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Arterielle
Hypertonie (Bluthochdruck) ist eine Volkskrankheit, die in Industriestaaten
mit einer Prävalenz von über 20% auftritt. Sie
spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung kardiovaskulärer
Erkrankungen wie Apoplex, Myokardinfarkt sowie Herz- und Nierenversagen.
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Der
mittlere arterielle Druck ist das Produkt aus Herzzeitvolumen und
totalem peripherem Widerstand. Erhöht sich einer der beiden
Faktoren ohne Gegenregulation durch den anderen, steigt der Blutdruck.
Nur in weniger als 10% der Fälle kann eine organische Ursache
für die Hypertonie gefunden werden (renale Hypertonie,
endokrine Hypertonie, Aortenisthmusstenose). In mehr als 90% aller
Fälle ist die Ursache für die pathologische Blutdrucksteigerung
bisher unklar (essenzielle Hypertonie). Lebensgewohnheiten, wie
Konstitution, Ernährungsfaktoren, Stress, Rauchen und endokrine
Faktoren, spielen für die Entwicklung eine begünstigende Rolle.
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Der
hohe Druck im Gefäßsystem führt zu Endorganschäden
an Herz, Gehirn, Nieren, peripheren Arterien und dem Auge. Das Risiko
für die Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen
wie Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz, Apoplex und Niereninsuffizienz
ist unter Hypertonie deutlich erhöht. Im 2002 veröffentlichten „World
Health Report” vermutete die WHO, dass ca. 62% zerebrovaskulärer
Erkrankungen und ca. 49% ischämischer Herzerkrankungen
auf einen suboptimalen systolischen Blutdruck (> 115 mm Hg) zurückzuführen
sind (Rodgers, A and Vaughan, P. The World Health Report
2002. WHO. Reducing Risk, Promoting Healthy Life. 1–230.
2002). Die Behandlung von Bluthochdruck führt
zu einer Reduktion des Schlaganfallrisikos um ca. 40% und zu einer
Reduktion des Myokardinfarktrisikos um ca. 15% (Whitworth,
J. A. (2003) 2003 World Health Organization (WHO)/International
Society of Hypertension (ISH) statement on management of hypertension.
J. Hypertens., 21, 1983–1992). Lewington
et al. konnten zeigen, dass ab einem Blutdruck von 115/75
mm Hg jede Zunahme des Druckes um 20 mm Hg systolisch oder 10 mm
Hg diastolisch das kardiovaskuläre Risiko verdoppelt (Lewington,
S., Clarke, R., Qizilbash, N., Peto, R., Collins, R. (2002) Age-specific
relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis
of individual data for one million adults in 61 prospective studies.
Lancet, 360, 1903–1913). Metaanalysen von Daten
aus klinischen Beobachtungen und Studien wie der „Hypertension
Optimal Treatment” (HOT)-Studie von 1998 begründen
den durch die WHO festgelegten Grenzwert für Bluthochdruck
von 140/90 (Whitworth, J. A. (2003) 2003 World Health Organization
(WHO)/International Society of Hypertension (ISH) statement on management
of hypertension. J. Hypertens., 21, 1983–1992).
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Eine
mögliche Einteilung verschiedener Werte für den
Blutdruck findet sich nachstehend: Blutdruck
(systolisch/diastolisch [mm Hg])
| optimal | < 120/< 80 |
| normal | < 130/< 85 |
| (prähypertensiv | 120–139/80–89) |
| hoch
normal | 130–139/85–89 |
| hypertensiv | ≥ 140/≥ 90 |
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Ein
Blutdruck von ≥ 140/90 mm Hg wird als erhöhter
Blutdruck beziehungsweise als Hypertonie angesehen.
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Sowohl
die Prophylaxe als auch die Therapie von Sekundärereignissen
der Hypertonie erweisen sich als schwierig. Eine optimale und präzise
Erkennung und Einstellung der Hypertonie so früh und so
kontinuierlich wie möglich ist daher von immanenter Bedeutung.
Eine zuverlässige Kontrolle der Therapiequalität
ist bisher nicht gegeben.
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Bislang
stand als einzige Möglichkeit zur Bestimmung des Blutdruckes
beziehungsweise zur Erkennung eines erhöhten Blutdruckes
die apparative Blutdruckmessung bei einem Arzt mittels Manschette
o. ä. zur Verfügung. Dabei weisen die kurzfristigen
Messungen den gravierenden Nachteil auf, dass lediglich Momentaufnahmen
erhalten werden. Die Messwerte werden von vielen Faktoren, wie beispielsweise
der Nervosität des Patienten, entscheidend beeinflusst.
Dadurch werden die Ergebnisse verfälscht. So können
Menschen mit sonst normalem Blutdruck bei Messungen durch medizinisches
Personal deutlich erhöhte Blutdruckwerte aufweisen. Daher
müssen diese „Gelegenheitsmessungen” oftmals
durch Selbstmessungen des Patienten und möglichst auch
durch automatische 24-Stunden-Messungen ergänzt werden.
Entsprechende 24-Stunden-Messgeräte erweisen sich zumeist
als unpraktikabel in der Handhabung.
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Es
war daher die Aufgabe bei vorliegender Erfindung, ein Verfahren
bereitzustellen, welches eine bessere Erkennung eines erhöhten
Blutdruckes ermöglicht und welches nicht die genannten
Nachteile aufweist.
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Diese
Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Bestimmung eines erhöhten
Blutdrucks von ≥ 140/90 mm Hg über einen zurückliegenden
Zeitraum anhand von Blutproben gemäß Anspruch
1 gelöst. In anderen Worten wird diese Aufgabe durch ein
Verfahren zur Bestimmung eines erhöhten Blutdrucks von ≥ 140/90
mm Hg über einen zurückliegenden Zeitraum anhand
von Blutproben gelöst, wobei das verstärkte und/oder
verringerte Auftreten spezifischer Markerproteine oder entsprechender
RNA proteinhaltiger Blutbestandteile des peripheren Blutes aus Blutproben
bestimmt wird und als Verstärkung/Verringerung eine Änderung
der Intensität um zumindest den Faktor 1,3 definiert ist,
wobei die Auswahl der spezifischen Markerproteine oder entsprechender RNA
auf einem Vergleich der Proteinzusammensetzung oder RNA-Zusammensetzung
proteinhaltiger Blutbestandteile des peripheren Blutes in Blutproben,
welche mit erhöhtem Blutdruck assoziiert sind, mit der
Proteinzusammensetzung oder RNA-Zusammensetzung dieser Blutbestandteile,
welche für einen Blutdruck von weniger als 140/90 mm Hg
charakteristisch ist, basiert.
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Dies
bedeutet, dass auf Basis der Blutproben eines Probanden oder Patienten
die Expression bestimmter signifikanter Markerproteine oder entsprechender
RNA bestimmt wird. Die erhaltenen Werte werden mit Expressionsdaten
bzw. RNA-Daten verglichen, welche einen normalen Blutdruck repräsentieren.
