-
Beschreibung der Erfindung
-
In
wasserhaltigen Medien von Organellen, Zellen oder Organismen müssen
neben gelösten nichtflüchtigen Substanzen physiologisch
wirksame Gase, die beim Stoffwechsel verbraucht werden, beispielsweise
Sauerstoff oder Kohlendioxid, gelöst sein. Da Gase in Wasser
schlecht löslich sind, ist die Menge eines Gases, die bei
Atmosphärendruck im Medium eines Kulturgefäßes
gelöst ist, oftmals nicht ausreichend zur Bedarfsdeckung,
so dass für Gas-Nachlieferung in das Medium gesorgt werden muss.
Es können sich andererseits auch stoffwechselbedingt Gase
im Medium so stark konzentrieren, dass für die Zellen und
Gewebe physiologisch ungünstige Bedingungen entstehen.
Ein Beispiel hierfür ist die Anreicherung von Sauerstoff
im Medium Stickstofffixierender Cyanobakterien. Die Regulation der Gaskonzentrationen
mit Hilfe einer äußeren Atmosphäre, z.
B. in dem ein Gas oder Gasgemisch durch das Medium oder das Gefäß geleitet
wird, bedingt ein offenes System, was für bestimmte Anwendungen nachteilig
ist. Eine bekannte Alternative hierzu besteht darin, in das abgeschlossene
Kulturgefäß bzw. in das Medium ein Reservoir einzubringen,
in dem sich ein fester oder flüssiger Gas speichernder
Stoff befindet, der die Konzentration eines physiologisch wirksamen
Gases im Kulturgefäß beeinflusst bzw. regelt.
-
Die
Entfernung eines im Stoffwechsel entstehenden Gases aus dem Flüssigmedium
oder der Atmosphäre im Kulturgefäß kann
durch quantitative Bindung an einen gefäßinternen
flüssigen oder festen Stoff erfolgen. Auch Zuführung
eines physiologisch wirksamen Gases in das gefäßinterne
Medium oder die gefäßinterne Atmosphäre
oder die Regulation eines Gaspartialdruckes im Kulturgefäß können durch
den Austausch mit einem gefäßinternen flüssigen
oder festen Gas speichernden Stoff realisiert werden. Nach dem heutigen
Stand der Technik werden diese Verfahren zur Kontrolle der Gaskonzentration
im Versuchs- oder Kulturgefäß in der Weise durchgeführt,
dass das Medium oder das im Gefäß befindliche
physiologische System über einen Gasraum mit einem festen
oder flüssigen Gas speichernden Stoff in Verbindung gebracht
wird, wobei sich dieser Stoff in einem gesonderten Reservoir innerhalb
des Gefäßes befindet.
-
Die
Anwendung eines gefäßinternen Gasreservoirs ist
erforderlich, wenn das Versuchs- oder Kulturgefäß hermetisch
abgeschlossen werden muss, beispielsweise um das Entweichen flüchtiger Substanzen
aus dem Medium in die äußere Gasatmosphäre
zu verhindern. Für die Anwendung von Kultur- oder Versuchgefäßen,
in denen sich physiologisch aktive Organellen, Zellen, Organe oder
Organismen befinden, kann es außerdem zweckmäßig sein,
auf den Gasaustausch zwischen dem Kulturgefäß und
einer äußeren Gasatmosphäre zu verzichten oder
ihn einzuschränken. Allein der für die Sättigung des
Mediums mit einer äußeren definierten Atmosphäre
erforderliche technische Aufwand und Platzbedarf (Schüttelgeräte,
Pumpen, Gasentkeimungsvorrichtung, Vorrichtung zur Gasbereitstellung)
kann eine Motivation für die Verwendung gefäßinterner Gasreservoire
sein.
-
Ein
bekanntes Beispiel für den Einsatz gefäßinterner
Gasreservoire ist das Warburg-Gefäß (Kleinzeller
1965, Manometrische Methoden und ihre Anwendung in der Biologie
und Biochemie, Gustav Fischer Verlag Jena). Es kann mit
einem oder mehreren internen Gasreservoiren ausgestattet sein, um die
Konzentration bestimmter Gase im physiologischen Medium zu regeln.
