrophoben Pyrin- und Pyrimidin-Basen zusammen, um den Wasserkontakt zu minimieren. Das Prinzip mit markierten Nukleinsäuren andere Nukleinsäuren zu analysieren nutzte erstmals Ed Southern (Southern Blot).
Micro-Arrays bestehen typischerweise aus einem auf ein Glassubstrat aufgebrachten organischen Film, auf den punktförmig (Dot mit ca. 100 bis 150 μm Durchmesser) einsträngiges DNA-Material aufgebracht wurde. Eine erfolgreiche Anbindung der zu analysierenden, mit Fluoreszenzfarbstoff versehenen einsträngigen DNA an die punktförmig auf den organischen Film aufgebrachte einsträngige DNA ist durch einen fluoreszierenden DNA-Dot nachweisbar. Statt einer vollständigen DNA können auch kurzkettige Moleküle (Oligos) analysiert werden.
Eine notwendige Voraussetzung für den erfolgreichen Einsatz von Micro-Arrays als empfindliche Sensorsysteme ist eine hohe Detektionsempfindlichkeit des Fluoreszenz-Lichtes. Diese Detektionsempfindlichkeit wird im wesentlichen durch die Stärke des zu detektierenden Signals und durch das Signal-Rausch-Verhältnis bestimmt. Ursachen für störende Hintergrundsignale sind beispielsweise Autofluoreszenz des Substrates, oder Verunreinigungen der im Anregungslicht befindlichen optischen Bauteile sowie intrinsisches Rauschen im Detektor selbst. Die Autofluoreszenz des Substrates oder der optischen Bauteile kann dabei weitgehend durch Verwendung nicht oder nur gering fluoreszierender Materialien eingeschränkt werden.
Das Glassubstrat der Micro-Arrays besteht typischerweise aus gereinigten plättchenartigen Glassubstraten wie BF33 und D263, auf denen funktionalisierte Silane aufgebracht sind, die einen weiteren organischen Film (Proteine, Antikörper oder DNA) binden. Hierbei besteht zunächst das Problem der Haftung zwischen den Glasplättchen und den funktionalisierten Silanen. Je rauher die Oberfläche des Trägers ist, desto besser haften die funktionalisierten Silane auf dem Glas.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, Gläser mit hoher Rauhigkeit der Oberfläche für die Herstellung von Protein- oder DNA-Microarray-Probenträgern bereit zustellen.
Es ist bekannt, zur Versiegelung der Oberflächen von Gegenständen Barriere- oder Sperrbeschichtungen einzusetzen. Derartige Barriereschichten werden zum Beispiel bei Lebensmittelverpackungen eingesetzt, um eine möglichst hermetische Versiegelung der verpackten Nahrungsmittel und eine Verlängerung der Haltbarkeit zu erreichen.
Kunststoffe mit geringer Gasdurchlässigkeit sind verfügbar, aber teuer und werden für hochspezialisierte Anwendungen produziert.
Eine solche hochspezialisierte Anwendung stellt die Lagerung der erwähnten Probenträgern im Zusammenhang mit der Protein oder DNA Microarray Technologie dar. Die Probenträger werden hierbei in Kunststoffboxen gelagert. In diesem Fall führt das Ausgasen des Kunststofffs der Boxen zu organischen Ablagerungen auf dem in der Kunststoffbox befindlichen Probenträger, was zu unerwünschten Änderungen der Fluoreszenz und der Oberflächenenergie des Probenträgers führt. Diese unerwünschten Änderungen der Fluoreszenzeigenschaften des Probenträgers verursachen insbesondere ein höheres Hintergrundrauschen bei der späteren Verwendung des Probenträgers, d. h. das Signal-Rausch-Verhältnis während späterer Messungen wird negativ beeinflusst. Die Veränderungen der Oberflächenenergie führen zu einer Vergrößerung des sogenannten Kontaktwinkels mit Wasser, was die Benetzungseigenschaften des Probenträgers negativ beeinflusst. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es daher, in kostengünstiger Weise Kunststoffboxen mit einer Barriereschicht zur Verhinderung des Ausgasens des Boxenmaterials während der Lagerung von Protein oder DNA Probenträgern zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgaben werden bereits in höchst überraschend einfacher Weise durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche.