Die Identifizierung der Markerproteine oder entsprechender RNA erfolgt
zuvor anhand eines Vergleichs der Proteinzusammensetzung oder RNA-Zusammensetzung
bei Bluthochdruck mit einer Proteinzusammensetzung oder RNA-Zusammensetzung,
welche für einen normalen Blutdruck kennzeichnend ist.
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Erfindungsgemäß ist
es bevorzugt, wenn die proteinhaltigen Blutbestandteile Plasmaproteine,
Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten umfassen. Besonders bevorzugt
sind als proteinhaltige Blutbestandteile Thrombozyten. Umfasst sind
hierbei ebenso Membranproteine auf der Thrombozytenoberfläche,
wie intrazelluläre Proteine. „Protein” im
Sinne der Erfindung umfasst auch Proteinfragmente. Bei Zu- oder
Abnahme eines Proteins sind auch dessen Spaltprodukte betroffen.
Entsprechend sind auch Veränderungen in der Zusammensetzung
von Proteinfragmenten umfasst. Da Proteine durch RNA codiert werden,
umfasst die Erfindung auch Veränderungen im Spiegel von
RNA, die für proteinhaltige Bestandteile des Blutes codiert.
Insbesondere umfasst dies RNA aus Thrombozyten. Die RNA-Bestimmung
erfolgt dabei über bekannte quantitative RNA-Bestimmungsmethoden
(über Realtime PCR mittels Systemen von Lightcylcer).
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Die
genannten proteinhaltigen Blutbestandteile weisen verschiedene Lebensspannen
auf, während der sie im Blut zirkulieren. So beträgt
die Lebensdauer von Erythrozyten ca. 120 Tage. Thrombozyten weisen eine
Lebensspanne von 8 bis 12 Tagen auf. Hinsichtlich der Leukozyten
beträgt die Lebensdauer in Abhängigkeit vom Typ
wenige Tage bis mehrere Monate.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht
entsprechend die Bestimmung eines erhöhten Blutdrucks von ≥ 140/90
mm Hg über einen zurückliegenden Zeitraum. Dieser
beträgt vorzugsweise 0 bis 120 Tage vor Entnahme der Blutprobe.
Besonders bevorzugt ist ein zurückliegender Zeitraum von
0 bis 12 Tagen, insbesondere von 0 bis 8 Tagen vor Entnahme der
Blutprobe.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren liefert keinen direkten
Mittelwert, sondern zeigt die Summe aller Veränderungen über den
relevanten Zeitraum. Der gemessene Wert stellt sich als ein „gewichteter
Mittelwert” über den jeweiligen Zeitraum dar,
da neugebildete Blutbestandteile möglicherweise noch keine
Veränderungen aufweisen.
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Anhand
der vorliegenden Erfindung ist es möglich, zu bestimmten,
ob der Blutdruck eines Patienten über einen zurückliegenden
Zeitraum wie oben beschrieben im normalen Bereich lag. Auf diesem
Weg kann das Risikoprofil von Hypertonikern ambulant, einfach und
schnell eingeschätzt werden. Dies ermöglicht den rechtzeitigen
Einsatz von Medikamenten zur Behandlung der Hypertonie und z. B.
auch die Gabe von Thrombozytenaggregationshemmern zur Verhinderung
kardiovaskulärer Komplikationen. Mittels der vorliegenden Erfindung
ist entsprechend auch eine Überwachung möglich,
ob ein Patient mit erhöhtem Blutdruck seine Medikamente
regelmäßig einnimmt und es ist eine Überwachung
möglich, ob die Medikamente ausreichend wirken. In einer
bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße
Verfahren daher zur Kontrolle eines therapeutischen Erfolgs eingesetzt.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Bluthochdruckbestimmungs-Kit,
welcher auf dem erfindungsgemäßen Verfahren beruht.
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Nachfolgend
wird im Detail auf die Thematik der Thrombozyten eingegangen, obwohl
die anderen genannten Bestandteile des peripheren Blutes vom Rahmen
der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfasst sind.
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Obwohl
unter Bluthochdruck die Belastung der Gefäßwand
erhöht ist, entstehen zu beobachtende Schäden
dieser Organe vorzugsweise durch Gefässverschlüsse
und Ischämien. Ledig lich 12–15% der unter Hypertonie
auftretenden, ersten Apoplexien sind hämorrhagisch (Perry,
H. M., Jr., Davis, B. R., Price, T. R., Applegate, W. B., Fields,
W. S., Guralnik, J. M., Kuller, L., Pressel, S., Stamler, J., Probstfield,
J. L. (2000) Effect of treating isolated systolic hypertension on
the risk of developing various types and subtypes of stroke: the Systolic
Hypertension in the Elderly Program (SHEP). JAMA., 284, 465–471).
Für die Gefäßverschlüsse verantwortlich
ist die hypertoniebedingte Steigerung der Arteriosklerose und Thrombogenese.
Die unter Hypertonie zu beobachtende Arteriosklerose betrifft vorzugsweise
die kleinen Arterien und Arteriolen, insbesondere von Herz, Gehirn
und Nieren. Die insbesondere unter Bluthochdruck gesteigerten Flussgeschwindigkeiten
an Engstellen und Gefässbifurkationen führen zu
gesteigerten Scherkräften, die eine Aktivierung von Thrombozyten
bewirken (Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V.,
Schafer, A. I., Moake, J. L. (1996) Platelets and shear stress.
Blood., 88, 1525–1541.; Zhang, J. N.,
Bergeron, A. L., Yu, Q., Sun, C., McIntire, L. V., Lopez, J. A.,
Dong, J. F. (2002) Platelet aggregation and activation under complex
patterns of shear stress. Thromb. Haemost., 88, 817–821; O'Rourke,
F., Dean, N., Akhtar, N., Shuaib, A. (2004) Current and future concepts
in stroke prevention. CMAJ., 170, 1123–1133; Schulz-Heik,
K., Ramachandran, J., Bluestein, D., Jesty, J. (2005) The extent
of platelet activation under shear depends on platelet count: differential
expression of anionic phospholipid and factor Va. Pathophysiol.
Haemost. Thromb., 34, 255–262). Es konnte gezeigt
werden, dass aktivierte Thrombozyten in der Lage sind, ruhende Endothelzellen
zu aktivieren (Henn, V., Slupsky, J. R., Grafe, M., Anagnostopoulos,
I., Forster, R., Muller-Berghaus, G., Kroczek, R. A. (1998) CD40
ligand on activated platelets triggers an inflammatory reaction
of endothelial cells. Nature, 391, 591–594). Bereits
im Frühstadium der Hypertonie kommt es zu Entzündung
und Aktivierung des Endothels. An aktivierte Endothelzellen können
auch ruhende Thrombozyten binden (Gawaz, M., Neumann, F.
