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Die
Erfindung betrifft ein Phasenkontrastmikroskop mit einer optischen
Achse, bei dem aus einem von einer Lichtquelle ausgehenden Strahlengang
mittels einer in einem Kondensors mit oder ohne Aperturblende vorgesehenen
oder diesem nachgeschalteten Kondensorblende mindestens ein auf
dem Mantel eines Hohlkegels liegender, das Objekt ”schräg” beleuchtendes
Strahlenbündel zur Beleuchtung des Objekts ausgeblendet
ist, bei dem das vom Objekt ausgehende Licht mittels eines Objektivs
mit Phasenplatte in einem Zwischenbild, das mit einem Okular als
Lupe betrachtet werden kann, abgebildet ist, wobei der Lichtdurchlass
des Kondensorblende mindestens einen konzentrische zur optischen
Achse angeordneten segmentartigen Lichtdurchlass zum Ausblenden
aufweist, und wobei die Phasenplatte mindestens ein konzentrisch
zur optischen Achse angeordneten Bereich mit einer erhöhten
optischen Dichte aufweist, welche die für die Objektdarstellung
im Phasenkontrast notwendige Phasenverschiebung der Hintergrundstrahlen
gegenüber den bilderzeugenden Strahlenanteilen bewirkt.
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Typische
biologische Objekte bewirken eine natürliche Phasenverschiebung
von nur etwa einer Viertelwellenlänge (λ/4); diese
Phasenverschiebung ist ohne optische Hilfsmittel, z. B. bei Hellfeldbeleuchtung nicht
adäquat sichtbar. Bei den konventionellen Phasenkontrastverfahren
(positiver und negativer Phasenkontrast) ist die Phasenplatte optisch
so ausgelegt, dass die Strahlen der Hintergrundbeleuchtung gegenüber
den bildgebenden Strahlen, welche vom Objekt ihren Ausgang nehmen,
so phasenverzögert werden, dass der resultierende Gangunterschied
zwischen beiden Strahlenkomponenten eine halbe oder eine ganze Wellenlänge λ beträgt.
Soll ein Gangunterschied von λ/2 erreicht werden, muss
die Phasenplatte im Objektiv die Hintergrundstrahlen um eine dreiviertel
Wellenlänge verzögern, wenn ein natürlicher
Gangunterschied von λ/4 zu Grunde gelegt wird (¾ λ – ¼ λ = ½ λ,
positiver Phasenkontrast). Dies wird dadurch erreicht, dass im Lichtdurchlass
der Phasenplatte entsprechend optische Dichten vorgesehen sind.
Damit in der gleichen Anordnung ein Gangunterschied von einer ganzen
Wellenlänge erreicht wird, muss die Phasenverzögerung
der Hintergrundstrahlen 1¼ λ betragen (1¼ λ – ¼ λ = λ,
negativer Phasenkontrast). Folgerichtig sind die etablierten konventionellen
Phasenkontrastverfahren technisch so ausgelegt, dass ein natürlicher
Gangunterschied von einer Viertelwellenlänge in maximalem
Kontrast dargestellt wird. Wenn der natürliche Gangunterschied,
d. h., wenn die optische Dichtedifferenz zwischen Objekt und umgebendem
Medium von diesem Leitwert abweicht und niedriger oder höher
als λ/4 liegt, entsteht eine Abschwächung des
Phasenkontrastes, da die in der Phasenplatte zustande kommende Phasenverschiebung
der Hintergrundstrahlen bei konventioneller technischer Auslegung
nicht veränderbar ist und somit variablen natürlichen
Gangunterschieden nicht angepasst werden kann.
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Die
konventionellen Phasenkontrastmethoden weisen aus technisch-physikalischen
Gründen insgesamt mehrere Limitierungen auf:
- – Begrenzter Kontrast bei sehr dünnen Objektanteilen
mit minimalen Gangunterschieden: Bei sehr dünnen Objektanteilen
mit minimalen Gangunterschieden zum umgebenden Medium ist der konventionelle
Phasenkontrast hinsichtlich der Kontrastierung des Objektes begrenzt,
so dass sich solche Strukturen bei ungenügender Phasenkontrast-Darstellbarkeit
ggf. nicht mit befriedigendem Kontrast von der Umgebung abgrenzen.
- – Halo-Phänomene: Typische Artefakte in Form
heller oder dunkler, an Randkonturen von Zellen oder Organellen
angrenzender Säume, welche die Qualität der Beobachtung
einschränken können.
- – Geringe Tiefenschärfe, ggf. auch geringe
Konturschärfe: Im konventionellen Phasenkontrast kann keine Erhöhung
der Tiefenschärfe oder sichtbare Verbesserung der Konturbetonung
durch Verringerung der Beleuchtungsapertur erreicht werden; die
Aperturblende des Kondensors muss im Unterschied zur Hellfeldbeleuchtung
geöffnet bleiben.
- – Ausgeprägte Abhängigkeit der Bildqualität
vom Korrektionsaufwand der verwendeten Objektive: Unterschiede im
Korrektionsaufwand der zur Verfügung stehenden Phasenkontrast-Objektive
wirken sich nachhaltiger auf die Bildqualität aus als im
Falle von Hellfeld- oder Dunkelfeld-Beleuchtung. Dies gilt sowohl für das
Ausmaß der chromatischen Korrektur (Achromate versus Apochromate),
als auch hinsichtlich des Ausgleichs sphärischer Abbildungsfehler
(nicht plankorrigierte Objektive versus Planobjektive). Bei Hellfeldbeleuchtung
können ggf. vorhandene optische Schwächen des
Objektivs in begrenztem Maße durch moderate Verringerung
der Beleuchtungsapertur (Schließen der Aperturblende) ausgeglichen
werden. Diese Möglichkeit besteht bei üblicher
Phasenkontrastbeleuchtung nicht.
