DE102008031265A1

DE102008031265A1 - Zellchipsystem mit Ableitkamin

Info

Publication number: DE102008031265A1
Application number: DE200810031265
Authority: DE
Inventors: Volker Lob
Original assignee: Individual
Current assignee: Lob Volker De
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2008-07-02
Publication date: 2010-01-07
Anticipated expiration: 2028-07-03
Also published as: DE102008031265B4

Abstract

Ein Zellchipsystem mit einer Zulaufkammer (12), einer Hauptkammer (14), in deren Bodenbereich sich eine Zellkulturkammer (20) mit darunter angeordnetem Sensorchip (22) befindet, sowie einer Ablaufkammer (16), bei dem ein in der Hauptkammer (14) eingepasster, vertikal verschiebbarer Verdrängungskörper (24) vorgesehen ist, der in der unteren Endstellung die Zellkulturkammer (20) nach oben hin begrenzt, ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturkammer (20) mindestens einen Ableitkamin (26) aufweist, über den beim vertikalen Herunterbewegen des Verdrängungskörpers (24) das darunter befindliche Fluid ableitbar ist, wobei der mindestens eine Ableitkamin (26) in der unteren Endstellung des Verdrängungskörpers (24) verschlossen ist.
Dieser Ableitkamin leitet beim Einführen des Verdrängungskörpers in der Hauptkammer befindliches überschüssiges Medium ab.