J., Dickfeld, T., Reininger, A., Adelsberger, H., Gebhardt, A.,
Schomig, A. (1997) Vitronectin receptor (alpha(v)beta3) mediates
platelet adhesion to the luminal aspect of endothelial cells: implications
for reperfusion in acute myocardial infarction. Circulation., 96, 1809–1818
Gawaz et al. 1997; Bombeli, T., Schwartz, B. R.,
Harlan, J. M. (1998) Adhesion of activated platelets to endothelial
cells: evidence for a GPIIbIIIa-dependent bridging mechanism and
novel roles for endothelial intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1),
alphavbeta3 integrin, and GPIbalpha. J. Exp. Med., 187, 329–339). Auf
Basis dieser primären Veränderungen kommt es langfristig
zu Atherogenese und Atherosklerose. Durch Freisetzung von Chemokinen
und damit Aufrechterhaltung/Aggravierung der Endothelentzündung
spielen aktivierte Thrombozyten auch bei der Atherogenese selbst
eine entscheidende Rolle (Gawaz, M., Langer, H., May, A.
E. (2005) Platelets in inflammation and atherogenesis. J. Clin.
Invest., 115, 3378–3384).
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Es
wird immer ersichtlicher, dass insbesondere Thrombozyten an jedem
Stadium der durch Hypertonie hervorgerufenen Endorganschädigung
beteiligt sind. Dennoch wurde gezeigt, dass die generelle Therapie hypertensiver
Patienten mit Thrombozytenaggregationshemmern (TAH) keinen Überlebensvorteil
bringt. In aktuellen Leitlinien kommen TAH daher lediglich zur Sekundärprophylaxe
zum Einsatz, d. h. erst, wenn bereits ein ischämisches
Ereignis stattgefunden hat Boulanger, J. M. Hill, M. D.
(2005) Hypertension and stroke: 2005 Canadian Hypertension Educational
Program recommendations. Can. J. Neurol. Sci., 32, 403–408; Cohen,
J. D. (2006) Managing hypertension: state of the science. J. Clin.
Hypertens. (Greenwich), 8, 5–11). Lediglich die europäischen
Leitlinien empfehlen eine niedrig dosierte Aspirintherapie. Allerdings
auch nur für Patienten mit erhöhtem Serum-Creatinin
oder einem 10-jahres Risiko für kardiovaskuläre
Ereignisse von > 20%
(Cifkova, R., Erdine, S., Fagard, R., Farsang, C., Heagerty,
A. M., Kiowski, W., Kjeldsen, S., Luscher, T., Mallion, J. M., Mancia,
G., Poulter, N., Rahn, K. H., Rodicio, J. L., Ruilope, L. M., van
Zwieten, P., Waeber, B., Williams, B., Zanchetti, A. (2003) Practice
guidelines for primary care physicians: 2003 ESH/ESC hypertension
guidelines. J. Hypertens., 21, 1779–1786).
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Einen
tauglichen Marker für einen erhöhten Blutdruck
anhand von proteinhaltigen Blutbestandteilen des peripheren Blutes
zu finden wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung als viel versprechend
angesehen. Insbesondere die Fokussierung auf Thrombozyten wurde
aus drei Gründen als geeignet erachtet:
- 1)
Thrombozyten zirkulieren 8 bis 12 Tage, im Mittel 10 Tage im Gefäßsystem,
kommunizieren während dieser Zeit fortwährend
mit ihrer Umgebung und „speichern” unter Umständen
die gewonnene Information in Form einer Veränderung exprimierter
Oberflächenmarker oder durch Sekretion veränderten
Proteingehalts,
- 2) Thrombozyten spielen bei der Athero- und Thrombogenese eine
zentrale Rolle, sind von Veränderungen also frühzeitig
betroffen und
- 3) Thrombozyten können einfach und schnell gewonnen
werden, bieten also eine gute Voraussetzung für ein Screening.
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Durch
ihre Fähigkeit, Endothelschäden zu erkennen und
darauf zu reagieren, spielen Thrombozyten eine zentrale Rolle bei
der primären Hämostase. Wie oben dargelegt scheinen
Thrombozyten auch an Entzündungsprozessen der Gefäßwand
wesentlich beteiligt zu sein.
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Für
die Atheroskleroseenstehung von besonderer Bedeutung ist die Fähigkeit
von Thrombozyten, auch bei intakter Endothelzellschicht aktiviert
zu werden und zu adhärieren. Im Allgemeinen bietet das
Endothel keinen Angriffspunkt für Thrombozyten.
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Verschiedene
Faktoren üben unter Bluthochdruck Einfluss auf Thrombozyten
aus. Dazu gehören veränderte Hämodynamik,
veränderte Rheologie, endotheliale Veränderungen,
erhöhter Sympathikotonus und aktiviertes Renin-Angiotensin-Aldosteron
System (RAAS). Diverse morphologische, biochemische und funktionelle
Veränderungen von Thrombozyten unter Bluthochdruck werden
beobachtet. Der Umfang von Veränderungen in Thrombozyten
ist beträchtlich. Um die Funktion und Reaktion von Thrombozyten
im Rahmen der Hypertonie besser zu verstehen, wurde daher nicht
auf einzelne Proteine fokussiert, sondern die Gesamtheit der Proteine – das
Proteom – betrachtet.
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Bei
kernhaltigen Zellen bieten Untersuchungen des Transkriptoms (”Transcriptomics”)
eine gute Übersicht über das Expressionsgeschehen.
In Thrombozyten ist dies infolge ihrer Kernlosigkeit schwierig.
Deshalb wird zur Analyse von Thrombozyten vorzugsweise das Proteom
untersucht.
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Um
das Proteom einer Zelle differenziert zu betrachten, ist es notwendig,
die einzelnen Proteine zu trennen. Die Auf trennung des Proteingemisches
erfolgt hauptsächlich über gelbasierte Methoden.
Die am weitesten verbreitete, gelbasierte Methode stellt die zweidimensionale
Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE) dar und wurde von O'Farrell
et al. und Klose et al. beschrieben (O'Farrell,
P. H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of
proteins. J. Biol. Chem., 250, 4007–4021.; Klose,
J. (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis
of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point
mutations in mammals. Humangenetik, 26, 231–243).
Die von Ünlü et al. publizierte
Weiterentwicklung, die zweidimensionale, differentielle Gelelektrophorese
(2D-DIGE), erlaubt inzwischen einen hochpräzisen quantitativen
Vergleich unterschiedlicher Proben basierend auf der 2D-PAGE (Ünlü,
M., Morgan, M. E., Minden, J. S. (1997) Difference gel electrophoresis:
a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis,
18, 2071–2077). So können auch anhand
einer geringen Zahl technischer Replikate verlässliche
Aussagen über Zu- bzw. Abnahme von Spotintensitäten
gemacht werden.
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Die
Hypertonie beim Menschen stellt eine multifaktorielle Erkrankung
dar. Eine ausreichende Standardisierung ist nur durch Verwendung
eines Tiermodells als Ausgangspunkt möglich. Um später
die klinische Relevanz der Ergebnisse zu kontrollieren, müssen
Rückschlüsse vom Tier auf den Menschen erfolgen.
Für die Ratte ist dies auf Proteinebene über entsprechende
Datenbanken möglich (www.expasy.org).
Spätestens seit der vollständigen Entschlüsselung
des Genoms der Ratte (Gibbs et al. (2004) Genome sequence
of the Brown Norway rat yields insights into mammalian evolution.
