DE102007021952A1

DE102007021952A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Nucleinsäureisolierung

Info

Publication number: DE102007021952A1
Application number: DE102007021952A
Authority: DE
Inventors: Yoshihiro Hitachinaka Yamashita; Toshinari Hitachinaka Sakurai
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-10
Publication date: 2007-11-22
Also published as: JP2007306867A; US20070269829A1; CN101074440A

Abstract

Es werden ein Nucleinsäureisolierapparat und ein Verfahren bereitgestellt, das die rasche Nucleinsäureisolierung aus einer Nucleinsäure enthaltenden Probe mit hoher Nucleinsäureausbeute und Reinheit erlaubt. Eine Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 ist auf einem Ständer 41 über eine Rippe 19 angebracht (A). Eine Lösung wird mit Hilfe einer Beladungspipettenspitze 42 durch einen ersten Öffnungsteil 14 in einen ersten Behälter 15 gegeben. Eine Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 zum individuellen Kontrollieren des Druckes im Inneren des ersten Behälters 15 und des zweiten Behälters 13 ist über das Verbindungselement 44 eng in den ersten Öffnungsteil 14 und den zweiten Öffnungsteil 12 eingepasst (B). Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 baut im Inneren des ersten Behälters 15 einen Druck auf, während im Inneren des zweiten Behälters 13 Druck abgebaut wird, so dass die Lösung von dem Behälter 15 über eine feste Phase 16 zu dem Behälter 13 bewegt wird (C). Nachdem der Vorgang des Bewegens der Lösung durch die feste Phase 16 so oft wie zweckmäßig durchgeführt worden ist, wird die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 von den ersten und zweiten Öffnungsteilen 14 und 12 abgebaut. Die Lösung, die in den zweiten Behälter 13 bewegt worden ist, wird mit einer Entnahmepipettenspitze 45 über den zweiten Öffnungsteil 12 aufgesaugt und dann aus der Vorrichtung 11 entfernt (D).

