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Die
Erfindung betrifft einen Bausatz aus einer Vielzahl von Elementen,
die sich gestapelt zu einem Reaktor zusammensetzen lassen sowie
einen zugehörigen Reaktor. Die Reaktoren lassen sich in funktioneller
Reihenfolge und Volumen anpassbar zusammensetzen. Durch fluidische
Querverbindungen lassen sich mehrere einzelne Reaktoren untereinander
zu einem Reaktorsystem höherer Ordnung verbinden.
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Derartige
Reaktoren und Reaktorsysteme höherer Ordnung können
für biologische, biochemische, chemische und physikalische
Prozesse sowie als elektrochemische Testzellen mit kontrollier-
und steuerbaren Prozessparametern eingesetzt werden. Der modulare
Aufbau erlaubt eine flexible Anpassung an das durchzuführende
Experiment. Insbesondere für die parallelisierbare Verfahrensentwicklung und
die kostengünstige Erprobung von Bioprozessen finden Miniatur-Bioreaktoren
weit verbreitet Anwendung, wie dies beispielsweise aus dem Artikel
J. I. Betts et al., Microb. Cell Fact., 2006, vol. 5, hervorgeht.
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In
EP 0 688 242 B1 wird
ein modular aufgebautes chemisches Mikroreaktorsystem höherer Ordnung
beschrieben, das aus einzelnen Scheiben zusammengefügt
wird. Ein durchgehender Kanal, der zwischen benachbarten Plättchen
genau orientiert ist, ermöglicht den fluidischen Transport.
Entsprechend sind Räume zwischen benachbarten Platten geschaffen,
um fluidische und reaktionstechnische Grundoperationen durchzuführen.
Aufgabe dieses bekannten Mikroreaktors ist es, diese integrierten
Grundoperationen, wie Mischen, Analyse, Separation und Reaktionsführung
als Prozesskette vollständig in einem zusammengefügten
Reaktorsystem umzusetzen. Die einzelnen Elemente sind in dem Sinne
kombinierbar, dass sich eine fluidische Verbindung zwischen den
einzelnen Scheiben realisieren lässt. Die einzelnen Reaktorkammern
sind durch die Auslegung der einzelnen Scheiben bereits bei der Herstellung
der Scheiben vordefiniert. Sie können beim späteren
Zusammenbau weder in ihrer Funktion noch in ihrer Größe
variiert werden.
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In
der
US 5 580 523 wird
ein Reaktorsystem beschrieben, das aus einzelnen Reaktoren mit Analyse-,
Separations- und Reaktionskammern besteht, die auf einer fluidischen
Montageplatte zu einem Durchflussreaktorsystem zusammengesetzt sind. Das
System wird in dieser Druckschrift als modularer Bausatz für
chemische Reaktionen bezeichnet. Unter einem modularem Bausatz wird
dabei verstanden, dass verschiedene Reaktoren auf einer Monta geplatte
nach Belieben zusammengeschlossen werden können, wobei über
den Aufbau der einzelnen Reaktoren keine Aussage getroffen wird.
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In
der
DE 198 28 995
A1 wird ein Mikroreaktionssystem höherer Ordnung
mit einem Mechanismus zur Aufnahme und Abgabe von Flüssigkeiten beschrieben. Ähnlich
wie bei der Anordnung gemäß der
US 5 580 523 basiert der Systemverbund
auf einer Art fluidischen Montageplatte, die benachbarte Mikroreaktoren
verknüpft. Das beschriebene Verfahren ermöglicht
einen Fluid-Austausch mit der Montageplatte durch eine äußere
Kraft wie einen Druckluftstoß oder eine lokale Wärmezufuhr.
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In
der
DE 199 17 330
B4 wird ein Verbindungssystem beschrieben, welches einzelne
Reaktoren für die Durchführung chemischer und/oder
biochemischer Reaktoren formschlüssig zu einem Mikroreaktorsystem
höherer Ordnung zusammengefügt. Hier erfolgt die
Verbindung nicht über eine fluidische Montageplatte, sondern über
einen durch die Seitenwände der einzelnen Reaktionskammern
verlaufenden Verbindungskanal.
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Die
bekannten Reaktoren weisen aber insbesondere für den Einsatz
in Forschung und Entwicklung den Nachteil auf, dass sie zu wenig
flexibel erweiterbar und zu teuer sind.
