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Die
Erfindung betrifft ein kombiniertes Spektroskopieverfahren zur Charakterisierung
von biologischen Proben mittels einer Kombination aus Nahfeld-Mikroskopie
im infraroten und Terahertz Bereich, mit fluoreszenzspektroskopischen
und topographische Methoden, sowie eine hierfür geeignete
Vorrichtung.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
chemische Charakterisierung der molekularen Zusammensetzung von
Oberflächen ist von großer Bedeutung in den Materialwissenschaften,
in der Mikroelektronik und in der Biotechnologie. Bisherige etablierte
Verfahren für die Analyse von Oberflächen umfassen
die Photoelektronen-Spektroskopie im Röntgenbereich (x-ray
photoelectron spectroscopy – XPS) (A. Rossi, et
al., Spectrosc. Eur. 16(6), 14–19 (2005); C.
J: Blomfield, J. Electron Spectrosc. Relat. Phenom. 143(2-3), 241–249
(2005)), Scanning Auger Spektroskopie (SAM) (M.
Prutton, Processing, Interpretation and Quantification of Auger
Images. In Surface Analysis by Auger and X-Ray Photoelectron Spectroscopy;
IM Publications: Charlton, England, pp 705–732 (2003))
und abbildende Sekundär-Ionen-Massenspektroskopie (imaging
secondary ion mass spectroscopy – SIMS) (J.-L.
Guerquin-Kern, et al., Biochim. Biophys. Acta 1724(3), 228–238 (2005)).
Viele dieser Techniken benötigen spezielle Umgebungsparameter
wie Vakuum, spezielle Probenpräparationen wie metallische Überzüge,
oder führen zur Modifikation oder Zerstörung der
Proben, was insbesondere im Zusammenhang mit der Untersuchung von
Biomaterialien problematisch ist. Die optische Mikroskopie hat ihren
Siegeszug für die Untersuchung biologischer Proben angetreten.
Dabei werden aufbauend auf der Detektion von fluoreszierenden Markern
sehr hohe Empfindlichkeiten erreicht. Allerdings wird durch die
Zugabe von Markern stets ein erheblicher Eingriff in das System
verursacht; z. B. können Diffusionsgeschwindigkeiten durch
das Anheften von Chromophoren erheblich verändert werden.
Von daher ist die Entwicklung zusätzlicher markierungsfreier
Mikroskopiemethoden wünschenswert. Eine Übersicht über
die verschiedenen Meßmethoden bezüglich ihrer
chemischen Information und der erzielten lateralen Auflösung
ist in 1 eingezeichnet.
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Eine
ebenfalls etablierte Technik zur Charakterisierung von Materialien
im mikroskopischen Maßstab (> 1 μm) stellt die Ramanmikroskopie
oder die Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie und -Mikroskopie
dar. Die Infrarotspektroskopie ist eine leistungsstarke Methode
zur chemischen und strukturellen Analyse. Für wissenschaftliche
und wirtschaftliche Anwendungen im Bereich der Physik, Chemie, Biologie,
Medizin, Geo- oder Materialwissenschaften sind Kenntnisse über
die Funktion, Struktur und Eigenschaften von Materie auf der ”sub-mikroskopischen” Nanoskala
unerlässlich und erfordern Analysemethoden, die möglichst
wenig Probenpräparation erfordern. Im Allgemeinen ist die
Auflösung begrenzt durch Beugungseffekte (typisch λ;
ca. mehrere μm im IR-Bereich).
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Der
IR-Bereich, der auch als chemischer Fingerprint-Bereich bezeichnet
wird, ist in besonderem Maße geeignet, die chemische Zusammensetzung zu
entschlüsseln. Jedes Molekül oder jede Substanz hat
in diesem Bereich typische Absorptionsbanden. Eine quantitative
Analyse ist leicht möglich, da die Absorption direkt proportional
zur Anzahl der Moleküle ist. Auch im THz-Bereich sind zunehmend
chemische Signaturen identifizierbar, auch wenn dort noch eine rasante
Entwicklung in den nächsten Jahren zu erwarten ist, bevor
diese für die breite Anwendung nutzbar sind.
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Im
sichtbaren Spektralbereich ist die Fluoreszenz-Mikroskopie eine
Methode, mit der einzelne Biomoleküle in Zellen nachgewiesen
werden können, wobei vorausgesetzt ist, dass das Molekül
durch ein Fluorophor markierbar ist. Die Fluorophore sind oft toxisch.