Nature, 428, 493–521) kann zusätzlich
auch ein Rückschluss über genetische Ähnlichkeiten
erfolgen.
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Es
gibt diverse Tiermodelle des Bluthochdrucks, hauptsächlich
bei der Ratte. Sowohl beim transgenen Cyp1a1ren-2-Modell, als auch
durch kontinuierliche subkutane Angiotensin-II-Infusion mittels
osmotischer Minipumpen lassen sich bei Ratten Ausmaß und
Dauer des Bluthochdrucks genau steuern. Die der Bluthochdruckentwicklung
zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen sind bei diesen
Modellen bekannt und es ist kein bzw. nur ein minimalinvasiver Eingriff
zur Induktion notwendig. Thrombozyten dieser Tiere eignen sich folglich
zur vergleichend gegenüberstellenden Proteomanalyse. Proteine,
die im Tiermodell unter Hypertonie verändert sind, stellen
mögliche Kandidaten für die gezielte Markersuche
am Menschen dar. Solche Kandidatenproteine wurden im Rahmen der
vorliegenden Erfindung identifiziert.
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Erfindungsgemäß ist
es bevorzugt, dass die Markerproteine oder entsprechende RNA aus
löslichen Proteinen aus dem Cytoplasma der Zellen oder
dem Plasma und/oder peripheren oder integralen Membranproteinen
bzw. entsprechender RNA ausgewählt sind, beziehungsweise
der Vergleich der Proteinzusammensetzung oder RNA-Zusammensetzung
auf löslichen Proteinen und/oder Membranproteinen bzw.
entsprechender RNA basiert. Insbesondere ist es bevorzugt, dass
die Markerproteine oder entsprechende RNA aus löslichen
Thrombozytenproteinen bzw. entsprechender RNA ausgewählt
sind, beziehungsweise der Vergleich der Proteinzusammensetzung oder
RNA-Zusammensetzung auf löslichen Thrombozytenproteinen
bzw. entsprechender RNA basiert.
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Anhand
von Blutproben wurde das verstärkte und/oder verringerte
Auftreten spezifischer Markerproteine, insbesondere von Thrombozytenproteinen,
bestimmt. Als Verstärkung/Verringerung wurde eine Änderung
der Intensität um zumindest den Faktor 1,3 definiert. Die
Auswahl der spezifischen Markerproteine oder entsprechender RNA
beruhte dabei auf einem Vergleich der Proteinzusammensetzung oder
RNA-Zusammensetzung proteinhaltiger Blutbestandteile des peripheren
Blutes in Blutproben, welche mit erhöhtem Blutdruck assoziiert
sind, mit der Proteinzusammensetzung oder RNA-Zusammensetzung dieser
Blutbestandteile, welche für einen Blutdruck von weniger
als 140/90 mm Hg charakteristisch ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
wurde eine Änderung der Intensität bezüglich
des verstärkten und/oder verringerten Auftretens spezifischer
Markerproteine oder entsprechender RNA proteinhaltiger Blutbestandteile
des peripheren Blutes um zumindest den Faktor 1,5 vorausgesetzt.
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Zur
Analyse des Proteoms bzw. zur Bestimmung der Intensität
der Markerproteine werden Methoden wie die ELISA-Technologie, Agglutinationstests,
durchflusszytometrische Tests, Gelelektrophorese, Westernblots,
Radioimmun Assays, Nachweisverfahren im Lateral-Flow-Verfahren,
chromogene Aktivierungstests und Funktionstests eingesetzt. Zur
Analyse, insbesondere des Proteoms der Thrombozyten wurde bevorzugt
ein gelbasierter Ansatz gewählt. Die Auftrennung eines
Proteingemisches auf einem zweidimensionalen Gel ist eine weit verbreitete
und gut etablierte Methode. Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen
lässt einen sehr sensitiven quantitativen Vergleich zweier
unterschiedlicher Proben zu. Besonders bevorzugt wurde die Intensität
der Markerproteine mittels zweidimensionaler differentieller Gelelektrophorese
(2D-DIGE) bestimmt. Die zweidimensionale differentielle Gelelektrophorese
(2D-DIGE) wurde wie oben beschrieben von Ünlü (Ünlü,
M., Morgan, M. E., Minden, J. S. (1997) Difference gel electrophoresis:
a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis,
18, 2071–2077) eingeführt und gilt heute
als bestmögliche Technologie der gelbasierten Proteomics.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform des gelbasierten Ansatzes
wird der pH-Bereich von 4 bis 7 für die isoelektrische
Fokussierung genutzt. Diese Auswahl des pH-Bereiches für
die isoelektrische Fokussierung führt zu einer gewissen
Einschränkung des beurteilbaren Anteils des Proteoms. Angesichts
der Zielsetzung, Marker anhand der Untersuchung möglichst
vieler Proteine gleichzeitig zu finden, erschien eine weitere Vorfraktionierung
als nicht sinnvoll. Die Auswahl anderer pH-Bereiche für
die isoelektrische Fokussierung oder die Ausweitung beispielsweise
auf den Bereich pH3 bis pH10 ist möglich.
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Durch
Fokussierung auf den pH-Bereich 4–7 konnten über
1000 Proteinspots getrennt und diese bezüglich ihrer Veränderungen
unter Hypertonie untersucht werden. 46 Proteine zeigen sich dabei
als reproduzierbar durch Hypertonie verändert.
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Insbesondere
erwiesen sich die nachfolgend genannten Proteine als Vertreter,
welche eine Intensitätsänderung um zumindest den
Faktor 1,3 aufweisen, wobei die Aufzählung nicht abschließend
ist: Alpha-mannosidase 2C1; Apolipoprotein A-I; Apolipoprotein E;
Bridging integrator 2; Coronin-1A; Dihydropyrimidinase-related protein
2; Fibrinogen alpha chain; Filamin-A; Formin-binding protein 1-like;
Gelsolin; Heat shock protein HSP 90-alpha; Heat shock protein HSP
90-beta; Non-muscle caldesmon; Pleckstrin; Programmed cell death 6-interacting
protein; Radixin; Ras-related protein Rab-11A; Ras-related protein
Rab-27B; Stress-induced- phosphoprotein 1; Talin-1; Thrombospondin-1;
Transgelin-2; Twinfilin-1; Vinculin. Besonders bevorzugt als spezifische
Markerproteine sind Proteine aus der nachstehend genannten Gruppe,
welche um zumindest den Faktor 1,5 verändert waren und
Thrombospondin-1; Formin-binding protein 1-like; Programmed cell
death 6-interacting protein; Talin-1; Filamin-A; Ras-related protein
Rab-27B; Ras-related protein Rab-11A; Alpha-mannosidase 2C1; Vinculin;
Dihydropyrimidinaserelated protein 2; Bridging integrator 2; Gelsolin;
Coronin-1A; Transgelin-2; Heat shock protein HSP 90-beta; Pleckstrin;
Fibrinogen alpha chain; Apolipoprotein E umfasst.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.