Bei der manometrischen Atmungsmessung wird das freigesetzte Kohlendioxid irreversibel
mit Hilfe eines gefäßinternen Gasreservoirs absorbiert.
Als Gas speichernder Stoff dient hierzu ein Filter, das mit einer
konzentrierten Lösung von Barium-, Kalium- oder Natriumhydroxid
getränkt ist. Um hypoxische Verhältnisse im Gefäß bei
der Photosynthese oder Luftstickstoffbindung aufrechtzuerhalten,
kann in einem internen Reservoir des Warburg-Gefäßes
der Sauerstoff an Pyrogallol chemisch gebunden werden. Um Kohlendioxid
an C-autotrophe Organismen zu liefern und die Kohlendioxidkonzentration
im physiologischen Medium zu regeln, wird im Warburg-Gefäß ein
internes Reservoir verwendet, das einen Kohlendioxid speichernden
konzentrierten Carbonatpuffer enthält, wobei die Kohlendioxidkonzentration
im Medium durch das pH-abhängige Gleichgewicht zwischen
den Hydrogencarbonat-Ionen und Kohlendioxid eingestellt wird.
-
In
allen bekannten Anwendungsfällen gefäßinterner
Gasreservoirs steht das Medium über einen gefäßinternen
Gasraum im Austausch mit dem Gas speichernden Stoff im Gleichgewicht.
Da die Flüssigphase bzw. die Flüssigphasen im
Versuchsgefäß geschüttelt werden, sind
bei vielen Anwendungen weder die Gasdiffusion im Medium noch der Gas-Übergang
zwischen den Phasen limitierend für den Umsatz, so dass
sich das Gleichgewicht der Gaskonzentrationen zwischen dem Gas speichernden
Stoff und dem Medium annähernd einstellen kann. Das Prinzip
eines internen Gas spendenden oder Gas bindenden Reservoirs über
einen gefäßinternen Gasraum findet vielfältige
Anwendung. Bekannte Beispiele sind die Kohlendioxidversorgung C-autotropher
Pflanzenzellkulturen oder Algen, die Schaffung hypoxischer Bedingungen
für die N-Fixierung durch Cyanobakterien oder die Versorgung
organotropher Organismen mit einer flüchtigen C-Quelle,
z. B. Methan oder Ethanol.
-
In
der bisher bekannten Form ist das physiologische Medium vom gefäßinternen
Reservoir durch einen im Inneren des Gefäßes befindlichen
Gasraum getrennt, der den Gasaustausch vermittelt. Die sichere Trennung
zwischen dem Medium oder dem physiologische System und dem Gas speichernden
Stoff erfordert die Anwendung spezieller Gefäße,
wobei sich der Gas speichernde Stoff und das Medium in abgetrennten
internen offenen Kammern befinden, die über einen Gasraum
verbunden sind. Nachteile dieser Lösung bestehen in erhöhten
Kosten für die Kultur- oder Versuchsgefäße
und dem vergrößerten Raumbedarf, der sich aus
dem gemeinsamen Gasraum ergibt. Da die internen Räume über
eine gemeinsame Gasphase verbunden sind, besteht in manchen Fällen
die Gefahr, das physiologische System oder das Medium mit dem Gas
speichernden Stoff beim Schütteln direkt in Verbindung
zu bringen, beispielsweise durch Spritzer einer Gas speichernden
Lösung. Dies muss besonders dann vermieden werden, wenn
der Gas speichernden Stoff toxisch wirkt.
-
Die
Aufgabe der Erfindung ist es, ein breit einsetzbares internes biokompatibles
Gasreservoir für beliebige Versuchs- oder Kulturgefäße
mit stoffwechselaktiven Organellen, Zellen, Organen oder Organismen
zur Verfügung zu stellen, das physiologisch wirksame Gase
in hoher Konzentration aufnehmen kann und es gestattet, deren Konzentration
im Gefäßinneren oder im gefäßinternen
physiologischen Medium sicher und biokompatibel zu regeln, ohne
dass hierzu ein großer Teil des Gefäßvolumens mit
Gas gefüllt sein muss.