Eine herausragende Rolle spielt inzwischen in der Mikroskopie das
GFP (green fluorescent protein aus Aequorea victoria). Dieses ist
biologisch verträglich, allerdings ist unklar, ob markierte
Proteine in allen Aspekten sich identisch zu unmarkierten verhalten.
Insbesondere bei Diffusionsprozessen wird dies teilweise bezweifelt.
Kleine Moleküle wie z. B. H2O, CO2, und NO sind durch Austausch von Atomen
mit radioaktiven Isotopen markierbar. Dieses führt aber zu
einem hohen Risiko, Zellschäden zu verursachen.
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Die
IR-Spektroskopie hat gegenüber der Nutzung von Strahlung
im optischen, UV oder gar Röntgenbereich den Vorteil, dass
die Strahlung im IR so niederenergetisch ist, dass sie nicht zur
Produktion von Radikalen oder zur Zellschädigung führt.
Die Idee der Nutzung der charakteristischen IR-Banden kommt heute
bereits in der FT- und Raman-Spektroskopie zum Tragen (D.
L. Wetzel, S. M. LeVine, Science 285, 1224 (1999); D.
L. Wetzel, S. M. LeVine, Cell. Mol. Biol. 44 (1998); N.
Uzunbajakva, et al., Biophys. J. 84, 3968 (2003)). FT-Spektrometer
mit Array-Detektor nutzen die Frequenzabhängigkeit der charakteristischen
Schwingungsbanden. Bei der Ramanspektroskopie wird mittels Streuung
durch einen Mehr-Photonenprozess das charakteristische IR-Spektrum
in jedem einzelnen Punkt erhalten, was zu einer zweidimensionalen
Kartierung genutzt werden kann. Die Begrenzungen der beiden bisher
verfügbaren neueren Techniken sind unterschiedlich und
sollen im Folgenden kurz aufgelistet werden, um dann die Vor- und
Nachteile der neuen erfindungsgemäßen Technik
gegenüber bereits etablierten Techniken zu demonstrieren:
Die
Empfindlichkeit der Raman-Spektroskopie ist limitiert durch den
geringen Streuquerschnitt von σ = 10–39 cm–2 für den Raman-Prozess.
Während die räumliche Auflösung aufgrund
der Nutzung von Strahlung im optischen Spektralbereich sehr gut
ist (z. B. 250 nm bei einem 500 nm Beleuchtungslaser), ist die Photonenausbeute
sehr gering. Dies bedeutet, dass in der Raman-Spektroskopie eine
Mittelung über längere Zeiträume notwendig
ist, um genügend Photonen zur Verfügung zu haben,
die eine eindeutige Detektion über dem Rauschlimit ermöglichen. Ferner
ist eine quantitative Analyse schwierig, da es sich um ein nichtlineares
Verfahren handelt. Es ist bekannt, dass durch Effekte wie SERS (Surface
Enhanced Raman-Spektroskopie) die Photonenausbeute um mehrere Größenordnungen
gesteigert werden kann (J. Wessel, J. of the Optical Society
of America B 2, 1538 (1985)). Dieser Prozess ist nicht
quantitativ vorhersagbar und hängt extrem von der genauen
lokalen Umgebung ab. Eine Messung der Intensität der Raman-Bande
kann daher nicht absolut quantitativ mit der Substanzmenge korreliert
werden, da Verstärkungen in unbekannter Höhe von
mehreren Größenordnungen auftreten können.
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Die
CARS-Mikroskopie (A. Zumbusch, et al., PRL 82(20) 4142 (1999); A.
Volkmer, et al., PRL 87(2) (2001); Ji-Xin Cheng,
et al., Biophys. J. 83, 502 (2002)) nutzt Fernfeld-Methoden,
kann aber zugleich ohne Markermoleküle chemische Informationen
extrahieren. Durch die simultane Verwendung von zwei Laserwellenlängen
können Raman-Shifts bestimmten Bindungen (aliphatische
C-H, C-O-Streckschwingungen, symmetrische CH2-Schwingungen)
zugeordnet werden. Es werden typischerweise nah-infrarote Wellenlängen
von 800 bis 1000 nm verwendet; dies limitiert die Auflösung
auf einige 100 nm. Allerdings ist es schwierig, mit Raman-Spektroskopie quantitative,
absolute Konzentrationen zu bestimmen.
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Beide
Methoden basieren auf der Anregung mit Lasern im optischen Spektralbereich,
die auf die zu untersuchende Probe fokussiert werden müssen, wodurch
an einzelnem Punkt hohe Intensitäten auftreten können.