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Die
Objektdarstellung im Phasenkontrast erlaubt eine gesteigerte Erkennbarkeit
sich lediglich durch geringe Unterschiede im Brechungsindex voneinander
abhebender Strukturen eines Präparats. Dazu werden Gangunterschiede
in den Lichtwegen des Phasenkontrastmikroskop erzeugt, die zur Interferenz
gebracht, diese Strukturen sichtbar werden lassen. Zur Durchführung
werden Phasenkontrastmikroskope eingesetzt, deren Strahlengang im
Kondensor mit einer Ringblende hohlkegelförmig ausgeblendet
ist. Aus
DE 10
2006 027 961.1 A1 ist ein Phasenkontrastmikroskop bekannt,
bei dem zur Kontraststeigerung der Abbildung ein Strahlengang von
der Lichtquelle über einen Kondensor mit einer den Strahlengang
hohlkegelförmig begrenzenden Ringblende zum Objekt geführt
ist, sowie von diesem über ein abbildendes Objektiv mit
einer Phasenplatte zu einem Zwischenbild, das mittels eines Okulars
als Lupe betrachtbar ist. Dabei wird zum Erreichen einer verbesserten
Strukturdarstellung unter Vermeidung der Nachteile konventionellen
Phasenkontrasts die Licht-Durchtrittsöffnung der Ringblende
der Blendenanordnung kreissektorförmig ausgebildet, sodass
das objektbeleuchtende Licht zu einem auf dem Mantel eines Hohlkegels
liegenden, sektorförmig begrenzten Lichtbündel
ausgeblendet ist. Weiter ist aus
DE 10 2007 029 814 A1 ein Durchlichtmikroskop
mit Beleuchtungsapparat und Aperturblende, Tubus mit Objektiv und
Okular sowie dem Objekt zwischen Beleuchtungsapparat und Objektiv
bekannt. Um transparente Objekte bei variabler Kontrastierung in
verbesserter Helligkeit und Auflösungsvermögen
darstellen zu können, wird zur Beleuchtung des Objekts
in der Beleuchtungseinrichtung mit einer Blende mit zentraler Blendenöffnung
und peripherer Ringspaltöffnung ein Zentrallicht-Strahlenbündel und
ein Peripherlicht-Strahlenbündel erzeugt und nach Durchgang
der das Objekt beleuchtenden Strahlenbündel wird im Objektiv
oder unmittelbar hinter diesem zumindest ein Teil eines der Strahlenbündel
mit einem lichtabsorbierenden Element in seiner Phasenlage geändert.
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Hier
setzt die Erfindung an, mit der die Nachteile des Standes der Technik überwunden
und eine Möglichkeit geschaffen werden soll, die Beleuchtungsart
zu modulieren. Die Lösung soll dabei einfach und wirtschaftlich
herstellbar sein und sie soll dem Anwender eine einfach zu bedienende
Möglichkeit an die Hand geben, Objekte in ihren auch sich
nur schwach abzeichnenden Konturen sichtbar zu machen.
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Die
Lösung dieser Aufgabenstellung ist für eine gattungsgemäße
Anordnung eines Mikroskops durch die kennzeichnenden Merkmale des
unabhängigen Hauptanspruchs definiert; vorteilhafte Weiterbildungen und
bevorzugte Ausführungsformen beschreiben die abhängigen
Unteransprüche.
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Die
Phasenplatte des Objektiv weist zumindest einen Bereich mit einem
Zentriwinkel kleiner 180° auf. Dieser konzentrisch zur
optischen Achse angeordnete Bereich bewirkt die für die
Objekt-Darstellung im Phasenkontrast notwendigen Phasenverschiebungen,
wobei der Bereich der Ringblende und der Bereich der Phasenplatte
zueinander korrespondierend angeordnet sind, so dass das objektbeleuchtende
Lichtbündel auf dem Mantel eines Hohlkegels liegend einem
hinsichtlich Zentriwinkel und Geometrie korrespondierenden Phasenplattenbereich
angepasst ist. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform
beträgt der Zentriwinkel der Kondensorblende sowie des
Phasenplatten-Bereichs der Phasenplatte höchstens 90°.
Vorteilhaft wird ein Zentriwinkel mit einem Wert von über
15° vorgesehen, um die Lichtstärke der Abbildung
in einem für die Beobachtung günstigen Bereich
zu halten. Bei zweisegmentiger Phasenplatte bzw. zweisegmentiger
Kondensorblende beträgt der Zentriwinkel nahezu 180°,
bei viersegmentigen nahezu 90°, bei sechssegmentigen nahezu
60°, bei achtsegmentigen nahezu 45°, bei zwölfsegmentigen
nahezu 30°. usw. Dabei berücksichtigt die Angabe ”nahezu” die mechanisch
notwendigen Stege zwischen den Sektoren. Der jeweils maximal mögliche
Zentriwinkel berechnet sich nach der Formel: 360°/Anzahl
der Phasenplattenbereiche. Durch diese Anordnung wird erreicht,
dass sehr variable Modifikationen der Phasenkontrastbeleuchtung
mit wechselnder Abbildungscharakteristik und Lichtstärke
erzeugt werden können. Je kleiner der Zentriwinkel der
einzelnen Bereiche der Phasenplatte und der korrespondierenden Lichtringblende
ausfällt, desto mehr unterschiedlich designte Phasenplattenbereiche und/oder
Beleuchtungsrichtungen können realisiert werden.