Description

Die Erfindung betrifft ein Zellchipsystem mit einer Zulaufkammer, einer Hauptkammer, in deren Bodenbereich sich eine Zellkulturkammer mit darunter angeordnetem Sensorchip befindet, sowie einer Ablaufkammer, wobei zwischen Zulaufkammer und Zellkulturkammer sowie zwischen Zellkulturkammer und Ablaufkammer jeweils Verbindungskanäle vorgesehen sind, wobei ferner ein in der Hauptkammer eingepasster, vertikal verschiebbarer Verdrängungskörper vorgesehen ist, der in der unteren Endstellung die Zellkulturkammer nach oben hin begrenzt.
Unter Zellchipsystemen im Allgemeinen versteht man Messaufbauten, die mit Hilfe von mikroskalierten Sensorstrukturen auf unterschiedlichen Trägersubstraten in der Lage sind, metabolische und morphologische Änderungen an einer Zellkultur festzustellen. Mit Hilfe von Biosensorchips ist man in der Lage, Änderungen im extrazellulären Medium dynamisch und über Tage zu detektieren.
Von zentraler Bedeutung für das sensor-gestützte Zellmonitoring ist eine Fluidikkomponente: Zum einen erfolgt dadurch über einen geregelten Austausch von Kulturmedien die kontinuierliche Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und der Abtransport von Metaboliten. Weiterhin ermöglicht das System die genau dosierte Zugabe von Wirkstoffen. Und schließlich wird nur über die Einstellung eines ausreichend kleinen Mikro-Reaktionsvolumens im Bereich der Zellkultur die Messung von Stoffwechselraten an kleinen Zell- und Gewebekulturen möglich. Hierzu wird ein sog. Drei-Kammer-System verwendet.
Ein solches Drei-Kammer-System ist beschrieben und dargestellt in Lob, V. et al. (2005): Cell-based Assays: Mikrosensorarraybasiertes Screening an lebenden Zellen und Geweben. BIOspektrum Sonderausgabe 11, 511–512, sowie in Brischwein, M. et al. (Februar 2006): Chip statt Maus: Microsensorarrays zur Chemikalienprüfung. Nachrichten aus der Chemie 54, 115–120.
Das Drei-Kammer-System besteht aus drei miteinander verbundenen Kammern. Eine Zu- und eine Ablaufkammer nehmen das an der Zellmessung beteiligte Fluid in sich auf. In einer Zellkulturkammer, befindet sich das zu untersuchende biologische Material. Ein Sensorchip schließt das Fluidsystem nach unten hin ab. Um das System in Betrieb zu setzen, muss das Drei-Kammer-System zuerst komplett mit Flüssigkeit gefüllt werden. Nur so kann verhindert werden, dass es beim Einführen des Verschlusskörpers zu keinen Lufteinschlüssen kommt. Dann wird der Verschlusskörper eingeführt. Das gesamte zu verdrängende Medium wird dabei durch Verbindungskanäle auf Höhe des Zellkulturbereichs in die Zu- bzw. Ablaufkammer abgeführt.
In der DE 199 20 811 A1 ist ein Fluidsystem beschrieben, das aus einem Perfusionskörper besteht. In eine nur nach oben geöffnete Kavität (Zellkammer) wird ein Zylinder mit Kanälen zum Fluidtransport eingeführt. Dabei ist wichtig, dass der von oben eingeführte Körper aufgrund seiner Verdrängung ein Reaktionsvolumen oberhalb der Zellkultur definiert. Um das Fluid oberhalb der Zellen austauschen zu können, besteht eine Flüssigkeitsbrücke zwischen dem Reaktionsvolumen und einem Reservoir oberhalb der Probe. Diese Brücke entsteht durch einen verkleinerten Durchmesser des Verdrängungskörpers gegenüber der Zellkammer. Diese Geometrie erlaubt erst das Einführen des Perfusionskörpers, da das zu verdrängende Medium nach oben entweichen kann. Es gibt jedoch mehrere Nachteile dieser Geometrie. Die Austauschfläche (Brücke) zwischen Reaktionsvolumen und Reservoir ist sehr groß. Sie kann auch nicht beliebig verkleinert werden, da dies zu einer Vergrößerung des Radius des Perfusionskörpers führen würde, da sich sonst der Perfusionskörper nicht mehr einführen lässt, weil das Medium nur nach oben entweichen kann. Je größer die Fläche der Flüssigkeitsbrücke ist, umso stärker wirken sich unerwünschte Diffusionseffekte auf die Messergebnisse aus.
Ein weiterer Nachteil der Geometrie liegt in der erschwerten Verschließung der Zellkulturkammer. Es kann zu Lufteinschlüssen beim Einführen des Perfusionskörpers kommen. Ebenso wird beim Verdrängen des Fluids ein erhöhter Druck auf die Zellkultur ausgeübt.
Es ist Aufgabe der Erfindung, diese geschilderten Nachteile zu vermeiden und ein gattungsgemäßes Zellchipsystem bereitzustellen, das eine vereinfachte Einrichtung und Messvorbereitung ermöglicht.
Diese Erfindung wird durch die im Anspruch 1 aufgeführten Merkmale gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Erfindungsgemäß weist die Zellkulturkammer mindestens einen Ableitkamin auf, über den beim vertikalen Herunterschieben des Verdrängungskörpers das darunter befindliche Fluid ableitbar ist, wobei der mindestens eine Ableitkamin in der unteren Endstellung des Verdrängungskörpers verschlossen ist.
Dieser mindestens eine Ableitkamin leitet beim Einführen des Verdrängungskörpers in der Hauptkammer befindliches überschüssiges Medium ab. Wichtig dabei ist, dass der Ableitkamin durch das vollständige Einführen des Verdrängungskörpers verschlossen wird, also nicht bis zum Boden der Hauptkammer bzw. zum oberen Ende der Zellkulturkammer reicht.
Durch die Geometrie des erfindungsgemäßen Systems, bei dem die Versorgungsreservoirs (die Zu- und Ableitkammern) seitlich zu der Messkammer angeordnet sind, wird das Einführen des Verdrängungskörpers mit Hilfe der Ableitkamine erst handhabbar.
Das System kann nun zu jedem Zeitpunkt geöffnet und geschlossen werden, ohne dass Luft bzw. überhöhter Druck an die in der Messkammer befindliche Zellkultur gelangt. Herkömmlicherweise musste das Drei-Kammer-System vor dem Schließen vollständig ge flutet werden und verdrängtes Medium wurde vom System nicht selbst aufgefangen. Die Belastung auf die Zellkultur aufgrund des erhöhten Druckes und der Scherkräfte, die beim Abfluss des Mediums nur durch die Verbindungskanäle zwischen Zellkulturkammer und Zusatzbehälter beim Schließvorgang des Systems entstehen, kann durch die Erfindung minimiert werden.
Bei einer Entfernung des Verdrängungskörpers wird ferner die Vermischung von Medium überhalb der Zellkultur und Medium aus einem der Zu- bzw. Ablaufbehälter minimiert.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Zellchipsystems ist es möglich, lebende Zellen realitätsnah, d. h. nahezu wie in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen und zwar in Echtzeit, dynamisch und multiparametrisch. Das System erlaubt somit ganz allgemein Aussagen zur Vitalität der untersuchten Zellen und kann detektieren ob und in welchem Ausmaß die Vitalität der Zellen durch Exposition von Wirkstoffen, Giften oder Umwelteinflüssen (inkl. Gase, Strahlung) verändert/beeinträchtigt wird. Dadurch ergeben sich insbesondere die folgenden Anwendungen:

– individuelle Sensitivitätsanalyse: Von individuellen Patienten (z. B. Krebspatienten) entnommene Zellproben werden hinsichtlich ihres Ansprechens auf unterschiedliche (z. B. Krebs-) Medikamente (einschließlich Medikamentenkombinationen und verschiedene Dosierungen) untersucht. Somit erhält der behandelnde Arzt eine wertvolle Entscheidungshilfe für die in diesem Fall effizienteste Therapieoption, gewinnt Zeit und erspart eine ggf. weniger wirksame, mit Nebenwirkungen belastete und teure Behandlung. Ähnliches Vorgehen ist neben Krebs auch bei Infektionserkrankungen (Bakterien, Pilze) und in allen weiteren Situationen anwendbar, bei denen unerwünschte Zellen bzw. Mikroorganismen medikamentös geschwächt oder abgetötet werden sollen, ohne den eigenen Organismus zu schädigen. Ebenso lässt sich an verschiedenen Zellproben eines Individuums (z. B. Muskelzellen, und Nervenzellen, Blutzellen, Hautzellen, Lymphzellen) das Ansprechen von therapeutischen Alternativen testen.
– Wirkstoffscreening: An Hand von Zellen/Zellkulturen (von denen das Ansprechverhalten auf pharmakologisch aktive Substanzen bekannt ist) werden verschiedene Wirkstoff-Kandidaten für neue Medikamente auf ihre Wirksamkeit hin getestet.
– Ersatz von Tier- und Humanversuchen: Neue Wirkstoffe/Medikamentenkandidaten werden anstatt im Tier- bzw. Humanversuch an Zellproben auf ihre Wirksamkeit oder Sicherheit hin getestet.
– Toxizitätstests: Substanzen (Flüssigkeiten, Gase), sowie Strahlen deren toxisches Potenzial untersucht werden soll, werden mit Zellen/Zellkulturen konfrontiert, von denen bekannt ist, dass sie sensitiv auf toxische Effekte reagieren. Anwendbar z. B. im Gewässerschutz oder Immissionsschutz.
– Biochemische Prozesskontrolle: Verfolgung biochemischer Prozesse bei Fermentierung und Brauprozessen; Überwachung der Vitalität/Aktivität der eingesetzten Organismen (Hefen, Bakterien).
– Zellbiologische Anwendungen: Überprüfung der Vitalität von z. B. Stammzellen, Eizellen, Samenzellen, etc.

