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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro System zum Testen Infektiositäts-beseitigender
Mittel und/oder Infektiositäts-beseitigender Maßnahmen
gegen Viren insbesondere Hepatitis-Viren mit Hilfe von Hepatozyten
aus Tupaia sp. (Südostasiatische Spitzhörnchen).
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Beschreibung und Einleitung
des allgemeinen Gebietes der Erfindung
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Die
Erfindung befasst sich mit der Entwicklung und Validierung von Verfahren
zum Nachweis der Wirkung von Mitteln und Maßnahmen zur
Inaktivierung und Neutralisierung der Virus-Infektiosität,
insbesondere der Infektiosität von Hepatitis B-Viren (HBV).
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Es
ist bekannt, dass einfache physikalische Desinfektionsmaßnahmen
gegen Krankheitserreger und deren Dauerformen über Hitze,
Kälte, Trocknung oder Bestrahlung nur sehr begrenzt einsetzbar
sind. Besonders schwierig ist es, Blut und Blutprodukte von Krankheitserregern
freizuhalten oder zu dekontaminieren. Größtes
Interesse gilt dabei der Virusdesinfektion des HBV, da bereits geringste
Mengen (1–10 Viren) zu einer Infektion führen
können.
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Der
Stand der Technik kennt zahlreiche Maßnahmen und Mittel
zur Flächen- oder Instrumentendesinfektion bzw. Beseitigung
von Krankheitserregern. So wird z. B. in
DE 102 23 934 A1 ein Desinfektionsmittel
mit Wirksamkeit gegen Hepatitis B-Viren beschrieben. Als bester
direkter Test der (Rest)-Infektiosität von HBV nach Desinfektionsmittelbehandlung
dienten in der Vergangenheit Schimpansen. Aufgrund der schon damals nicht
ausreichenden Zahl an Tieren, waren gesicherte statistische Auswertungen
nicht möglich. Heute sind aus ethischen und finanziellen
Gründen, Schimpansenversuche in diesem Zusammenhang überhaupt
nicht mehr durchführbar.
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Aus
Ermangelung eines direkten Tests für die positive Wirkung
dieser Mittel und Maßnahmen zur Inaktivierung und Neutralisierung
der Virus-Infektiosität, wurde und wird die Wirksamkeit
des Mittels gegen HBV nur indirekt nachgewiesen. Beim „morphological
alteration and disintegration test" (MADT) werden mit dem Elektronenmikroskop
(EM) morphologische Veränderungen der viralen Partikel
nach Behandlung untersucht, wie z. B. Zerstörung der Virushülle
[1, 2]. Dieses Verfahren ist durch die visuelle Beurteilung sehr
subjektiv und schwierig zu interpretieren, zumal manche Desinfektionsmittel,
wie z. B. Aldehyde, fixierende Eigenschaften haben, die nicht zu
einer im EM sichtbaren Strukturveränderung des Virus führen
[3]. Beim „endogenen Polymerase Test" wird die Aktivität
der im Viruspartikel verpackten HBV-Polymerase auf den Einbau von
radioaktiv markierten Nukleotiden in das HBV-Genom überprüft.
Ein Verlust dieser Aktivität nach Inaktivierungsver fahren wird
dann mit dem Verlust der Infektiosität gleichgesetzt. Diese
Methode ist jedoch in der Literatur sehr umstritten und ist zudem
nicht sensitiv [3].
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In
einer weiteren Methode wird die Zerstörung der Antigenität
des viralen Oberflächenproteins (Hepatitis B surface antigen,
HBsAg) angegeben. In diesem indirekten Test wird dem zu testenden
Desinfektionsmittel HBsAg-haltiges Serum, Aqua bidest und eine 2%
Serumalbuminlösung bzw. fötales Kälberserum
(FKS) zugesetzt. Nach einer definierten Einwirkzeit und Verdünnung
des Ansatzes wird mit radioaktiv markierten Antikörpern
gegen HBsAg in einem Radioimmunoassay (z. B. der Firma Abbott) die
Menge an Radioaktivität bestimmt und ermittelt. Entsprechend
dem von G. Frösner, G. Jentsch, H. Uthermann in
Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. B 176, 1, (1982) „Zerstörung
der Antigenität und Beeinflussung der immunochemischen
Reaktivität von Antigenen des Hepatitis B Virus durch Desinfektionsmittel
im Prüfmodell" beschriebenen Verfahrens wurde dann
von einer völligen Inaktivierung des HBsAg ausgegangen,
wenn die Radioaktivität (cpm) nach Einwirkung des Desinfektionsmittels
unter dem 2,1 fachen der Radioaktivität (cpm) der Versuchsansätze
ohne Viruszugabe lag [4]. Bei diesen Arbeiten wurde jedoch mit kommerziellen
Testkits zur HBsAg Bestimmung gearbeitet, bei dem nichts über
Art der enthaltenen Antikörper und deren Epitope bekannt
war.
