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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur kausalen Diagnose
des Bluthochdrucks (Hypertonus), der eine frühe Diagnose und eine hochwirksame,
auf den jeweiligen Patienten massgeschneiderte und möglichst
nebenwirkungsfreie Therapie ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen DNA-Chip zur Entwicklung
neuer blutdrucksenkender Pharmaka und zur Stratifizierung von Patienten
in frühen
Phasen der klinischen Prüfung
solcher neuen Pharmaka.
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Etwa
15 Millionen Menschen leiden in Deutschland an Bluthochdruck, davon
etwa 5 Millionen unerkannt (Deutsche Bluthochdruckliga, 2000). Bluthochdruck
stellt mit seinen Folgeerkrankungen (Arteriosklerose, Herzinfakt,
Schlaganfall, Herzhypertrophie und Herzinsuffizenz) die weitaus
häufigste Ursache
für Krankheit
und Tod in allen westlichen Industrienationen dar, noch vor malignen
Entartungen (Krebs). Bluthochdruck beruht auf einer übermässigen Engstellung
der Blutgefässe
oder auf einer unzureichenden Flüssigkeitsausscheidung
durch die Niere. An der Regulation des Muskeltonus der glatten Muskulatur
in den Blutgefässen
und damit der Gefässweite
als auch an der Flüssigkeitsausscheidung durch
die Niere sind eine Vielzahl von zentralnervösen Mechanismen und Hormonsystemen
beteiligt. Diese steuern und regeln den Blutdruck, der physiologischerweise
bei körperlicher
Arbeit, Angst, Stress, Erregung etc. ansteigt. Eine Entgleisung
eines oder mehrerer dieser Systeme führt letztendlich zum Bluthochdruck.
In neun von zehn Fällen
sind die eigentlichen Ursachen des Bluthochdrucks nicht bekannt (essentielle
Hypertonie). Eine genetische Vorbelastung (Prädisposition) durch Mutation
von Genen, die für
Proteine kodieren, die in blutdruckregulierende Signalkaskaden involviert
sind, manchmal erst in Kombination mit äußeren Faktoren (Stress, Rauchen, Übergewicht,
mangelnde körperliche
Bewegung, Fehlernährung),
ist jedoch höchst
wahrscheinlich.
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Hypertonus
kann zur Zeit nur rein symptomatisch diagnostiziert werden, routinemässig durch
einfache Messung nach Riva-Rocci (Arm-Manschette, Stethoskop) oder
in der Intensiv-Medizin blutig-invasiv über arterielle Katheter. Das
heisst, dass bei Diagnose-Stellung die Krankheit und evtl. auch
negative Folgeerscheinungen bereits manifestiert sind. Die Diagnose
ist bei Grenzwert-Hypertonie auch nicht unproblematisch, da schon
physiologischerweise grosse Schwankungen im Blutdruck zu beobachten
sind (z. B. Tagesrythmik) und ausserdem viele Einflüsse den
Blutdruck variieren können
(z. B. Angst vor der Untersuchung; vor der Diagnose; „Weisskitteleffekt"). Eine Früherkennung,
also eine Möglicheit
den Beginn der Erkrankung noch vor einer signifikanten Blutdrucksteigerung
zu diagnostizieren, gibt es nicht. Auch ist es bei einer solchen
Volkskrankheit mit einer so grossen Zahl von Betroffenen vollkommen
unbefriedigend, nur eine einzige physikalische Methode der Diagnose
zu haben, d. h. auf pathologische, klinisch-chemische oder andersgeartete
apparative Möglichkeiten
ganz verzichten zu müssen.
Auch kann essentieller Bluthochdruck nur rein symptomatisch durch
Ausprobieren verschiedener blutdrucksenkender Wirkstoffe als Monotherapie
oder in Kombinationstherapie behandelt werden ("einstellen"), da die primäre, kausale Ursache jeweils
nicht bekannt ist. Ein grosser Teil der Patienten bleibt aber therapieresistent,
und auch bei erfolgreich behandelten Patienten verschlechtern sich
die Befunde oft wieder mit zunehmendem Alter. Es ist daher einmal
dringend erforderlich, eine Früherkennungsmethode
zu etablieren, die bereits einen entstehenden Hypertonus erkennt,
noch bevor der physikalisch messbare Blutdruck signifikant erhöht ist,
um rechtzeitig anatomische Veränderungen
der Blutgefässe;
die dann irreversibel sind, und weitere Folgeschäden zu verhindern.