Die Energien der Strahlung liegt typischerweise im NIR oder optischen
Spektralbereich. Dadurch können aber photochemische Prozesse ausgelöst
werden und es kann zur Schädigung der Zelle kommen.
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Die
Fourier-Transform-Spektroskopie ist eine seit langem etablierte
Technik, die kommerziell von verschiedenen Firmen wie z. B. Bruker,
PerkinElmer, und anderen erhältlich ist. Die Limitation
der FT-Spektroskopie ist durch ihre begrenzte räumliche Auflösung
gegeben (typisch 10 μm). In der FT-Spektroskopie ist aufgrund
der relativ schwachen Lichtquelle ebenfalls eine relativ lange Mittelungszeit möglich.
Während sie ebenso wie die Raman-Spektroskopie den Vorteil
hat, dass ein komplettes IR-Spektrum simultan aufgenommen wird,
eignen sich diese Methoden aufgrund der Mittelungszeit und der räumlichen
Auflösung (s. u.) nicht, um schnelle dynamische Prozesse
(<< 1 s) in Zellen
zeitaufgelöst zu untersuchen.
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Für
direkte Transmissionsmessungen durchs wässerige Medium
im infraroten Spektralbereich, die eine absolute Quantifizierung
von Biomolekülen ermöglichen könnte,
wird als Strahlungsquelle auch Synchrotronstrahlung (N.
Jamin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Applied Biological Sciences
95, 4837 (1998); H.-Y. N. Holman, et al., Biopolymers
57, 329 (2000); H.-Y. N. Holman, et al., Journal
of biomedical optics 7, 417 (2002)) verwendet, die hinreichend Leistung
hat, um wässrige Lösungen im infraroten Spektralbereich
zu durchdringen, da Wasser ein starker Absorber ist. Allerdings
ist diese Strahlungsquelle nicht jederzeit frei verfügbar
und Messzeiten sind nur eingeschränkt vorhanden.
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Die
IR-Laserspektroskopie weist eine hohe Empfindlichkeit auf. Nachweise
im parts-per-trillion-(ppt)-Bereich wurden bereits realisiert (G.
von Basum, et al., Opt. Lett. 29, 797 (2004)). Eine Messung ist
daher in sehr kurzen Zeiten im Millisekunden-Bereich möglich.
Gebiete von 1 μm2 großen
Flächen können mit 30 nm Auflösung in
ca. 1 Sekunde kartiert werden.
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Die
Auflösung eines Mikroskops ist generell durch das Abbe-Limit
gegeben. 1873 stellte Ernst Abbe fest, dass der kleinste erreichbare
Fokus einer Linse durch die verwendete Wellenlänge λ und
ihren Brechungsindex n auf λ/(2n) limitiert ist. In der
Fernfeld-Mikroskopie begrenzt dieses Beugungs- bzw. Abbe-Limit typischerweise
die Auflösung und damit sind Strukturdetails, z. B. von
lebenden Zellen, nur begrenzt sichtbar zu machen.
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Durch
spezielle Anordnungen kann diese Grenze etwas unterschritten und
die 3-dim Auflösung verbessert werden (S. W. Hell,
et al., Journal of Microscopy 187, 1 (1997); M.
Schrader, et al., J. Applied Physics 84(8), 4033 (1998); A.
Egner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99(6), 3370 (2002); A.
Lahrech, et al., Optics Letters 21, 1315 (1996)). Dennoch
impliziert diese Beugungsgrenze, dass im Infraroten wesentlich schlechtere
räumliche Auflösungen als im optischen Spektralbereich
erreicht werden können, da die Wellenlänge hier
im μm-Bereich liegt.
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Das „Problem” der
begrenzten Auflösung kann durch die Technik der Nahfeld-Mikroskopie,
die im optischen schon länger als SNOM oder NSOM (scanning
nearfield optical microscopy) etabliert ist, auf den vorgegebenen
IR-Bereich gelöst werden. Damit sind dann Untersuchungen
an lebenden Zellen auf Nanometer-Skalen möglich. Pionierarbeiten
von Keilmann und Mitarbeitern (B. Knoll, F. Keilmann, Journal
of Microscopy 194, 512 (1999); B. Knoll, F. Keilmann,
Nature 399, 134 (1999)) haben gezeigt, dass auch im IR-Bereich
das Abbe-Limit deutlich unterschritten werden kann, indem man Techniken
der so genannten Nahfeld-Mikroskopie nutzt, die im Folgenden weiter
ausgeführt wird.