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Hinsichtlich
des Charakters des Phasenkontrastbildes gilt, dass, je größer
das optisch relevante beleuchtende Kreissegment gehalten bzw. aus
je mehr Richtungen das Objekt segmental beleuchtet wird, desto mehr
das resultierende Bild dem konventionellen Phasenkontrast ähnelt,
wohingegen, je schmaler der beleuchtende Lichtsektor ausfällt
bzw. je weniger segmentale Lichtsektoren zur Verfügung
stehen, desto ”schräger” die resultierende
Phasenkontrast-Beleuchtung sein wird. Wird das beleuchtende Licht
aus nur einer definierten Richtung zum Objekt geleitet, hat dies
den Vorteil einer erhöhten Reliefdarstellung, allerdings
den Nachteil einer gewissen Inhomogenität des Bilduntergrundes.
Diese Inhomogenität kann vermieden werden, wenn die Objektbeleuchtung
aus zwei oder mehr gegenüberliegenden bzw. symmetrisch
angeordneten punktuellen Lichtdurchlässen erfolgt. Hierdurch
wird allerdings der Reliefcharakter des resultierenden Bildes verringert
zugunsten einer homogeneren Ausleuchtung.
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Die
Lichtstärke (= Beleuchtungsapertur) wird selbstredend durch
die optisch wirksame Gesamtfläche der beleuchtungsrelevanten
Lichtsektoren determiniert. Je geringer die Lichtstärke,
desto höher liegen die nutzbare Tiefenschärfe
bzw. Fokustiefe und die erforderliche Beleuchtungsintensität/Helligkeit
der Lichtquelle. Dabei ist es vorteilhaft, wenn der/die Zentriwinkel
von Kondensorblende und/oder des Phasenplattenbereichs der Phasenplatte
einstellbar ist/sind. Dabei versteht es sich von selbst, dass eine
solche Anpassung auch mit einem Satz Objektiven mit unterschiedlichen
Phasenplatten erreicht werden kann. Um für laufende Untersuchungen
ein Anpassen an die vorliegenden Bedingungen leicht zu ermöglichen,
ist es dabei vorteilhaft, wenn Kondensorblenden mit gleichen oder
unterschiedliche weiten Lichtdurchtrittsöffnungen und/oder
objektivseitige Phasenplatten mit hinsichtlich Größe
und/oder optischer Dichte gleichen oder unterschiedlichen Bereichen um
die optische Achse drehbar ausgebildet sind. Zur sicheren Bedienung
ist es vorteilhaft, wenn die verdrehbare Kondensorblende bzw. Phasenplatten
arretierbar ist. Dazu wird diese vorteilhaft als Revolverscheibeausgebildet.
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Eine
Weiterbildung wird darin gesehen, dass die Phasenplatte im Objektiv,
mehrere derartige Bereiche umfasst, welche in geeigneter Symmetrie
angeordnet Phasenverschiebungen in unterschiedlichem Ausmaß bewirken.
So kann die Kondensorblende so ausgebildet sein, dass das objektbeleuchtende
Licht innerhalb des Lichtdurchlasses aus einem, zwei oder mehr einzelnen
Strahlenbündeln gebildet ist. Dazu weisen die Kondensorblende
und/oder die objektivseitige Phasenplatte vorzugsweise jeweils zwei
oder mehr Bereiche auf, so dass das objektbeleuchtende Licht innerhalb
des sektoralen Lichtdurchlasses aus einem, zwei oder mehr einzelnen
Strahlengängen gebildet ist.
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Die
bisher beschriebenen Ausführungsvarianten beziehen sich
auf sektorförmige Unterteilungen der Phasenplatte, welche
so gestaltet sind, dass innerhalb des jeweiligen Bereichs ein konstanter
Gangunterschied besteht, wobei der Bereich einen Zentriwinkel von
höchstens 180° aufweist. Alternativ lässt
sich ein bis zu weitgehend stufenlos durchstimmbarer Phasenkontrast
realisieren, wenn der Phasenplatte anstelle eines Profils mit treppenförmigen,
aufeinander folgenden Stufen mit einem rampenförmig ansteigenden
Profil versehen wird, so dass der Gangunterschied mit zunehmender
Rampenhöhe kontinuierlich steigt. Wenn der korrespondierende
kondensorseitige Lichtdurchlass entsprechend schmal und kleinflächig
gestaltet wird, kann auch bei einer solchen technischen Auslegung
ein hinreichend homogenes Bild entstehen. Die Homogenität
der Ausleuchtung ist auch bei dieser Ausführungsvariante
steigerbar, wenn die Phasenplatte mehrere, z. B. vier einander gegenüberliegende
Rampen zu je 90° Bogenlänge enthält und
der zugehörige kondensorseitige Lichtdurchlass mit vier über
Kreuz angeordneten, einander gegenüberliegenden quasipunktuellen
Lichtdurchlässen versehen wird.
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Sofern
ein konventioneller Phasenkontrast mit einer 360°-Objektbeleuchtung
beibehalten werden soll, d. h. vorgesehen ist, den kondensorseitigen
Lichtring, wie in
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1 dargestellt,
insgesamt für die Objektbeleuchtung zu nutzen, kann mit überschaubarem
Aufwand auch eine grundlegend andere mechanische Lösung
in Betracht kommen, wenn mehrere Phasenplatten unterschiedlicher
optischer Dichte auf einem kleindimensionierten Blendenschieber
angeordnet werden, wie er in etwas größerer Ausführung
beispielsweise als einführbarer Schieber in der Polarisations-
und Interferenzkontrast-Mikroskopie etabliert ist. Selbstredend
kann stattdessen auch eine drehbare Revolverscheibe in ein hierfür
designtes Phasenkontrastobjektiv integriert werden, welche mehrere
solcher Phasenplatten als Set beinhaltet, vergleichbar einer miniaturisierten
Ausführung einer Lichtblendenscheibe in einem Phasenkontrast-Universalkondensor.