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Beispiele
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Am
Rattenmodell wurde der Einfluss der Hypertonie auf das zytosolische
Proteom von Thrombozyten untersucht. Hierfür wurde ein
Protokoll zur Isolation von Thrombozyten aus Rattenblut erstellt
und die Umsetzung der 2D-PAGE für Rattenthrombozyten optimiert.
Im Anschluss wurden Thrombozyten aus mehreren unterschiedlich strukturierten
Tierexperimenten analysiert.
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Vorversuche zur Etablierung der Methoden
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Vorversuche zur Hypertonieinduktion
in zwei Rattenmodellen
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Um
bei Tierversuchen zur Untersuchung der Thrombozyten unabhängig
von telemetrischer Blutdruckmessung zu sein, wurden Vorversuche
durchgeführt, in denen das Verhältnis von Induktorkonzentration
(Indol-3-Carbinol, I3C) zur Ausprägung des Hochdrucks untersucht
wurde. Außerdem wurden in den Vorversuchen Laborparameter
untersucht, die in anschließenden Versuchen ohne telemetrische
Blutdruckmessung zum Vergleich herangezogen wurden.
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Vorversuch für eine zweiwöchige
Hypertonieinduktion bei Cyp1a1ren-2 transgenen Ratte
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Bei
10 Cyp1a1ren-2 transgenen Ratten wurde die dosisabhängige
Wirkung einer chronischen I3C-Applikation (Beimischung zum Futter)
auf den arteriellen Blutdruck bestimmt. Ein leichter Anstieg des
Blutdrucks wurde bei einer Dosis von 0,133% I3C im Futter beobachtet,
ein Anstieg innerhalb von vier bis fünf Tagen auf deutlich
hypertensive Werte wurde bei einer Dosis von 0,167% I3C erreicht
(siehe 1).
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Ab
dieser Dosis konnte auch ein signifikanter Anstieg der Plasmareninkonzentration
(PRC), sowie der Aldosteronkonzentration gemessen werden. Weder
das Serum-Kalium, noch Serum-Natrium änderten sich signifikant.
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Vorversuch für eine zweiwöchige
Hypertonieinduktion bei Fischer-Ratten (F344) mittels subkutaner
Angiotensin-II-Infusion
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In
Vorversuchen an insgesamt sechs F344-Ratten mit Minipumpen wurde
das Verhalten des Blutdrucks bei einer Freisetzungsrate von 450
ng Angiotensin II (ANG II)/kg Körpergewicht/Minute untersucht. Hierbei
stieg der Blutdruck innerhalb von 4–7 Tagen auf über
160 mm Hg an (siehe 1). PRC und Aldosteron wurden
nach 7 und 14 Tagen bestimmt. PRC war nach 7 Tagen bereits deutlich
supprimiert, Aldosteron deutlich erhöht.
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Etablierung eines Protokolls
zur Gewinnung von Thrombozyten aus Vollblut der Ratte
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Um
für die Untersuchungen genügend Protein zu haben,
musste der Anteil isolierter Thrombozyten an der Gesamtzahl an Thrombozyten
im Vollblut möglichst hoch liegen. Gleichzeitig musste
die Kontamination mit Leukozyten und Erythrozyten möglichst
gering gehalten werden, damit nur Thrombozytenproteine in den Proteomanalysen
untersucht wurden. Anhand diverser Zentrifugationsreihen wurde die
optimale Kombination aus Zentrifugalbeschleunigung und Zentrifugationsdauer
ermittelt, um eine möglichst hohe Ausbeute an Thrombozyten
zu erhalten. Außerdem wurden die auf die Isolation folgenden
Waschschritte optimiert. Im Mittel wurden 35,1% der im Vollblut
vorhandenen Thrombozyten isoliert und gewaschen.
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Anpassung der 2D-Gelelektrophorese für
das zytosolische Proteom von Rattenthrombozyten
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Ein
generelles Protokoll zur Durchführung der 2D-Gelelektrophorese
sowie ein entsprechendes Protokoll zur Untersuchung zytosolischer
humaner Thrombozytenproteine lagen vor. Neben Anpassung des Volumens
an Harnstoff/Thioharnstoff, sowie Dauer und Intensität
der Ultraschallbehandlung zur Lysierung der Thrombozyten, musste
der für die Zielsetzung optimale pH-Bereich definiert werden.
Der Vergleich von Proteomkarten der Bereiche pH3–10 und
pH4–7 zeigte, dass sich der Isoelektrische Punkt des Hauptanteils
der Proteine im Bereich zwischen pH4 und pH7 befindet. Dieser Bereich
wurde daher für weitere Untersuchungen verwendet.
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Ergebnisse 2D-DIGE
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Einfluss einer 14tägigen Hypertonie
auf das Thrombozytenproteom bei Cyp1a1ren-2 transgenen Ratten (Experiment
1)
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In
Cyp1a1ren2-Ratten wurde durch Zufütterung von 0,167% I3C
ein 14 Tage andauernder Bluthochdruck von ca. 160 mm Hg systolisch
erzeugt. Anschließend wurde das Proteom der Thrombozyten
dieser Tiere mit dem Proteom von Thrombozyten normal gefütterter,
normotensiver Cyp1a1ren-2-Ratten verglichen. Mit Hilfe der 2D-DIGE
konnten 66 Spots detektiert werden, deren Intensität unter
hypertensiven Bedingungen um mehr als das 1,5fache zu- oder abnahm
(One-Way-ANOVA p < 0,01
korrigiert nach Benjamini und Hochberg). Fünfzig dieser
Spots zeigten nach 14tägiger Hypertonie eine verstärkte
Intensität, 16 Spots eine verminderte Intensität.
Um diese Ergebnisse zu validieren und um modellspezifische Veränderungen
auszuschließen, wurde das Experiment an einem zweiten Tiermodell
erneut durchgeführt.
-
Einfluss einer 14tägigen Hypertonie
auf das Thrombozytenproteom von F344-Ratten mit ANG-II-Infusion
(Experiment 2)
-
Bei
F344-Ratten wurde durch eine subkutane ANG-II-Infusion (450 ng ANG
II/kg Körpergewicht/Minute) mittels osmotischer Minipumpen über
14 Tage ein Bluthochdruck von ca. 160 mm Hg systolisch erzeugt. Als
Kontrolle dienten F344-Ratten, denen Kochsalz (NaCl) subkutan infundiert
wurde. Nach 14tägiger Behandlung wurde das Proteom der
Thrombozyten beider Rattengruppen mit Hilfe der 2D-DIGE verglichen.
Dabei wurden 156 Spots detektiert, die unter Hypertonie mehr als
1,5fach verändert waren (One-Way-ANOVA p < 0,01 korrigiert
nach Benjamini und Hochberg). Neunundsiebzig dieser Spots zeigten
eine durch Hypertonie verstärkte Intensität, 77
Spots eine verminderte Intensität.