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Befindet
sich eine räumlich sehr kleine Strahlungsquelle oder ein
kleiner Lichtstreuer (Nano-Emitter) bzw. ein sehr kleiner Detektor
(Nano-Collector) nahe am Objekt, so ist im nicht-linear abklingenden elektromagnetischen
Nahfeld die Auflösung nicht mehr durch die Wellenlänge
des Lichtes sondern durch den Durchmesser dieser Strahlungsquelle bzw.
des Detektors begrenzt.
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Für
die Realisierung einer Raster-Nahfeld-Sonde gibt es prinzipiell
zwei Möglichkeiten. In einem Fall besteht die Sonde aus
einem Nano-Detektor, der mit der Feldstärke an einer beleuchteten Oberfläche
lokal wechselwirkt. Im umgekehrten Fall wird die Probenoberfläche
lokal durch eine Nano-Lichtquelle beleuchtet und das daraus resultierende
Signal im Fernfeld gemessen. Bei beiden Ansätzen ist die
zu erzielende Auflösung nicht durch Beugung begrenzt, sondern
vielmehr durch die Größe der Sonde vorgegeben
(kommerzielle metallisierte AFM-Spitzen haben typische Dimensionen
von 30 nm und kleiner).
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Solch
eine lokale Quelle wurde experimentell zum ersten Mal von Ash und
Nichols im Mikrowellen-Bereich (λ = 3 cm) realisiert, so
dass sie 0.5 mm breite Metallstreifen abbilden konnten (E.
A. Ash, G. Nichols, Nature 237, 510 (1972)). Für
das sichtbare Spektrum stellten 1984 unabhängig voneinander Lewis
et al. sowie Pohl et al. in Silizium bzw.
aus Quarzglas geätzte Apertursonden (A. Lewis,
et al., Ultramicroscopy 13, 227 (1984); D. W. Pohl,
et al., Appl. Phys. Lett. 44, 651 (1984)) vor und erweiterten
so die moderne Rastersondenmikroskopie um den Zweig der optischen
Nahfeldmikroskopie mit Auflösungen im Bereich von 50 nm.
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Mit
der optischen Nahfeldmikroskopie, welche Streusonden oder angespitzte
Fasern mit Nano-Aperturen nutzen, sind Auflösungen von
einigen nm erzielbar (E. Betzig, et al., Biophysical J.
49, 269 (1986); F. Zenhausern, et al., Science
269, 1083 (1995); E. Betzig, et al., Science 251,
1468 (1991); A. Lewis, K. Lieberman, Nature 354,
214 (1991); K. Lieberman, et al., Science 247,
59 (1990)). Eine Auflösung von 70 nm ist durch
die Verwendung von Immersionslinsen erzielt worden (L. P.
Ghislain, V. B. Elings, Appl. Phys. Lett. 72, 2779 (1998).
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Es
existieren bisher nur relativ wenige Publikationen (hauptsächlich
von der Gruppe Keilmann und Mitarbeiter) über Nahfeld-Mikroskopie
im infraroten Spektralbereich. In der Literatur finden sich Beispiele
unter Verwendung von Mikrowellen (
W. Krieger, et al., Physical
Review B 41, 10229 (1990);
B. Knoll, et al., Appl.
Phys. Lett. 70, 2667 (1997);
B. Knoll, F. Keilmann,
Optics Communications 162, 177 (1999)), Fern-Infrarot oder
THz-Wellen (
Hou-Tong Chen, et al., Applied Physics Letters
83, 3009 (2003);
U. Schade, et al., Applied Physics
Letters 84, 1422 (2004)) und im mittleren Infrarot (im
Wesentlichen mit dort vorhandenen CO
2-Lasern)
B.
Knoll, F. Keilmann, Journal of Microscopy 194, 512 (1999);
B.
Knoll, F. Keilmann, Nature 399, 134 (1999);
E.
Bründermann, M. Havenith, Annu. Rep. Prog. Chem., Sect.
C: Phys. Chem., DOI: 10.1039/b703982b(2008)).
DE-A-10 2005 029 823 beschreibt
ein Verfahren zur tiefenaufgelösten Nahfeldmikroskopie,
das sowohl für UV-, VIS- und IR bis hin zum Mikrowellenbereich
anwendbar ist.
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Im
langwelligen infraroten Spektralbereich erweisen sich Glasfasern
als ungünstig, da der Bereich der gezogenen (tapered) Faser
höhere Verluste erzeugt, als im optischen Spektralbereich.