-
Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein gefäßinternes
Gasreservoir für Versuchs- und Kulturmedien nach Anspruch
1 gelöst. Die Unteransprüche beziehen sich auf
vorteilhafte Varianten der Erfindung. Das erfindungsgemäße
Gasreservoir besteht aus einem durch eine Membran begrenzten abgeschlossenen
Behälter und einem darin eingeschlossenen festen oder flüssigen
Gas speichernden Stoff. Für die Erfindung ist die Anwendung
einer gasdurchlässigen hydrophoben Membran als Trennmedium
zwischen dem physiologischen Medium und dem gefäßinternen
Gasreservoir wesentlich. Letzteres enthält den Gas speichernden
oder Gas bindenden Stoff in einem membranbegrenzten abgeschlossenen
Raum. Der erfindungsgemäße Ersatz des gefäßinternen
Gas vermittelnden Gasraumes durch eine gasdurchlässige
Membran hat den Vorteil eines geringen zusätzlichen Raumbedarfes
im Versuchs- und Kulturgefäß. Außerdem
bietet er vielfältige Möglichkeiten, das gefäßinterne
Gasreservoir an die Erfordernisse der Kultur oder des Experimentes
anzupassen, ohne das speziell geformte Gefäße
erforderlich sind. Die Membran ist für nicht flüchtige
Stoffe hydrophile Stoffe undurchlässig und besitzt für
Gasmoleküle eine definierte Permeabilität. Der
im Behälter eingeschlossene Gas speichernde Stoff steht
nur über den Gasaustausch in Wechselwirkung mit dem Medium
innerhalb des Kultur- oder Versuchsgefäßes, weil
die Poren der Membran ausschließlich Gas oder eine in Wasser
nicht lösliche Flüssigkeit enthalten. Für
die Festlegung der Raten des Gasaustausches mit dem Medium, der
Gaskonzentration im Medium oder der Kapazität des Gasreservoirs
ergeben sich Gestaltungsmöglichkeiten durch die Wahl der Membran,
des Oberflächen-Volumenverhältnisses des Reservoirs
sowie durch die Auswahl und Konfektionierung des eingebrachten Gas
speichernden Stoffes. Die Kontamination des Mediums durch Spritzer
einer toxischen Flüssigkeit, die sich zur Gasbindung im
Reservoir befindet, ist bei Verwendung des erfindungsgemäßen
Gasreservoirs ausgeschlossen.
-
Es
sind zahlreiche gasdurchlässige, für wässrige
Lösungen und flüssiges Wasser undurchlässige
Membranen bekannt. Polyethylen geringer Dichte (PELD) besitzt für
Wasserdampf eine weit geringere Permeabilität als für
Sauerstoff, Kohlendioxid, Stickstoff und weitere Gase. Es ist als
preiswertes und in unterschiedlichster Stärke verfügbares
Membranmaterial für zahlreiche Anwendungen des erfindungsgemäßen
Gasreservoirs geeignet, besonders in den Fällen, wo der
Transport von Wasserdampf durch die Membran begrenzt werden soll.
Die Permeabilität einer 20 μm dicken handelsüblichen
Verpackungsfolie aus PELD beträgt größenordnungsmäßig
20 mmolm–2h–1atm–1 für Sauerstoff und etwa
60 mmol m–2h–1atm–1 für Kohlendioxid (Robertson
G. L. 1993. Food packaging Principles and Practise. Marcel Decker.
Inc. New York. NY). Die Sauerstoffpermeabilität
einer solchen Folie reicht bei einer Oberfläche von 100
cm2 aus, das Volumen von 1 L Wasser mit Sauerstoff
in etwa 400 min zur Hälfte zu sättigen. Die genannte
Kohlendioxidpermeabilität ermöglicht den Kohlendioxidfluss
von 1–2 μmolh–1 aus
einem Reservoir mit 10 cm2 Oberfläche,
wenn das Reservoir mit einem Carbonatpuffer gefüllt ist,
der einen Kohlendioxidpartialdruck von 20–30 mbar aufrechterhält.