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Im
Stand der Technik ist bereits bekannt, dass Mikroarrays zur Untersuchung
der Beteiligung von Genen bei der rheumatoiden Arthritis verwendet werden
können;
Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 2150–2155, 1997. Für diesen
Zweck wurden Sonden für
die Nukleinsäure
der induzierbaren NO-Synthase (INOS) und des Interleukin-6 (Il-6)
auf einem Mikroarray aufgebracht. Dabei sind INOS und Il-6 jeweils
in dem gleichen blutdruckregulierenden System, nämlich im Ca2 +-Haushalt, involviert.
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Die
DNA-Chip-Technologie ist ein sehr effizientes Verfahren, unter anderem
zum Nachweis von DNA-Polymorphismen. Diesen Nachweis mit Hilfe der
DNA-Chip-Technologie nutzt ein bereits bestehendes Verfahren zur
kausalen Diagnose von Bluthockdruck, d. h. es werden Unterschiede
in der DNA-Sequenz von, Genen zwischen verschiedenen. Individuen,
die für
Proteine kodieren, die für
blutdruckregulierende Mechanismen verantwortlich sind, nachgewiesen:
Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass nur wenige Arten
der essentiellen Hypertonie monogenetisch sind, die meisten Fälle werden
auf eine Kombination von Mutationen zurückzuführen sein, von denen jede einzelne
nur wenig prädiktiven
Wert hat. Ein weiterer Nachteil ist, dass sich aus ethischen Gründen die
DNA-Analyse im Hinblick auf die Prädisposition für eine schwere
Erkrankung wie Bluthochdruck nicht durchsetzen lassen wird Dennoch
ist es dringend wünschenswert,
bei jedem Patienten abzuklären,
welcher der vielen möglichen, blutdruckregulierenden
Mechanismen gestört
und damit für
seinen individuellen Hochdruck verantwortlich ist. Erst die kausale
Diagnose der Ursachen, die zum Bluthochdruck eines jeden einzelnen
Patienten führen,
also des Hormonsystems oder zentralnervösen Mechanismus, die im individuellen
Fall entgleist sind, wird eine maßgeschneiderte, auf den jeweiligen Patienten
hin orientierte Therapie ermöglichen.
Auch unerwünschte
Nebenwirkungen einer ungeeigneten Medikation können so weitestgehend vermieden werden.
Damit würden
die Heilungserfolge dieser größten Volkskrankheit
erheblich verbessert und somit Morbidität und Mortalität erheblich
gesenkt werden.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Mittel
zur kausalen Diagnose von Bluthochdruck zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe
der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens
zur Früherkennung von
Bluthochdruck.
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Die
Aufgaben werden durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand
gelöst.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Subklasse" bezeichnet eine
Gruppe von Patienten mit Bluthochdruck, wobei die kausale Ursache
des Bluthochdrucks auf eine Störung
desselben blutdruckregulierenden Systems zurückzuführen ist. Die Patienten einer
Subklasse reagieren daher auf ein blutdrucksenkendes Medikament
gleich.
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Der
hier verwendete Ausdruck "blutdruckregulierende
Systeme" bezeichnet
zentralnervöse
Mechanismen oder hormonelle Systeme, die an der Regulation des Kontraktionszustands
der glatten Muskulatur der Blutgefässe (Gefässweite) oder an der Resorptionsleistung
des Nierenepithels beteiligt sind. Gestörte blutdruckregulierende Systeme
sind solche, die für
einen Bluthochdruck kausal verantwortlich sind.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Bluthochdruck" bezeichnet jede
Art der Hypertonie der Stadien I, II, III und IV. Altersabhängig liegt üblicherweise bereits
eine Hypertonie bei einem systolischen Wert über 140 mm Hg und einem diastolischen
Wert von 90 bis 94 mm Hg vor. Eine Hypertonie liegt üblicherweise
auch bei alleiniger Erhöhung
des diastolischen Werts vor, wobei folgende Einteilungen vorgenommen
werden können:
milde Hypertonie bei 95 bis 104 mm Hg, mittelschwere Hypertonie
bei 105 bis 114 mm Hg, Schwere Hypertonie bei über 115 mm Hg.