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer Nucleinsäure enthaltenden Probe.
2. Stand der Technik
Die Analyse von Nucleinsäure, einer genetische Information tragenden Substanz, wird auf verschiedenen Gebieten durchgeführt, beispielsweise in der akademischen Forschung und in der Medizin. Die Nucleinsäureanalyse umfaßt oft Nucleinsäureamplifizierungstechniken, typischerweise die Polymerasekettenreaktion (PCR). Die PCR ist ein Verfahren zum Amplifizieren von Nucleinsäure in einer basensequenzspezifischen Art und Weise und erlaubt den Nachweis, die Quantifizierung und dergleichen eines Zielgens.
Wenn eine Nucleinsäureanalyse wie PCR durchgeführt wird, ist es erforderlich, die Nucleinsäure aus einem biologischen Material oder dergleichen zu isolieren und sie in einem solchen Maß zu reinigen, daß sie keine Substanzen enthält, welche die Analysereaktion behindern.
In einem Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer biologischen Probe wird die Eigenschaft von Nucleinsäure, in Anwesenheit eines chaotropen Mittels an eine Silicamaterial enthaltende feste Phase zu adsorbieren, ausgenutzt (B. Vogelstein und D. Gillespie, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 76(2), 615–619 (1979)). Diese Eigenschaft wird auch in einem anderen Verfahren ausgenutzt, bei dem Nucleinsäure unter Verwendung einer Nucleinsäureisoliervorrichtung mit einer Röhre, worin eine Silicamaterial enthaltende feste Phase vorhanden ist, gereinigt (JP-Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 11-127854 A (1999) und JP-Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 2005-241299 A).
In diesem Verfahren werden eine biologische Probe und ein chaotropes Mittel gemischt, um Nucleinsäure aus der biologischen Probe freizusetzen. Eine Lösung, die die Nucleinsäure und das chaotrope Mittel enthält, wird unter Einsatz der Nucleinsäureisoliervorrichtung einem Vorgang des Zuführens und Abführens unterworfen, um zu bewirken, daß die Mischlösung mit der festen Phase in Kontakt kommt, wodurch zugelassen wird, daß die Nucleinsäure an die feste Phase adsorbiert wird. Danach wird eine Lösung zur Entfernung von Unreinheiten aus der festen Phase einem Vorgang des Zuführens und Abführens unter Einsatz der Nucleinsäureisoliervorrichtung unterworfen, um zu bewirken, daß die Lösung mit der festen Phase in Kontakt kommt, um Verunreinigungen aus der festen Phase zu entfernen. Dann wird eine Lösung zur Elution der Nucleinsäure von der festen Phase unter Einsatz der Nucleinsäureisoliervorrichtung zugeführt und abgeführt, wodurch zugelassen wird, daß die Lösung mit der festen Phase in Kontakt kommt, und bewirkt wird, daß die Nucleinsäure von der festen Phase eluiert wird.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
In dem in den vorstehend genannten Patentveröffentlichungen offenbarten Verfahren führt das Zuführen und Abführen der Lösung in der Nucleinsäureisoliervorrichtung dazu, daß die Lösung mit der festen Phase bei einer erhöhten Kontakteffizienz in Kontakt kommt, wodurch die Effizienz der Bindung der Nucleinsäure an die feste Phase, das Waschen und das Eluieren verbessert werden können und die Nucleinsäureisolierung mit hoher Ausbeute und Reinheit durchgeführt werden kann.
In dem vorstehend genannten Verfahren erfordert jedoch der Vorgang, bei dem bewirkt wird, daß die Lösung, die eine biologische Probe enthält und eine hohe Viskosität aufweist, für das Zuführen und Abführen durch die feste Phase strömt, einen langen Zeitraum. Insbesondere ist bei dem Zuführvorgang, weil der Druckunterschied zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Nucleinsäureisoliervorrichtung nicht mehr als maximal 1 Atmosphärendruck ist, der Zuführdruck eingeschränkt, was zu einer verlängerten Zuführdauer und zu einer verlängerten Dauer des gesamten Nucleinsäureisolierverfahrens führt.
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure bereitzustellen, wobei Nucleinsäure aus einer Nucleinsäure enthaltenden Probe mit hoher Nucleinsäureausbeute und Reinheit rasch isoliert werden kann.
Erfindungsgemäß sind ein erster Behälter und ein zweiter Behälter über eine Öffnung, worin sich ein Nucleinsäureadsorptionsteil befindet, miteinander verbunden. Der erste Behälter oder der zweite Behälter ist unter Druck gesetzt, während in dem anderen Behälter der Druck abgebaut ist, so daß die Probenlösung durch den Nucleinsäureadsorptionsteil hin- und herbewegt wird.
Wirkungen der Erfindung
Erfindungsgemäß kann Nucleinsäure aus einer Nucleinsäure enthaltenden Probe mit hoher Nucleinsäureausbeute und Reinheit rasch isoliert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt schematisch eine Nucleinsäureisoliervorrichtung, die in einem Nucleinsäureisolierapparat gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird.
2 zeigt einen Querschnitt entlang der Linie A-A in 1.
3 zeigt einen Querschnitt entlang der Linie B-B der 1.
4 veranschaulicht einen Vorgang zur Isolierung von Nucleinsäure unter Verwendung der Nucleinsäureisoliervorrichtung.
5 zeigt ein weiteres Beispiel der erfindungsgemäßen Nucleinsäureisoliervorrichtung.
6 zeigt ein weiteres Beispiel der erfindungsgemäßen Nucleinsäureisoliervorrichtung.
7 zeigt ein weiteres Beispiel der erfindungsgemäßen Nucleinsäureisoliervorrichtung.
8 zeigt ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure.
9 zeigt eine erfindungsgemäße Nucleinsäureisoliervorrichtung.
10 zeigt ein schematisches Diagramm einer Lösungszuführeinheit der Nucleinsäureisoliervorrichtung.
11 zeigt ein schematisches Diagramm der Druckaufbau/Druckabbaueinheit der Nucleinsäureisoliervorrichtung.
12 zeigt ein schematische Diagramm einer Lösungsabfuhrvorrichtung der Nucleinsäureisoliervorrichtung.
13 zeigt ein Blockdiagramm des elektrischen Systems der Nucleinsäureisoliervorrichtung.