Demgemäß ist ein Beschichtungsverfahren bei der Herstellung von Probenträgern mit folgenden Schritten vorgesehen:

a) Bereitstellen von Glasplättchen mit einer Objektseite;
b) Flammen-pyrolytisches Auftragen von SiO_x auf die Objektseite des Glasplättchens zur Erzeugung einer metalloxidischen Rauhigkeitsschicht, vorzugsweise einer Rauhigkeitsschicht aus SiO_x, beziehungsweise SiOx enthaltend;
c) Aufbringen einer organischen Schicht auf die Rauhigkeitsschicht;
d) Aufbringen von cDNA Arrays auf die organische Haftschicht des Glasplättchens zum Erhalt von cDNA-Microarray-Probenträgern.

Das erfindungsgemäße Verfahren sieht also das Bereitstellen eines Trägers mit einer zumindest teilweise flachen Oberfläche vor, auf der mittels Flammenpyrolyse eine SiO_x Schicht, vorzugsweise eine SiO₂- oder SiO₂-artige Schicht aufgebracht wird, bis eine gewünschte Rauhigkeit oder Schichtdicke erreicht wird.
In einer ersten Ausführungsform des Verfahrens werden Glasplättchen, die eine glatte Oberfläche aufweisen, mittels Flammenpyrolyse mit einer SiOx Schicht versehen. Insbesondere kann hierbei SiO₂ verwendet werden. Statt SiO_x können auch andere Metalloxide verwendet werden, sofern diese eine ähnliche Topologie der Beschichtung ausbilden. Zwar ist Silizium streng genommen kein Metall, aber SiOx als Metalloxid zu bezeichnen, stellt einen in der speziellen Chemie des vorliegenden Gebietes üblichen Sprachgebrauch dar. Abhängig von den Ablagerungsparametern wie Temperatur und Einwirkungszeit der Flamme, ergibt sich eine rauhe Oberfläche, die von wenigen, weit verstreuten, tröpfchenförmigen Teilchen oder von vielen Teilchen verursacht werden, wobei die Größe der Teilchen bis zu einer Nanostruktur reicht. Die sich an der Oberfläche ablagernden Teilchen haben eine Größe von etwa 10–100 nm Durchmesser. Größere Strukturen (bis 500 nm) können sich durch die Zusammenlagerung kleinerer Teilchen ergeben.
Die mittlere Schichtdicke der Rauhigkeitsschicht beträgt 10 nm bis 5 nm und besteht aus tröpfchenförmigen Partikeln.
Zusätzlich kann ein optisch wirksames anorganisches Schichtsystem, z. B. ein Inteferenzschichtsystem auf dem Probeträger aufgebracht werden. Dieses Interferenzschichtsystem kann insbesondere so ausgelegt werden, dass das Quadrat der Feldamplitude im Bereich der aufgebrachten cDNA durch Überlagerung des einfallenden und des an den einzelnen Schichten reflektierten Lichts maximal oder zumindest fast maximal ist. Vorzugsweise befindet sich dabei die cDNA in einem Bereich, in welchem das Quadrat der Feldamplitude zumindest 75% des Maximalwerts beträgt.
Vor der Aufbringung der funktionalisierten Silane in dem von Schott/Nexterion verwendeten Beschichtungsprozess wird das Glas vor der Aufbringung der organischen Schichten (Silane) gereinigt. Ein hierbei von der Anmelderin typischerweise verwendete Reinigungsprozess hier genannt ”V22” ist äußerst aggressiv, was die Oberfläche des Glases angreift und Teile der Oberfläche wegätzt. Auch die mittels Flammenpyrolyse aufgebrachte Schicht wird angeätzt und teilweise entfernt, was die Rauhigkeit wieder reduziert.
Wurde zuvor eine anorganische Interferenzschicht aufgebracht, so wird diese während des Renigungsprozesses durch die Rauhigkeitsschicht geschützt.
Die durch den Reinigungsprozess verursachte Minderung der Rauhigkeit der Oberflächenstruktur stellt ein Problem dar, das durch vorheriges Aufbringen einer äußerst rauhen Oberfläche gelöst wird. Dies stellt sicher, dass nach dem Reinigen trotz des damit verbundenen Entfernens von Oberflächenstruktur eine hinreichend raue Oberfläche übrig bleibt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die durch Flammenpyrolse erzeugte Beschichtung mittels einer Hitzebehandlung stabilisiert, d. h. die Beschichtung wird getempert.
Erfindungsgemäß liegt die Tempertemperatur vorzugsweise im Bereich von 400°C bis 600°C und die Temperzeit vorzugsweise im Bereich von 10 Minuten bis 120 Minuten.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die mit der Rauhigkeitsschicht beschichtete und mit organischen Schichten funktionalisierte Oberfläche mit cDNA oder Proteinen beschichtet. Die derart beschichtete Oberfläche kann anschließend hybridisiert oder Proteinreaktionen ausgesetzt werden.