-
Vergleich der unter Hypertonie
auftretenden Veränderungen im Thrombozytenproteom zweier
unterschiedlicher Rattenmodelle
-
Die
beiden 14-Tage Fall/Kontroll-Experimente Experiment 1 und Experiment
2 sind methodisch identisch und unterscheiden sich lediglich in
Rattenstamm und Induktionsmethode. Veränderungen, die in
beiden Experimenten auftreten, können also mit großer
Wahrscheinlichkeit auf die Hypertonie bzw. auf das aktivierte Renin-Angiotensin-System
zurückgeführt werden. Es wurden sowohl für
Experiment 1 als auch für Experiment 2 Listen erstellt
mit den Spots, deren Intensität signifikant und mehr als
1,5fach zu- bzw. abnahm (One-Way-ANOVA p < 0,01; Korrektur nach Benjamini und
Hochberg). Der Vergleich der Listen zeigt 35 Spots, die in beiden
Experimenten induziert sind und 11 Spots, die in beiden Experimenten
reprimiert sind. (siehe 3, 4 und 5).
-
Rückbildung der unter 14tägiger
Hypertonie aufgetretenen Veränderungen nach 10tägiger
Erholungsphase (Experiment 3)
-
Um
die Rückbildung der Veränderung zu Untersuchen
wurde in F344-Ratten mit Hilfe von ANG-II-Infusion ein 14tägiger
Bluthochdruck induziert. Danach wurden die Minipumpen explantiert
und eine 10tägige Erholungsphase angeschlossen. Nach diesem
Zeitraum erfolgte ein Vergleich des Thrombozytenproteoms mit Placebobehandelten
Tieren (14 Tage NaCl-Minipumpe mit 10tägiger Erholungsphase).
Unter diesen Bedingungen wurden 16 Spots detektiert, deren Intensität
bei den zuvor hypertensiven Ratten signifikant niedriger war. Kein
Spot zeigte nach der Erholungsphase noch eine verstärkte
Intensität. Der Vergleich mit den sowohl in Experi ment
1 als auch in Experiment 2 veränderten Spots brachte keine Übereinstimmung
(siehe 6).
-
Identifizierung der unter
Hypertonie veränderten Spots
-
Die
46 unter hypertensiven Bedingungen bei beiden Rattenmodellen veränderten
Spots wurden, soweit möglich, aus dem Gel ausgeschnitten
und mittels MALDI-ToF-Massenspektrometrie analysiert. So konnten
29 der 35 Spots mit verstärkter Intensität und
alle Spots mit abgeschwächter Intensität identifiziert
werden, wie in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt. Die Tabelle
zeigt detaillierte Listen der in Experiment 1 und Experiment 2 veränderten
Spots. Die Spotintensitäten sind relativ zur jeweiligen
Kontrolle im Experiment angegeben.
-
-
-
Einfluss 14tägiger Hypertonie
auf das Thrombozytenproteom von Ratten bei einmaliger Blutentnahme
(Experiment 4)
-
Im
Weiteren sollte das zeitliche Auftreten der Veränderungen
untersucht werden. Dazu wurde bei F344-Ratten mittels chronischer
subkutaner ANG-II-Infusion ein 14tägiger Bluthochdruck
induziert. An Tag 7 der Hochdruckphase wurden zusätzlich
einmal 3 ml Blut entnommen und daraus Thrombozyten isoliert. Als Kontrolle
dienten Thrombozyten derselben Ratten, die 4 Tage vor Implantation
der Minipumpen isoliert wurden. Der Vergleich des Thrombozytenproteoms
nach 14tägiger Hypertonie mit der Kontrolle zeigte deutlich
weniger Veränderungen als zuvor. Auch der Vergleich von
Experiment 4 mit Experiment 1 und Experiment 2 zeigte wenig Übereinstimmung:
so waren lediglich 4 Spots, die in Experiment 1 und 2 induziert
waren auch in Experiment 4 induziert. Keiner der zuvor durch Hypertonie
reprimierten Spots war auch in Experiment 4 reprimiert. Aufgrund
der fehlenden Reproduzierbarkeit der 14-tage Werte wurden die Thrombozyten
von Tag 7 nicht gesondert untersucht.
-
Die
Proben der unterschiedlichen Ratten einer Gruppe in Experiment 1
und Experiment 2 wurden vor der Auftrennung gepoolt. So stellen
die verschiedenen Gele technische Replikate der gleichen Probe dar.
Intensitätsunterschiede ergeben sich innerhalb einer Gruppe
nur noch durch technisch bedingte Variationen. Entsprechend können
bei der Statistik enge Kriterien angewandt werden. Um die Varianzen
innerhalb der Gruppen beurteilen zu können, wurden bei
den folgenden Experimenten die Proben einzelner Ratten getrennt auf
Gelen untersucht. Hierbei handelt es sich also um biologische Replikate
mit entsprechend größerer Variation (siehe 5). Um
Experiment 1 und Experiment 2 mit diesen Experimenten zu vergleichen
wurden sie erneut, mit schwächeren statistischen Kriterien
ausgewertet. Hierbei wurden solche Spots als signifikant betrachtet,
die in der Varianzanalyse (ANOVA) eine Irrtumswahrscheinlichkeit
(Fehler 1. Art) von p < 0,05
hatten und mindestens 1,3fach reguliert waren. Selbst mit dieser
abgeschwächten Statistik zeigten sich nur 10 Spots in allen
drei Experimenten induziert und nur ein Spot in allen drei Experimenten
reprimiert. Neben der unterschiedlichen Kontrollgruppe unterscheidet
sich Experiment 4 nur in der Blutentnahme während der Hochdruckphase
an Tag 7. Um den Einfluss von Blutentnahmen auf die Veränderungen
im Thrombozytenproteom zu kontrollieren, wurde Experiment 5 durchgeführt.
-
Einfluss 14tägiger Hypertonie
auf das Thrombozytenproteom von Ratten bei zweimaliger Blutentnahme
(Experiment 5)
-
Es
wurde bei F344-Ratten mit Hilfe von ANG-II-Infusion ein 14tägiger
Bluthochdruck induziert. Als Kontrolle dienten zum einen Thrombozyten
unbehandelter Ratten und zum anderen Thrombozyten placebobehandelter
Ratten (NaCl-Minipumpen). Während der 14tägigen
Hochdruckphase wurde den Ratten an Tag 3 und Tag 10 jeweils 3 ml
Blut entnommen.
-
Auch
das Ergebnis von Experiment 5 konnte die Veränderungen
in Experiment 1 und Experiment 2 nicht reproduzieren: kein Spot
ist in Experiment 1, Experiment 2 und Experiment 5 gleichzeitig
induziert und nur ein Spot ist in allen Experimenten reprimiert.
Im gekreuzten Vergleich ergibt sich jedoch ein anderes Bild: 21
der in Experiment 1 und Experiment 2 verstärkten Spots
sind in Experiment 5 abgeschwächt und 17 der in Experiment
1 und Experiment 2 abgeschwächten Spots sind in Experiment
5 verstärkt. Um den Effekt des Aderlasses isoliert zu untersuchen,
wurde Experiment 6 durchgeführt.