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Die
Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht
darin, einen Weg aufzuzeigen, wie Reaktoren wesentlich flexibler,
kostengünstiger und anwenderfreundlicher herstellbar sind.
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Diese
Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Patentansprüche
gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der vorliegenden Erfindung sind
Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Bekannte
Systeme sind so konzipiert, dass aus einzelnen Reaktoren zusammengesetzt
Reaktormodule gebildet werden. Demgegenüber basiert die
vorliegende Erfindung auf der Idee, die Grundeinheit „Reaktor” in
weitere Untereinheiten zu unterteilen: Reaktoren werden erfindungsgemäß aus
einer Vielzahl von stapelbaren Elementen zusammengesetzt, die sowohl
in ihrer Gestalt und hinsichtlich ihres Materials wie auch in ihrer
Anzahl weitgehend beliebig kombinierbar sind.
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Grundgedanke
der vorliegenden Erfindung ist es daher, Elemente bereitzustellen,
die in variabler Reihenfolge aufeinandergestapelt einen Reaktor
mit Reaktionskammer und integrierten Begasungs- und Zugangskanälen
ergeben. Der Reaktor kann in Volumen und Funk tionalität
an die experimentellen Anforderungen anpassbar sein und mit weiteren
Reaktoren zu einem Reaktorsystem höherer Ordnung zusammengeschlossen
werden. Der Reaktor kann nach Gebrauch wieder in die einzelnen Elemente zerlegt
werden, wobei diese Elemente mehrfach verwertbar sein können.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
sind die Elemente mit einer Aussparung, die z. B. einen rechteckförmigen,
insbesondere einen abgerundeten quadratischen Querschnitt hat, und
Bohrungen versehen. Aufeinandergestapelt bilden die quadratischen
Aussparungen der Einzelelemente eine Reaktorkammer aus. Selbstverständlich
können für die Reaktorkammer auch beliebige andere
Querschnittsformen (länglich, elliptisch, kreisförmig
etc.) vorgesehen sein. Die Bohrungen befinden sich seitlich der
Aussparung für die Reaktorkammer und bilden ein vertikales
Kanalsystem, d. h. ein Kanalsystem, dessen Richtung mit der Richtung übereinstimmt,
in welcher die einzelnen Elemente aufeinander gestapelt werden.
Durch Vertiefungen und/oder Aussparungen in einzelnen Elementen
werden Verbindungen zwischen den Kanälen und der Reaktorkammer
geschaffen.
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In
einer vorteilhaften Ausgestaltung wird ein zusammenhängender
dichter Reaktor dadurch erhalten, dass die einzelnen Elemente mittels
Schrauben zusammengespannt werden. Dies stellt eine sehr einfache,
kostengünstige und jederzeit leicht demontierbare Variante
dar.
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Weiterhin
kann die Dichtigkeit des Reaktorgefäßes durch
die abwechselnde Verwendung eines harten Materials und eines weicheren
Dichtungsmaterials erhöht werden.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
mit nach außen reichenden Durchgangslöchern wird
eine fluidische Verbindung und Verknüpfung des Reaktors,
beispielsweise durch eine Verschraubung, mit benachbarten Reaktoren
zu einem Reaktorsystem höherer Ordnung ermöglicht.
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Zur
Separation der Reaktormedien bei gleichzeitiger ionischer Verbindung
zweier benachbarter Reaktoren kann eine Ionenaustauschmembran zwischen
den Reaktoren angebracht werden.
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Die
Integration von Sensorik, insbesondere optischer Sensorik, hat sich
als besonders zweckmäßig für die Prozesskontrolle
erwiesen. Hierfür wird in vorteilhafter Weise eine transparentes
Bodenelement vorgesehen.
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In
einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform für
(bio-)elektrochemische Messungen werden zwei über Ionenaustauschmembranen
verbundene Elektroden-Kompartimente zur jeweils anderen Seite über
eine weitere Ionenaustauschmembranen mit Referenzelektroden verbunden.
Die Messung der Elektroden-Potentiale gegen die jeweils benachbarte Referenzelektrode
erlaubt eine vom Membranwiderstand unabhängige Bestimmung
der Zellspannung.