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Das
An- und Abschalten von Genen ist Grundlage aller biologischen Prozesse
und ausserdem eine extrem sensitive Antwort auf veränderte äussere Bedingungen.
DNA-Chips werden daher die Biomedizin und Molekularbiologie in den
nächsten Jahren
revolutionieren. Mit der Extraktion der RNA aus einer biologischen
Probe, dem Einwirken von markierter cDNA auf einen DNA-Chip (Hybridisierung)
und seine Analyse ist innerhalb kürzester Zeit eine grosse Fülle von
Informationen über
das Genexpressionsprofil und damit über den Zustand der Zellen
in der biologischen Probe unter veränderten Bedingungen möglich. Die
auf der Hybridisierung von Nukleinsäuren basierende Technologie
hat den Vorteil einer extrem hohen Spezifität, Sensitivität und relativ
leichten Durchführbarkeit,
im Gegensatz z. B. zur Analyse von Proteinmustern.
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Geschieht
das An- und Abschalten von Genen in Blutgefässen oder Nierentubuluszellen
in nichtphysiologischer Weise, so kann es die Ursache des Bluthochdrucks
sein oder kann als messbares Zeichen für die jeweils gestörten blutdruckregulierenden
Mechanismen verwertet werden. Hintergrund dafür ist, dass alle intrazellulären Signalkaskaden, die
an der Regulation des Gefässtonus
oder des Nierenepithel-Transports beteiligt sind, entweder direkt oder
indirekt auch Transkriptionsfaktoren und damit die Aktivität von Genen
beeinflussen. Ist die Expression eines oder mehrerer Gene codierend
für Proteine,
die an diesen blutdruckregulierenden Systemen beteiligt sind, gestört, oder
tragen diese Gene Mutationen, die die Funktion der entsprechenden
Proteine beeinträchtigen,
so wirkt sich dies auf den Blutdruck aus.
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung
eines DNA-Chips zur kausalen Diagnose des Bluthochdrucks, umfassend mindestens
zwei verschiedene Nukleinsäuren,
codierend für
je ein Polypeptid, wobei die Polypeptide in verschiedenen blutdruckregulierenden
Systemen involviert sind, und die Nukleinsäuren als Indikator für mindestens
zwei gestörte
blutdruckregulierende Systeme dienen, und gegebenenfalls ferner
umfassend eine oder mehrere Nukleinsäuren, codierend für Polypeptide,
die in jeder Zelle exprimiert werden und zur Grundausstattung einer
Zelle gehören,
(sogenannte Housekeeping-Gene)
zur Normierung der erhaltenen Signale. Bevorzugt ist ein DNA-Chip,
wobei ein, zwei, drei, vier, fünf,
sechs oder mehr Nukleinsäuren
mindestens zweier blutdruckregulierender Systeme enthalten sind.
Ferner bevorzugt ist ein DNA-Chip mit mindestens je einer Nukleinsäure, codierend
für je ein
Polypeptid, von drei, vier, fünf,
sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn,
sechzehn oder siebzehn blutdruckregulierender Systeme.