14 zeigt eine Tabelle der Ergebnisse eines Verifizierungsexperiments, bei dem das erfindungsgemäße Verfahren mit anderen Verfahren verglichen wurde.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Im folgenden werden die Ausführungsformen der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
1 zeigt schematisch eine Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 (Nucleinsäureisolierbehälter), die in einem Nucleinsäureisolierapparat gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird. 2 zeigt einen Querschnitt entlang der Linie A-A der 1; 3 zeigt einen Querschnitt entlang der Linie B-B der 1.
In den 1 bis 3 besteht die Nucleinsäureisoliervorrichtung 1 gemäß der erfindungsgemäßen Ausführungsform aus zwei Behältern 15 und 13 mit einem ersten Öffnungsteil 14 bzw. einem zweiten Öffnungsteil 12 im oberen Teil. Die zwei Behälter sind am Boden durch einen Kanal 17 miteinander verbunden, worin eine feste Phase 16 für die Adsorption von Nucleinsäure eingeführt ist.
Somit ist die Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 aus dem ersten Behälter 15 mit dem ersten Öffnungsteil 14 und dem zweiten Behälter 13 mit dem zweiten Öffnungsteil 12 zusammengesetzt. Der erste Behälter und der zweite Behälter sind durch eine Trennwand 18, welche den Verbindungskanal 17 mit der darin eingeführten festen Phase 6 aufweist, voneinander isoliert. Eine scheibenförmige Rippe 19 ist um die Öffnungen 12 und 14 herum angebracht.
An dem ersten Öffnungsteil 14 und dem zweiten Öffnungsteil 12 kann eine Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung abnehmbar angebracht sein. Wenn die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung angebracht ist, können der erste Behälter 15 und der zweiten Behälter 13 hermetisch versiegelt sein. Eine Pipettenspitze oder dergleichen zum Entnehmen oder Zuführen einer Lösung kann durch das erste Öffnungsteil 14 bzw. das zweite Öffnungsteil 12 in den ersten Behälter 15 oder in den zweiten Behälter 13 eingeführt werden.
Die feste Phase 16 ist so eingeführt, daß ihre Seitenflächen eng an die Innenwände des Verbindungskanals 17 angepaßt sind, so daß die Lösung, die den Verbindungskanal 17 passiert, durch das Innere der festen Phase 16 strömt. Die Rippe 19 ist eine Struktur, die zuläßt, daß die Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 durch einen Ständer oder dergleichen getragen werden kann. Sie dient auch dazu, eine bestimmte Kontaktfläche zwischen der Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 und der Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung aufrechtzuerhalten, wenn diese angebracht ist, wobei das hermetische Versiegeln verbessert wird.
Im folgenden wird ein Verfahren unter Bezugnahme auf 4 beschrieben, bei dem bewirkt wird, daß die Lösung durch die feste Phase in der Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 gemäß der vorliegenden Erfindung hin- und herbewegt wird.
4(A) zeigt die Nucleinsäureisoliervorrichtung 11, die auf einem Ständer 41 über die Rippe 19 aufmontiert ist. Eine Lösung wird in den ersten Behälter 15 mit Hilfe einer Beladungspipettenspitze 42 durch den ersten Öffnungsteil 14 gegeben.
Dann wird, wie 4(B) zeigt, eine Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 zum individuellen Kontrollieren des Drucks im Inneren des ersten Behälters 15 und des zweiten Behälters 13 eng an den ersten Öffnungsteil 14 und den zweiten Öffnungsteil 12 über ein Verbindungselement 44 angebracht. Das Innere des ersten Behälters 15 wird dann durch die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 über den ersten Öffnungsteil 14, wie in 4c gezeigt, unter Druck gesetzt, während im Inneren des zweiten Behälters 13 durch die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 über den zweiten Öffnungsteil 12 Druck abgebaut wird.
Im Ergebnis bewegt sich die Lösung von dem ersten Behälter 15 durch den Verbindungskanal 17 zu dem zweiten Behälter 13.
Dann wird, wie in 4(B) gezeigt, Druck im Inneren des ersten Behälters 15 durch die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 über den ersten Öffnungsteil 14 abgebaut, während im Inneren des zweiten Behälters 13 durch die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 über den zweiten Öffnungsteil 12 Druck aufgebaut wird, wodurch die Lösung von dem zweiten Behälter 13 über den Verbindungskanal 17 zu dem ersten Behälter 15 bewegt wird.
Nachdem der Vorgang, bei dem bewirkt wird, daß die Lösung von dem ersten Behälter 15 durch den Verbindungskanal 17 zu dem zweiten Behälter 13 bewegt wird, auf ähnliche Weise so oft wie zweckmäßig durchgeführt worden ist, wird die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 von dem ersten Öffnungsteil 14 und dem zweiten Öffnungsteil 12 abgenommen. Danach wird, wie in 4(D) gezeigt, die Lösung, die zu dem zweiten Behälter 13 bewegt worden ist, mit Hilfe einer Entnahmepipettenspitze 45, die durch den zweiten Öffnungsteil 12 in den zweiten Behälter 13 eingeführt worden ist, angesaugt und dann aus der Vorrichtung 11 entfernt.
Die Öffnung des Behälters 15, die mit dem Verbindungskanal 17 verbunden ist, befindet sich an dem untersten Teil des Behälters 15, so daß die Lösung, die sich zu dem zweiten Behälter 13 bewegt, am Verbindungskanal 17 auf konzentrierte Weise gewonnen werden kann.
Andererseits ist die Öffnung des zweiten Behälters 13, die mit dem Verbindungskanal 17 in Verbindung steht, auf derselben Höhe wie oder niedriger als die entsprechende Öffnung des ersten Behälters 15 angebracht, jedoch höher als der unterste Teil des zweiten Behälters 13.
Auf diese Weise kann die Lösung im Inneren des ersten Behälters 15 durch den Verbindungskanal 17 effizient in den zweiten Behälter 13 strömen, ohne daß sie in dem ersten Behälter 15 verbleibt. Die Lösung, die sich in dem zweiten Behälter 13 bewegt hat, wird durch die Pipettenspitze 45 angesaugt, welche in den zweiten Behälter 13 eingeführt worden ist und deren Spitze den untersten Teil des zweiten Behälters 13 berührt. Die Lösung wird dann effizient aus der Vorrichtung entfernt, ohne daß sie in dem zweiten Behälter 13 verbleibt.