-
Einfluss zweimaliger Blutentnahme auf
das Thrombozytenproteom normotensiver Ratten (Experiment 6)
-
Experiment
6 bestand aus zwei Gruppen mit je 4 Ratten, wobei eine Gruppe gänzlich
unbehandelt blieb und bei der anderen Gruppe zwei Blutentnahmen
von 3 ml im Abstand von 7 Tagen durchgeführt wurden. Die
4 Tage nach der zweiten Blutentnahme isolierten Thrombozyten wurden
dann mit den Thrombozyten unbehandelter Ratten verglichen. Beim
Vergleich der Thrombozytenproteome konnten deutliche Veränderungen festgestellt
werden. Diese Veränderungen konnten zu weiten Teilen durch
den Vergleich von Experiment 6 mit der Placebogruppe aus Experiment
5 reproduziert werden: 16 der 19 in Experiment 6 verstärkten
Spots sind auch in der Placebogruppe aus Experiment 5 verstärkt.
Von den 34 in Experiment 6 abgeschwächten Spots sind 27
auch in der Placebogruppe aus Experiment 5 abgeschwächt.
Dies zeigt auch, dass die Implantation der Minipumpen keinen wesentlichen
Einfluss auf das Thrombozytenproteom ausübt (siehe auch
6 und
7). Tabelle 2 (Anzahl signifikant veränderter
Spots in den einzelnen Experimenten und Anzahl der übereinstimmend
veränderter Spots in je zwei Experimenten)
| | Gesamtzahl 1.3fach
veränderter Spots | | Gesamtzahl 1.3fach veränderter
Spots | Anzahl
gemeinsamer Veränderungen |
| Experiment
1 + | 89 | Experiment
2 + | 123 | 55 |
| Experiment 1 – | 60 | Experiment 2 – | 125 | 41 |
| |
| Experiment
1/Experiment 2 + | 55 | Experiment
4 + | 89 | 10 |
| | | Experiment 5 (ANGII)
+ | 74 | 0 |
| | | Experiment
6 + | 19 | 0 |
| | | Experiment
3 + | 0 | 0 |
| |
| Experiment
1/Experiment 2 – | 41 | Experiment
4 – | 32 | 1 |
| | | Experiment 5 (ANGII) – | 96 | 1 |
| | | Experiment 6 – | 34 | 0 |
| | | Experiment 3 – | 16 | 0 |
| |
| Experiment
1/Experiment 2 + | 55 | Experiment
4 – | 32 | 1 |
| | | Experiment 5 (ANGII) – | 96 | 21 |
| | | Experiment 6 – | 34 | 5 |
| | | Experiment 5 (NaCl) – | 25 | 3 |
| | | Experiment 3 – | 16 | 2 |
| |
| Experiment
1/Experiment 2 – | 41 | Experiment
4 + | 89 | 9 |
| | | Experiment 5 (ANGII)
+ | 74 | 17 |
| | | Experiment 6 + | 19 | 4 |
| | | Experiment 5 (NaCl) + | 28 | 4 |
| |
| Experiment
5 (NaCl) + | 28 | Experiment
6 + | 19 | 16 |
| | | Experiment 6 – | 34 | 0 |
| Experiment 5 (NaCl) – | 58 | Experiment 6 + | 19 | 0 |
| | | Experiment 6 – | 34 | 27 |
| |
| Experiment
5 (ANGII) + | 74 | Experiment
6 + | 19 | 19 |
| Experiment
5 (ANGII) – | 96 | Experiment
6 – | 34 | 25 |
| |
| Experiment
4 + | 89 | Experiment
6 + | 19 | 4 |
| | 89 | Experiment 5 (ANGII)
+ | 74 | 8 |
| | | | | |
| Experiment
4 – | 32 | Experiment
6 – | 34 | 1 |
| | 32 | Experiment 5 (ANGII) – | 96 | 1 |
| |
| Experiment
3 + | 0 | | | |
| |
| Experiment
3 – | 16 | Experiment
5 (ANGII) + | 74 | 0 |
| | 16 | Experiment
5 (ANGII) – | 96 | 12 |
| | 16 | Experiment
6 – | 34 | 0 |
-
Ergebnisse Massenspektrometrie
-
Von
den 1041 in der ursprünglichen Spotmap vorhandenen Spots
wurden 153 als ”Spots of Interest (SOI)” definiert.
Diese SOI befinden sich in mindestens einer der im Rahmen der Auswertung
erstellten Listen. Tabelle 2 zeigt eine Synopsis der Einzellisten
signifikant veränderter Spots und ihre jeweilige Übereinstimmung mit
den anderen durchgeführten Experimenten.
-
Von
besonderem Interesse waren dabei vor allem die 46 nach strikten
Kriterien in Experiment 1 und Experiment 2 regulierten Spots. Zur
Identifikation der SOI wurden präparative Gele angefertigt.
Hierzu wurden ca. 600 μg Proteingemisch aus dem Thrombozytenlysat
mittles 2D-PAGE aufgetrennt, die Gele mittels Coomassie gefärbt
und anschließend die SOI per Hand ausgeschnitten. Durch
die geringere Sensitivität der Coomassiefärbung
wurden weniger Spots sichtbar als zuvor mittels Fluoreszenzfärbung.
Somit standen einige SOI zur Identifikation mittels Massenspektrometrie
nicht zur Verfügung. Auch die einmalig durchgeführte
Fluoreszenzfärbung eines Teils der aufgetrennten Probe
und anschließendes Ausschneiden der Spots mittels Roboter konnte
die Anzahl der identifizierten Proteine nicht deutlich erhöhen.
Von den 83 ausgeschnittenen Spots konnten 64 mittels Massenspektrometrie
(MS) und anschließende Datenbanksuche eindeutig identifiziert
werden. Bei einigen dieser Spots lag die theoretische Masse jedoch
deutlich über der Masse, die der Position auf dem Gel entsprechen
würde. Hier ist davon auszugehen, dass nur ein Fragment
dieses Proteins vorliegt. In Tabelle 3 ist für diese der
Bereich der Aminosäuresequenz angegeben in dem die durch
Massenspektrometrie gefundenen Peptide lagen (siehe auch 8).
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Zum überwiegenden
Teil handelt es sich bei den identifizierten Spots um Proteine des
Zytoskeletts (Filamin A, Talin-1), darunter solchen, die eine wichtige
Rolle bei der Zelladhäsion (Vinculin) und Zellmigration (Myosin-9,
Coronin-1A, Twinfilin-1) spielen. Neben Stoffwechselproteinen (Apolipoprotein
A-I precursor) wurden auch Proteine detektiert, die für
die Thrombozytenfunktion von entscheidender Bedeutung sind (Plekstrin, Thrombospondin-1,
Fibrinogen alpha chain). Soweit bekannt wurde in Tabelle 3 die allgemeine
Funktion mit aufgeführt.
-
Beschreibung der Abbildungen
-
1:
Verlauf des systolischen Blutdrucks bei den Rattenmodellen im Vorversuch.