Ebenso ist das Fasermaterial, z. B. aus Silberhalogeniden oder Chalcogeniden,
schwerer zu bearbeiten als Fasern aus Glas im optischen Bereich,
die mit kommerziellen Ziehsystemen und aufgrund der Fließeigenschaften von
Glas relativ leicht auf Durchmesser von 100 nm gezogen werden können.
Daher sind faserbasierte Infrarot-Nahfeldmikroskope mit tetraedal
oder pyramidal angespitzten Fasern bis auf einen Faktor 2–5 (P.
Ephrat, et al., Appl. Phys. Lett. 84, 637 (2004)) nicht
besser als IR-Fernfeld-Systeme λ/(2n), wobei n der Brechungsindex
des Mediums ist.
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Zurzeit
scheint die Verwendung von Nano-Spitzen als Streusonden die beste
Möglichkeit zu sein, Auflösungen im Nanometerbereich
im infraroten Spektralbereich zu erreichen. Benutzt man eine sehr
kleine Spitze als Streuquelle, z. B. einen metallisierten Cantilever
eines Rasterkraft-Mikroskops (atomic force microscrope – AFM),
und führt diese nahe an die Probe heran, so kann das Nahfeld des Objekts
mit einer Auflösung im Nanometer-Bereich abgerastert und
im Fernfeld auf einen Detektor abgebildet werden.
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Grundvoraussetzung
für die Infrarot-Nahfeld-Mikroskopie sind Strahlungsquellen
großer Leistung. Diese sind aus einer einfachen Überlegung über
die relevanten Flächen notwendig: eine 30 nm durchmessende
Spitze kann aus einem Fokuspunkt mit 3 μm Durchmesser (bei
6 μm Wellenlänge der kleinste erreichbare Wert
nach Abbe) nur 1/10000 der Leistung modulieren. Hinzu kommen noch
weitere Verluste in der Kopplung der elektromagnetischen Welle des
Lasers in die Spitze, die man sich vereinfacht als Antenne denken
kann. Als Folge treten Leistungsverluste im Bereich von sechs Größenordnungen
und mehr auf. Wird die Spitze im wässrigen Medium genutzt
sind zusätzliche Leistungsverluste zu erwarten. Somit sind
leistungsstarke Strahlungsquellen notwendig, um ausreichend Streustrahlung
und Leistung für die Detektion zu erzeugen.
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Nur
durch IR-Nahfeldmikroskopische Methoden können allerdings
Ortsauflösungen unterhalb von einer Wellenlänge
von 1 μm erreicht werden. Eine Auflösung von einem μm
ist aber im Allgemeinen unzureichend, um eine chemische Kartierung
innerhalb von Zellen oder Membranen vorzunehmen.
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Eine
Kombination der IR-Nahfeldmikroskopie mit anderen etablierten Spektroskopiemethoden ist
bisher noch niemals realisiert worden.
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Kurzbeschreibung der Erfindung
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein Verfahren und eine
Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, in dem/der die Kombination
von etablierten Fluoreszenztechniken mit der markerfreien IR-Detektion
ermöglicht wird, wobei für eine Anwendung in biologischen
Proben gewährleistet sein muss, dass an der gleichen, bis
auf nm identischen Ortsposition gleichzeitig das Fluoreszenzlicht
des markierten Proteins und die Änderung der Umgebung anhand
der Änderung im IR Spektrum sichtbar gemacht werden kann.
Dies wurde durch das Verfahren der vorliegenden Anmeldung und dafür
geeignete Vorrichtung gewährleistet.
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Die
Erfindung betrifft somit
- (1) ein Verfahren
zum Nachweis von funktionellen Strukturen in einer biologischen
Probe, bestehend aus einer Kombination von (a) Nahfeld-Mikroskopie
im infraroten (IR) oder Terahertz (THz) Bereich mit (b) einem oder
mehreren spektroskopischen Verfahren ausgewählt aus Ramanmikroskopie, Fluoreszenzspektroskopie
und topographische Methoden, wobei das Verfahren Fokussierung der Probe
und gleichzeitige oder sequenzielle Bestimmung von (a) und (b) in
der Probe umfasst;
und
- (2) eine Vorrichtung insbesondere zur Durchführung
des zuvor genannten Verfahrens mit
– einer Einrichtung
zur Infrarot-(IR-) oder Terahertz-(THz-)mikroskopischen Untersuchung
der Probe im IR- oder THz-Bereich und
– einer Einrichtung
zur zusätzlichen fluoreszenzspektroskopischen Untersuchung
der Probe.