Je nach Anzahl der wechselbaren Phasenplatten lassen sich unterschiedlich
viele Kontrastierungsvarianten bei jeweils erhaltener allseitiger
360°-Beleuchtung erreichen.
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Aus
den vorausgehenden Darstellungen folgt, dass zu jedem real vorhandenen
natürlichen Gangunterschied zwischen Objekt und umgebendem
Medium eine korrespondierende Phasenplatte konzipiert werden kann,
welche dergestalt als Phasenbremse wirkt, dass der resultierende
Gangunterschied zwischen den bildgebenden Strahlen und Hintergrund-Strahlen
eine halbe bzw. eine ganze Wellenlänge beträgt,
je nachdem, ob positiver oder negativer Phasenkontrast realisiert
werden soll. Tabelle 1 zeigt hierauf basierende Berechnungsbeispiele
für reale Gangunterschiede zwischen Objekt und Medium in
einem Bereich von 0,10 bis 0,40 λ.
| Gangunterschied
Objekt-Medium | Phasenverzögerung
im Phasenring – positiver Phasenkontrast | Phasenverzögerung
im Phasenring – negativer Phasenkontrast |
| 0,10 λ | 0,60 λ | 1,10 λ |
| 0,15 λ | 0,65 λ | 1,15 λ |
| 0,20 λ | 0,70 λ | 1,20 λ |
| 0,25 λ | 0,75 λ | 1,25 λ |
| 0,30 λ | 0,80 λ | 1,30 λ |
| 0,35 λ | 0,85 λ | 1,35 λ |
| 0,40 λ | 0,90 λ | 1,40 λ |
Tabelle
1: Optimale Phasenverzögerungen von Phasenplatten für
positiven und negativen Phasenkontrast in Abhängigkeit
von dem vorherrschenden natürlichen Gangunterschied zwischen
Objekt und umgebendem Medium.
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Selbstredend
können die in dieser Tabelle beispielhaft dargestellten
optischen Auslegungen optimierter Phasenplatten in letztlich beliebiger
Weise modifiziert werden, je nachdem, wie hoch der jeweils vorherrschende
natürliche Gangunterschied jeweils ausgeprägt
ist. Vorteilhafte Werte für die Phasenverzögerung zeigt
Tabelle 1: Da die Wege der zur Interferenz gebrachten Strahlenbündel
unterschiedlich sind, lassen sich so Strukturen erkennen, die sich
voneinander lediglich geringfügig im Brechungsindex unterscheiden.
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Dazu
ist die Kondensorblende, die ein oder mehrere konzentrisch zur optischen
Achse ausgerichtete, in ihrer Geometrie kongruent zu den Phasenplattenbereichen
angeordnete sektorale oder punktuelle Bereiche enthält,
um die optische Achse drehbar vorgesehen. So lässt sich
das Einstellen vereinfachen. Vorteilhaft ist dabei auch die objektivseitige
Phasenplatte mit Bereichen erhöhter optischer Dichte um
die optische Achse drehbar vorgesehen. Um die Einstellung fixieren
zu können, ist die verdrehbare Kondensorblende bzw. Phasenplatte
in ausgewählter Stellung arretierbar. Bevorzugt ist dabei
die Kondensorblende bzw. Phasenplatte als Revolverscheibe ausgebildet.
So können nach Wahl des Anwenders unterschiedliche Bereiche
der Phasenplatte von den beleuchtenden Strahlenbündeln
angesteuert werden. Zweckmäßigerweise sind Arretierungen der
drehbar im Kondensor angeordneten Kondensorblende, entsprechend
den verschiedenen möglichen Einstellungspositionen, vorzusehen
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Zum
optischen Einrichten von Beleuchtungsapparatur und Objektiv dient – wie
bei Phasenkontrastmikroskopen üblich – ein Einstellfernrohr.
Dabei versteht es sich von selbst, dass unter Beibehaltung eines
kreisförmigen Lichtdurchlasses und optisch homogener kreisförmiger
Phasenplatte spezielle Phasenkontrastobjektive für variablen
Phasenkontrast erstellt werden können, bei denen ein Set
mehrerer Phasenplatten unterschiedlicher optischer Dichte auf einem
Schieber oder einer geeignet gelagerten drehbaren Revolverscheibe im
Objektiv integriert werden, so dass unterschiedliche optische Kontrastierungen
durch Wechseln der Phasenplatte erreicht werden, indem jeweils eine
andere Phasenplatte in geeigneter Justierung in den Strahlengang
eingebracht wird. Weiter versteht es sich von selbst, dass mit diesen
Anordnungen auch Untersuchungen bei invertiertem Strahlengang (umgekehrtes
Mikroskop) bzw. bei invertierter Objektbeleuchtung durchführbar sind.
Zusätzlich kann die Anordnung der Beleuchtungseinrichtung
mit Kondensor am Mikroskopstativ zum Variieren der Richtung und/oder
des Einstrahlwinkels des das Objekt beleuchtenden Strahlenbündels
kippbar ausgebildet sein. Dadurch kann Richtung und/oder Einstrahlwinkel
des beleuchtenden Strahlenbündels variiert werden.