Wesentlich größere Flüsse können
mit dem gleichen Puffer bei Verwendung hydrophober Folien mit Poren einer
Größe von 10 bis 200 nm erreicht werden. Solche
Folien sind kommerziell verfügbar und werden in vielfältiger
Weise als gasdurchlässige Barriere für flüssiges
Wasser eingesetzt. Sie bilden zwar keine selektive Barriere für
den Transport von Wasserdampf, können aber ebenso wie Folien
aus PELD jeden festen oder in Wasser gelösten Gas bindenden toxischen
Stoff effektiv von physiologischen wässrigen Medien trennen.
Ihre Permeabilität für Gase kann mehr als das
Tausendfache der Permeabilität gleich dicker PELD-Folien
erreichen.
-
Das
erfindungsgemäße gefäßinterne
biokompatible Gasreservoir kann wie die bekannten gefäßinternen
Gasreservoire generell zur Regelung der Konzentration physiologisch
wirksamer Gase in Versuchs- und Kulturgefäßen
eingesetzt werden. Dies betrifft Gase, die im Stoffwechsel entstehen
oder verbraucht werden wie Sauerstoff, Kohlendioxid, Stickstoff,
Ammoniak, Methan oder Ethanoldampf, sowie entwicklungssteuernde
Gase wie Ethylen oder gasförmige Stressoren wie Ozon oder
Schwefelwasserstoff, aber auch Wasserdampf. Die Wasserdampfpermeabilität
einer geeigneten Membran kann beispielsweise zur Einstellung einer
definierten Luftfeuchte durch ein erfindungsgemäßes
Reservoir in einem abgeschlossenen Versuchsgefäß eingesetzt
werden.
-
Wesentlich
ist, dass der Gas speichernde Stoff ein physiologisch wirksames
Gas in absorbierter oder chemisch gebundener Form enthält,
binden oder freisetzen kann und dass er nicht in einer das physiologische
System störender Menge das Reservoir verlasst. Hierfür
geeignete feste oder flüssige Stoffe sind in großer
Zahl bekannt. Sie werden bereits in vielfältiger Weise
zur Bildung gefäßinterner Gasreservoire eingesetzt.
Beispielsweise sind zahlreiche organische Flüssigkeiten
bekannt, die entweder in Wasser nicht löslich sind oder
nicht flüchtig sind und gleichzeitig Gasmoleküle
aus der Gasphase gegen einen hohen Konzentrationsgradienten akkumulieren.
Alle diese Flüssigkeiten können als Gas speichernde
Stoffe oder als Komponenten eines Gas speichernden Stoffes eingesetzt
werden. Sie können Gasmoleküle aufnehmen und abgeben,
wobei der Gleichgewichtspartialdruck durch die Konzentration des
gelösten Gases in der organischen Flüssigkeit bestimmt
wird. Wenn der Gas speichernde Stoff ein physiologisch wirksames
Gas im Gleichgewicht mit einem bestimmten Partialdruck des freien
Gases enthält, kann das erfindungsgemäße
Gasreservoir zur Einstellung eines definierten Gaspartialdrucks
im Gefäß eingesetzt werden. Wenn der Gas speichernde Stoff
Sauerstoff mit einer bestimmten Rate irreversibel freisetzt, wie
es beispielsweise von Peroxiden bekannt ist, kann das Reservoir
zur Versorgung des physiologischen Systems mit Sauerstoff eingesetzt werden.
Wenn der Gas speichernde Stoff ein physiologisch aktives Gas, z.