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Zweckmäßigerweise
ist hierbei vorgesehen, dass die Vorrichtung durch eine weitere
Einrichtung zur topographischen Untersuchung der Probe gekennzeichnet
ist, wobei die Einrichtung ein der Oberflächenstruktur
der Probe nachführbares Abtastelement aufweist.
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In
vorteilhafter Weiterbildung der Erfindung ist ferner vorgesehen,
dass das Abtastelement eine axiale Erstreckung aufweisende Abtastspitze
eines Raman und/oder Rasterkraft-Mikroskops ist, die einen axialen
Kanal für den Transport der elektromagnetischen Strahlung
der Einrichtung für die fluoreszenzspektroskopische Untersuchung
der Probe aufweist und als Antenne die IR- oder THz-Strahlung der Einrichtung
zur nahfeldspektroskopischen Untersuchung der Probe aussendet.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren (1) kann z. B.
die Diffusion eines Markerproteins verfolgt werden und die gleichzeitigen Änderungen
in der Membran anhand der Änderung der für die
Sekundärstruktur spezifischen Amidbande sichtbar gemacht
werden. Weiterhin ermöglicht das Verfahren simultan eine
markerfreie Selektion von Hybridisierung z. B. auf DNA Chips im
nm-Maßstab und eine auf optischen Markern beruhenden Fluoreszenz-Nachweis.
Schließlich ist es noch zur Beobachtung des Signaltransport
in Zellen und zur markerfreien Beobachtung des Transportes von z.
B. pharmakologisch relevanten Substanzen in Zellen geeignet. Besonders
interessant ist das Verfahren, da zunehmend spezielle IR-Marker
synthetisiert werden können. Durch eine Kombination der
verschiedenen Techniken können mehrere Komponenten gleichzeitig
nachgewiesen werden.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1: Übersicht
verschiedener Methoden bezüglich chemischer Selektivität
in Relation zur räumlichen Auflösung (adaptiert
von G. von Basum, et al., Opt. Lett. 29, 797 (2004)).
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2:
Detail-Bild mit den Komponenten: Flüssigkeitszelle, Laser,
AFM-Spitze, Detektion. Die gestrichelte Messeinheit mit Detektor
(Messung in Reflektion) ist bei leerer Flüssigkeitszelle,
schwach absorbierenden Flüssigkeiten oder bei trockenen Proben
nutzbar. Es ist auch möglich interferometrisch zu messen,
indem die Streustrahlung entlang des Strahlengangs des Lasers rückverfolgt
und durch einen Strahlteiler vor dem Laser auf den Detektor abgelenkt
wird.
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3:
Aufbau des WITec Systems, worin U1 eine XY-Positioniereinheit; U2
ein Scanningtisch; U3 ein Objektivrevolver mit Objektiven einschließlich
des Trägheitsantriebs und der SNOM-Spitze; U4 ein dichroitischer
Spiegel; U5 eine Strahlablenkungseinheit; U6 ein Binokulartubus
mit Okularkamera; U9 eine Schubstange; U11 eine Laserkopplungseinheit, optischer
Input; U14 ein Mikroskop-Z-Tisch mit Schrittmotor; M7 ein Hellfeld-Blendenschieber
mit Zentrierschrauben und Rändelrad; ein M9 Objektivrevolver;
M10 ein Reflektorschieber; L1 ein Sammelobjektiv des inversen Mikroskops;
L2 ein manueller Justierknopf für die Z-Position des inversen
Mikroskops; L3 eine motorgetriebene X-Y-Z-Positioniereinheit des
inversen Mikroskops; L4 ein Umlenkspiegel; L7 eine Tubuslinse; L8
ein klappbarer Spiegel; L14 eine Hochempfindliche Schwarzweiß-Video-CCD-Kamera;
E2 eine Einmodenlichtleitfaser; E3 ein Laser und E5 ein spezieller
Strahlengang, der zum externen Detektor ausgekoppelt werden kann, ist.
Der klappbare Spiegel L8 erlaubt die Auskopplung des Streulichts
entlang des Magenta eingefärbten Strahlengangs E5 für
eine nachfolgende Detektionseinheit. Alternativ kann das Licht auch
durch einen weiteren klappbaren Spiegel zwischen L4 und L8 ausgekoppelt
werden.
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4:
Aufbau eines Rasterkraft-Mikroskops (AFM) für die Scanning
Nahfeld-Infrarot-Mikroskopie (SNIM).