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Anhand
der in den beiliegenden Zeichnungen dargestellten Ausgestaltungen
wird die Erfindung im Folgenden näher erläutert. Ähnliche
oder korrespondierende Einzelheiten sind in den Figuren mit denselben
Bezugszeichen versehen. Es zeigen:
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1 eine
perspektivische Ansicht eines Grundelements ohne spezielle zusätzliche
Funktion;
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2 eine
perspektivische Ansicht eines Düsen-Elements;
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3 eine
perspektivische Ansicht eines Verbindungselements;
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4 eine
perspektivische Ansicht eines Dichtungselements;
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5 eine
perspektivische Ansicht eines Bodenelements;
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6 eine
perspektivische Ansicht eines Deckelelements für den Fall
eines Reaktors ohne separat abnehmbaren Deckel;
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7 eine
perspektivische Ansicht eines zusammengesetzten Reaktors;
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8 eine
Darstellung eines Messaufbaus für elektrochemische Experimente
mit Referenzelektroden;
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9 eine
graphische Darstellung des Sauerstoffeintrags (kLa-Wert)
als Funktion der Strömungsgeschwindigkeit;
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10 das
Mischverhalten des Bioreaktors bei eingeschalteter Begasung mit
Luft (11 ml min–1) im Vergleich
zu einem nicht begasten Reaktor;
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11 die
Entwicklung der Biomassenkonzentration, der Sauerstoff-Sättigung
und des pH-Wertes während der Fermentation von E. coli;
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12 einen
Vergleich von kohlenstoffbasierten Elektrodenmaterialien als Kathode
mit adsorbierter Laccase als enzymatischem Katalysator;
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13 das
Verhalten einer mikrobiellen Anode bei Zugabe einer lebenden (Vierecke)
oder abgetöteten (Dreiecke) Wildtyp-Kultur von S. oneidensis
als Katalysator unter Last.
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Im
Folgenden werden unter Bezugnahme auf die Figuren vorteilhafte Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung beschrieben.
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1 zeigt
ein Grundelement 102, das durch seine rechteckförmige
Aussparung 104 einen Reaktorraum ohne zusätzliche
spezielle Funktion definiert. Die beiden Bohrungen 105 bilden
mit ihren oberen und unteren Nachbarn Kanalverbindungen für
Begasung und/oder Medienzugang oder Medienaustausch. Die äußeren
vier Bohrlöcher 106 erlauben eine Verschraubung
der einzelnen Elemente. Die zentrale rechteckförmige, hier
abgerundete, Aussparung 104 bildet mit seinen oberen und
unteren Nachbarn die Reaktorkammer aus.
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2 zeigt
ein Düsen-Element 108. Bohrungen in darüber
oder darunter liegenden Elementen bilden einen Kanal aus, der bei
der Düse 110 sein Ende findet. Über die
Düse gelangen Gasblasen in den Reaktor. Diese können
sowohl der Begasung als auch der Durchmischung des Reaktormediums
dienen.
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3 zeigt
ein Verbindungselement 112. Vom zentralen Reaktorbereich 111 führt
eine quer zu der Stapelrichtung verlaufende Bohrung 113,
welche einen Kanal bildet, durch die Seitenwand des Elementes hindurch
und kann über Verschraubungen, die durch seitliche Bohrungen 115 verlaufen,
verspannt mit benachbarten Elementen verbunden werden.
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4 zeigt
ein Dichtungselement 114, das eine fluidisch abgedichtete
Verbindung mit benachbarten Reaktoren ermöglicht. In der
Mitte befindet sich der fluidische Durchgang, außen befinden
sich Durchgänge für die Schraubverspannung.
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5 zeigt
eine erste Ausführungsform eines Bodenelements 116. Über
dem Quadrat in der Mitte befindet sich die Reaktorkammer. Optische Sensorspots 120 erlauben
eine Messung von pH-Wert und Sauerstoffkonzentration. Selbstverständlich
können aber auch jegliche andere Sensortechnologien, beispielsweise
auf holographischer, amperometrischer oder potentiometrischer Basis, eingebaut
werden. Wird der Reaktor ohne separat abnehm baren Boden realisiert,
so befinden sich Gewinde in den vier äußeren Bohrungen,
um die Verschraubung zu sichern.
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6 zeigt
ein Deckelelement 118 für den Fall eines Reaktors
ohne separat abnehmbaren Deckel. Die äußeren vier
Löcher 106 sind als Durchgang für die
Schraubverspannung vorgesehen. Die anderen Bohrungen 107 sind
als Gewinde ausgeführt und ermöglichen beispielsweise über
Luer-Lock-Verbinder einen flexiblen Anschluss von Begasung, Sterilfiltern
oder eines Septumsverschlusses für sterile Probennahme.