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In
einer Weiterentwicklung dieser Surrogattests wurde die Zerstörung
von definierten Epitopen des HBsAg nach Inaktivierungsverfahren
mit charakterisierten monoklonalen anti-HBs Antikörpern
mittels ELISA untersucht [5]. In dieser Studie wurde die Zerstörung
des viralen HBV DNA-Genoms durch Nukleinsäurezerstörende
Desinfektionsmittel mit Hilfe der Polymeraseketten Reaktion (PCR)
untersucht. Dies erfolgte in Übereinstimmung mit der Richtlinie
des Bundesgesundheitsamtes von 1982 (Bundesgesundheitsblatt
25, 1982, Seiten 397–398) und der Deutschen Vereinigung
zur Bekämpfung von Viruserkrankungen e. V. (DVV) zur Prüfung
von chemischen Desinfektionsmitteln auf Wirksamkeit gegen Viren.
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Alle
oben genannten Surrogatteste zeigen jedoch einen mangelnden Bezug
zur Infektosität des HBV.
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Weitere
Surrogattests für HBV beziehen sich auf die Inaktivierung
anderer umhüllten Viren, wie Sindbis oder Herpesviren,
die jedoch aufgrund der Strukturunterschiede der Oberflächenproteine
zu HBV stark abweichen und nur sehr eingeschränkt auf HBV übertragbar
sind. Um dieses Problem zu umgehen, wurde auf animale Hepatitis
B Virus Spezies zurückgegriffen, die zur Familie der Hepadnaviridae
gehören. Insbesondere wurde dabei das Enten (engl. duck)
Hepatitis B Virus (DHBV) aus der Ordnung der Avihepadnaviridae verwendet.
Infektionsstudien mit Peking Enten, die sich mit DHBV infizieren
lassen, aber auch mit bebrütete Enteneier, sowie primäre
Entenhepatozyten Kulturen sind möglich. Dieses System wurde
als Surrogatsystem für HBV zur Validierung der Virus-Inaktivierung
in Blutprodukten durch Psoralen und UV-Licht [6] sowie der DNA-zerstörenden
Chemikalie PEN 110 benutzt [7]. Obwohl DHBV zur gleichen Virusfamilie
gehört wie HBV, zeigt DHBV sehr geringe Übereinstimmung
in der Genomsequenz zu HBV. Zudem zeigen die HBV-Oberflächenproteine
eine stärkere Vernetzung über Disulfid-Brücken,
als DHBV, was zur stärkeren Resistenz von HBV gegenüber
Desinfektionmitteln führen kann (Übersicht in:
[8]).
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Infektionssysteme für HBV
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HBV
ist sehr Organ- und Wirtsspezifisch, d. h. es infiziert primär
nur den Menschen und einige wenige höhere Primaten, eine
produktive Infektion findet nur in differenzierten Leberparenchymzellen
(Hepatozyten) statt. Es existiert kein einfaches Tiermodell zum
Testen der Infektiosität, zudem können für
in vitro Infektionsversuche nur primäre humane Hepatozyten
aus chirurgischen Leberteilresektaten verwendet werden, die jedoch
sehr variabel in Verfügbarkeit, Suszeptibilität
und Viabilität sind (Übersicht in: [8]). Alle
bekannten Leberzelllinien sind nichtsuszeptibel für HBV.
Als einzige Ausnahme ist die HepaRG-Zelllinie [9] zu nennen, die
nach 4 wöchiger Kultivierung eine begrenzte Suszeptibilität
für HBV aufweist [9]. Allerdings ist diese Suszeptibilität sehr
von den Kulturbedingungen abhängig (wie z. B. speziellen
Chargen von fötalem Kälberserum).
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Es
besteht daher der Bedarf an einem verbesserten Testsystem zum Nachweis
der Wirkung Infektiösitäts-beseitigender Mittel
und Infektiositäts-beseitigender Maßnahmen gegen
Krankheitserreger insbesondere HBV, der die Nachteile des im Stand
der Technik bekannten indirekten Tests behebt und auch den neueren Richtlinien
des Robert-Koch-Institutes und des DVV, nach denen die Wirksamkeit
von anti-infektiösen Zusammensetzungen oder Desinfektionsmitteln über
4log10 Verdünnungsstufen messbar sein muss, berücksichtigt.
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Aufgabe
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es einen verbesserten Test zum Nachweis
der Wirkung Infektiositäts-beseitigender Mittel und/oder
Infektiositäts-beseitigender Maßnahmen gegen Krankheitserreger
insbesondere HBV bereitzustellen, sowie ein Verfahren zur Durchführung
des Testes.