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von
funktionellen Strukturen in biologischen Proben gemäß Aspekt
(1) der Erfindung wird durch die Kombination von Nahfeld-Mikroskopie
im infraroten (IR) oder Terahertz (THz) Bereich mit Ramanmikroskopie,
Fluoreszenzspektroskopie und/oder topographische Methoden, strukturelle
Information über die Probe erhalten.
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Die „Fokussierung” der
Probe im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst dabei sowohl das Einbringen
einer festen Probe auf einem geeigneten Träger (Fokussierung
im engeren Sinne) als auch das Einbringen einer flüssigen
Probe in einer geeigneten Messzelle.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren können
insbesondere lebende Zellen bzw. Zellsysteme, Vorstufen wie artifizielle
Membransysteme mit Lipiden und Membranen, Zelldetails mit nanometrischer Auslösung,
Membransegmente und eingebettete Membranproteine untersucht werden.
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Zwar
ist die Messung in Flüssigkeiten, insbesondere wässrigen
Lösungen, nicht unproblematisch, da diese im IR und THz
Spektralbereich stark absorbieren. Durch Einsatz einer geeigneten
Flüssigkeitszelle, die die Bedingungen von lebenden Zellen bzw.
Teilsystemen sowie effiziente IR und THz Strahlungseinkopplung und
-auskopplung gewährleisten, und den Einsatz von IR und
THz Lasern mit hoher Leistung im Dauerbetrieb (continuous wave)
lässt sich das Problem umgehen. Auch musste die Messtechnik
angepasst werden, um Messungen mit gepulsten Laserquellen durchzuführen
und um potentiell eine Zeitauflösung für Dynamiken
zu erreichen, für die eine Zeitbereichstechnik (Time-Domain-Spektroskopie – TDS)
nicht möglich ist: z. B. Laserpulszeiten im Nanosekundenbereich
und Pikosekundenbereich bzw. für gepulste Synchrotronstrahlung
und Free Electron Laser.
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In
einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens erfolgt eine Kombination von IR Nahfeld-Mikroskopie und
Rasterkraft Mikroskopie (Atomic Force Microscope – AFM)
und optional Fluoreszenzspektroskopie.
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Die
hierfür erforderliche Vorrichtung basiert z. B. auf einer
kommerziellen Vorrichtung der Firma WITec, die mit einem steuerbarer
Klappspiegel zur Auskopplung des infraroten Streulichts der AFM-Spitze
(AFM, Atomic Force Microscope = Rasterkraft-Mikroskop) versehen
wurde und die mit einem in Hardware und Software integrierten zusätzlichen
Lock-In zur phasenempfindlichen Messung des Streusignals aufgrund
der Modulation der AFM-Spitze versehen wurde (siehe 3 zum
allgemeinen Konzept sowie 2).
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Mit
dem in 4 gezeigten Aufbau wurden Lateralauflösungen
in Topographie und IR-spektroskopische Aufnahmen im Bereich von
30 nm × 30 nm erzielt. Eine weitere Erhöhung der
Auflösung ist durch Verwendung von schärferen
Spitzen möglich.
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Zur
phasenempfindlichen Detektion wird durch einen elektrisch angeregten
Piezokristall an der Spitze diese zu Eigenschwingungen angeregt,
so dass das Streusignal mit der Frequenz des AFM Balkens (AFM cantilever)
moduliert wird.
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Hiermit
wird die direkte, unmodulierte Streustrahlung herausgefiltert, die
auf die Probe außerhalb des AFM Balkens fällt.
Bei der Messung des Streusignals auf einer Oberschwingung (elektronischen Harmonischen)
des AFM Cantilevers wird dann auch das störende, gestreute
Signal von der Oberseite des Balkens reduziert. Es verbleibt der
nicht-lineare Streustrahlungsanteil der Nahfeld-Wechselwirkung zwischen
nanometrischer AFM-Spitze und Probe.
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Die
Oszillation des AFM Cantilevers wird auch als „non-contact” Modus
bezeichnet, da die mechanische Wechselwirkung mit der Probe gering
ist und sich damit für weiche Materialien wie biologische und
chemische Strukturen und damit für Zellen eignet.