In einer dritten Ausführungsform der Erfindung besteht der bereitgestellte Träger aus einer ausgasdicht verschließbaren Kunststoffbox. Auf die Innenseite dieses Trägers wird mittels Flammenpyrolyse ein Metalloxid, vorzugsweise SiO_x wie SiO₂, aufgebracht. Hierbei ist die Kontaktzeit zwischen Flamme und Kunststoffträger kurz, um ein Schmelzen des Kunststoffs zu verhindern.
Der Beschichtungsvorgang kann mehrfach wiederholt werden, um verbesserte Barriereschichten auf dem Kunststoff aufzubringen. Hierbei können Abkühlzeiten vorgesehen werden, um Hitzestau im Kunststoffträger zu verhindern.
Es hat sich gezeigt, dass der Kunststoffträger nicht von flacher Geometrie sein braucht, sondern dass auch komplexe Geometrien mit Einbuchtungen und Ecken mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer Sperrschicht gegen Ausgasen versehen werden können. Somit können auch geformte Kunststoffteile beschichtet werden.
Experimentell wurde nachgewiesen, dass sehr viele verschiedene Kunststoffarten auf die erfindungsgemäße Weise beschichtet werden können.
In Abhängigkeit von den Beschichtungsparametern wurden Beschichtungen verschiedener Dicke hergestellt. Hierbei betrug die mittlere Beschichtungsdicke der Innenseite der Kunststoffbox an der dicksten Stelle 20 nm bis zu 100 nm und an den Seitenwänden 5 nm bis zu 40 nm. Die lokale Rauhigkeit der beschichteten Oberfläche lag im Bereich 10 nm bis 200 nm. Im Falle einer ”dünnen” Beschichtung betrug die mittlere Dicke der Beschichtung ungefähr 20 nm bis 100 nm im dicksten Bereich und war auf den Seitenwänden der Boxen nicht nachweisbar. Im Falle einer ”dicken” Beschichtung betrug die mittlere Schichtdicke ca. 20–100 nm in einigen Bereichen und ungefähr 5 nm bis 40 nm auf den Seitenwänden der Boxen.
Die Auswirkungen der Beschichtung der Innenseiten der Kunststoffboxen wurde auf Basis der Hintergrundfluoreszenz der in den Boxen gelagerten Probenträger gemessen. Die ”dicke” Beschichtung zeigte in allen Fällen eine deutliche Verbesserung der Reduzierung der Hintergrundfluoreszenz der Probenträger.
Die Oberflächenfluoreszenz konnte um bis zu einem Faktor 2 reduziert werden.
Im Falle der ”dünnen” Beschichtung konnte ein derartiger Effekt nicht nachgewiesen werden, da hier die Seitenwände der Kunststoffbox nicht beschichtet waren.
Die Auswirkung der Beschichtung der Innenseiten der Kunststoffboxen wurde auch mittels des Kontaktwinkels von Wasser auf dem im Inneren der Kunststoffbox gelagerten DNA Probenträger gemessen. Unter dem Kontaktwinkel wird derjenige Winkel verstanden, den ein Flüssigkeitstropfen auf der Oberfläche eines festen Stoffes zu dieser Oberfläche bildet. Im Falle von ”dicken” Beschichtungen konnte ein lediglich kleiner Anstieg des Kontaktwinkels nachgewiesen werden.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert, wobei gleiche und ähnliche Elemente mit gleichen Bezugszeichen versehen sind und die Merkmale verschiedener Ausführungsbeispiele miteinander kombiniert werden können.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Es zeigen dazu:
1 die schematische Darstellung eines Micro-Arrays, beziehungsweise eines Micro-Array-Probenträgers
2 die Zunahme der Rauhigkeit der Oberfläche eines Microarrays während des Beschichtungsvorgangs,
3 einen Vergleich der Veränderung der Oberflächenbeschaffenheit eines Microarrays, ausgehend von der Beschaffenheit nach der Beschichtung, zwischen einem vor dem Reinigungsprozess hitzebehandelten und einem vor dem Reinigungsprozess nicht hitzebehandelten Slide,
4a, b Diagramme zu Messungen der Intensität des Hintergrundsignals vor und nach der Hybridisierung sowie des Kontaktwinkels verschiedener Slides,
5 ein Diagramm zu Messungen der normalisierten Signalintensität von Slides mit verschieden behandelten Oberflächen,
6 die Oberflächenbeschaffenheit verschiedener Stellen einer SiO_x-beschichteten Kunststoffbox,
7 Ergebnisse der Analyse der Oberflächenbeschaffenheit verschiedener Stellen einer beschichteten Kunststoffbox,
8a–d Diagramme der Messung der Hintergrundfluoreszenz nach Lagerung der Slides in beschichteten Kunststoffboxen für zwei Monate bei Raumtemperatur,
9a–d Diagramme der Messung der Hintergrundfluoreszenz nach Lagerung verschiedener Typen von Slides in beschichteten Kunststoffboxen für 100 Stunden bei 60°C,
10 ein Diagramm des Kontaktwinkels mit Wasser nach Lagerung gereinigter Slides in beschichteten Kunststoffboxen für 100 Stunden bei 60°C,
Die erste beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft ein Micro-Array, beispielsweise für DNA-Analysen. Die typische Größe eines derartigen sogenannten Slides beträgt 2,5 cm mal 7,5 cm.