Somit wird die Lösung, die in dem zweiten Behälter 13 oder den ersten Behälter 15 vorhanden ist, schließlich vollständig zu dem zweiten Behälter 13 bewegt, aus dem die Gesamtmenge dann durch die Pipettenspitze 45, die durch den zweiten Öffnungsteil 12 in den zweiten Behälter 13 eingeführt worden ist, aufgesaugt und aus der Vorrichtung 11 nach außen entfernt.
Die vorstehend beschriebene Nucleinsäureisoliervorrichtung kann neben der Konfiguration der 1 auch wie in den 5 bis 7 beschrieben ausgestattet sein.
5 zeigt ein Beispiel, bei dem die feste Phase 16 an den untersten Teil des ersten Behälters 15 fixiert ist und die Zentralachse des Verbindungskanals 17 eine Verlängerung der Zentralachse des zylinderförmigen oder quaderförmigen Behälters 15 ist, so daß die Lösung in dem Verbindungskanal 17 entlang der Zentralachse fließen kann.
Ein weiteres Beispiel zeigt 6, bei dem der erste Behälter 15 und der zweite Behälter 13 keine gemeinsame Trennwand aufweisen, sondern unabhängige Behälter sind, die durch einen Kanal 17 miteinander verbunden sind. In diesem Beispiel ist die Zentralachse des Verbindungskanals 17 im wesentlichen in einer Richtung senkrecht zu der Zentralachse des zylinderförmigen oder quaderförmigen Behälters 15, wie in dem Beispiel der 1 gezeigt.
Ein weiteres Beispiel ist in 7 gezeigt, welches aus einem röhrenförmigen ersten Behälter 15 und einem zweiten Behälter 13 besteht, worin die feste Phase 16 an der Spitze (auf dem Boden) des ersten Behälters 15 fixiert ist, wobei der erste Behälter 15 innerhalb des zweiten Behälters 13 enthalten ist.
In diesem Beispiel können der erste Behälter 15 und der zweite Behälter 13 über den Verbindungsteil 20 abnehmbar aneinander verknüpft sein. Der erste Behälter 15 mit einer darin enthaltenen Lösung kann von dem zweiten Behälter 13 gelöst werden, während durch die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung, die an den ersten Behälter 15 verbunden ist, Druck abgebaut wird, und der auf diese Weise abgelöste erste Behälter 15 kann in eine vorbestimmte Position bewegt werden. Indem dann im Inneren des ersten Behälters 15 mit der Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung Druck aufgebaut wird, kann die Lösung von dem ersten Behälter 15 zu einer festgelegten Position bewegt werden. Somit funktioniert in diesem Beispiel der erste Behälter 15 auch als Pipettenspitze oder dergleichen, um die Lösung aus dem Behälter zu entfernen.
Im folgenden wird ein Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 unter Bezugnahme auf 8 beschrieben.
In Stufe S1 der 8 werden eine Nucleinsäure enthaltende Probe, ein chaotropes Mittel und bei Bedarf eine Substanz, um die Freisetzung von Nucleinsäure aus der Probe zu verstärken, und eine Substanz, um die Adsorption von Nuclein säure an die Silicamaterial enthaltende feste Phase zu fordern gemischt.
Nachdem die Mischlösung in den ersten Behälter 15 der Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 gegeben worden ist, wird die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung angeschlossen, um die Mischlösung zu bewegen, so daß bewirkt wird, daß die Nucleinsäure an die feste Phase absorbiert wird. Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird dann abgenommen, und die Mischlösung, die zu dem zweiten Behälter 13 bewegt worden ist, wird dann aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 entfernt (Stufen S2 bis S4).
Dann wird eine Waschlösung zur Entfernung von Verunreinigungen in der festen Phase 16 in den ersten Behälter 15 der Nucleinsäureisoliervorrichtung 1 gegeben, und die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird angeschlossen, um die Mischlösung zu bewegen und Verunreinigungen in der festen Phase 16 zu entfernen. Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird dann abgenommen, und die Waschlösung, die in den zweiten Behälter 13 bewegt worden ist, wird aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung entfernt (Stufen S5–S7).
Eine Lösung zur Elution von Nucleinsäure aus der festen Phase 16 wird dann in den ersten Behälter der Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 gegeben, und die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird angeschlossen, um die Mischlösung zu bewegen, so daß Nucleinsäure aus der festen Phase 16 eluiert wird. Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird dann abgenommen, und die Lösung, die in dem zweiten Behälter 13 bewegt worden ist, wird als gereinigte Nucleinsäurelösung gewonnen (Stufen S8 bis S10).
Im folgenden wird die Gesamtkonfiguration des Nucleinsäureisolierapparats, welcher die erfindungsgemäße Nucleinsäureisoliervorrichtung einsetzt, unter Bezugnahme auf die 9 bis 13 beschrieben.
9 ist eine schematische Draufsicht des erfindungsgemäßen Nucleinsäureisolierapparats. Der Nucleinsäureisolierapparat 100 umfaßt eine Lösungszuführeinheit 102 und eine Druckaufbau/Druckabbaueinheit 103, die auf einer Schiene 101 angeordnet sind. Die Lösungszuführeinheit 102 ist auf der Schiene 101 entlang der Y-Achse beweglich. Die Druckaufbau/Druckabbaueinheit 103 ist sowohl entlang der Y-Achse als auch entlang der Z-Achse beweglich.
Der Apparat umfaßt auch einen Arm 104, der entlang der X-Achse beweglich ist. Auf dem Arm 104 ist eine Lösungsabführeinheit 105 angebracht, die entlang der Y-Achse, die entlang des Arms 104 liegt, und entlang der Z-Achse beweglich ist. Auf einer Arbeitsoberfläche 106 des Gestells sind ein Ständer 107 zur Aufnahme der Nucleinsäureisoliervorrichtung 11, ein Gestell 108 für nicht benutzte Pipettenspitzen, Reagenzfläschchen 109, ein Reagenzaufnahmemittel 110 zum Vorbereiten des Reagenses, ein Aufnahmemittel 111 für flüssigen Abfall für die Mischlösung und die Waschlösung und ein Aufnahmemittel 112 für gebrauchte Pipettenspitzen angebracht.