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7 zeigt
einen zusammengesetzten Reaktor 100 bestehend aus den zuvor
beschriebenen Elementen. Bodenelement 116 und Deckelelement 118 sind
im Unterschied zu den Ausführungsformen aus 5 bzw. 6 so
ausgestaltet, dass durch eine zusätzliche Schraubverbindung,
Boden und Deckel separat vom Rumpf des Reaktors abnehmbar sind.
Ein abwechselndes Stapeln von harten Elementen aus Polycarbonat
und dünneren Dichtungselementen aus Silikon oder Viton® erlauben den Aufbau eines fluidisch
dichten Reaktors.
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Insbesondere
kann für die nichtelastischen Elemente Polycarbonat (Makrolon®) in verschiedenen Dicken (z. B.
3 mm, 5 mm, 12 mm) verwendet werden und mittels an sich bekannter
Bearbeitungstechniken wie z. B. Wasserstrahlschneiden, Fräsen und
Bohren, strukturiert werden. Für die elastischen Dichtelemente
kann z. B. Silikonfolie mit einer Dicke von 2 mm oder Viton®-Folie mit einer Dicke von 1 mm verwendet
werden, die mit Hilfe von Laserschneiden oder Wasserstrahlschneiden
strukturiert wird. Selbstverständlich kann auch mittels
abgeschiedener Schichten auf den nichtelastischen Elementen oder hochpräzise
bearbeiteter Metalloberflächen die erforderliche Fluiddichtigkeit
erreicht werden. Auch nicht spanende Verfahren wie z. B. Spritzguss
können zur Herstellung der einzelnen Elemente vorteilhaft
eingesetzt werden.
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Mit
Bezug auf die 7 bis 13 soll
nachfolgend anhand eines Prototypen eine spezielle Ausführungsform
eines Reaktorsystems 200 beschrieben werden, deren Reaktoren 100 nach
dem erfindungsgemäßen Baukastenprinzip hergestellt
wurden.
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Reproduzierbare
Untersuchungen an Bio-Mikrosystemen erfordern einen sehr flexiblen und
vollständig charakterisierten experimentellen Aufbau, der
in seinen Eigenschaften einem Bioreaktor entspricht. Zu diesem Zweck
wurde gemäß der vorliegenden Erfindung ein Miniatur-Bioreaktor
entwickelt, der aus Bausatz-Elementen zusammengesetzt wird. Der
modu lare Aufbau ermöglicht eine Anpassung in Volumen und
verfügbaren Schnittstellen für Begasung, Medienwechsel,
Sensorik und Probenahme. Ferner können mehrere einzelne
Bioreaktoren zusammengeschlossen betrieben oder für elektrochemische
Messungen über Membranen gekoppelt werden.
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Die
Charakterisierung des Reaktors ergibt kLa-Werte
und Mischzeiten, die im üblichen Bereich für nicht-modulare
Blasensäulenreaktoren liegen. Die vielseitige Anwendbarkeit
des neuen Systems wurde anhand der Wachstumskurve einer Escherichia
coli Kultur sowie durch elektrochemische Untersuchungen an einer
enzymatischen Kathode und einer mikrobiellen Anode für
Bio-Brennstoffzellen demonstriert.
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Parallelisierbare
Verfahrensentwicklung und kostengünstige Erprobung von
Bioprozessen haben Miniatur-Bioreaktoren in der Biotechnologie unerlässlich
gemacht. Einzelne Herstellungsschritte für pharmazeutische,
kosmetische oder andere Fermentationsprodukte werden in Reaktoren
mit kleinen Volumina optimiert und anschliessend auf große
Produktionsreaktoren übertragen.
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Im
Allgemeinen werden Bioreaktoren nach ihrem Misch-Mechanismus in
Rührkessel-, Schüttel- und Blasensäulen-Reaktoren
unterteilt. In Blasensäulen-Reaktoren steigen Blasen vom
Reaktorboden aus auf und versorgen somit das System mit Sauerstoff
und bewegen gleichzeitig das Medium. Vorteile von Blasensäulenreaktoren
sind ihre geringe Reparaturanfälligkeit, Langlebigkeit
und geringen Betriebskosten, da sie ohne bewegliche mechanische Teile
auskommen.