Vorzugsweise sind zwei Ableitkamine vorgesehen, die sich bezüglich der Hauptkammer gegenüberliegen.
Sofern vorzugsweise die Ableitkamine nach oben hin offen sind, ist gewährleistet, dass beim Einführen des Verdrängungskörpers zuerst Medium mit geringerer Dichte (Luft) und später Medium mit größerer Dichte (Flüssigkeit) abgeführt wird. Erst kurz bevor das Reaktionsvolumen in der Zellkulturkammer endgültig definiert wird durch die untere Endstellung des Verdrängungskör pers, enden die Ableitkamine. Der Zellkulturbereich ist somit in der Messstellung nach oben hin verschlossen.
Da die Ableitkamine das Flüssigkeitsreservoir in der Zu- bzw. Ableitkammer mit der Hauptkammer verbinden, ergibt sich ein weiterer Vorteil bei einem beimpften geöffneten System, bei dem der Verdrängungskörper nicht eingeführt ist. Das Flüssigkeitsvolumen oberhalb der Zellen, das als Nährstoffdepot dient, ist stark vergrößert und ermöglicht somit eine längere Versorgung der Zellen ohne zusätzlichen Bedienaufwand.
Die Höhe des unteren Endes des mindestens einen Ableitkamins über dem Boden der Zellkulturkammer beträgt mindestens 0,1 mm, vorzugsweise 0,5–3 mm.
Jeder Ableitkamin weist vorzugsweise einen Querschnitt von 5–10 mm², bevorzugt zwischen 40–80 mm² auf, weil dieser bei einer schnellen Einführung des Verdrängungskörpers das überschüssige Fluid ausreichend schnell abführen muss. Wenn zwei Ableitkamine vorgesehen sind, ist der Querschnitt pro Ableitkamin vorzugsweise kleiner als wenn nur ein Ableitkamin vorgesehen ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausbildung der Erfindung ist der Ableitkamin dadurch gebildet, dass die Wandung zwischen Zulauf- bzw. Ablaufkammer und Hauptkammer im Wesentlichen entlang der gesamten vertikalen Erstreckung bis oberhalb des oberen Endes der Zellkulturkammer durchbrochen ist. Diese Ausbildung hat den Vorteil, dass das Flüssigkeitsreservoir bei herausgenommenem Verdrängungskörper erheblich erweitert ist, weil Zulaufkammer, Hauptkammer und Ablaufkammer einen gemeinsamen Raum bilden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels in der beigefügten Zeichnung weiter erläutert. Dabei zeigt:
1: eine schematische Schnittdarstellung eines Zellchipsystems, und
2: eine schematische perspektivische Ansicht des Zellchipsystems von 1
Die in den Zeichnungen dargestellte bevorzugte Ausführungsform eines Zellchipsystems 10 besteht aus einer Zulaufkammer 12, einer Hauptkammer 14 und einer Ablaufkammer 16, die über Verbindungskanäle 18a, 18b derart miteinander in Verbindung stehen, dass ein flüssiges Medium aus der Zulaufkammer 12 über den Verbindungskanal 18a in den im Bodenbereich der Hauptkammer 14 ausgebildeten Zellkulturkammer 20, und von dort über den Verbindungskanal 18b in die Ablaufkammer 16 strömen kann. Die Strömungsgeschwindigkeit bzw. Strömungsrichtung wird durch an die Zulauf- bzw. Ablaufkammern 12, 16 angelegten Über- bzw. Unterdrücke bestimmt. Unterhalb der Zellkulturkammer 20 ist ein Sensorchip 22 angeordnet, über den Messwerte erfasst werden können.
In der Hauptkammer 14 ist ein Verdängungskörper 24 angeordnet, der näherungsweise dichtend in der Hauptkammer 14 auf und ab bewegbar und auch vollständig entnehmbar ist. Vorzugsweise hat die Hauptkammer 14 und der Verdrängungskörper aus fertigungstechnischen Gründen einen kreisförmigen Querschnitt.
In der Verbindungswand zwischen Zulaufkammer 12 und Hauptkammer 14 bzw. zwischen Hauptkammer 14 und Ablaufkammer 16 ist jeweils ein vertikaler Schlitz 26a, 26b eingearbeitet, welche die erfindungsgemäßen Ablaufkamine 26 bilden. Die Schlitze 26a, 26b erstrecken sich von ganz oben bis zu einer Höhe von vorzugsweise 0,5–3 mm oberhalb des Bodens der Zellkulturkammer 20, damit diese durch den Verdrängungskörper 24 in seiner in 1 gezeigten unteren Endstellung verschlossen ist.
Im Betrieb wird eine Zellkulturlösung in eine der drei Kammern 12, 14, 16 des Zellchipsystems eingeführt und zwar im wesentlichen bis alle drei Kammern gefüllt sind. Sodann wird der Ver drängungskörper 24 eingesetzt und nach unten geschoben, wobei unter dem Verdrängungskörper 24 befindliche Luft oder Lösung seitlich über die Ablaufkamine 26 in die seitlichen Zu- und Ablaufkammern 12, 16 abströmen kann. Wenn sich der Verdrängungskörper 24 seiner unteren Entstellung nähert, überfährt er die unteren Enden der Ableitkamine 26, sodass damit die Verbindungen zwischen Zellkulturkammer 20 und Zu- bzw. Ablaufkammer 12, 16 über die Ableitkamine 26 verschlossen sind. Danach kann überschüssige Lösung die Zellkulturkammer 20 nur noch über die Verbindungskanäle 18 verlassen, bis der Verdrängungskörper 24 seine untere Endstellung erreicht hat.
Anschließend wird zwischen Zulaufkammer 12 und Ablaufkammer 16 ein gezielter Pegelunterschied erzeugt, der zu einer hydrostatischen Druckdifferenz zwischen beiden Kammern 12, 16 führt, wodurch Zellkulturlösung aus der Zulaufkammer 12 über den Verbindungskanal 18a in die Zellkulturkammer 20 strömt. Über den Sensorchip 22 werden Messwerte der zu messenden physikalischen Größen der dort stattfindenden Stoffwechselvorgänge gemessen, bevor die Lösung über den Verbindungskanal 18b in die Ablaufkammer 16 abströmt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 19920811 A1 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Lob, V. et al. (2005): Cell-based Assays: Mikrosensorarraybasiertes Screening an lebenden Zellen und Geweben. BIOspektrum Sonderausgabe 11, 511–512 [0004]
- Brischwein, M. et al. (Februar 2006): Chip statt Maus: Microsensorarrays zur Chemikalienprüfung. Nachrichten aus der Chemie 54, 115–120 [0004]