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Mit
vorstehend beschriebener Einrichtung des Phasenkontrastmikroskops
lässt sich der Kontrast der damit erzeugten Bilder erheblich
steigern. Die sektoral begrenzten Strahlenbündel werden
zusammengeführt und erzeugen letztendlich das Bild, das
mit dem Okular als Lupe betrachtet werden kann. Dabei liegen die
von der Kondensorblende sektorierten Lichtbündel auf dem
Mantel eines Hohlkegels und sie sind hinsichtlich Zentriwinkel und
Geometrie den korrespondierenden Phasenplatten- Bereichen angepasst,
so dass die für optisch basierte Phasenkontrastdarstellungen
erforderliche Kongruenz von kondensorseitigen Lichtdurchlässen
und objektivseitigen Phasenplatten stets gewährleistet
ist.
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Mittels
spezieller Ausführungen des Mikroskopstatives im Hinblick
auf die Beleuchtungsapparatur kann durch kontrolliertes Kippen der
beleuchtenden Komponenten, bei sicherzustellender bleibender optischer Kongruenz
von Kondensorblende und Phasenplatte, neben der Einstrahlrichtung
zusätzlich auch der Einstrahlwinkel des beleuchtenden Strahlenbündels
in Relation zur Position des Objektes verändert werden,
wodurch weitere Variationen der erhältlichen dreidimensionalen
Darstellung des Objektes realisiert werden können, wie
auch bereits in
DE
10 2006 027 961.1 A1 näher beschrieben.
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Ist
das Phasenkontrast-Objektiv für lange Arbeitsabstände
und Glasdicken von Objektträgerstärke speziell
gerechnet und korrigiert, kann durch eine Invertierung des Strahlenganges
in Abhängigkeit von der Objektbeschaffenheit eine inverse
Beleuchtung zur weiteren Intensivierung oder Modifizierung der dreidimensionalen
Darstellung angewandt werden. Dabei passiert das beleuchtende Strahlenbündel
zunächst das Deckglas, beleuchtet hernach schräg
einfallend das Objekt und gelangt zuletzt durch den Objektträger
zum Objektiv. Bei dieser inversen Beleuchtungsvariante können
je nach Objekt Schattenwürfe auf der Oberfläche
des Objektträgers entstehen, deren Ausdehnung der regionären
Schichtdicke des Objektes proportional ist, was auch schon in
DE 10 2006 027 961.1
A1 näher beschrieben ist.
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Das
Wesen der Erfindung wird beispielhaft an Hand der 1 bis 9 näher
erläutert; dabei zeigen:
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1:
Konventioneller Phasenkontrast mit Kondensorblende und Phasenplatte
nach Stand der Technik: Strahlengang eines Lichtmikroskops (schematisch);
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2:
Konventioneller Phasenkontrast nach 1: Korrekte
Justierung von Kondensorblende und Phasenplatte (Stand der Technik);
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3:
Modifizierter Phasenkontrast mit Kondensor-Lichtblende und Phasenplatte:
Strahlengang eines Lichtmikroskops mit modifizierter Phasenplatte
mit 2 Paar Segmenten (schematisch);
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4:
Modifizierter Phasenkontrast nach 3: Korrekte
Justierung von sektoraler Lichtblende und Phasenplatte;
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5:
Einzelheit Phasenplatte mit 2 Paar Sektoren mit angedeutetem Strahlengang
bei zweiseitiger Objektbeleuchtung;
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6:
Modifizierter Phasenkontrast mit Kondensor-Lichtblende und Phasenplatte:
Strahlengang eines Lichtmikroskops mit modifizierter Lichtblende
mit 4 Einzel-Segmenten (schematisch);
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7 Modifizierter
Phasenkontrast nach 6: Korrekte Justierung von sektoraler
Lichtblende und Phasenplatte;
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8 Einzelheit:
Phasenplatte mit 4 Einzel-Segmenten mit angedeutetem Strahlengang
bei einseitiger Objekt-Beleuchtung;
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9:
Lichtdurchtrittsöffnungen von modifizierten Lichtblenden
(unten) und segmentierten Phasenplatten (oben), jeweils unterschiedlich
sektioniert (paarweise untereinander).
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Der
in den 1 und 2 dargestellte Stand der Technik
zeigt den Strahlengang eines Lichtmikroskops mit konventionellem
Phasenkontrast sowie die korrekte Justierung. Der Strahlengang verläuft
(schematisch dargestellt) von der Lichtquelle 1 der Beleuchtungseinrichtung über
eine Kondensorblende 2 mit vollringförmier Lichtdurchlassöffnung 2a,
welche auf einer auswechselbar Kondensorblende 2 im Kondensor 3 angeordnet
ist. Das austretende Licht 6 durchsetzt das Objekt 4.
Vom Objektiv 5 werden die den Hintergrund bildenden Strahlen 6.1 und
die das Bild erzeugenden Strahlen 6.2 zum Zwischenbild 8 gebündelt.
Durch Interferenz mit dem Hintergrundlicht 6.1 erzeugt
dabei der in seiner Phasenlage veränderte bilderzeugende
Stahlenanteil 6.2 den erhöhten Kontrast. Dabei
wirkt die in der hinteren Brennebene des Objektivs 5 angeordnete
Phasenplatte 7 als ”Phasenschieber”.
Das so erzeugte Zwischenbild 8 kann durch das als Lupe
wirkende Okular 9 vom menschlichen Auge 10 betrachtet
werden. Daher tritt die Bilderzeugung nur dann vollkommen ein, wenn die
Kondensorblende 2 im Kondensor 3 und die Phasenplatte 7 hinsichtlich
des Strahlenganges und der optischen Achse des Systems mit großer
Genauigkeit justiert sind (2). Dabei
durchdringt das durch den ringförmigen Lichtdurchlass in
Hohlkegelform aus dem Kondensor 3 (360°-Beleuchtung)
austretenden, das Objekt 4 allseitig, d. h. über
dessen gesamte Zirkumferenz, also aus 360°, beleuchtende
Licht auch die Phasenplatte 7 allseitig. Diese Einstellung
wird in aus der Phasenkontrastmikroskopie bekannter Weise überprüft
und justiert (2).