10 zeigt ein schematisches Diagramm der Lösungszuführeinheit 102. Die Lösungszuführeinheit 102 umfaßt: eine Düse 201 zum Entnehmen der Lösung, einen Düsenhalter 206 zum Halten der Düse 201, eine Pumpe 203 zum Aufsaugen des Reagenses, ein Umschaltventil 204 zum Umschalten des Reagenses, eine Leitung 202, die das Umschaltventil 204 und die Düse 201 verbindet, und eine Leitung 205 zum Verbinden des Umschaltventils 204 mit jedem Reagans.
Die Lösungszuführeinheit 102 bewegt sich auf der Schiene 101 entlang der Y-Achse und befindet sich über dem Reagensaufnahmemittel, wo es das Umschaltventil 204 aktiviert und ein festgelegtes Reagens auswählt, von dem eine vorbestimmte Menge vorbereitet wird. Die Lösungszuführeinheit 102 bewegt sich dann entlang der Achse und wird über einer festgelegten Nucleinsäureisoliervorrichtung 11, die von dem Ständer 107 getragen wird, positioniert, wo eine festgelegte Menge des Reagenses über die Düse 201 entleert wird, wodurch die Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 mit dem Reagans beladen wird.
11 zeigt ein schematisches Diagramm der Druckaufbau/Druckabbaueinheit 103. Die Druckaufbau/Druckabbaueinheit 103 umfaßt: eine Verbindungseinheit 301 zum Verbinden der Spritzen 303 und 304, welche die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 darstellen, und zum Verbinden der Öffnungen 12 und 14 der Nucleinsäureisoliervorrichtung 11; Leitungen 302, welche die Spritzen 303 und 304 mit der Verbindungseinheit 301 verbinden; und einen Verbindungsteilhalter 305 zum Halten des Verbindungselements 301.
Die Druckaufbau/Druckabbaueinheit 103 bewegt sich auf der Schiene 101 entlang der Y-Achse und wird über einer festgelegten Nucleinsäureisoliervorrichtung 11, die auf dem Ständer 107 angebracht ist, positioniert. Die Einheit bewegt sich dann entlang der Z-Achse abwärts. Ihre Verbindungseinheit 301 ist eng an die Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 angepaßt, und die Einheit baut im Inneren jedes des Behälters 13 und 15 mit Hilfe der Spritzen 303 und 304 einen festgelegten Druck auf und ab. Nachdem die Lösung bewegt worden ist, bewegt sich die Einheit entlang der Z-Achse aufwärts, so daß die Verbindungseinheit 301 von der Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 abgelöst wird.
12 zeigt ein schematisches Diagramm der Lösungsabführeinheit 105. Die Lösungsabführeinheit 105 umfaßt: einen Verbindungsteil 401 zum Verbinden mit einer Spitze 45, einen Verbindungsteilhalter 404 zum Halten des Verbindungsteils 401, eine Spritze 403 für das Ansaugen/Entnehmen einer Lösung und eine Röhre 402, welche den Verbindungsteil 401 und die Spritze 403 verbindet.
Die Lösungsabführeinheit 105 bewegt sich entlang der X-Achse und der Y-Achse zu einer festgelegten Position über dem Pipettenspitzengestell 108, wo sie dann entlang der Z-Achse abwärts bewegt wird, so daß eine Pipettenspitze in den Verbindungsteil 401 gedrückt wird. Die Einheit hebt dann die Pipettenspitze entlang der Z-Achse an und bewegt sich entlang der X-Achse und der Y-Achse und wird über einer festgelegten Nucleinsäureisoliervorrichtung 11, die auf dem Ständer 107 angebracht ist, positioniert, wobei die Einheit entlang der Z-Achse abgesenkt wird, wobei die Pipettenspitze in die Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 eingeführt wird. Dann saugt die Einheit die Lösung im Inneren der Nucleinsäureisoliervorrichtung 11 auf, die Pipettenspitze wird entlang der Z-Achse aufwärts bewegt und bewegt sich dann entlang der X-Achse und der Y-Achse. Nach der Positionierung über der Abwasseraufnahmevorrichtung 111 senkt die Lösungsabführeinheit 105 die Pipettenspitze abwärts entlang der Z-Achse, wobei sie in die Abwasseraufnahmevorrichtung 111 eingeführt wird, wo die Lösung entleert wird.
Die Lösungsabführeinheit 105 hebt dann die Pipettenspitze entlang der Z-Achse auf, bewegt sich entlang der X-Achse und der Y-Achse, bis sie über der Aufnahmevorrichtung 112 für benutzte Pipettenspitzen positioniert ist, wo die Pipettenspitze entlang der Z-Achse abgesenkt wird, wobei sie in die Aufnahmevorrichtung 112 für gebrauchte Pipettenspitzen eingeführt wird. Die Einheit bewegt sich dann entlang der X-Achse, so daß der Verbindungsteil 401 in eine unförmige Furche eingeführt wird, die mit der Aufnahmevorrichtung 112 für Pipettenspitzen ausgestattet ist. Die Einheit bewegt sich dann aufwärts entlang der Z-Achse, wobei die Pipettenspitze von dem Verbindungsteil 401 entfernt wird, sobald die obere Öffnung der Pipettenspitze in der unförmigen Furche gefangen wird, wodurch die Pipettenspitze in den Behälter 112 für Pipettenspitzen verworfen wird.
13 zeigt ein schematisches Blockdiagramm des elektrischen Systems des Nucleinsäureisolierapparats der vorliegenden Erfindung. Ein Personalcomputer (PC) 500 hat als Operationskontrolleinheit die folgenden Verbindungen: ein Operationsfeld und eine Tastatur 501 für die Eingabe der Operationsbedingungen oder dergleichen, eine Anzeigeeinheit (CRT) 502 zum Anzeigen der eingegebenen Information und des Operationsstandes, und eine Mechanismuskontrolleinheit 503 zum Kontrollieren der einzelnen Mechanismuseinheiten des Apparats.
Die Mechanismuskontrolleinheit 503 kontrolliert: die Pumpe 203 zum Entfernen der Lösung, das Umschaltventil 204 zum Umschalten des Reagenstyps, den Motor 504 zum Bewegen des Düsenhalters 206 entlang der Y-Achse, und die Motoren 505 und 506 zum Bewegen der Kolben zum Aufbauen und Abbauen von Druck mit Hilfe der Spritzen 303 und 304. Die Mechanismuskontrolleinheit 503 kontrolliert außerdem: einen Motor 507 zum Bewegen des Verbindungsteilhalters 305 entlang der Y-Achse, einen Motor 508 zum Bewegen des Verbindungsteilhalters 305 entlang der Z-Achse, einen Kolbenbewegungsmotor 509 zum Aufsaugen/Abstoßen einer Lösung mittels der Spritze 403, einen Motor 510 zum Bewegen des Arms 104, der die Lösungsabführeinheit 105 trägt, entlang der X-Achse, einen Motor 511 zum Bewegen des Verbindungsteilhalters 404 entlang der Y-Achse und einen Motor 512 zum Bewegen des Verbindungsteilhalters 404 entlang der Z-Achse.