Claims

Zellchipsystem mit einer Zulaufkammer (12), einer Hauptkammer (14), in deren Bodenbereich sich eine Zellkulturkammer (20) mit darunter angeordnetenm Sensorchip (22) befindet, sowie einer Ablaufkammer (16), wobei zwischen Zulaufkammer (12) und Zellkulturkammer (20) sowie zwischen Zellkulturkammer (20) und Ablaufkammer (16) jeweils Verbindungskanäle (18a, 18b) vorgesehen sind, wobei ferner ein in der Hauptkammer (14) eingepasster, vertikal verschiebbarer Verdrängungskörper (24) vorgesehen ist, der in der unteren Endstellung die Zellkulturkammer (20) nach oben hin begrenzt, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturkammer (20) mindestens einen Ableitkamin (26) aufweist, über den beim vertikalen Herunterbewegen des Verdrängungskörpers (24) das darunter befindliche Fluid ableitbar ist, wobei der mindestens eine Ableitkamin (26) in der unteren Endstellung des Verdrängungskörpers (24) verschlossen ist.
Zellchipsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwei sich bezüglich der Hauptkammer (14) gegenüberliegende Ableitkamine (26a, 26b) vorgesehen sind.
Zellchipsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das andere Ende des mindestens einen Ableitkamins (26) in einen Sammelbehälter mündet.
Zellchipsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Sammelbehälter die Zulaufkammer (12) oder die Ableitkammer (16) ist.
Zellchipsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Ableitkamin (26) dadurch gebildet ist, dass die Wandung zwischen Zulauf- bzw. Ablaufkammer (12, 16) und Hauptkammer (14) im wesentlichen entlang der gesamten vertikalen Erstreckung bis oberhalb des oberen Endes der Zellkulturkammer (20) durchbrochen ist.
Zellchipsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Ableitkamin (26) einen Querschnitt hat von 5–10 mm2, vorzugsweise von 40–80 mm2 aufweist.
Zellchipsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Ableitkamin (26) mindestens 0,5 mm, bevorzugt 1 mm–3 mm über dem Boden der Zellkulturkammer (20) endet.
Anwendung des Zellchipsystems nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Sensitivitätsanalyse, bei der Zellproben unterschiedlichen Wirkstoffen bzw. Wirkstoffzusammensetzungen ausgesetzt werden.
Anwendung des Zellchipsystems nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur biochemischen Prozesskontrolle, bei der in biochemische Prozessen, insbesondere bei der Fermentierung, die Vitalität bzw. Aktivität der eingesetzten Organismen überwacht wird.