B. Sauerstoff oder Kohlendioxid, irreversibel bindet, kann das Reservoir
dazu eingesetzt werden, die Konzentration des Gases im Kulturgefäß zu
begrenzen oder die vom physiologischen System abgegebene Menge des
Gases quantitativ zu bestimmen. Als Gas speichernder Stoff wird
im Sinne dieser Erfindung auch ein Stoff angesehen, der ein Gas
irreversibel bindet und sich dabei chemisch verändert,
wie z. B. bei der Bindung von Sauerstoff an Pyrogallol.
-
Einige
physiologisch wirksame Gase, z. B. Kohlendioxid und Ammoniak, stehen
in wässrigen Pufferlösungen im pH-abhängigen
Gleichgewicht mit hydratisierten Ionen, z. B. Hydrogencarbonationen und
Ammoniumionen. Entsprechende Pufferlösungen können
als gasspeichernde Stoffe eingesetzt werden. Wenn das Reservoir
eine gepufferte Ammoniumsalzlösung umfasst, die Ammoniak
an ein Hydrokulturmedium abgibt, kann es als kontinuierlich fließende
Quelle für pflanzenverfügbaren Stickstoff eingesetzt
werden. Stickstoffverbindungen bilden mengenmäßig
den Hauptbestandteil einer mineralischen Nährlösung
und bestimmen deren osmotischen Druck. Die dargestellte Anwendung ermöglicht es,
einen ausreichenden Vorrat an verwertbarem Stickstoff in einem Kulturgefäß mit
begrenztem Volumen unterzubringen, ohne das physiologische System
osmotisch zu belasten. Gasspeichernde Stoffe im erfindungsgemäßen
Sinn sind auch starke Laugen oder Säuren, da sie physiologisch
wirksame Gase, z. B. Kohlendioxid oder Ammoniak, vollständig binden
und so dem Kulturmedium entziehen.
-
Ausführungsbeispiele
-
- 1. Eine sterile Kultur von Synechocystis sp. PCC6803
(30 ml) wird durch Schütteln bei Raumtemperatur in 50 ml-Gewebekulturflaschen
(Cellstar®) mit gasdurchlässigem
Deckel auf einem kompletten mineralischen BG-11-Medium nach Rippka
et al. (J. Gen. Microbiol. 111, S. 1–61, 1979)
unter Dauerlicht bei 40–60 μmolm–2s–1 angezogen. Die optische Dichte
bei 750 nm beträgt nach dem Beimpfen 0,2. Diese Kultur
(Kontrollvariante) zeigt bereits nach einem Tag eine deutliche Limitation.
Die Kultur wird in einer parallel angesetzten Versuchsvariante unter
sonst gleichen Bedingungen mit einem ins Medium eingebrachten erfindungsgemäßen
internen Reservoir für Kohlendioxid angezogen. Das Reservoir
besteht aus einem durch einen Knoten abgeschlossenen länglichen
Foliensäckchen aus PELD mit der Stärke 20 um und
einem Umfang von 2,8 cm, der 2,5 ml eines 3 M Kaliumhydrogencarbonat/-carbonat-Puffers
(Kohlendioxid-Partialdruck 32 mbar) enthält. Der Zuwachs
beträgt im Verlauf von 40 h mehr als das Dreifache der
Kontrollvariante (1).
- 2. Um den Sauerstoffbedarf eines Wurzelsystems in einer Hydrokultur
zu decken, wird ein erfindungsgemäßes Gasreservoir
in die mineralische Nährlösung eingebracht. Es
besteht aus einem beidseitig verschlossenen Schlauch aus dünner PELD-Folie
und ist mit 100 g eines granulierten Sauerstoff speichernden Stoffes,
der zu etwa 25% Gewichtsprozent aus Magnesiumperoxid besteht, gefüllt.
Das Reservoir entlässt in das Medium Sauerstoff mit einer
kontrollierten Rate, die ausreicht, um den Sauerstoffbedarf des
Wurzelsystems zu decken. Bei dieser Anwendung wird ausgenutzt, dass
sich Magnesiumperoxid mit Kohlendioxid zu unlöslichem Magnesiumcarbonat
und Sauerstoff umsetzt. Die Geschwindigkeit dieses Umsatzes kann
durch Beimengungen zum Granulat gesteuert werden kann. Wenn die
atmungsbedingte Abgabe von Kohlendioxid steigt, wird die Sauerstoffabgabe
aus dem erfindungsgemäßen Reservoir erhöht.