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Lösung der Aufgabe
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Ansprüche
gelöst, insbesondere durch ein Testsystem gemäß Anspruch
1 unter Bereitstellung von Tupaia-Hepatozyten und gereinigten humanen
Hepatitisviren, sowie ein Verfahren zu dessen Durchführung.
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Das
erfindungsgemäße Testsystem hat den Vorteil dass
zur Infektion der Hepatozyten humane Hepatitisviren vorzugsweise
gereinigte HBV bzw. gereinigte Virionen aus dem Serum/Plasma HBV-infizierter
Menschen bereit gestellt werden. Diese Viren zeigen im Gegensatz
zu rekombinanten Viren aus Zellkulturen eine größere
Homogenität in Strukturmerkmalen der Infektiosität
und zeigen die typische Widerstandsfähigkeit gegenüber
Infektiositäts-beseitigenden Mitteln und Infektiositäts-beseitigender
Maßnahmen, die den rekombinanten Viren aus Zellkultur aufgrund
der Kultivierungsbedingungen meist verlorengegangen ist. Daher wird durch
die Verwendung von humanen Hepatitisviren vorzugsweise gereinigten
HBV bzw. gereinigten Virionen aus dem Serum/Plasma HBV-infizierter
Patienten zur Infektion der Hepatozyten, die tatsächliche
Infektionssituation im Testsystem besser dargestellt.
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Das
erfindungsgemäße Testsystem hat weiterhin den
Vorteil dass für die Infektion mit humanen Hepatitisviren
Hepatozyten aus Tupaia sp. z. B. von Tupaia belangeri bereitgestellt
werden. Diese Tupaiahepatozyten weisen vorteilhafterweise eine reproduzierbare
Lebensfähigkeit (Viabilität) und hohe Empfänglichkeit (Suszeptibilität)
für HBV auf.
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Bisher
war es aufgrund der Spezies-Spezifität von HBV nur möglich,
primäre humane Hepatozyten mit HBV in vitro zu infizieren.
Diese Zellen müssen jedoch mit chirurgischen Eingriffen
entnommen werden und sind daher nur schwer verfügbar.
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Zudem
zeigen zahlreiche Studien, dass diese primären humanen
Hepatozyten starke Schwankungen in der Viabilität und auch
der Suszeptibiliät für HBV aufweisen (Übersicht
in: [8]), sie sich daher nicht für den Einsatz in einem
Testsystem eignen.
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Das
Verfahren zur Testdurchführung umfasst die Bereitstellung
von Tupaia Hepatozyten und gereinigten humanen Hepatitisviren, die
optimierte Infektion der Tupaia Hepatozyten nach Behandlung mit
dem mindestens einem Infektiositäts-beseitigenden Mittel
und/oder nach Behandlung mit mindestens einer Infektiositäts-beseitigenden
Maßnahme im Vergleich zur Nichtbehandlung oder im Vergleich
mit der Bandlung mit mindestens einem Kontrollmittel, sowie die
Auswertung der Wirksamkeit dieser Mittel bzw. Maßnahmen
auf die Infektiosität.
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Das
Verfahren zur Testdurchführung hat den Vorteil dass die
Wirksamkeit der Infektiositäts-beseitigenden Mittel und/oder
der Infektiositäts-beseitigenden Maßnahmen in
quantitativen, methodisch unabhängigen, alternativen Verfahren
zum Nachweis der HBV Infektion über 3log10 Verdünnungsstufen
vorzugsweise 4log10 Verdünnungsstufen nachgewiesen wird.
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Zu
diesen Verfahren gehören beispielsweise Messungen, die
eine Neuproduktion viraler, HBV-spezifischer Proteine nachweisen,
wie z. B. Nachweis der Produktion und/oder Sekretion von viralen
Proteinen durch Antikörper z. B. mittels ELISA oder Western-Blot
(z. B.: HBsAg und HBeAg im Überstand infizierter Zellen);
Nachweis der Synthese und/oder Sekretion von viralen Proteinen durch
die Zugabe radioaktiver Stoffe (z. B. radioaktiv markierter Aminosäuren
oder Nukleotide, als „metabolische Markierung"). Desweiteren
die HBV mRNA-Bestimmung in infizierten Zellen und der Nachweis des
episomalen Genoms oder replikativer Intermediate in der Zelle oder
in sekretierten Viren mittels Nukleinsäure-Amplifikations-Techniken
(z. B.: PCR), Southern-Northern-Blots oder weiterer Hybridisierungs-Techniken
wie z. B. der Fluoreszenz- in situ Hybridisierung (FISH); oder mit
Hilfe der Zugabe radioaktiv markierter Nukleotide, die in das virale
Genom, HBV replikative Intermediate oder virale mRNA eingebaut werden
können („metabolische Markierung” von
Nukleinsäuren). Alternativ werden mittels kommerzieller
Antikörper virus-spezifische Proteine in den infizierten
Zellen nachgewiesen (z. B. über Immunfluoreszenz oder Immuncytochemie).
Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
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Der
Begriff Infektiositäts-beseitigendes Mittel umfasst alle
flüssigen und festen Stoffe oder Stoffgemische, die dazu
geeignet sind, totes oder lebendes Material in einen Zustand zu
versetzen, dass es nicht mehr infizieren kann. Dies sind Stoffe
oder Stoffgemische, die zur Vernichtung von Krankheitserregern,
Entseuchung, Entkeimung eingesetzt werden, wie Desinfektionsmittel
zur Hände-, Flächen- und Instrumenten-Desinfektion,
z. B. Peressigsäure, Wasserstoffperoxid, Natriumhypochlorit,
Chlor, Ozon, Iod, Aldehyde, Ethylenoxid und Detergenzien. Kommerziell
erhältlich ist Sagrotan®,
ein Desinfektionsmittel für Gegenstände und Flächen,
das bakterizid, fungizid und teilweise viruzid wirken soll. Wirksame
Bestandteile darin sind 2-Propanol, Ethanol und Glyoxal. Sterilium® ist ein Desinfektionsmittel/Antiseptikum
speziell für Haut und Schleimhäute zur Hautdesinfektion
vor chirurgischen Eingriffen. Es wird viruzid gemäß RKI-Empfehlung
Bundesgesundheitsblatt 01/2004 gegen Hepatitis B, Hepatitis C und
HIV eingesetzt und besteht aus 2-Propanol, 1-Propanol und Mecetroniumetilsulfat.
Betadine oder Betaisodona® Lösung.
Der Wirkstoff ist 10 mg Iod als Polyvidon-Iod pro 1 ml Lösung.
Als Infektiositäts-beseitigende Mittel werden zudem biologische
Enzyme wie beispielsweise Proteasen verwendet.
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Kontrollmittel
sind positive oder negative Kontrollmittel, wobei die negativen
Kontrollmittel keine oder nur geringe Auswirkung auf die Infektiosität
haben, wie beispielsweise Wasser, THM Medium und wobei die positiven
Kontrollmittel, eine nachgewiesene Reduktion der HBV Infektion über
3log10 Verdünnungsstufen vorzugsweise über 4log10
Verdünnungsstufen bewirken, wie z. B. Peressigsäure
und Formaldehyd-Lösung.
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Der
Begriff Infektiositäts-beseitigende Maßnahme umfasst
physikalische Desinfektionsmaßnahmen gegen Krankheitserreger
und deren Dauerformen über Hitze, Kälte, Trocknung,
Druck oder Bestrahlung.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren wird zum Nachweis der
Wirkung mindestens eines Infektiositäts-beseitigenden Mittels
und/oder mindestens einer Infektiositäts-beseitigenden
Maßnahme gegen Krankheitserreger insbesondere HBV verwendet, über
3log10 Verdünnungsstufen vorzugsweise über 4log10
Verdünnungs stufen. Eine weitere Verwendung stellt der Nachweis
von möglichen Resistenzen von HBV gegen bestimmte Infektiositäts-beseitigende
Mittel und Maßnahmen dar.
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Ausführungsbeispiele
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1. Bereitstellung von Tupaiahepatozyten
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Die
Bereitstellung von Tupaiahepatozyten umfasst die Isolation und Kultivierung
von Tupaiahepatozyten. Diese Tupaiahepatozyten werden als primären
Zellen aus Tupaia belangeri (Südostasiatische Spitzhörnchen)
isoliert. Alternativ werden auch aus Tupaia Knochenmark oder Tupaia
Stammzellen hergestellte Hepatozyten eingesetzt.