1 zeigt einen schematischen, nicht maßstäblichen Aufbau eines zur DNA-Analyse verwendeten, als Ganzes mit 10 bezeichneten Micro-Arrays, beziehungsweise Micro-Array-Probenträgers. Das Micro-Array 10 besteht aus einem Substrat 1 aus Glas, einem Interferenzschichtsystem 2, welches als fluoreszenzverstärkende Beschichtung wirkt, und fluoreszenzfähigem Material, welches auf der Oberfläche 7 der fluoreszenzverstärkenden Beschichtung, beziehungsweise dem Interferenzschichtsystem 2 aufgebracht ist und welches typischerweise aus einer ca. 2 nm dicken organischen Haftschicht 3 und punktförmig aufgebrachten ca. 40 nm dickem DNA-Halbstrang-Material mit angehängtem Fluoreszenzmolekül 4, beispielsweise Cy3, besteht. Bei dem Interferenzschichtsystem 2 kann es sich beispielsweise um Interferenzschichten handeln, wie sie in der EP 1591773 B1 beschrieben werden. Ein solches Interferenzschichtsystem umfasst hoch- und niedrigbrechende dielektrische Schichten.
Alternativ kann auch das Interferenzschichtsystem weggelassen werden oder es kann das aufgebrachte DNA-Halbstrang-Material ungelabelt sein und das zu analysierende DNA Halbstrang Material das Fluoreszenz Label tragen.
Bei den hierbei entstehenden Substraten handelt es sich um die von Schott Nexterion produzierten Probenträger Slide E, Slide A, Slide A+ und Slide AL.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nach Bereitstellung eines Probenträgers oder Slides mit dem prinzipiellen Aufbau gemäß 1 dieser Probenträger flammenpyrolytisch mit SiO_x beschichtet. Die Flammenpyrolyse wird unter Verwendung von Silanen durchgeführt. Durch Veränderung der Beschichtungsparameter, wie Temperatur und Dauer des Beschichtungsvorgangs kann die Menge der auf der Oberfläche des Probenträgers abgelagerten Oxidpartikel gesteuert werden. Die Ablagerung einer zunehmenden Menge von Oxidpartikel wird in 2 gezeigt. Die in 2 gezeigten Slides weisen von rechts oben nach links unten eine zunehmende Menge von abgelagerten Oxidpartikeln auf. Der Mengenbereich reicht von wenigen auf der Oberfläche des Probenträgers 20 verstreuten Partikeln bis hin zu größeren Ansammlungen von Partikeln auf dem Probenträger 24, wobei diese Ansammlungen oder Cluster einen Durchmesser im Bereich von ca. 20 nm bis 500 nm aufweisen. Die Probenträger 21 bis 23 weisen eine steigende Anzahl von angelagerten Partikeln auf ihrer Oberfläche auf. Mit steigender Anzahl der auf der Oberfläche der Slides abgelagerten Partikel steigt die Rauhigkeit dieser Oberfläche. Diese Rauhigkeit variiert von einer vergleichsweise glatten Oberfläche im Falle der Ablagerung nur weniger Partikel bis hin zu einer ziemlich rauhen Oberfläche mit einer Nanostruktur im Falle der Ablagerung von Partikelclustern.
Nach ihrer Beschichtung werden die Slides gereinigt. Ein von Schott Nexterion eingesetzter Reinigungsprozess (hier V22), ist hochagressiv und greift die Glasoberfläche des Probenträgers an. Auch die zuvor aufgebrachte Siliziumoxidschicht wird durch diesen Reinigungsprozess angegriffen und daher teilweise wieder entfernt. Dies reduziert die Rauhigkeitseigenschaften der Oberfläche des Probenträgers. Möchte man als Endprodukt Slides mit einer bestimmten Rauhigkeit haben, so besteht eine Möglichkeit zur Erreichung dieses Ziels darin, während des Beschichtungsvorgangs dafür zu sorgen, dass sehr viele Partikel abgelagert werden. Dies hat zur Folge, dass nach Abschluss des Reinigungsvorgangs eine für die gewünschte Rauhigkeit ausreichende Partikelmenge auf der Oberfläche des Probenträgers verblieben ist.