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Bei
den in den 3–9 für
den modifizierten Phasenkontrast dargestellten erfindungsgemäßen Veränderungen
des vorbeschriebenen Strahlengangs ist die auswechselbare Kondensorblende 2 mit
vollringförmiger Lichtdurchlassöffnung 2a im
Kondensor 3 durch eine konzentrisch zur optischen Achse
angeordnete Kondesorblende 11 ersetzt, die eine oder mehrere
einander symmetrisch gegenüberliegend angeordnete punktuelle
oder sichelförmige bzw. kreissektorförmige Licht-Durchtrittsöffnungen 11a...11n aufweist.
Daher wird bei dieser Anordnung folgerichtig das Objekt 4 nur
noch über ein singuläres oder einige relativ schmale Lichtbündel
beleuchtet, welches durch die betreffende(n) schmale(n), sichelförmige(n)
oder eiförmigen) Austrittsöffnung(en) 11a gelangt.
Zusätzlich ist die dem Objektiv 5 nachgeschaltete
konventionelle Phasenplatte 7 durch eine modifizierte Phasenplatte 12 ersetzt,
deren Lichtdurchtrittsbereiche ein- oder mehrsegmentig umgestaltet
ist. Dabei muss auch hier die Ausrichtung so erfolgen, dass die
optischen Achsen von Kondensorblende 11 und Phasenplatte 12 zusammenfallen
und das Bild der Lichtblende 11 konzentrisch im Ring der
Phasenplatte 12 erscheint (4 und 7).
Die Lichtdurchtrittsbe reiche der Phasenplatte 12 besteht
bei dieser Modifikation im Unterschied zu Phasenplatten 7 mit
herkömmlichem Phasenkontrast aus mehreren Bereichen 12a...12n,
welche in geeigneter Reihenfolge und Gruppierung so aufeinander
folgen, dass sich unterschiedliche Phasenverzögerungen
ergeben. Je nachdem, welches der Bereiche 12a...12n der
Phasenplatte 12 von den ein oder zwei korrespondierenden
beleuchtenden Strahlenbündeln (5, 8)
angesteuert wird, ergeben sich unterschiedliche Phasenverzögerungen
des bildgebenden Strahlenanteils 6.2 zum Hintergrundlicht 6.1 und
folglich auch unterschiedliche optisch wirksame Gangunterschiede
zwischen Objektlicht und Bildhintergrund. Die Bildentstehung erfolgt
ansonsten in gleicher Weise, wie bei einem Mikroskop mit konventionellem Phasenkontrast.
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Bei
der erfindungsgemäßen technischen Umgestaltung
werden somit nicht mehr die gesamten Zirkumferenzen von Phasenplatte 12 und
Kondensorblende 11 zur Bildentstehung genutzt, sondern
nur begrenzte Kreissektoren variabler Bogenlänge. Jeder
Kreissektor der Kondensor-Lichtblende 11' ist kongruent
mit einem Kreissektor der Phasenplatte 12. Allerdings wird
dabei nur ein begrenzter Bereich der Phasenplatte zur Entstehung
des Phasenkontrastbildes benutzt. Daher kann die Phasenplatte 12 in
mehrere Kreisbogen-Bereiche 12a...12n (9)
untergliedert werden, die unterschiedliche Gangunterschiede bewirken,
die je nach Stellung der Phasenplatte 12 gewählt
werden können. Die Länge dieser jeweiligen Kreisbögen 12a...12n der
Phasenplatte 12 muss kongruent sein zu der Bogenlänge
des kondensorseitigen sektorförmigen Lichtdurchlasses 11a...11n der
Kondensorblende 11. Zweckmäßigerweise
kann eine solche sektoral variabel strukturierte Phasenplatte 12 dadurch
realisiert werden, dass nach Art treppenförmigen Schichtdicken-Zuwachses
sukzessive Beschichtungen auf der Phasenplatte 12 aufgetragen
werden. Je dicker die jeweilige Beschichtung mit erhöhter
optischer Dichte ist, desto größer wird die Phasenverzögerungsein.
Selbstredend können auch unterschiedliche Materialien mit
divergierender optischer Dichte verwendet werden. Wird nun der Lichtdurchlass 11a...11n der
Kondensorblende 11 durch Rotation der Lichtblende 11 um
die optische Achse jeweils so eingestellt, dass er einen definierten
Bereich der untergliederten Phasenplatte 12 ausleuchtet,
ergibt sich auf diese Weise ein mehrstufig variabler Gangunterschied.
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Wenn
eine solche Phasenplatte 12 z. B. in vier kreissektorförmige
Bereiche 12a, 12b, 12c, 12d (6, 7, 8)
zu je nahezu 90° Bogenlänge untergliedert wird,
können diese vier Sektoren mit unterschiedlich dimensionierten
Bereichen ausgelegt werden, z. B. für konventionellen positiven
und negativen Phasenkontrast und zwei von der Standardeinstellung
abweichende. Varianten (wie in den 6 bis 8 dargestellt.). Sofern
der kreissektorförmige Lichtdurchlass singulär
ist und einen Zentriwinkel von 90° nicht überschreitet, können
bei dieser Ausführungsvariante insgesamt vier unterschiedliche
Kontrastierungen erreicht werden. Das Objekt 4 wird jeweils
aus einer Richtung von einem, maximal 90° umfassenden Lichtkonussektor
schräg beleuchtet. Alternativ können mehrere Bereiche
mit übereinstimmendem Gangunterschied einander gegenüberliegend
angeordnet werden. So können beispielsweise zweimal zwei
90°-Bereiche gleicher Phasenverschiebung paarweise diametral
gegenüberliegend auf einer Phasenplatte 12 angeordnet
werden (3, 4, 5).