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Die
Isolation von primären Tupaiahepatozyten erfolgt nach einer
modifizierten „Zwei-Schritt-Kollagenase-Methode" nach Seglen
[10]. Entsprechend den Tierschutzrichtlinien wird das Tier getötet
und nach Eröffnung des Abdomens wird die Leber über
die Pfortader (Vena portae) mit einem Schlauchpumpensystem mit HBSS
(Hanks' Balanced Salt Solution ohne MgCl2 und
CaCl2)/5 mM EGTA (z. B. der Firma Invitrogen)
perfundiert. Nach vorzugsweise 20-minütiger Perfusion wird
die Leber noch ca. 10 Minuten mit HBSS ohne EGTA und danach für
ca. 15–20 Minuten mit einer Kollagenaselösung
perfundiert (250 mg Kollagenase I oder IV, z. B. der Firma Sigma
in geeignetem Medium z. B. 200 ml vorgewärmtes DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle Medium z. B. der Firma Invitrogen), gelöst
und sterilfiltriert). Nach Entfernung der Galle wird die Leber zerkleinert, die
Suspension durch eine Siebdruckgaze (vorzugsweise Porengröße
210 μm, z. B. von Koenen Siebdrucktechnik, München)
filtriert, um eine Abtrennung der nicht perfundierten Gewebeteile
zu erreichen. Das Filtrat wird zentrifugiert, vorzugsweise in 50
ml Röhrchen bei 4°C und 40 × g für
6 min. Der Überstand wird verworfen, das Pellet langsam
in geeignetem Medium, z. B. 10 ml DMEM (4°C) resuspendiert
und mit geeignetem Medium, z. B. DMEM (4°C) wieder aufgefüllt,
z. B. auf 40 ml. Dieser Waschvorgang wird vorzugsweise dreimal durchgeführt,
wobei die Zellen nach der letzten Zentrifugation in Medium, vorzugsweise
30 bis 40 ml Tupaia Hepatozyten Medium (THM) + 10% Fötales
Kälber Serum (FKS z. B. der Firma Invitrogen) aufgenommen
werden.
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An
dieser Stelle wird alternativ eine Viabilitätsprüfung
z. B. mittels WST-1 Test (Fa. Roche) durchgeführt. Die
Viabilität liegt vorzugsweise bei ca. 95%. Die Suspension
weist vorzugsweise 99% Hepatozyten auf. Zellkulturplatten (z. B.
12-well Platten der Firma BD) werden mit einer speziellen extrazellulären
Matrix beschichtet (z. B. Collagen, der Firma BD, 1:20 in sterilem
Bidest verdünnt), davon werden vorzugsweise 0,5 ml pro
Well bei 37°C auf einem Schüttler mindestens 5
Minuten inkubiert, dann wieder abgenommen und die Platten nach kurzer
Trockenzeit verwendet. In jede Kavität der 12-well-Platte
werden 0,5 ml THM + 10% FKS vorgelegt und Hepatozyten in einer Zelldichte
von ca. 105 Zellen pro Well ausplattiert.
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Nach
vier Stunden Inkubation bei 37°C und 5% CO2 in
einem Brutschrank, wird das Medium entfernt und durch THM ohne FKS
ersetzt. Bis zum weiteren Gebrauch werden die Zellen im Brutschrank
gelagert (37°C, 5% CO2).
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Zusammensetzung des Tupaia Hepatozyten
Mediums (THM):
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Alle
Angaben beziehen sich auf 1 Liter Medium.
| 1 L | DMEM | z.
B. von Firma Invitrogen |
| 10
ml | ITS-Mix:
0,5 mg/ml Insulin | z.
B. von Invitrogen |
| | 0,5
mg/ml Transferrin | |
| | 0,5 μg/ml
Natriumselenit | |
| 2 g | Bovines
Serumalbumin | z.
B. von Sigma |
| 2 g | Glukose | z.
B. von Merck, Darmstadt |
| 2 g | Galaktose | z.
B. von Merck |
| 0,1
g | Ornithin | z.
B. von Sigma |
| 0,03
g | Prolin | z.
B. von Sigma |
| 0,61
g | Nikotinamid | z.
B. von Sigma |
| 0,544 μg | ZnCl2 | z.
B. von Fluka, Seelze |
| 0,75 µg | ZnSO4 × 7 H2O | z.
B. von Sigma |
| 0,2 µg | CuSO4 × 5 H2O | z.
B. von Sigma |
| 0,025 µg | MnSO4 | z.
B. von Sigma |
| 50 µM | Glutamax
I | z.
B. von Invitrogen |
| 0,01 µM | Dexamethason | z.
B. von Invitrogen |
| 100
mg | Gentamicin | z.
B. von Invitrogen |
| 250 µg | Amphotericin
B | z.
B. von Invitrogen |
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2. Bereitstellung von gereinigten humanen
Hepatitisviren
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Die
Bereitstellung von gereinigten humanen Hepatitisviren umfasst die
Isolation von HBV-Viren aus Seren oder Plasmen HBV-infizierter Menschen,
z. B. Menschen, die chronisch HBV infiziert sind und die Reinigung
z. B. mittels Saccharose-Dichtegradienten-zentrifugation nach Verfahren
von Glebe und Gerlich, 2004 [11]. Diese Reinigung der Viren führt
zu einer deutlichen Anreicherung der Viren mit der fast quantitativen
Abtrennung von Plasma/Serumproteinen und HBV subviralen Partikeln.