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Die
auf dem DNA-Chip verwendeten Nukleinsäuren codieren für Peptide,
die an biochemischen Prozessen beteiligt sind, die insbesondere
in einem oder mehreren der folgenden blutdruckregulierenden Systemen
involviert sind:
- • Das sympathisch-adrenerge
Nervensystem und das adrenerge System des Nebennierenmarks
- • Das
parasympathische Nervensystem
- • Das
Renin-Angiotensin-System
- • Das
Aldosteron-System
- • Das
Hypophysen-Adiuretin (Vasopressin)-System
- • Das
Atriale-Natriuretische-Peptid-System
- • Das
renale Kallikrein-Kinin-System
- • Das
NO (Stickoxid)-System
- • Das
EDHF-System (endothelial derived hyperpolarization factor)
- • Das
Prostaglandin-System
- • Das
Endothelin-System
- • Das
PTHrP-System (parathormon related peptide)
- • Das
Histamin-System
- • Das
Serotonin-System
- • Das
Purinerge System
- • lokale
Wachstumsfaktoren und/oder
- • Der
Calcium-Haushalt der glatten Gefässmuskelzelle
oder des Herzens
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Die
auf dem DNA-Chip verwendete Nukleinsäure kann jede Nukleinsäure sein,
von der bekannt ist, dass sie für
ein Peptid codiert, das in blutdruckregulierende Systeme involviert
ist oder das bei Bluthochdruck vermehrt oder vermindert exprimiert
ist. Für
den erfindungsgemäßen DNA-Chip werden insbesondere
Nukleinsäuren
verwendet, die aus den folgenden Nukleinsäuren ausgewählt sind: glattmuskuläres α-Actin, kardiales α-Actin, skeletales α-Actin, adrenerger
Rezeptor β1,
adrenerger Rezeptor β2, β-adrenerge
Rezeptorkinase II, Adrenomedullin, Aldosteron-Synthase, Ang II-Rezeptor
Typ I (AT 1), Angiotensin converting enzyme (ACE), Arginin Vasopressin
(AVP), Arginin Vasopressin Rezeptor (VI), Atrialer Natriuretischer
Faktor, Brain Natriuretic Peptide, Ca2 +-sarkoplasmatische Retikulum ATPase (SERCA),
Calcium-Release
Channel (Ryanodinrezeptor II), Collagen Typ I, Collagen Typ III,
Collagen Typ IV, Collagen Typ V, Connexin 43 (Cx 43), Cytochrom
P 450 CYP11-B2, Desmin, Endothelin I (ET-I), Endothelin III (ET III), Endothelin
Rezeptor (ETA), Endothelin Rezeptor (ETB), lösliches E-Selectin, Fibroblast growth factor (FGF-II),
Fibronectin, α-Untereinheit
des inhibitorischen G-Proteins
(GI-α),
G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase II (GRK 2), α1-Untereinheit der löslichen
Guanylatcyclase, β1–Untereinheit der
löslichen
Guanylatcyclase, Heat Shock Protein 70 (hsp 70), Induzierbare NO-Synthase
(INOS), Insulin Like Gowth Factor 1 (IGF1), Insulin Like Gowth Factor
1 Rezeptor, Interleukin 6, Interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM-I), Kardiothrophin
1 (CT 1), Laminin, Medium-Chain Acyl-Coenzym A Dehydrogenase (MCAD),
Membrancarrier für
Elektrolyte, Membrancarrier für
Aminosäuren,
Membrancarrier für
Harnstoff, Mitochondriale DNA, Monozyten Chemoattractant Protein
I (MCP I), Schwere α-Kette von Myosin,
Schwere β-Kette
von Myosin, Myosin-leichte Kette 2, Natrium-Kalium (Na+/K+) ATPase
Isoformen I, II und III, Natrium-Protonenaustauscher (NHE-I), Nerve
growth factor (NGF), NO-Synthase (Typ II), NO-Synthase Endotheliale
(ENOS), Ornithindecarboxylase (ODC), Osteopontin, PAI-I, Parathormonähnliches
Protein (PTH related Protein), Phosphodiesterase V, Phospholamban,
Platelet derived growth factor PDGF-A receptor, Platelet derived growth
factor PDGF-A, Platelet derived growth factor PDGF-B receptor, Platelet
derived growth factor PDGF-B, Endothelin I, Procollagen α-1 (I), Procollagen α-1 (III),
Procollagen α-2
(IV), Prostacyclin Synthetase (PGI-II Synthetase), S-100 b-Protein,
Superoxid-Dismutase,
Thrombospondin, Tissue plasminogen activator (tPA), Transforming
growth factor β, Tropoelastin, α-skeletales
Tropomyosin, kardiales Troponin I, skeletales Troponin I, Vascular
Natriuretic Peptide, Vasculäres
Zelladhäsionsmolekül (VCAM-I), Vascular
endothelial growth factor/permeability factor (VEGF), und Voltage-Gated-K+
Channel (KV1.2, KV1.5, KVβ1,
KVβ2, KVβ3).