Sofern die Kondensorblende 11 in passender Weise mit zwei
ebenfalls einander gegenüberliegenden sektorförmigen
Lichtdurchlässen bestückt wird, welche einen Kreisbogen
von höchstens 90° umfassen, kann zwischen zwei
Kontrastierungsvarianten gewechselt werden, wenn die Kondensblende 3 jeweils
so verdreht wird, dass beide Lichtdurchlässe 11a...11n mit
einem passenden Paar zweier Phasenplattenbereiche 11a...12n kongruent
sind. In diesem Fall wird das Objekt aus zwei einander gegenüberliegenden
Richtungen beleuchtet, wie in 3 dargestellt.
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Grundsätzlich
können auch kürzere Kreissegmente 12a...12n eingesetzt
werden, so dass je nach technischer Zielsetzung auch beispielsweise
drei-, vier oder sechs-segmentige Phasenplatten 12 (in 9 angedeutet)
erstellt werden können, welche eine entsprechend höhere
Bandbreite unterschiedlicher Gangunterschiede realisieren lassen.
In entsprechender Weise können auch drei oder mehr optisch
identische Phasenplattenbereiche 12a...12n in
geeigneter Symmetrie als Paar, Triplett oder Quartett auf der Phasenplatte
angeordnet werden, wobei die lichtdurchlassenden Bereiche 11a...11n der
Kondensorblende 11 in analoger Symmetrie kongruent zu den
korrespondierenden Phasenplattenbereichen 12a...12n der
Phasenplatte 12 zu gestalten und anzuordnen wären
(9a–e: Phasenplatte oben, Kondensorblende
unten). Im Einzelnen zeigen 9a die
Phasenplatte mit 2 × 2 Bereichen, 9b die
Phasenplatte mit 2 × 3 Bereichen, 9c die
Phasenplatte mit 2 × 6 Bereichen, 9d die
Phasenplatte mit 3 × 4 Bereichen und 9e die
Phasenplatte mit 4 × 3 Bereichen, wobei jeweils Segmentpaare
gleichen Gangunterschiedes einander diametral gegenüberliegen.
Der korrespondierende Lichtdurchlass der Kondensorblende 11 besteht
aus zwei oder mehr Kreissektoren 11a, 11b mit
jeweils adäquater Bogenlänge (je nach Auslegung
zu etwa 90°, 60° oder 30°). Diese Kondensorblende 11 ist
vorteilhaft drehbar ausgebildet und mit Arretierungen versehen.
Bei insgesamt drei Arretierungsmöglichkeiten können
so beispielsweise drei Kontrastierungsvarianten gewählt
werden, wobei das Objekt jeweils aus zwei Raumrichtungen beleuchtet
wird (siehe 9b). 9a bis 9e zeigen verschiedene Ausführungsbeispiele
für mehrgliedrige Phasenplatten 12, deren einzelne
Bereiche 12a...12n mit entsprechenden Bogenlängen
zwischen etwa 90° bei 2 × 2 Bereichen bis etwa
30° bei 4 × 3 Bereichen. Zugeordnet sind jeweils eine
Kondensorblende mit 2 (9a–c),
3 (9d) oder 4 (9e)
lichtdurchlassenden Bereichen, so dass die entsprechenden Strahlengänge
ausgeblendet werden können. Je nachdem; ob die zugeordnete
Kondensorblende 11 mit zwei, drei oder vier sektoralen
Lichtdurchlässen 11a...11n zu je 30° Bogenlänge ausgestattet sind,
ergeben sich sechs, vier oder drei Kontrastierungsvarianten, wobei
das Objekt 4 aus zwei, drei oder vier Richtungen beleuchtet
wird (9c–e).
-
Hinsichtlich
des Charakters des Phasenkontrastbildes gilt, dass, je größer
das optisch relevante beleuchtende Kreissegment
11a...
11n gehalten
bzw. aus je mehr Richtungen das Objekt
4 segmental beleuchtet wird,
desto mehr das resultierende Bild dem konventionellen Phasenkontrast ähnelt,
wohingegen, je schmaler der beleuchtende Lichtsektor sein wird bzw.
je weniger Lichtsektoren
11a...
11n zur Verfügung
stehen, desto „schräger” die resultierende
Phasenkontrast-Beleuchtung ausfällt. Wird das beleuchtende
Licht nach
DE
10 2006 027 961.1 A1 aus nur einer definierten Richtung
zum Objekt
4 geleitet, hat dies zwar den Vorteil einer erhöhten
Reliefdarstellung, allerdings den Nachteil einer gewissen Inhomogenität
des Bilduntergrundes. Diese Inhomogenität kann vermieden
werden, wenn die Objektbeleuchtung aus zwei oder mehr gegenüberliegenden bzw.
symmetrisch angeordneten punktuellen Lichtdurchlässen
11a...
11n erfolgt.
-
Sollte
bei diesen Ausführungsvarianten die Kondensorblende 11 mit
den jeweiligen Lichtdurchlässen 11a...11n nicht
drehbar, sondern fest im Kondensor 3 montiert werden, kann
alternativ dazu die variabel gestaltete Phasenplatte 12 im
Objektiv 5 drehbar gelagert sein. Die hierfür
erforderliche Drehfassung wäre analog zur Drehfassung einer
objektivseitigen Irisblende oder entsprechend einer Drehvorrichtung
zur Deckglaskorrektur vorzusehen.