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3. Verfahren zum Nachweis der Wirkung
Infektiositäts-beseitigender Mittel und Infektiositäts-beseitigender Maßnahmen
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3.1. Inaktivierung der Viren durch Zugabe
des Infektiositäts-beseitigender Mittel bzw. der Kontrollflüssigkeit
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Aus
den isolierten und gereinigten HBV-Viren aus Seren oder Plasmen
HBV-infizierter Menschen wird eine Virusverdünnung in THM
Tupaia Hepatozyten Medium hergestellt, die somit eine definierte
Konzentration an gereinigten Viren enthält. Für
eine Reduktion der HBV Infektion über 3log10 Verdünnungsstufen
vorzugsweise über 4log10 Verdünnungsstufen, werden
vorzugsweise mindestens 1 × 108 Viren
eingesetzt. Der Virustiter wird nach Standardmethoden z. B. über
den Nachweis an Genom-Äquivalenten bestimmt.
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Ein
Versuchsansatz ist beispielsweise wie folgt zusammengesetzt:
10%
Virusverdünnung
10% humanes Negativ-Serum (negativ
auf die Anwesenheit von bekannten Viren und Antikörpern
gegen Hepatitis B Viren)
80% Infektiositäts-beseitigendes
Mittel oder Kontrollmittel
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Die
Virusverdünnung wird als letztes zu den beiden anderen
Komponenten gegeben, kurz vermischt und die Zeitnahme gestartet.
Nach bestimmten Einwirkzeiten z. B. 1 bis 5 Minuten werden Proben
entnommen z. B. 50–100 µl pro Ansatz und zur Entfernung
des Infektiositäts-beseitigenden Mittels bzw. des Kontrollmittels aus der
Probe durch Säulenchromatographie z. B. auf eine Illustra
MicrospinTM S-400 HR Säule (z.
B. der Firma GE Healthcare) gegeben und beispielsweise 2 Minuten
bei 2500 rpm zentrifugiert. Die Viruslösung (im Zentrifugat)
wird dann zur Infektion mit Tupaiahepatozyten eingesetzt.
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Alternativ
werden die isolierten und gereinigten HBV-Viren aus Plasmen HBV-infizierter
Menschen mit Infektiositäts-beseitigenden Maßnahmen
behandelt, wie beispielsweise Hitze z. B. 121°C, Kälte,
Trocknung, Druck und/oder Bestrahlung und anschließend
zur Infektion mit Tupaiahepatozyten eingesetzt.
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3.2. Infektion mit Tupaiahepatozyten
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Die
Infektion der Hepatozyten aus Tupaia belangeri erfolgt nach 48 h
oder 72 h nach der Aussaat von 105 Zellen
pro Well in einer 12-Well Schale bzw. 2,5 × 105 Zellen
pro Well in einer 6-Well Schale. Die Inokula werden für
mindestens 16 Stunden mit den Zellen inkubiert. Das Inokulum wird
durch zweimaliges Waschen mit 800 µl bzw. 2 ml DMEM entfernt.
Alle 72 Stunden wird das Medium gewechselt, indem die Zellkultur-Überstände
gesammelt und bei –20°C gelagert werden und 600 µl
(12-well) bzw. 1,5 ml (6-well) THM neu aufgelegt werden. Nach 360
Stunden wird die Zellviabilität bestimmt (z. B. mittels
Standard WST-1-Test). Dazu wird das WST-1-Reagenz (z. B. der Firma
Roche) 1:50 in DMEM (ohne Phenolrot, z. B. von Firma Invitrogen)
verdünnt und je 300 µl (12-well) bzw. 1 ml pro
Well (6-well) für eine Stunde bei 37°C mit den
Zellen inkubiert. Dabei wird das Tetrazolium-Salz WST-1 durch aktive
Enzyme in lebenden eukaryotischen Membranen zu einem löslichen Formazan
gespalten, dessen Menge dann der metabolischen Aktivität
der Zellen entspricht. Anschließend wird je 100 µl
in eine Mikrotiter-Platte überführt und die Extinktion
bei 450 nm (Referenz 620 nm) im Photometer gemessen.
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3.2. Nachweis der Wirksamkeit der Infektiositäts-beseitigenden
Mittel und/oder Infektiositäts-beseitigender Maßnahmen
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Die
Wirksamkeit der Infektiositäts-beseitigenden Mittel und/oder
Infektiositäts-beseitigenden Maßnahmen auf die
Infektiosität der HBV-Viren auf Hepatozyten aus Tupaia
belangeri erfolgt über 3log10 Verdünnungsstufen
vorzugsweise über 4log10 Verdünnungsstufen hinweg
mit Auswertung in quantitativen vorzugsweise methodisch unabhängigen
Verfahren zum Nachweis der HBV Infektion. Zu diesen Verfahren gehören
z. B. ELISA-Test zur Messung der Sekretion von viralen Proteinen
(HBsAg und HBeAg) im Überstand infizierter Zellen, sowie
die HBV mRNA-Bestimmung in infizierten Zellen.