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Besonders
bevorzugt ist ein erfindungsgemäßer DNA-Chip
mit den nachstehend aufgeführten Nukleinsäuren, wobei
die Nukleinsäuren
Polypeptide codieren, die in den jeweils genannten blutdruckregulierenden
Systemen involviert sind: Aldosteron-Synthase und Cytochrom P 450
CYP11-B2, involviert im Aldosteron-System, Ang II-Rezeptor Typ I (AT
1), Angiotensin converting enzyme (ACE), Interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM-I),
Vasculäres Zelladhäsionsmolekül (VCAM-I),
Vascular endothelial growth factor/permeability factor (VEGF), Monozyten
Chemoattractant Protein I (MCP I), PAI-I, Transforming. growth factor β und Fibroblast
growth factor (FGF-II), involviert im Renin-Angiotensin-System, adrenerger
Rezeptor β1,
adrenerger Rezeptor β2, β-adrenerge
Rezeptorkinase II und G-Protein-gekoppelte Rezeptorkipase II (GRK
2), involviert im Sympathisch/adrenerges System, und Induzierbare NO-Synthase
(INOS), Interleukin 6 und Monozyten Chemoattractant Protein I (MCP-I),
involviert im Ca2+-Haushalt.
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Im
Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet "in blutdruckregulierenden Systemen involvierte Proteine" einerseits, dass
die Polypeptide an biochemischen Prozessen in Blutgefässen, im Herzmuskel oder
im Nierentubulusepithel beteiligt sind, die bei einer Fehlfunktion
zu einem Bluthochdruck führen.
Andererseits sind damit auch solche Proteine gemeint, deren Expression
aufgrund eines Bluthochdrucks herunter- oder hochreguliert wird
(surrogat marker- knapp formuliert – Glückwunsch!). Daher können in Gewebeproben
von Bluthochdruckpatienten (z. B. weisse Blutzellen, blutgefässreiches
Gewebe, Herzmuskelgewebe, Nierengewebe) auch Gene in ihrer Expression
verändert
sein, deren Produkte den Bluthochdruck nicht kausal hervorrufen.
Solche Gene können
ebenfalls indikativ für
die blutdruckregulatorischen Systeme sein, die im jeweiligen Patienten
gestört
sind.
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Die
gegebenenfalls zur Normierung der Signale auf dem erfindungsgemäßen DNA-Chip
verwendeten Nukleinsäuren
können
solche sein, von denen bekannt ist, daß sie in jeder Zelle exprimiert
werden und zur Grundausstattung der Zellen gehören. Üblicherweise werde die Gene,
die für
diese Nukleinsäuren
kodieren, auch als Housekeeping-Gene bezeichnet. Eine beispielhafte
Auswahl für
solche Nukleinsäuren
ist nachfolgend wiedergegeben: zelluläres β-Actin, Cyclophilin, Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase
(GAPDH), Glycero-3-phosphatdehydrogenase
(GPDH), Histone, Phospholipase, Ribosomale Proteine, Tubulin, Ubiquitin.