Jeder Teil des Nucleinsäureisolierapparats wird gemäß den Anweisungen aus dem Computer auf der Grundlage eines festgelegten Programms betrieben.
Die Nucleinsäure enthaltende Probe kann aus Gesamtblut, Blutserum, Blutplasma, Auswurf, Urin, Speichel, Samen oder anderen Geweben oder aus Körperflüssigkeiten, die Zellen, Bakterien, Viren oder dergleichen enthalten, bestehen. Sie kann auch aus kultivierten Zellen, kultivierten Bakterien, grob gereinigten Nucleinsäuren oder dergleichen bestehen.
Das chaotrope Mittel kann aus Natriumiodid, Kaliumiodid, Natriumperchlorat, Natriumthiocyanat, Guanidinthiocyanat oder Guanidinhydrochlorid bestehen. Das chaotrope Mittel ist eine Substanz zum Fördern der Freisetzung einer Nucleinsäure aus der Probe und der Adsorption der Nucleinsäure auf einer festen Phase.
Die Freisetzung der Nucleinsäure aus der Probe kann auch gefördert werden durch: ein physikalisches Verfahren unter Verwendung von Ultraschall, Bewegung oder dergleichen, ein chemisches Verfahren unter Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels, Proteindenaturierungsmittels oder dergleichen, ein biochemisches Verfahren unter Verwendung eines Proteinabbauenzyms oder dergleichen, oder einer Kombination davon.
Die Adsorption der Nucleinsäure auf der Silicamaterial enthaltenden festen Phase kann auch durch ein organisches Lösungsmittelgemisch gefördert werden. Das organische Lösungsmittel kann aus einer oder mehreren Verbindungen bestehen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem aliphatischen Alkohol, einem aliphatischen Ether, einem aliphatischen Ester und einem aliphatischen Keton besteht. Beispiele des aliphatischen Alkohols, der eingesetzt werden kann, umfassen Methanol, Ethanol, 2-Propanol, 2-Butanol und Polyethylenglycol. Beispiele des aliphatischen Ethers, der eingesetzt werden kann, umfassen Diethylenglycoldimethylether, Diethylenglycoldiethylether, Ethylenglycoldimethylether, Ethylenglycoldiethylether, Propylenglycoldimethylether, Propylenglycoldiethylether und Tetrahydrofuran.
Beispiele des aliphatischen Esters, der eingesetzt werden kann, umfassen Ethyllactat und Propylenglycolmono methyletheracetat. Beispiele des aliphatischen Ketons, das eingesetzt werden kann, umfassen Aceton, Hydroxyaceton und Methylketon.
Die feste Phase kann aus einer Substanz bestehen, die Silicamaterial enthält, wie Glasteilchen, Silicamaterialteilchen, Glasfasern, Silicafasern und monolithisches Silicamaterial. Alternativ dazu kann sie aus einem organischen Polymer mit einer hydrophilen Gruppe, beispielsweise einer Hydroxygruppe, auf ihrer Oberfläche bestehen, wobei das Polymer eine Vielzahl von kontinuierlichen Poren aufweist. Ein Verbindungselement mit Versiegelungseigenschaften kann zwischen den Seitenflächen der festen Phase und den Innenwänden des Verbindungskanals so angeordnet sein, daß die feste Phase eng an der Innenwand des Verbindungskanals anliegt, wenn es eingeführt wird, so daß bewirkt wird, daß die Lösung durch das Innere der festen Phase strömt, wenn sie durch den Verbindungskanal geleitet wird.
Um zu verhindern, daß aufgrund des Widerstandes der Lösung bei ihrer Bewegung die feste Phase aus dem Verbindungskanal fließt, kann ein Halteelement mit flüssigkeitsverbindenden Eigenschaften an jedem Ende der in dem Verbindungskanal befindlichen festen Phase angeordnet sein.
Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung kann aus einer Spritze, einer Pumpe oder dergleichen für jeden Behälter bestehen, wobei das Volumen gleich oder größer ist als das Volumen der zu bewegenden Lösung. Vorzugsweise werden die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung und die Nucleinsäureisoliervorrichtung über eine Verbindungseinheit mit Versiegelungseigenschaften verbunden, so daß der Raum zwischen der Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung und der Nucleinsäureisoliervorrichtung hermetisch versiegelt erhalten bleibt.
Eine Waschlösung, die Verunreinigungen entfernen kann, die an die Silicamaterial enthaltende feste Phase gebunden worden sind, während die Adsorption der Nucleinsäure auf der Silicamaterial enthaltenden festen Phase aufrechterhalten bleibt, wird ausgewählt. Beispielsweise kann die Waschlösung aus Ethanol oder Diethylenglycoldimethylether bestehen, zu der ein chaotropes Mittel, ein oberflächenaktives Mittel, ein Puffer oder dergleichen gegeben worden ist. Alternativ dazu kann sie aus einer wässerigen Lösung aus Ethanol oder Diethylenglycoldimethylether bestehen.
Das Eluat zum Eluieren der Nucleinsäure, die an die feste Phase gebunden worden ist, muß in der Lage sein, eine Nucleinsäure von der Silicamaterial enthaltenden festen Phase zu eluieren. Es kann beispielsweise aus nucleasefreiem Wasser oder einer nucleasefreien Pufferlösung mit niedriger Salzkonzentration bestehen. Das Eluat kann ein Analysereaktionsreagens enthalten, das für die Nucleinsäureanalysereaktion eingesetzt wird, die nachstehend beschrieben wird.
Wenn beispielsweise PCR als eine solche Nucleinsäureanalysereaktion durchgeführt wird, kann ein Eluat, das ein PCR-Reagens (Pufferlösung, Primer, Enzym oder dergleichen) enthält, eingesetzt werden. In diesem Fall kann die PCR-Reaktion unmittelbar in dem Eluat gestartet werden.
Im folgenden wird ein Verifizierungsexperiment beschrieben, das durchgeführt wurde, um die Wirkungen der Erfindung zu untersuchen.
Die Probe, das Reagens und die in dem Verifizierungsexperiment eingesetzte Vorrichtung werden nachstehend beschrieben.
1. Probe