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3.3. Nachweis der HBV Infektion in vitro
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3.3.1. Nachweis der Sekretion viraler
Proteine im Überstand von HBV-infizierten Zellen
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Die
HBsAg Konzentration der Überstände von infizierten
Zellkulturschalen wird mit Hilfe des Test-Kits Enzygnost 5.0 (z.
B. der Firma Dade Behring) nach Anleitung der Produktbeschreibung
durchgeführt.
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1 zeigt
die Auswertung einer Infektion der primären Hepatozyten
aus Tupaia belangeri (PTH) mit Hepatitis B Viren, die unbehandelt
sind (Kontrolle, dunkelgrau) oder mit Peressigsäure (PAA,
hellgrau) behandelt wurden. Dargestellt ist die HBsAg-Sekretion
von mit infizierten Tupaiahepatozyten 15 Tage nach Inkubation mit
gereinigtem unbehandeltem HBV und mit Peressigsäure behandelter
Viren. HBV (in log10 Genomäquivalenten/105 Zellen) wird mit 0,5% (hellgrau) PAA oder
H2O (unbehandelt, dunkelgrau) für
5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird das Infektiositäts-beseitigenden
Mittel mit einer Gelfiltrations-Säule entfernt. Die gestrichelte
Linie entspricht dem Cut-off.
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3.3.2. Nachweis replikativer Intermediate
des HBV (z. B. HBV mRNA) in infizierten Zellen
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Zelluläre
mRNA der HBV-infizierten Kulturen wird zunächst isoliert
(z. B. mittels Dynabeads® mRNA DIRECT
Micro Kit, Fa. Invitrogen). Die HBV mRNA wird dann mittels real-time
RT-PCR spezifisch nachgewiesen (z. B. mittels LightCycler System
der Fa. Roche) und gegen einen HBV mRNA Standard quantifiziert [12].
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Literaturverzeichnis:
-
- 1. Thraenhart, O., R. Dermietzel, E.
Kuwert, and N. Scheiermann. (1977). [Morphological alteration and
desintegration of dane particles after exposure with "Gigasept".
A first methological attempt for the evaluation of the virucidal
efficacy of a chemical disinfectant against hepatitisvirus B (author's
transl)]. Zentralbl Bakteriol [Orig B]. 164(1–2): 1–21.
- 2. Thraenhart, O., E. K. Kuwert, N. Scheiermann, R.
Dermietzel, D. Paar, D. Maruhn, A. Alberti, H. J. Richter, and J.
Hotz. (1982). Comparison of the morphological alteration and disintegration
test (MADT) and the chimpanzee infectivity test for determination
of hepatitis B virucidal activity of chemical disinfectants. Zentralbl
Bakteriol Mikrobiol Hyg [B]. 176(5–6): 472–84.
- 3. Sattar, S. A., J. Tetro, V. S. Springthorpe, and
A. Giulivi. (2001). Preventing the spread of hepatitis B and C viruses:
where are germicides relevant? Am J Infect Control. 29(3): 187–97.
- 4. Frosner, G., G. Jentsch, and H. Uthemann. (1982).
[Destroying of antigenicity and influencing the immunochemical reactivity
of hepatitis B virus antigens (HBsAg, HBcAg and HBeAg) through disinfectants--a
proposed method for testing (author's transl)]. Zentralbl Bakteriol
Mikrobiol Hyg [B]. 176(1): 1–14.
- 5. Jursch, C. A., W. H. Gerlich, D. Glebe, S. Schaefer,
O. Marie, and O. Thraenhart. (2002). Molecular approaches to validate
disinfectants against human hepatitis B virus: Med Microbiol Immunol
(Berl). 190(4): 189–97.
- 6. Eble, B. E. and L. Corash. (1998). Duck hepatitis
B virus inactivation and 8-methoxypsoralen photoadduct formation
in human platelet concentrates. Photochem Photobiol. 67(6): 700–13.
- 7. Aytay, S., A. Ohagen, M. R. Busch, B. Alford, J.
R. Chapman, and A. Lazo. (2004). Development of a sensitive PCR
inhibition method to demonstrate HBV nucleic acid inactivation.
Transfusion. 44(4): 476–84.
- 8. Glebe, D. and S. Urban. (2007). Viral and cellular
determinants involved in hepadnaviral entry. World J Gastroenterol.
13(1): 22–38.