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Die
Nukleinsäuresequenzen
der auf dem DNA-Chip verwendeten Nukleinsäuren können aus den allgemein zugänglichen
Datenbanken (z. B. GeneBank, EMBL) entnommen und nach den üblichen Kriterien
ausgesucht werden. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, die einmalig
(unique) sind, keine GC-reichen Regionen aufweisen, keine intramolekulare
Hybridisierung erlauben und keine Loops bilden. Vorzugsweise wird
eine einzelsträngige
Nukleinsäure
auf den erfindungsgemäßen DNA-Chip
aufgebracht. Dabei kann sowohl der Sense- als auch der Antisense-Strang
verwendet werden. Es kann aber auch eine doppelsträngige Nukleinsäure auf
den erfindungsgemäßen DNA-Chip
aufgebracht werden. Die Länge
der Nukleinsäuren
ist dabei nach oben oder unten nicht begrenzt, solange die Länge für eine spezifische
Hybridisierung ausreicht. Die Nukleinsäuren können ferner DNA-, RNA- oder
Hybrid-Moleküle
sein. Die Herstellung solcher Nukleinsäuren ist Stand der Technik
und es können
als Oligonukleotide, PCR-Produkte, klonierte DNA- oder cDNA-Fragmente
oder cRNAs nach in-vitro Transkription (natürlich oder modifiziert) mit
Standard-Techniken auf einen Träger
aufgebracht und immobilisiert werden. Bei einzelsträngigen Nukleinsäuren wird
vorzugsweise die zur cDNA komplementäre Sequenz (bei Verwendung
von cDNA aus der biologischen Probe) oder die zur RNA komplementäre Sequenz
(bei Verwendung von RNA aus der biologischen Probe) aufgetragen.
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Der
Träger,
auf den die Nukleinsäuren
aufgetragen. werden, kann jeder Träger sein, der üblicherweise
für DNA-Arrays
oder DNA-Chips verwendet wird. Die Verfahren zum Auftragen und Immobilisieren
der Nukleinsäuren
sind ebenfalls Stand der Technik und dem Fachmann bekannt.
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Der
erfindungsgemäße DNA-Chip
kann z. B. zur sensitiven Früherkennung
eines sich entwickelnden Hypertonus verwendet werden, noch bevor
sich klinisch ein Bluthochdruck manifestiert. Der DNA-Chip kann
ferner zur Einteilung der Patienten in Subgruppen verwendet werden.
Anhand der auf dem DNA-Chip vorhandenen Gene lassen sich die blutdruckregulatorischen
Systeme nachweisen, die bei den jeweiligen Bluthochdruckpatienten
gestört
sind. Die Patienten-Subgruppen können
dann mit individuell geeigneten Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen
therapiert werden, die nicht nur das Symptom Bluthochdrucks beseitigt,
sondern auch der kausalen Verursachung des Bluthochdrucks entgegenwirkt. Ferner
kann der erfindungsgemäße DNA-Chip
zur Entwicklung neuer blutdrucksenkender Pharmaka oder zur Stratifizierung
von Patienten in frühen
Phasen der klinischen Prüfung
solcher neuen Pharmaka eingesetzt werden. Ein Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft daher die Verwendung des erfindungsgemäßen DNA-Chips
zur Diagnose von Bluthochdruck, auch zur Frühdiagnose, zur Einteilung von
Bluthochdruckpatienten in Subgruppen mit unterschiedlichen Bluthochdruckauslösenden Ursachen
und zur Überwachung
der Therapie von Bluthochdruck.
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Dazu
wird den zu untersuchenden Patienten Blut oder Gewebeproben entnommen.
Aus diesen Patienten-Proben kann RNA mit Standardtechniken isoliert
und entweder als qGesamt-RNA oder nach Fraktionierung als PolyA+-RNA weiterverwendet werden. Die RNA kann
mit Hilfe von reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben und dabei
mit einer Markierung, z. B. mit einer fluoreszierenden Gruppe oder
einem Isotop etc., versehen werden. Ferner kann die RNA direkt markiert
oder unmarkiert zur Hybridisierung auf dem DNA-Chip eingesetzt werden. Nach
Hybridisierung der Probe-Nukleinsäuren mit den Ziel-Nukleinsäuren auf
dem Träger,
nachfolgenden Waschschritten etc, wird die Bindung von Proben-Nukleinsäuren mit
den auf dem Träger
befindlichen Ziel-Nukleinsäuren
analysiert. Dies kann durch optische Verfahren im Falle einer Fluoreszenzmarkierung,
durch Autoradiographie oder durch jedes andere Verfahren erfolgen,
das in der Lage ist, eine erfolgreiche Hybridisierung von Proben-Nukleinsäuren mit
Ziel-Nukleinsäuren
zu erkennen.