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Herkömmliche
Bioreaktoren werden in der Regel als Glaskörper mit festen
Anschlüssen gefertigt. Sie sind hinsichtlich Sauerstofftransfer
und Mischverhalten optimiert, lassen sich aber nur schwer an spezifische
experimentelle Bedürfnisse anpassen. In grundlegenderen
Forschungs- und Entwicklungsfragen von Bio-Mikrosystemen, in denen Flexibilität
gefragt ist, werden daher häufig provisorisch ausgelegte
Aufbauten verwendet. Bei Untersuchungen an Bio-Brennstoffzellen
kann dies dazu führen, dass durch einen zu geringen Sauerstoffeintrag oder
zu hohen Membranwiderstand die erzielbaren Leistungsdichten künstlich
limitiert werden.
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Im
Folgenden wird die Realisierung eines Blasensäulen-Reaktors
aus den erfindungsgemäßen Bausatz-Elementen erläutert
und hinsichtlich Sauerstoff-Transfer und Mischzeit charakterisiert.
Neben einer beispielhaften Fermentation mit E. coli wird die spezielle Eignung
des Bioreaktorsystems für elektrochemische Experimente
anhand zweier Untersuchungen an Bio-Brennstoffzellen demonstriert.
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Polycarbonat-Elemente
aus Makrolon® der Dicke 5 mm sowie
Dichtungselemente (1 bzw. 2 mm Dicke) aus Viton-(Lézaud & Co Marpingen)
und Silikonfolie wurden mittels Wasserstrahl geschnitten. 12 mm
dicke Polycarbonat-Elemente wurden gefräst. Silikon-Schläuche
sowie Luer-Lock Verbindungen wurden von Novodirekt (Kehl) geliefert.
In den Experimenten kamen zwei Sterilfiltersysteme mit jeweils 0,2 μm
Poren zum Einsatz: Puradisc (Whatman, Dassel) und Midisart 2000
(Sartorius, Göttingen). Sauerstoffkonzentrationen und pH-Werte
wurden mit den Sensorspot-Systemen Oxy-4 mini und pH-1 mini von PreSens – Precision
Sensing GmbH (Regensburg) ausgelesen. Ein InoLab® 720
Mess-System von WTW (Weilheim) wurde zur elektrochemischen pH-Wert
Bestimmung verwendet. Gas-Proportionierer von ANALYT-MTC (Müllheim)
wurden zur Einstellung der Sauerstoff-Konzentration eingesetzt.
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Die
Sauerstoff-Transfer-Rate (kLa) wurde mittels
der Dynamischen Sauerstoff Methode bestimmt. Hierzu wurde ein einzelner
Reaktor mit Stickstoff gespült, bis sich eine Sauerstoffsättigung
unter 0,1% einstellte. Anschließend wurde der Reaktor mit reinem
Sauerstoff begast. Die Gasflussrate wurde über einen Gasproportionierer
kontrolliert. Aus dem resultierenden exponentiellen Anstieg zwischen
20% und 80% Sauerstoffsättigung wurden kLa-Werte
errechnet.
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Für
die Wachstumskurve mit E. coli wurden 7 ml LB-Medium (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen) mit 50 μg/ml Ampicillin (Roche, Mannheim)
und 0,2 ml einer Übernachtkultur von E. coli JM109 mit
Kontrollvektor pGEM-3Z (beides Promega, Mannheim) angeimpft und
bei 37°C unter Begasung mit Luft kultiviert. Stichproben
von 0,15 ml wurden in „UV-Küvetten mikro” (Brand,
Wertheim) hinsichtlich ihrer optische Dichte bei 650 nm (UV300,
Unicam Instruments, Cambridge, UK) untersucht. Die Messwerte wurden
mittels der im Anschluss bestimmten Biotrockenmasse in Biomassekonzentrationen
umgerechnet.
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Für
enzymatische Kathoden wurden 20 U Laccase von Trametes versicolor
in 100 mM Citratpuffer (beides Sigma-Aldrich, Taufkirchen) bei pH
= 5 und Raumtemperatur verwendet und mit Luft begast. Die Kompartimente
wurden durch Membranen aus Fumapem F-950® (FuMA-rech,
St. Ingbert) getrennt. Elektroden aus Graphitvlies (Alfa Aesar,
Karlsruhe), HOPG (highly ordered pyrolytic graphite, SPI supplies,
West Chester, PA, USA) und Stücken von porösen
Kohlenstoffröhren (Novasep, Epone, Frankreich) wurden zur
elektri schen Kontaktierung mit Leit-C (Piano, Wetzlar) an Platindraht
(Chempur, Karlsruhe) geklebt.