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Durch
die Verwendung von Strahlungsquellen im mittleren IR mit hoher Leistung
sind Nahfeld-Messungen erst möglich, u. a. mit dem am Lehrstuhl
für Physikalische Chemie II der Ruhr-Universität Bochum
entwickelten optisch-parametrischen Oszillator (OPO). In Kombination
mit einem wellenlängenunabhängigen optischen Aufbau
zur Strahlformung und Strahlfokussierung kann ein „Table-Top”-System
realisiert werden. Die IR-Laserspektroskopie weist eine hohe Empfindlichkeit
auf. Nachweise im parts-per-trillion-(ppt)-Bereich wurden bereits
realisiert (G. von Basum, et al., Opt. Lett. 29, 797 (2004)).
Eine Messung ist daher in sehr kurzen Zeiten im Millisekunden-Bereich
möglich. Gebiete von 1 μm2 großen
Flächen können mit 30 nm Auflösung in ca.
1 Sekunde kartiert werden (rote Blutkörperchen haben z.
B. einen Durchmesser von 2–4 μm). Somit sind auch
schnelle Änderungen detektierbar. Ziel ist es, Prozesse
in lebenden Zellen in Echtzeit zu verfolgen. Interessante neue Fragestellungen
umfassen dabei den Auf- und Abbau von Lipiden in der Zelle bei der
Fortbewegung, Veränderung bei Zellteilung oder Zelltod,
Strukturänderung von Lipiden, aufgrund der Zugabe von Signalproteinen,
Detektion von Proteinaggregation (lipid rafts) in Membranen.
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Zurzeit
ist das Nanoskop des Lehrstuhls für Physikalische Chemie
II der Ruhr-Universität Bochum im Bereich der charakteristischen
Lipid-Bande 2500–4000 nm und Amid-Bande/Protein-Bande 5000–6600
nm ausgetestet. Dazu wurde aufbauend auf den Erfahrungen bei der
Realisierung eines Nahfeld-IR-Mikroskops im Frequenzbereich des
CO2 Lasers (9000–10000 nm) vorgegangen,
der von Knoll und Keilmann publiziert (B. Knoll, et al.,
Appl. Phys. Lett. 70, 2667 (1997); B. Knoll, F.
Keilmann, Optics Communications 162, 177 (1999)) wurde.
Der derzeitige Aufbau ist in 4 dargestellt,
der die Möglichkeiten eines AFMs mit der IR Nahfeld-Mikroskopie verbindet.
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Der
IR-Strahl des OPO wird auf die Spitze des AFM fokussiert und beleuchtet
dabei die Probe, die in X-Y-Z-Richtung gerastert/gescannt werden kann.
Der AFM-Cantilever, und damit die Spitze, oszilliert im exponentiell
abfallenden Nahfeld der IR-beleuchteten Probe. Dabei wird vergleichbar
zum Tapping- oder Dynamic-Modus des AFMs die Eigenschwingung des
AFM-Cantilevers zum phasenempfindlichen Nachweis genutzt. Dieser
wird durch eine Frequenz im Bereich von 100 bis 190 kHz anregt,
wobei die Frequenz von den Materialeigenschaften des kommerziellen
Cantilevers abhängt. Auch niedrigere Frequenzen im Bereich
von 10 kHz sind möglich. Für die Messung kann
in dieses System z. B. ein kommerzielles AFM von Nanotec (www.nanotec.es,
Spanien) verwendet werden.
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Der
AFM-Kopf wurde für die Anwendung im zuvor beschriebenen
System neu konstruiert, da typische AFM-Systeme die Spitze über
die Probe scannen. Für eine optimale Fokussierung des IR-Lichtes auf
die Spitze ist eine fixierte Spitze, die vertikal – im Tapping-Modus – um
wenige Nanometer oszilliert, günstiger. Allerdings wird
die Ansteuerelektronik und Software für alle AFM-Modi des
Systems unverändert genutzt, wobei ein zusätzlicher
Kanal das optische Streusignal durch das Nahfeld mit der Topografie
und verschiedene andere Signaturen, z. B. Normal-Force-Signale,
simultan aufzeichnet. Die Nanospitze befindet sich typischerweise
im Abstand von wenigen bis einigen zehn Nanometern von der Probe.
Das Streulicht wird z. B. über eine Kalziumfluorid-(CaF2)-Linse auf einen IR-Detektor geführt
(Mercury-Cadmium-Telluride-(MCT)-Detektor). Der Nachweis des Streulichtes
wird phasensensitiv mithilfe eines Lock-In-Verstärkers
erfasst, wobei die Modulation über die Eigenschwingung
oder Harmonische der Eigenschwingung der AFM Spitze erfolgt. Somit
entstehen dann simultan topographische und IR-Nahfeld Bilder entsprechend
der vorgegeben Auflösung und der Größe
des Gebietes, das untersucht wird.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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