Auf ähnliche Weise kann auch das gegebenenfalls unter der Rauhigkeitsschicht befindliche Interferenzschichtsystem gegen aggressive Reinigungsprozesse geschützt werden. Ein Teil der Rauhigkeitsschicht wird während des aggressiven Reinigungsprozesses ”geopfert” und schützt so das darunter befindliche Interferenzschichtsystem. Eine weitere Möglichkeit zur Verringerung der Sensitivität der Slides gegenüber dem Reinigungsprozess besteht darin, im Anschluss an die Flammen pyrolytische Beschichtung der Slides die Beschichtung in der Flamme ohne Zugabe von Silanen durch thermische Behandlung zu stabilisieren. Mittels dieses Ansatzes wurden eine erhöhte Resistenz der Oberflächenbeschichtung gegenüber dem Reinigungsprozess erreicht.
Gemäß den Untersuchungsergebnissen der Erfinder besteht eine dritte Möglichkeit zum Erhalt einer gewünschten Rauhigkeit der Oberfläche des Slides darin, die Probenträger nach Abschluss des Beschichtungsvorgangs und vor Beginn des Reinigungsprozesses ohne Verwendung der Flamme des Pyrolysevorgangs einer Hitzebehandlung zu unterziehen. Hierzu wurden die Probenträger für 30 Minuten auf 500°C erhitzt. Eine derartige Hitzebehandlung wird auch als Tempern der Probeträger bezeichnet.
3 zeigt einen Probenträger 30 nach Abschluss des flammenpyrolytischen Beschichtungsvorgangs. Die Slides 31 und 32 stellen Probenträger nach dem Reinigungsprozess dar, wobei der Probenträger 31 vor der Reinigung keiner zusätzlichen Hitzebehandlung unterzogen wurde. Der Probenträger 32 wurde vor dem Reinigungsprozess für 30 Minuten auf 500°C erhitzt. Im Vergleich zum Probenträger 31 weist der Probenträger 32 nach Abschluss des Reinigungsprozesses eine deutlich höhere Anzahl von Partikeln, also eine deutlich höhere Rauhigkeit seiner Oberfläche auf. Die Hitzebehandlung ist also geeignet, die flammenpyrolytisch aufgebrachte Beschichtung gegenüber dem Reinigungsprozess zu stabilisieren.
Zur Untersuchung der Eigenschaften der Slides für die spätere Anwendung wurde der von Schott Nexterion hergestellte Slidetyp E vor der Epoxyfunktionalisierung in verschiedener Weise behandelt. Hierzu wurden zunächst reine Glassides aus Gläsern der Typen BF33 und D263 mit einer rauen SiO₂ Beschichtung versehen und anschließend gemäß folgender Matrix weiter behandelt.

Nummer Slide SiO₂ Beschichtung Hitzebehandlung Reinigung

1 D263, BF33 rauh 500°C, 30 min V22

2 D263, BF33 rauh keine V22

3 D263, BF33 rauh keine keine

4 D263, BF33 rauh keine V22
Um die derart behandelten Slides hinsichtlich ihrer Eigenschaften unter Anwendungsbedingungen zu untersuchen, wurde sie nach ihrer Epoxy-Funktionalisierung einer Oligo-Oligo Hybridisierung unterzogen.
Als Proben wurden Moleküle mit 48 Teilchen, sogenannte 48mere, mit einem NH₂ Link (Operon 20 μm) in einem Nexterion Spot H50 verwendet. Als Target wurde ein Oligo 3a (16mer) verwendet, an das Cy3 als Fluoreszenzmolekül angehängt war. Die Hybridisierung erfolgte mittel einer Tecan Hybridisierungsstation HS4800, einem Nexterion Hybridisierungspuffer bei einer Targetkonzentration von 1 nM und 60 pmol von jedem Dye-Präparat pro Slide. Das Scanning wurde durchführt mittels einer Tecan LS400. Die Signalscans fanden statt bei 95 und 117 PMT (Photo Multiplier Tube).