-
Bei
den beschriebenen Modifikationen des Strahlenganges wird das Objekt 4 nicht
mehr aus 360° konzentrisch und allseitig von dem aus dem
Kondensor 3 austretenden hohlkegeligen Lichtkonus 6 beleuchtet, sondern
nur noch von den beleuchtenden Strahlen aus von der Lage des Lichtdurchlasses 11a...11n bestimmten
Richtung, wobei das oder die beleuchtende(n) Strahlenbündel
schrägwinklig auf das Objekt 4 treffen. Die Hintergrunds-Strahlen 6.1 und
die bilderzeugenden Strahlenanteile 6.2, die durch Beugung
der Beleuchtungsstrahlen am Objekt 4 entstehen, werden
wie üblich zum Objektiv 5 geleitet. Da allerdings
die Beleuchtung aus einer oder nur einigen wenigen Richtungen erfolgt,
gehen auch die bilderzeugenden Strahlen 6.2 vergleichsweise
gebündelt zum Objektiv 5, so dass nicht mehr alle
Flächenanteile der Linsen des Objektivs in gleichem Maße
an der Bildgebung beteiligt sind.
-
Um
die erfindungsgemäße Beleuchtung des Objekts 4 zu
erreichen, wird die im oder am Kondensors 3 eingesetzte
Kondensorblende 2 durch eine Kondensorblende 11 ersetzt,
die auf einem Kreis um deren optische Achse mindestens eine Lichtdurchtrittsöffnung 11a aufweist,
die einen Zentriwinkel von höchstens 90°, oder
auch z. B. 60° oder weniger umfasst. Dabei versteht es
sich von selbst, dass im Falle von zwei oder mehr Einzelöffnungen
diese auf dem entsprechenden Umkreis angeordnet sind und ggf. einen
entsprechend kleineren Zentriwinkel umfassen. Die Aper turblende
(nicht näher dargestellt) des Kondensors 3 bleibt
wie bei konventioneller Phasenkontrastbeleuchtung in geöffneter.
Position.
-
Sofern
im Unterschied zum konventionellen Phasenkontrast das Objekt durch
einen schräg auftreffenden Lichtstrahl nur aus definierter
Richtung beleuchtet wird, resultiert eine an interferenzkontrastmikroskopische
Bilder erinnernde höhere Dreidimensionalität der
Darstellung. Diese räumlichen Effekte sind abhängig vom
konkreten Relief des jeweiligen Objektes, d. h. den Schichtdicken-Unterschieden,
wobei sich auch Faltungen von Zellmembranen entsprechend plastisch
darstellen. Wenn ein Drehtisch verwendet wird, kann zudem die Beleuchtungsrichtung
im Interesse einer optimierten Plastizität der dreidimensionalen
Ausrichtung des Objektes = wie in
DE 10 2006 027 961.1 A1 ausführlich
dargelegt – angepasst werden. Indem dieser Beleuchtungsstrahl
durch Drehen der Lichtringfassung kreisförmig verschoben
wird, trifft er auf unterschiedliche Bereiche der modifizierten
Phasenplatte, wodurch, entsprechend der Anzahl unterschiedlicher
Phasenplattenbereiche, zwischen verschiedenen Kontrastierungsvarianten
gewechselt werden kann. Je höher die Anzahl der unterschiedlich
phasenverzögernden Bereiche auf der Phasenplatte ist, desto
mehr Einstellungsvarianten können durch konzentrisches
Verdrehen der kondensorseitigen Lichtaustrittsöffnung realisiert
werden.
-
Da
bei einer aus einer oder wenigen Richtungen kommenden punktuellen
Anleuchtung eines Objektes 4 die bildgebenden Strahlen 6.2 ebenfalls
relativ punktuell durch die abbildenden Linsen des Objektivs 5 verlaufen,
minimieren sich vorhandene Abbildungsrestfehler der verwendeten
Objektive. Sofern Objektive nicht plankorrigiert sind, ergibt sich
daher eine verbesserte Planität des mikroskopischen Bildes
bei gleichzeitig erhöhtem Kontrast. Mit einem einfachen
und preiswerten achromatischen Phasenkontrast-Objektiv lassen sich daher
Bildqualitäten erreichen, die durchaus der Qualität
höher korrigierter Planoptiken vergleichbar sind oder zumindest
nahe kommen. Zusätzlich ergeben sich aus der im modifizierten
Phasenkontrast stattfindenden Verringerung der Beleuchtungsapertur
eine Steigerung der Tiefenschärfe bzw. vertikalen Auflösung
und eine verbesserte Darstellung feiner Konturverläufe.
-
- 01
- Lichtquelle
- 02
- Kondensorblende 2
- 02a
- Lichtdurchtrittsöffnung 2a vollringförmig)
- 03
- Kondensor 3
- 04
- Objekt 4
- 05
- Objektiv 5
- 06
- beleuchtendes
hohlkegeliges Licht 6
- 06.1
- Hintergrundlicht 6.1
- 06.2
- bilderzeugender
Strahlenanteil 6.2
- 07
- Phasenplatte 7
- 07a
- Lichtdurchtrittsbereich 7a (ringförmig)
- 08
- Zwischenbild 8
- 09
- Okular 9
- 10
- menschlichen
Auge 10
- 11
- Kondensorblende
(modifiziert)
- 11a...11n
- sichelförmige
bzw. kreissektorförmige Lichtdurchtrittsöffnung
- 12
- Phasenplatte 12 (modifiziert)
- 12a...12n
- sichelförmiger
bzw. kreissektorförmiger Lichtdurchtrittsbereich
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 102006027961
A1 [0004, 0019, 0020, 0036, 0040]
- - DE 102007029814 A1 [0004]