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Das
den Patienten entnommene Gewebe kann als Biopsie, z. B. aus dem
blutgemssreichen Mund-Nasenbereich
oder aus jedem anderen blutgefässreichen,
aber relativ risikoarm zu entnehmenden Gewebe, oder aus dem Herzmuskel,
z. B. im Rahmen einer Herz-Katheterisierung zur Bestimmung der Kontraktilität und Herzleistung,
entnommen werden. Ferner können
dem Patienten Lymphozyten (weisse Blutzellen) aus dem Blut entnommen
werden.
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Erfindungsgemäß lassen
sich die Patienten anhand ihres Genexpressionsprofils (Genaktivität: ON-OFF;
hoch-niedrig) in Subgruppen einteilen, d. h. in Subgruppen in denen
ein oder mehrere der vorstehend beschriebenen hormonellen oder zentralnervösen Signalwege
(blutdruckregulierenden Systeme) gestört sind.
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Beispielsweise
sind in Bluthochdrück-Patienten
mit Hyperaldosteronismus (Aldosteron-System) die Gene für Aldosteron-Synthase
und für
Cytochrom P 450 CYP11-B2 in weissen Blutzellen aktiviert. Diese
Patienten sollten mit einem Aldosteron-Antagonisten, z. B. mit Spirolacton,
behandelt werden.
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Beispielsweise
sind in Bluthochdruck-Patienten mit erhöhtem zirkulierenden Angiotensin
II (erhöhte
Plasma-Renin-Aktivität;
Renin-Angiotensin-System) einerseits die Expression des Angiotensin
II Rezeptors (Typ 1, AT1) in weissen Blutzellen, andererseits die
Expression des Angiotensin Converting Enzyme, des Interzellulären Adhäsionsmolekül (ICAM-I),
des Vaskulären
Adhäsionsmoleküls (VCAM-I),
des Vascular endothelial growth factor/permeability factor (VEGF),
des Monozyten Chemoattractant Proteins (MCP I), des PAI-1, des Transforming
growth factor β und
des Fibroblast growth factor (FGF-II) in Blutgefässen oder die Expression des
Brain Natriuretic Peptide (BNP) im Herzmuskel erhöht. Diese
Patienten sollten mit einem Angiotensin II – Rezeptor-Antagonisten, z.
B. mit Irbesartan, oder einem angiotensin converting enzyme (ACE)-Hemmer,
z. B. mit Enalapril oder Captopril, behandelt werden.
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Beispielsweise
sind in Bluthochdruck-Patienten mit stimuliertem sympathisch-adrenergen
System (sympathisch-adrenerges Nervensystem und das adrenerge System
des Nebennierenmarks) einerseits die Expression der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase
II in weissen Blutzellen, andererseits die Expression der adrenergen
Rezeptoren (β1
und β2)
und der ββ-adrenergen
Rezeptor-Kinase in Blutgefassen oder die Expression der Omithindecarboxylase
(ODC) im Herzmuskel erhöht.
Diese Patienten sollten mit einem β-adrenergen Rezeptor-Blocker, z. B. mit
Atenolol oder Bisoprolol, behandelt werden.
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Beispielsweise
sind in Bluthochdruck-Patienten mit gestörtem Ca++-Haushalt
der Gefässmuskelzellen
(Calcium-Haushalt der glatten Gefässmuske1ze11e oder des Herzens)
die Expression von Interleukin 6 in Blutgefassen erniedrigt. Diese
Patienten sollten mit einem Ca++-Kanal-Blocker, z. B.
mit Verapamil, Nifedipine oder Amlodipine behandelt werden.
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Beispielsweise
sind in Bluthochdruck-Patienten mit gestörtem NO-System die Expression
in Blutgefässen
einerseits der endothelialen NO-synthase (eNOS) erniedrigt, andererseits
des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE) oder des Kollagen Typ I
erhöht.
Diese Patienten sollten mit NO-Donatoren, z. B. mit Nitraten behandelt
werden.