Die Versuchsergebnisse waren wie folgt:
Sofern die Slides nicht flammenpyrolytisch beschichtet waren, lag eine blanke Glasoberfläche ohne zusätzliche Struktur auf der Oberfläche vor. In diesem Fall waren, nach Aufbringen von cDNA-Arrays auf die Oberfläche der Probenträger, die Spots klein und die Intensitäten bei der Fluoereszenzuntersuchung vergleichsweise schwach.
Sofern die Slides flammenpyrolytisch beschichtet waren und nach der Beschichtung ohne zusätzliche Hitzebehandlung mit dem V22 Prozess gereinigt wurden, waren die Spots, nach Aufbringen von cDNA-Arrays auf die Oberfläche des Probenträgers, immer noch vergleichsweise klein, aber die Intensitäten höher. Für die 48mere waren die Spots klar sichtbar. Dies wird damit erklärt, dass sich nach dem Reinigungsprozess noch eine sehr dünne, aktive SiO₂ Schicht auf der Slideoberfläche befindet.
Im Falle von Slides, die nach der Beschichtung und vor dem Reinigungsprozess einer Hitzebehandlung unterzogen wurden, verbleibt eine signifikante Oberflächenstruktur auf den Slides. Die Spots sind in diesem Fall etwas größer und weisen eine höhere Intensität auf, als bei Slides, die vor dem Reinigungsprozess keiner Hitzebehandlung unterzogen worden Ware. Alle Spots waren sehr gut sichtbar. Das für verschiedene Slides berechnete Signal zu Hintergrund Verhältnis zeigt an, dass bei hitzebehandelten Slides eine Steigerung der Empfindlichkeit um einen Faktor 2 möglich ist. Auch erscheint es möglich, die Größe der Spots durch eine Änderung der Oberflächenstruktur der Slides, z. B. durch eine Änderung der Beschichtungsparameter, zu verändern.
4a zeigt von links nach rechts jeweils paarweise die Intensitäten des Hintergrundrauschens vor und nach der Hybridisierung der Slides für auf verschiedene Weise behandelte Slides.
Das linke Paar von Balken zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes Slide, das vor dem Reinigungsprozess getempert wurde. Das zweite Balkenpaar von links zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes Slide, das vor dem Reinigungsprozess keiner Hitzebehandlung unterzogen wurde. Das von links dritte Balkenpaar zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes, aber nicht gereinigtes Slide, während das rechte Balkenpaar die Ergebnisse für ein Referenzslide darstellt.
4b zeigt von links nach rechts den Kontaktwinkel mit Wasser der Slides für auf verschiedene Weise behandelte Slides. Gleichzeitig zeigt dieses 4b die Spotgrößen.
Das linke Paar von Balken zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes Slide, das vor dem Reinigungsprozess getempert wurde.
Diese Hitzebehandlung der beschichteten Slides erfolgt bei einer Temperatur im Bereich von 400°c bis 600°C für eine Zeitdauer im Bereich von 120 bis 10 Minuten. Bei den von den Erfindern durchgeführten Untersuchungen erfolgte das Tempern der Slides bei einer Temperatur von 500°C für die Dauer von 30 Minuten.
Das zweite Balkenpaar von links zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes Slide, das vor dem Reinigungsprozess keiner Hitzebehandlung unterzogen wurde. Das von links dritte Balkenpaar zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes, aber nicht gereinigtes Slide, während das rechte Balkenpaar die Ergebnisse für ein Referenzslide darstellt.
5 zeigt die Versuchsergebnisse in Form eines Diagramms. Dieses Diagramm stellt von links nach rechts jeweils paarweise die normalisierten Signalintensitäten und das Signal-Hintergrund-Verhältnis für auf verschiedene Weise behandelte Slides dar.
Das linke Paar von Balken zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes Slide, das vor dem Reinigungsprozess getempert wurde.
Diese Hitzebehandlung der beschichteten Slides erfolgt bei einer Temperatur im Bereich von 400°c bis 600°C für eine Zeitdauer im Bereich von 120 bis 10 Minuten. Bei den von den Erfindern durchgeführten Untersuchungen erfolgte das Tempern der Slides bei einer Temperatur von 500°C für die Dauer von 30 Minuten.
Das zweite Balkenpaar von links zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes Slide, das vor dem Reinigungsprozess keiner Hitzebehandlung unterzogen wurde. Das von links dritte Balkenpaar zeigt die Ergebnisse für ein beschichtetes, aber nicht gereinigtes Slide, während das rechte Balkenpaar die Ergebnisse für ein Referenzslide darstellt.
Die zweite beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft Kunststoffboxen für die Aufbewahrung von Probeträgern, wie beispielsweise DNA-Microarrays. Diese Kunstoffboxen können bis zu 25 Slides aufnehmen.