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Für
mikrobielle Anoden wurde Shewanella oneidensis anaerob in Minimalmedium
mit 50 mM Natrium-Lactat und 100 mM Fumarat angezogen. Diese Kultur
(OD600: 0,3) wurde in Mineralmedium ohne
Lactat und Fumarat gewaschen, in den Bioreaktor überführt
und bei Raumtemperatur unter Begasung mit Stickstoff inkubiert.
Die Kompartimente waren durch Nafionmembranen (Quintech, Göppingen) getrennt,
die elektrische Kontaktierung der Graphitvlies-Elektroden erfolgte
wie für enzymatische Elektroden beschrieben. Um den Versuch
zu starten, wurde Natrium-Lactat (50 mM) zugegeben.
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Galvanostatische
Lastkurven wurden durch Messung der Elektrodenpotentiale gegen Referenzelektroden
(SCE, KE 11, Sensortechnik Meinsberg GmbH, Ziegra-Knobelsdorf) unter
stufenweise erhöhter galvanostatischer Last bestimmt. Im
Falle enzymatischer Kathoden wurde die Last jede Stunde um 5 μA
heraufgesetzt und der letzte Wert in die Lastkurve eingetragen.
Während der Untersuchung der mikrobiellen Anoden wurde
mit Datennahme und Lastwechsel gewartet bis das Elektrodenpotential
um weniger als 4 mV/Std schwankte. Die Einstellung der galvanostatischen
Lasten erfolgte über einem Stimulus-Generator (STG2008,
Multichannel Systems, Reutlingen). Für die Datennahme wurde
ein Keithley 2700 Datennahme-System (Keithley, Gemering) verwendet.
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Die
Reaktorkammern des Miniatur-Bioreaktors werden wie in 7 gezeigt
aus abwechselnd aufeinandergestapelten Polycarbonat-Elementen und
Silikon-Dichtungen gebildet. Bohrungen in den aufeinanderliegenden
Elementen bilden die für Begasung und Mediumszugang notwendigen
Kanäle. Funktionen wie Düsen oder Mediumszugang
sind als Strukturen in die Dichtungs-Elemente eingearbeitet. Die
notwendige Durchmischung des Mediums wird, wie bei Blasensäulen-Reaktoren üblich,
durch aufsteigende Blasen bewirkt.
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Wie
aus 7 erkennbar, weist der Miniatur-Bioreaktor einen
Begasungskanal, eine Düse, einen Medienzugang, einen Medien-Port
und einen Verbindungskanal zu benachbarten Zellen auf. Deckel- und
Bodenplatte sind für eine vereinfachte Handhabung separat
verschraubt. 8 zeigt den Aufbau für
elektrochemische Experimente mit zwei Referenzelektroden 124.
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Am
Deckel stehen Luer-Lock Verbindungen für Medienwechsel,
Gaszufuhr und -abfuhr sowie für einen Septumsanschluss
zur sterilen Probennahme zur Verfügung. Auf der Bodenplatte
befinden sich optische Sensorspots, die eine kontinuierliche Aufzeichnung
von Sauerstoff-Konzentration und pH-Wert von außen ermöglichen.
Alle Anschlüsse befinden sich an der Ober- und Unterseite,
so dass einzelne Reaktorkammern nebeneinander aufgebaut und über
ein Verbindungs-Element zu größeren Systemen zusammengeschlossen
werden können.
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Mittels
einer ionenleitenden Membran lassen sich einzelne Reaktorkammern
mit unterschiedlichen Medien bei gleichzeitiger ionischer Verbindung
betreiben. Für elektrochemische Experimente werden zwei
Reaktorkammern (Anoden- und Kathoden-Kompartiment) mit zwei Referenzelektroden-Halterungen
als seitlichen Abschluss verwendet (siehe 8). Die
separate Messung der Elektrodenpotentiale gegen Referenzelektroden
ermöglicht eine vom Membranwiderstand unbeeinflusste Bestimmung
der Zellspannung.