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Die
folgenden Figuren und Beispiele dienen nur der Erläuterung
und beschränken
in keiner Weise den Umfang der Erfindung.
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Entnahme einer Submucosa-Biopsie aus dem
Mund oder der unteren Nasenmuschel (extrem blutgefässreiches
Gewebe), aus dem Herzen oder Gewinnung von weissen Blutzellen
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Sowohl
die Unterlippe als auch die untere Nasenmuschel sind zur Biopsieentnahme
geeignet, da. sie gut zugänglich
sind, zur Anästhesie
das Aufsprühen
eines Lokalanästhetikums
ausreicht, das Gewebe sehr reich an Arteriolen und Venolen ist, aber
keine größeren Gefäße oder
Nerven aufweist und die Entnahmedefekte nicht sichtbar sind und schnell
heilen.
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1. Unterlippe
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Bei
8 Patienten wurde nach Applikation von 1%igem Xylocainspray mit
Epinephrinzusatz (Xylocain1%®, Astra Chemie) die Unterlippe
eleviert und in Höhe
der Gingiva mit einem Skalpell Größe 15 ein 2–4 mm langer oberflächlicher
Schleimhautschnitt angelegt. Mit dem schneidenden Zängchen nach
Grünwald
(Storz) wurde durch den Schnitt submucös jeweils ein Gewebefragment
von ca. 250 mg Gewicht entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
In der Regel war eine weitere Versorgung des Entnahmedefektes nicht
erforderlich, eine Reepithelisierung war nach 2 bis 3 Tagen abgeschlossen.
Vereinzelt kam es perioperativ zu einer stärkeren Blutung, so daß der Defekt
mit einer Einzelknopfnaht mit resorbierbarem Nahtmaterial (Vicryl 3/0,
Ethicon) verschlossen wurde.
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2. Untere Nasenmuschel
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Bei
10 Patienten erfolgte zunächst
Einsprühen
der Nasenschleimhäute
mit Pantocain/Privin (1/1, Pantoprivin2%®, Astra
Chemie). Nach erfolgter Oberflächenanästhesie
erfolgte mit dem schneidenden Zängchen
nach Grünwald
(Storz) jeweils die Entnahme eines ca. 250 mg messenden Gewebsfragments
submucös
vom lateralen Anteil des Kopfes der Concha inferior. Das Gewebe
wurde sofort in flüssigem
Stickstoff schockgefroren. Bei stärkerer Blutung erfolgte bipolare
Koagulation. Eine Gewebsnaht war nicht erforderlich. Der Defekt
heilte in 3–4
Tagen ab.
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3. Herzmuskelbiopsie
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Bei
drei Patienten wurde im Rahmen einer Links-Herz-Kathetensierung
zur Diagnose der linksventrikulären
Funktion eine Biopsie von ca. 500 mg aus der freien Kammerwand mit
einer Stanze entnommen. Das Gewebe wurde sofort in flüssigem Stickstoff
schockgefroren.
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4. Weisse Blutzellen:
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Bei
15 Patienten wurden 100 ml Blut entnommen und auf konventionelle
Weise in Erythrozyten, Thrombozyten und Lymphozyten subfraktioniert (Lymphoprep,
Nycomed, Pharma AS oder "durch Dichtegradientenzentrifugation
auf einem Ficoll/Metrizoat-Gradienten"). Die Lymphozytenfraktion wurde sofort
weiterverarbeitet.
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5. RNA-Gewinnung:
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Aus
den Gewebeproben bzw. den weissen Blutzellen wurde mit verschiedenen
Extraktionsverfahren mit Hilfe kommerziell erhältlicher "kits" die
Gesamt-RNA gewonnen. Die Ausbeute betrug etwa 0.5 mg RNA pro g Herzmuskel;
0.1 mg RNA pro g Submukosa-Gewebe und etwa 0.1 mg RNA pro Lymphozyten-Präparation.
Die RNA wurde mit konventionellen Methoden (Blots, Hybridisierung
mit radioaktiv oder nicht-radioaktiv markierten Sonden) hinsichtlich der
Expression der involvierten Gene untersucht.