Der für die Kunststoffboxen verwendete Kunststoff gibt Gase ab, was als ”Ausgasen” bezeichnet wird.
Werden derartige Probeträger oder Slides längere Zeit in Kunststoffboxen gelagert, so verunreinigen die Ausgasungen die Slideoberfläche mit organischen Ablagerungen, was zu einer Verschlechterung der Oberflächeneigenschaften der Slides führt. Zu den für die Anwendung der Slides relevanten Oberflächeneigenschaften zählen insbesondere die Fluoreszenzeigenschaften, gemessen als Signal-Hintergrund-Verhältnis, und der Kontaktwinkel mit Wasser.
Um das Ausgasen der Kunststoffbox an ihrer Innenseite zu verhindern, wird diese Innenseite mit dem erfindungsgemäßen Verfahren flammenpyrolytisch SiO_x beschichtet.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass sich die Innenseite der für die Lagerung und den Transport von Slides vorgesehenen Kunststoffboxen flammenpyrolytisch mit SiOx beschichten lässt, ohne dass der Kunststoff während des Beschichtungsvorgangs thermisch angegriffen wird.
Es ergibt sich eine zwar nicht ganz einheitliche, aber fortlaufende Beschichtung des größten Teils der Innenseite der Kunststoffboxen. 6 zeigt die Oberfläche 61 einer Kunststoffbox im mittleren Bereich der Box, sowie die Oberfläche 62 in der Ecke einer Kunststoffbox. Die Oberfläche 61 weist eine Schichtdicke von etwa 100 nm auf,. Die Oberfläche 62 hat eine Schichtdicke von etwa 40 nm.
Durch Variation der Beschichtungsparameter können verschiedene Schichtdicken erreicht werden. Zur Untersuchung der Einwirkungen derart behandelter Kunststoffboxen auf in ihnen gelagerte Slides wurden zum Einen Kunststoffboxen verwendet, bei denen die flammenpyrolytisch aufgebrachte Beschichtung an ihrer dicksten Stelle, d. h. im mittleren Bereich der Oberfläche, etwa 20 nm betrug und an den Seitenwänden in einigen Fällen nicht nachweisbar (siehe 71 in 7, ”dünne Beschichtung”). Zum Anderen wurden Kunststoffboxen untersucht, bei denen die flammenpyrolytisch aufgebrachte Beschichtung an ihrer dicksten Stelle, d. h. im mittleren Bereich der Oberfläche, etwa 40 nm und an den Seitenwänden in einigen Fällen etwa 20 nm betrug (siehe 72 in 7, ”dicke Beschichtung”). Als Referenzbox wurde eine gereinigte, nicht beschichtete Standardbox verwendet.
Als Slides wurden die von Schott Nexterion produzierten Slidetypen E, A+, A und AL verwendet. Diese Slides wurden jeweils bei Raumtemperatur für zwei Monate und für 100 Stunden bei 60°C in Kunststoffboxen mit dünner, mit dicker und ohne Beschichtung gelagert. Die zweite Testreihe mit der Lagerung der Slide bei erhöhter Temperatur stellt einen ”beschleunigten” Versuchsaufbau dar.
Die 8a bis 8d zeigen für die Slidetypen E (8a), A+ (8b), A (8c) und AL (8d) für eine Lagerung bei Raumtemperatur für die Dauer von zwei Monaten die Stärke des Hintergrundrauschens, d. h. der Eigenfluoreszenz der Slideoberflächen. Jedes der Diagramme zeigt drei waagrechte Balken, wobei der obere Balken die Werte für eine Lagerung der Slides in einer unbeschichteten Kunststoffbox, der mittlere Balken die Werte für eine Lagerung der Slides in einer Kunststoffbox mit dicker Beschichtung und der untere Balken die Werte für eine Lagerung der Slides in einer Kunststoffbox mit dünner Beschichtung repräsentiert.
Die 9a bis 9d zeigen für die Slidetypen E (9a), A+ (9b), A (9c) und AL (9d) für eine Lagerung der Slides bei einer Temperatur von 60°C für eine Dauer von 100 Stunden die Stärke des Hintergrundrauschens, d. h. der Eigenfluoreszenz der Slideoberflächen. Jedes der Diagramme zeigt drei waagrechte Balken, wobei der obere Balken die Werte für eine Lagerung der Slides in einer unbeschichteten Kunststoffbox, der mittlere Balken die Werte für eine Lagerung der Slides in einer Kunststoffbox mit dicker Beschichtung und der untere Balken die Werte für eine Lagerung der Slides in einer Kunststoffbox mit dünner Beschichtung repräsentiert. Die senkrechten Balken in jeder der 10a–10d geben die Hintergrundfluoreszenz der bei Raumtemperatur gelagerten Referenzslides an.