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Durch
Mischen von Luft mit Stickstoff mittels Gas-Proportionierer lassen
sich der Partialdruck von Sauerstoff in der Gaszuleitung sowie auch
der Sauerstofftransfer ins Reaktorsystem regulieren. Zwischen Gas-Proportionierer
und Bioreaktor durchströmt das Gas eine 60 cm hohe mit
Wasser gefüllte Blasensäule. Hierdurch wird das
zugeführte Gas mit Wasser gesättigt. Dies verhindert
ein durch Flüssigkeitsaufnahme verursachtes Austrocknen. Über
Sterilfilter tritt das Gas nach Durchlaufen der Bioreaktor-Peripherie
in den sterilen Reaktorbereich ein.
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9 zeigt
die Abhängigkeit der gemessenen kLa-Werte
von der eingestellten Strömungsgeschwindigkeit der Blasen
an der Düse. Mit 2,5 × 10–3 s–1 bei 0,2 m s–1 Strömungsgeschwindigkeit
liegt der kLa-Wert etwas tiefer als bei
modernsten Reaktoren, jedoch noch im für Blasensäulenreaktoren üblichen Bereich.
Bei Blasensäulenreaktoren lässt sich für
die Abhängigkeit des kLa-Wertes
von der Strömungsgeschwindigkeit u meist ein einfaches
Potenzgesetz der Art kLa = cub angeben.
Die hier erhaltenen Daten zeigen einen zu u0,4 proportionalen
Zusammenhang.
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Zur
Darstellung des Mischverhaltens wurden 0,1 ml verdünnte
Tintenlösung zu 7 ml deionisierten Wasser in den Reaktor
gegeben. 10 zeigt, dass im Falle einer
Blasen getriebenen Bewegung des Reaktormediums bereits nach 2 s
keine Schlieren mehr zu identifizieren sind. Ohne Begasung sind
nach 30 s noch deutliche Schlieren zu erkennen.
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11 zeigt
die aufgenommene Wachstumskurve der E. coli-Fermentation. Die Zunahme der
Biomassenkonzentration sättigt nach sechs Stunden bei 17
g l–1. Während der Kultivierung
wurden die Sauerstoffsättigung und der pH-Wert mittels optischer
Sensorik aufgezeichnet. Die Sauerstoffsättigung nimmt während
der Wachtumsphase stark ab und erholt sich, sobald die Wachtumsrate
sinkt. Der pH-Wert entwickelt sich parallel zum Verlauf der Biomassenkonzentration
und steigt von 7,1 auf 8,8 an. Die Beobachtungen aus 10 und 11 entsprechen
den in der Literatur gezeigten Verläufen. Dabei zeigt 10 das
Mischverhalten des Bioreaktors bei eingeschalteter Begasung mit
Luft (11 ml min–1) im Vergleich
zu einem nicht begasten Reaktor. 11 zeigt
die Entwicklung der Biomassenkonzentration, der Sauerstoff-Sättigung
und des pH-Wertes während der Fermentation von E. coli.
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Mit
der in 8 gezeigten Aufbauvariante werden nachfolgend
Untersuchungen an enzymatischen und mikrobiellen Bio-Brennstoffzellen
beschrieben. Die Trennung der einzelnen Kompartimente durch Membranen
in Kombination mit dem Einsatz von Referenzelektroden erlaubt, Anode
und Kathode unabhängig voneinander zu charakterisieren.
Somit kann der Einfluss verschiedener Parameter auf die Leistungsfähigkeit
einer einzelnen Elektrode untersucht werden.
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Die
enzymatische Biobrennstoffzellen-Kathode enthält Laccase
als Katalysator. Das Enzym Laccase reduziert selektiv Sauerstoff
zu Wasser und kann nach Adsorption Elektronen ohne Mediator mit einer
Kohlenstoff-Elektrode austauschen. Dabei hängt die Leistungsfähigkeit
der Kathode auch von der Beschaffenheit des Elektrodenmaterials
ab.
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Allerdings
sind solche in der Literatur beschriebenen Kathoden, mit den unterschiedlichsten Anoden
kombiniert und nicht unabhängig von diesen untersucht.