Gesundes menschliches Blut (Antikoagulans EDTA-2Na zugegeben)

2. Reagens
2.1 Chaotrope Lösung

5,5 M Guanidiniumhydrochlorid, 80 mM MES, 47 mM EDTA-2Na, 20 % (Vol./Vol.) Polyoxyethylensorbitanmonolaurat und 1 % (Vol./Vol.) Disfoam

2.2 Enzymlösung

20 mg/ml Proteinase K und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)

2.3 Organisches Lösungsmittel

Diethylenglycoldimethylether

2.4 Waschlösung At

950 mM Guanidiniumhydrochlorid, 14 mM MES, 8 mM EDTA-2Na, 4 %(Vol./Vol.) Polyoxyethylensorbitanmonolaurat und 30 (Vol./Vol.) Diethylenglycoldimethylether

2.5 Waschlösung B

55 %(Vol./Vol.) Ethanol, 14 mM Essigsäurekalium und 11 mM Essigsäure

2.6 Eluat

10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 0,1 mM EDTA (pH 8,0)

3. Nucleinsäureisoliervorrichtung
3.1 Feste Phase
Als feste Phase wurde monolytisches Silicamaterial (4 mm Durchmesser, 2 mm Länge, 15 μm Porengröße) eingesetzt.
3.2 Erfindungsgemäße Nucleinsäureisoliervorrichtung
Eine erfindungsgemäße Nucleinsäureisoliervorrichtung mit der in 1 gezeigten Form wurde aus Polypropylenharz hergestellt, wobei jeder der Behälter ein Volumen von etwa 1 ml hatte und der Verbindungskanal 4 ml Durchmesser und 2 mm Länge aufwies und eine feste Phase hatte, die unter Druck eingepaßt wurde.
3.3 Eine Nucleinsäureisoliervorrichtung (Nucleinsäureisoliervorrichtung vom Spitzentyp) für ein Verfahren, das sich von dem erfindungsgemäßen Verfahren unterscheidet.
Eine Nucleinsäureisoliervorrichtung für ein Verfahren, das sich von dem erfindungsgemäßen Verfahren unterscheidet, wurde aus Polypropylenharz hergestellt, wobei der Behälter ein Volumen von etwa 1 ml der Lösung hatte und einen Durchmesser von 4 mm an seinen Spitzen aufwies, wobei die feste Phase unter Druck eingepaßt wurde. Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung für das Aufsaugen und das Abgeben der Lösung wurde an die Öffnung der Nucleinsäureisoliervorrichtung vom Spitzentyp verbunden, um zu bewirken, daß die Lösung durch die feste Phase geleitet wurde.
3.4 Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung
Als die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wurde eine Spritze (2,5 ml Volumen) eingesetzt. Die Verbindung der Nucleinsäureisoliervorrichtung und der Spritze wurde mit Hilfe einer Siliconharzverbindungseinheit hergestellt, die der Form jedes Verbindungsteils angepaßt war. Für die erfindungsgemäße Nucleinsäureisoliervorrichtung wurden zwei Spritzen und zwei solche Verbindungseinheiten eingesetzt. Für die Nucleinsäureisoliervorrichtung vom Spitzentyp wurden eine solche Spritze und eine solche Verbindungseinheit eingesetzt. Das erfindungsgemäße Nucleinsäureisolierverfahren für die Nucleinsäureisoliervorrichtung ist wie folgt:

(1) Zu 0,2 ml Gesamtblut wurden 0,02 ml Enzymlösung und 0,24 ml chaotrope Lösung gegeben und gemischt.
(2) Es wurde 20 Minuten bei 50°C inkubiert.
(3) Es wurde 0,2 ml organisches Lösungsmittel zugegeben und gemischt.
(4) Die Mischlösung wird in die Nucleinsäureisoliervorrichtung gegeben.
(5) Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird mit der Nucleinsäureisoliervorrichtung verbunden, und die Mischlösung wird zwischen den einzelnen Behältern 4,5 mal hin- und herbewegt.
(6) Die Mischlösung wird aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung entnommen.
(7) 1,0 ml der Waschlösung A wird in die Nucleinsäureisoliervorrichtung gegeben.
(8) Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird mit der Nucleinsäureisoliervorrichtung verbunden, so daß bewirkt wird, daß die Lösung in den anderen Behälter strömt.
(9) Die Waschlösung wird aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung entnommen.
(10) 1,0 ml der Waschlösung A wird in die Nucleinsäureisoliervorrichtung gegeben.
(11) Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird mit der Nucleinsäureisoliervorrichtung verbunden, so daß die Mischlösung in den anderen Behälter strömt.
(12) Die Waschlösung wird aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung genommen
(13) 1,0 ml der Waschlösung B wird in die Nucleinsäureisoliervorrichtung gegeben.
(14) Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird mit der Nucleinsäureisoliervorrichtung verbunden, so daß die Mischlösung in den anderen Behälter strömt.
(15) Die Waschlösung wird aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung entnommen.
(16) 1,0 ml der Waschlösung B wird in die Nucleinsäureisoliervorrichtung gegeben.
(17) Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird mit der Nucleinsäureisoliervorrichtung verbunden, so daß die Mischlösung in den anderen Behälter strömt.
(18) Die Waschlösung wird aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung entfernt.
(19) 0,2 ml des Eluats wird in die Nucleinsäureisoliervorrichtung gegeben.
(20) Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird mit der Nucleinsäureisoliervorrichtung verbunden, und es wird be wirkt, daß das Eluat zwischen den Behältern 4 bis 5 mal hin- und herbewegt wird.
(21) Das Eluat wird aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung entnommen und als gereinigte Nucleinsäurelösung gewonnen.