A) Zunahme des Blutdrucks bei Fütterung transgener Ratten
(TGR) mit 0,167% I3C bzw. subkutaner Infusion von ANG II über Minipumpen
bei Fischerratten (F344). Der Blutdruck transgener Ratten bleibt
ohne I3C-Zufütterung im Normbereich. Ebenso bleibt der
Blutdruck von Fischerratten bei NaCl-Infusion über Minipumpen
im Normbereich. B) Einfluss von Blutentnahmen (Pfeil) auf den systolischen
Blutdruck bei subkutaner ANG II- bzw. NaCl-Infusion mittels osmotischer
Minipumpen.
-
2: Übereinstimmung
der Veränderungen im Thrombozytenproteom unter Hypertonie
bei zwei unterschiedlichen Rattenmodellen. A) Anzahl induzierter
Spots B) Anzahl reprimierter Spots
-
3:
Die 46 durch Bluthochdruck sowohl in transgenen Ratten als auch
in Fischer-Ratten mit ANG-II-Infusion veränderten Spots.
2D-DIGE Gel des zytosolischen Thrombozytenproteoms von Fischer-Ratten
mit Minipumpe. Virtuell wurde die Spotmap von Proben ANG-II-behandelter
Ratten (rot bei farbiger Darstellung) über die Spotmap
von Proben placebo-behandelter Ratten (grün bei farbiger
Darstellung) gelegt. Spots, die in beiden Proben vorhanden waren
sind gelb (bei farbi ger Darstellung) dargestellt. Spots, die mittels MS
identifiziert worden sind, wurden entsprechend bezeichnet. Unter
RAAS-abhängiger Hypertonie verstärkte Spots sind
grün bezeichnet (bei farbiger Darstellung), abgeschwächte
Spots sind rot bezeichnet (bei farbiger Darstellung).
-
4:
Liniendiagramme der auf die jeweilige Kontrolle normalisierten Spotintensitäten
in den Einzelexperimenten. In A, Spalte 1 sind alle Spots dargestellt,
die in Experiment 1 nach Induktion verstärkt waren. In
A, Spalte 2 sind die in Experiment 2 aufgetretenen Veränderungen
dieser in Experiment 1 verstärkten Spots dargestellt. Es
zeigt sich, dass fast alle diese Spots auch in Experiment 2 unter
ANG-II-Infusion verstärkt waren. In A, Spalte 3 sind die
in Experiment 3 aufgetretenen Veränderungen der in Experiment
1 verstärkten Spots dargestellt. Acht Tage nach Explantation
der Minipumpen sind die Veränderungen demnach rückläufig. Analog
dieser Darstellung sind in B diejenigen Spots dargestellt, deren
Intensität in Experiment 2 durch ANG-II-Infusion verstärkt
war. In C und D sind jeweils die Spots dargestellt, deren Intensität
in Experiment 1 bzw. Experiment 2 vermindert war.
-
5:
Zwei unterschiedliche experimentelle Ansätze zur Untersuchung
des Thrombozytenproteoms mittels 2D-DIGE. Aus statistischen Gründen ist
es üblich, bei der Durchführung der 2D-DIGE 3–4
technische Replikate anzulegen. A) Vorgehen in Experiment 1 und
Experiment 2: Vor der gelbasierten Auftrennung wurde das Thrombozytenlysat
der Einzeltiere gepoolt, anschließend der Pool 4× mittels
2D-DIGE aufgetrennt. B) Vorgehen in den übrigen Experimenten:
Das Thrombozytenlysat der Einzeltiere wurde separat mittels 2D-DIGE aufgetrennt.
Auf Replikate der Einzeltiere wurde aus finanziellen Gründen
und aufgrund der geringen Probenmengen verzichtet.
-
6 Liniendiagramme
der auf die jeweilige Kontrolle normalisierten Spotintensitäten
in den Einzelexperimenten. In A, Spalte 1 sind alle Spots dargestellt,
die in Experiment 1 nach Induktion verstärkt waren. In A,
Spalte 2 sind de in Experiment 2 aufgetretenen Veränderungen
dieser in Experiment 1 verstärkten Spots dargestellt. Es
zeigt sich, dass fast alle diese Spots auch in Experiment 2 unter
ANG-II-Infusion verstärkt waren. In A, Spalte 3 sind die
in Experiment 3 aufgetretenen Veränderungen der in Experiment
1 verstärkten Spots dargestellt. Acht Tage nach Explantation
der Minipumpen sind die Veränderungen demnach rückläufig. Analog
dieser Darstellung sind in B diejenigen Spots dargestellt, deren
Intensität in Experiment 2 durch ANG-II-Infusion verstärkt
war. In C und D sind jeweils die Spots dar gestellt, deren Intensität
in Experiment 1 bzw. Experiment 2 vermindert war.
-
7:
Box Plot der auf die jeweilige Kontrolle normalisierten Spotintensitäten
in den Einzelexperimenten. Für jeden Spot wurde der Median
aus den vier bzw. fünf Replikaten ermittelt. Auf den entsprechenden Median
der Kontrollgruppe wurde normalisiert. Im Boxplot dargestellt sind
die Mittelwerte der Spotintensitäten der Replikate. Entsprechend
liegt der Wert der Kontrollgruppe nicht exakt auf 1 sondern nur
nahe 1.
-
Nach
Hypertonie-Induktion mittels I3C sind bei transgenen Ratten deutliche Änderungen
der Spotintensitäten zu beobachten (Kontrolle: transgene
Ratten ohne I3C-Zufütterung) (Experiment 1). Gleiches gilt
für die ANG-II-Infusion mittels Minipumpen bei Fischer-Ratten
(Kontrolle: Fischer-Ratten mit NaCl-Minipumpen) (Experiment 2).
A Bei Verwendung von Fischerratten als Kontrolle, bei denen keine
Minipumpe implantiert wurde, jedoch wiederholte Blutentnahmen erfolgten
(Experiment 5§), ist zu erkennen,
dass die subkutane NaCl-Infusion keinen wesentlichen Effekt hat.
Wesentliche Effekte durch Pumpenimplantation können also
ausgeschlossen werden. Ebenfalls kaum Effekt hat die ANG-II-Infusion,
wenn wiederholte Blutentnahmen vorgenommen werden. B Werden als
Kontrolle unbehandelte Ratten eingesetzt (Experiment 5§§),
so sind durch wiederholte Blutentnahmen allein deutliche Effekte
zu beobachten (Experiment 5§§ und
Aderlass, Experiment 6). Die zusätzliche Infusion von ANG
II hat kaum noch weitere Änderungen der Spotintensitäten
zur Folge.
-
8:
Abdeckung der Aminosäuresequenz der vermuteten Proteine
durch die in der Massenspektrometrie gemessenen, tryptischen Peptide
(gelb: Bereich der Aminosäuresequenz, in dem Peptide gemessen wurden).
Die zur Identifikation von Filamin-A verwendeten Peptide befinden
sich ausschließlich im C-terminalen Ende der Aminosäuresequenz.
Bei einer Gruppe von FLNa Spots scheint ein weiteres Fragment am
C-Terminus zu fehlen. Für den Thrombospondin-1 precursor
wurden fast ausschließlich Peptide des N-Terminus gefunden.
Im Gegensatz dazu ist die Sequenzabdeckung beim Gelsolin beinahe
vollständig.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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