Gleichzeitig wird die Anhäufung von Kohlendioxid im Medium
limitiert.
- 3. Um eine Pflanze über die Hydrokultur mit einer pflanzenverfügbaren
Stickstoffverbindung zu versorgen, wird ein erfindungsgemäßes
Gasreservoir in die mineralische Nährlösung eingebracht. Es
besteht aus einem an den Enden verschlossenen dünnwandigen
Folienschlauch aus PELD, der 30 ml einer 1 M wässrigen
Ammoniumhydrogencarbonat – Lösung enthält.
Das gefäßinterne Gasreservoir gibt mit kontrollierter
Rate Ammoniak an die mineralische Nährlösung ab.
Diese Rate kann durch die Dicke der Membran oder den pH-Wert der
gepufferten Ammoniumhydrogencarbonat – Lösung
eingestellt werden. Der an das Medium abgegebene Ammoniak reagiert
im Medium zu Ammoniumionen und wird von der Wurzel in dieser Form
oder nach Nitrifikation in Nitratform aufgenommen.
- 4. Um die Konzentration von Ethylen in einer pflanzlichen Gewebekultur
zu regeln, wird in das 200 ml einer Zellsuspension enthaltende Kulturgefäß ein
Gasreservoir in Form eines zweiseitig verschlossenen Folienschlauches
aus porösem Polypropylen eingebracht. Der Folienschlauch
hat ein Fassungsvermögen von 20 ml und ist mit einem ölhaltigen
Granulat gefüllt. Das Granulat enthält 5 ml eines
aliphatischen Öls, in dem Ethylen in definierter Konzentration
gelöst ist. Wird Sauerstoffversorgung der Zellen mit Hilfe
eines erfindungsgemäßen Gasreservoirs (vergl.
Beispiel 2) aufrechterhalten, kann der Austausch mit der äußeren
Atmosphäre stark reduziert oder unterbunden werden, so
dass sich eine definierte Konzentration an Ethylen im Kulturgefäß im
Gleichgewicht mit der Ölphase im Reservoir eingestellt.
- 5. In eine flache, 50 ml fassende Gewebekulturflasche mit perforiertem
hydrophobem Deckel, werden 20 ml einer mineralischen Nährlösung
ohne ionische Stickstoffquelle und zwei Reservoire eingebracht,
die als Folienschläuche aus PELD gestaltet sind (vergl.
Beispiel 1). Eines dieser Reservoire enthält 2,5 ml einer
Pyragallol-Lösung und dient der Entfernung von gelöstem
Sauerstoff aus dem Kulturmedium, während das andere Reservoir
mit 2,5 ml eines kohlendioxidspeichernden Puffers (vergl. Beispiel
1) gefüllt ist und der Versorgung der Kultur mit Kohlendioxid
dient. Die Kulturflasche wird mit dem Cyanobakterium Anabaena variabilis
beimpft, belichtet und geschüttelt. Die Entfernung des
Sauerstoffs aus dem Kulturmedium ermöglicht die ungehinderte
Bindung von Luftstickstoff durch die sauerstoffempfindliche Nitrogenase.
Die Versuchsvariante mit der Kombination beider Reservoire zeigt
ein schnelleres Wachstum als die Vergleichsvariante ohne Gasreservoir
sowie die Variante, die nur eines der beiden Reservoire enthält.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Kleinzeller
1965, Manometrische Methoden und ihre Anwendung in der Biologie
und Biochemie, Gustav Fischer Verlag Jena [0004]
- - Robertson G. L. 1993. Food packaging Principles and Practise.
Marcel Decker. Inc. New York. NY [0009]
- - J. Gen. Microbiol. 111, S. 1–61, 1979 [0012]