Mit dem beschriebenen Aufbau wurden Kathoden mit verschiedenen Elektrodenmaterialien ohne
Anoden-Einflüsse charakterisiert und konnten damit erstmals
direkt verglichen werden. Wie in 12 erkennbar,
ist das Kathodenpotential von Elektroden aus dreidimensionalen Materialien
deutlich höher als das von Elektroden aus zweidimensionalen
Materialien. Die bessere Leistung wird bedingt durch die höhere
spezifische Oberfläche.
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Gemäß der
vorliegenden Ausführungsform wurde eine mikrobielle Biobrennstoffzellen-Anode mit
S. oneidensis als Katalysator aufgebaut. Mikroorganismen als Anoden-Katalysatoren
stellen besondere Anforderungen an den Versuchsaufbau. Zum einen
ist für die Kultivierung ein Bioreaktor nötig,
der sterile kontrollierte Bedingungen bereitstellt. Zusätzlich
müssen anaerobe Bedingungen garantiert werden, um Leistungsverlust
durch direkten Transfer der Elektronen auf Sauerstoff zu verhindern.
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In
mikrobiellen Biobrennstoffzellen werden meist Eisenreduzierer wie
das γ-Proteobakterium S. oneidensis eingesetzt. 13 zeigt
eine deutliche Absenkung des Anodenpotentials durch den Stoffwechsel
von S. oneidensis. Durch den Vergleich von Anoden mit verschiedenen
Mutanten wird untersucht, welche Gene für den mediatorlosen
Elektronentransfer zur Elektrode verantwortlich sind. Dabei wird
die Spezifität von Mutanten in potentiellen Cytochromen
der äußeren Zellmembran gegenüber metallischen
Elektronenakzeptoren erfasst.
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Zusammenfassend
lässt sich festhalten, dass für die Charakterisierung
von Bio-Mikrosystemen ein Bioreaktor entwickelt wurde, der aus aufeinander
gestapelten Bausatz-Elementen flexibel aufgebaut werden kann. Dieser
zeigte mit einem kLa-Wert von 0,3 × 10–2 s–1 und
einer Mischzeit von unter 2 s bei 11 ml min–1 Gasfluss
Eigenschaften, die vergleichbar zu konventionellen Blasensäulen-Reaktoren
sind. Mittels Wachstumskurve einer E. coli-Kultur und Bio-Brennstoffzellen
Untersuchungen wurde die vielseitige Anwendbarkeit des Systems demonstriert. Weitere
Verbesserungen dieser lediglich das Funktionsprinzip demonstrierenden
experimentellen Ergebnisse sind bei entsprechender Optimierung der biologischen,
chemischen und geometrischen Parameter zu erreichen.
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Durch
weitere Ergänzungen wie beispielsweise automatisierte Probennahme,
holographische Sensorik oder automatisierbare pH-Regulierung kann
der vorgestellte Aufbau zu einem komplexen Reaktorsystem höherer
Ordnung ausgebaut werden. Auch Untersuchungen von elektrochemischen
Reaktionsprodukten oder Zytotoxizitäts-Untersuchungen von
Implantat-Elektroden können mit diesem System durchgeführt
werden.
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Die
vorliegende Erfindung bietet zusammenfassend gegenüber
bekannten Lösungen die folgenden Vorteile:
Der Einsatz
verschiedener aufeinander genormter Elemente aus einer Art Bausystem
erlaubt sowohl eine Volumenanpassung durch die Anzahl eingebauter
Elemente, wie auch eine funktionelle Anpassung durch Auswahl und
Einbaureihenfolge der Bausatz-Elemente.
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Der
Reaktor kann nach Gebrauch demontiert und bei entsprechender Materialauswahl
können alle Elemente wiederverwendet werden.
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Bei
entsprechender Auswahl des Materials kann der Reaktor autoklaviert
werden. Die einzelnen Elemente lassen sich derart verbinden, dass
der Reaktor anschliessend steril oder auch unter anaeroben Bedingungen
betrieben werden kann.
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Die
Vorteile der vorliegenden Erfindung kommen insbesondere bei einem
Bausatz zum Herstellen von Miniatur-Reaktoren zum Tragen. Jedoch
ist das Prinzip nicht auf eine bestimmte Reaktorgröße beschränkt.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - EP 0688242
B1 [0003]
- - US 5580523 [0004, 0005]
- - DE 19828995 A1 [0005]
- - DE 19917330 B4 [0006]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Artikel J.
I. Betts et al., Microb. Cell Fact., 2006, vol. 5 [0002]