- 9. Gripon, P., S. Rumin, S. Urban, J. Le Seyec, D. Glaise,
I. Cannie, C. Guyomard, J. Lucas, C. Trepo, and C. Guguen-Guillouzo.
(2002). Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.
Proc Natl Acad Sci US A. 99(24): 15655–60.
- 10. Seglen, P. O. (1976). Preparation of isolated rat
liver cells. Methods Cell Biol. 13: 29–83.
- 11. Glebe, D. and W. H. Gerlich. (2004). Study of the
endocytosis and intracellular localization of subviral particles
of hepatitis B virus in primary hepatocytes. Methods Mol Med. 96:
143–51.
- 12. Glebe, D., M. Aliakbari, P. Krass, E. V. Knoop,
K. P. Valerius, and W. H. Gerlich. (2003). Pre-s1 antigen-dependent
infection of Tupaia hepatocyte cultures with human hepatitis B virus.
J Virol. 77(17): 9511–21.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - G. Frösner,
G. Jentsch, H. Uthermann in Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. B 176,
1, (1982) „Zerstörung der Antigenität
und Beeinflussung der immunochemischen Reaktivität von
Antigenen des Hepatitis B Virus durch Desinfektionsmittel im Prüfmodell" [0006]
- - Bundesgesundheitsblatt 25, 1982, Seiten 397–398 [0007]
- - Thraenhart, O., R. Dermietzel, E. Kuwert, and N. Scheiermann.
(1977). [Morphological alteration and desintegration of dane particles
after exposure with "Gigasept". A first methological attempt for
the evaluation of the virucidal efficacy of a chemical disinfectant
against hepatitisvirus B (author's transl)]. Zentralbl Bakteriol
[Orig B]. 164(1–2): 1–21 [0039]
- - Thraenhart, O., E. K. Kuwert, N. Scheiermann, R. Dermietzel,
D. Paar, D. Maruhn, A. Alberti, H. J. Richter, and J. Hotz. (1982).
Comparison of the morphological alteration and disintegration test
(MADT) and the chimpanzee infectivity test for determination of
hepatitis B virucidal activity of chemical disinfectants. Zentralbl
Bakteriol Mikrobiol Hyg [B]. 176(5–6): 472–84 [0039]
- - Sattar, S. A., J. Tetro, V. S. Springthorpe, and A. Giulivi.
(2001). Preventing the spread of hepatitis B and C viruses: where
are germicides relevant? Am J Infect Control. 29(3): 187–97 [0039]
- - Frosner, G., G. Jentsch, and H. Uthemann. (1982). [Destroying
of antigenicity and influencing the immunochemical reactivity of
hepatitis B virus antigens (HBsAg, HBcAg and HBeAg) through disinfectants--a
proposed method for testing (author's transl)]. Zentralbl Bakteriol
Mikrobiol Hyg [B]. 176(1): 1–14 [0039]
- - Jursch, C. A., W. H. Gerlich, D. Glebe, S. Schaefer, O. Marie,
and O. Thraenhart. (2002). Molecular approaches to validate disinfectants
against human hepatitis B virus: Med Microbiol Immunol (Berl). 190(4): 189–97 [0039]
- - Eble, B. E. and L. Corash. (1998). Duck hepatitis B virus
inactivation and 8-methoxypsoralen photoadduct formation in human
platelet concentrates. Photochem Photobiol. 67(6): 700–13 [0039]
- - Aytay, S., A. Ohagen, M. R. Busch, B. Alford, J. R. Chapman,
and A. Lazo. (2004). Development of a sensitive PCR inhibition method
to demonstrate HBV nucleic acid inactivation. Transfusion. 44(4):
476–84 [0039]
- - Glebe, D. and S. Urban. (2007). Viral and cellular determinants
involved in hepadnaviral entry. World J Gastroenterol. 13(1): 22–38 [0039]
- - Gripon, P., S. Rumin, S. Urban, J. Le Seyec, D. Glaise, I.
Cannie, C. Guyomard, J. Lucas, C. Trepo, and C. Guguen-Guillouzo.
(2002). Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.
Proc Natl Acad Sci US A. 99(24): 15655–60 [0039]
- - Seglen, P. O. (1976). Preparation of isolated rat liver cells.
Methods Cell Biol. 13: 29–83 [0039]
- - Glebe, D. and W. H. Gerlich. (2004). Study of the endocytosis
and intracellular localization of subviral particles of hepatitis
B virus in primary hepatocytes. Methods Mol Med. 96: 143–51 [0039]
- - Glebe, D., M. Aliakbari, P. Krass, E. V. Knoop, K. P. Valerius,
and W. H. Gerlich. (2003). Pre-s1 antigen-dependent infection of
Tupaia hepatocyte cultures with human hepatitis B virus. J Virol.
77(17): 9511–21 [0039]