Es zeigt sich, dass in allen Fällen die Kunstoffboxen mit einer „dicken” Beschichtung zu einer signifikanten Verbesserung hinsichtlich der Reduktion der Eigenfluoreszenz der Slideoberflächen führten. Die Reduktion der Fluoreszenz ging bis zu einem Faktor von über zwei. Das Ergebnis, dass eine ”dünne” Beschichtung nicht zu einem derartigen Effekt führte, ist darin begründet, dass im Falle einer dünnen Beschichtung diese nicht die gesamte Innenfläche der Kunststoffbox bedeckt.
10 zeigt den Kontaktwinkel mit Wasser für gereinigte Slides, die bei 60°C für eine Dauer von 100 Stunden in unbeschichteten Kunststoffboxen (oberer Balken), in Kunststoffboxen mit dicker Beschichtung (mittlerer Balken) und in Kunststoffboxen mit dünner Beschichtung (unterer Balken) gelagert wurden. Der senkrechte Balken in 10 gibt den Kontaktwinkel der bei Raumtemperatur gelagerten Referenzslides an.
Auch diese Untersuchungen ergaben einen eindeutigen positiven Effekt im Falle der ”dicken” Beschichtung der Innenseiten der Kunststoffboxen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- EP 1591773 B1 [0050]

Claims

Beschichtungsverfahren bei der Herstellung von Probenträgern mit folgenden Schritten: a) Bereitstellen von Glasplättchen mit einer Objektseite; b) Flammen-pyrolytisches Auftragen von SiO_x auf die Objektseite des Glasplättchens zur Erzeugung einer SiO_x enthaltenden Rauhigkeitsschicht; c) Aufbringen einer organischen Schicht auf die Rauhigkeitsschicht; d) Aufbringen von cDNA Arrays auf die organische Haftschicht des Glasplättchens zum Erhalt von cDNA-Microarray-Probenträgern.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt a) des Bereitstellens das Reinigen der Glasplättchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt a) des Bereitstellens das Aufbringen eines optisch wirksamen anorganischen Schichtsystems umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt b) des Flammen-pyrolytischen Auftragens das Verbrennen von Silanen oder siliziumorganischen Verbindungen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Rauhigkeitsschicht eine mittlere Schichtdicke im Bereich von 10 nm bis 50 nm aufweist und tröpfchenförmige Partikel enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei nach dem Flammen-pyrolytischen Auftragen der Rauhigkeitsschicht diese bei erhöhter Temperatur getempert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Tempertemperatur im Bereich von 400°C bis 600°C und die Temperzeit im Bereich von 10 Minuten bis 120 Minuten liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Rauhigkeitsschicht vor Aufbringen der organischen Schichten gereinigt wird;
Verfahren nach Anspruch 1 bis 8 wobei die Rauhigkeitsschicht bei der Reinigung eine darunter befindliche anorganische Interferenz Schicht schützt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mit der Rauhigkeits-Schicht beschichtete und mit organischen Schichten funktionalisierte Oberfläche mit cDNA oder geeigneten Proteinen beschichtet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mit cDNA oder Proteinen beschichtete Oberfläche hybridisiert oder Proteinreaktionen ausgesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, mit folgenden weiteren Schritten: Bereitstellen einer ausgasdicht verschließbaren Kunststoffbox; Flammen-pyrolytisches Auftragen von SiO_x auf die Innenseite der Kunststoffbox zur Erzeugung einer Sperrschicht aus SiO_x; ausgasdichte Aufbewahrung von cDNA- oder Protein Microarrays Probeträgern in der mit einer Sperrschicht versehenen Kunststoffbox.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Beschichtungsdicke der Innenseite der Kunststoffbox an der dicksten Stelle im Bereich von 20 nm bis 100 nm und an den Seitenwänden im Bereich von 5 nm bis 40 nm liegt.
Substrat, herstellbar nach einem der Ansprüche 2 bis 11, wobei die beschichtete Oberfläche eine Rauhigkeit im Bereich von 10 nm bis 200 nm aufweist.
Kunststoffbox, erhältlich nach Anspruch 12, mit Bodenwänden, Seitenwänden und Ecken, wobei die Beschichtungsdicke an der dicksten Stelle im Bereich von 20 nm bis 100 nm und im Gebiet der Seitenwände im Bereich von 5 nm bis 40 nm liegt.