Im folgenden wird ein Nucleinsäureisolierverfahren 1 (welches durch Ansaugen und Abgeben der Flüssigkeit eine Hin- und Herbewegung umfaßt), die sich von dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure unterscheidet, als Vergleichsbeispiel beschrieben.

(1) Zu 0,2 ml Gesamtblut werden 0,02 ml Enzymlösung und 0,24 ml chaotrope Lösung gegeben und gemischt.
(2) Es wird 20 Minuten bei 50°C inkubiert.
(3) Es wird 0,2 ml organisches Lösungsmittel zugegeben und gemischt.
(4) Die Mischlösung wird in eine Nucleinsäureisoliervorrichtung vom Spitzentyp über ihre obere Öffnung gegeben. Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird angeschlossen, und die Mischlösung in der Vorrichtung wird entleert. Die Lösung wird dann 4 mal aufgesaugt und abgegeben (und wird insgesamt 4,5 mal durch Ansaugen und Abgeben hin- und herbewegt).
(5) Die Mischlösung wird verworfen.
(6) 1,0 ml der Waschlösung A wird in die Vorrichtung durch ihre obere Öffnung gegeben und dann abgegeben.
(7) Die Waschlösung wird verworfen.
(8) 1,0 ml der Waschlösung A wird über ihre obere Öffnung in die Vorrichtung gegeben.
(9) Die Waschlösung wird verworfen.
(10) 1,0 ml der Waschlösung B wird über ihre obere Öffnung in die Vorrichtung gegeben.
(11) Die Waschlösung wird verworfen.
(12) 1,0 ml der Waschlösung B wird über ihre obere Öffnung in die Vorrichtung gegeben und dann entleert.
(13) Die Waschlösung wird verworfen.
(14) 0,2 ml des Eluats wird über ihre obere Öffnung in die Vorrichtung gegeben. Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird angeschlossen, und das Eluat im Inneren der Vorrichtung wird abgegeben. Das Eluat wird dann 4 mal aufgesaugt und abgegeben (und insgesamt 4,5 mal durch Aufsaugen und Abgeben hin- und herbewegt).
(15) Das Eluat wird als gereinigte Nucleinsäurelösung gewonnen.

Im folgenden wird Nucleinsäureisolierverfahren 2 (welches die Bewegung der Flüssigkeit in einer Richtung durch Abgabe umfaßt), welches sich von den erfindungsgemäßen Nucleinsäureisolierverfahren unterscheidet, als Vergleichsbeispiel beschrieben.

(1) Zu 0,2 ml Gesamtblut werden 0,02 ml Enzymlösung und 0,24 ml der chaotropen Lösung gegeben und gemischt.
(2) Es wird 20 Minuten bei 50°C inkubiert.
(3) 0,2 ml des organischen Lösungsmittels wird zugegeben und gemischt.
(4) Die Mischlösung wird über ihre Öffnung in die Nucleinsäureisoliervorrichtung vom Spitzentyp gegeben. Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird angeschlossen. Die Mischlösung in der Vorrichtung wird dann abgegeben (Abgabe in einer Richtung).
(5) Die Mischlösung wird verworfen.
(6) 1,0 ml der Waschlösung A wird über ihre Öffnung in die Vorrichtung gegeben und dann abgegeben.
(7) Die Waschlösung wird verworfen.
(8) 1,0 ml der Waschlösung A wird über ihre Öffnung in die Vorrichtung gegeben und dann abgegeben.
(9) Die Waschlösung wird verworfen.
(10) 1,0 ml der Waschlösung B wird über ihre obere Öffnung in die Vorrichtung gegeben und dann abgegeben.
(11) Die Waschlösung wird verworfen.
(12) 1,0 ml der Waschlösung B wird über ihre Öffnung in die Vorrichtung gegeben und dann abgegeben.
(13) Die Waschlösung wird verworfen.
(14) 0,2 ml des Eluats wird über ihre Öffnung in die Vorrichtung gegeben. Die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung wird angeschlossen und das Eluat in der Vorrichtung wird dann abgegeben. (Abgabe in einer Richtung).
(15) Das Eluat wird als gereinigte Nucleinsäurelösung gewonnen.

Im folgenden wird ein Verfahren zur Beurteilung der durch das Verifikationsexperiment gereinigten Nucleinsäure beschrieben.
1. Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der Nucleinsäure
Die Konzentration der Nucleinsäure wurde durch Messen der Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers und anschließendes Berechnen des Verhältnisses zu der Einheitsabsorption (1,0) einer 50 μg/ml DNA-Lösung bei 260 nm bestimmt. Die Reinheit der Nucleinsäure wurde durch Messen der Absorption bei 260 nm und bei 280 nm unter Verwendung des Spektrophotometers und Berechnen des Verhältnisses (A260/A280) bestimmt.
2. Messung der für die Nucleinsäureisolierung erforderlichen Zeit
Der für die Bereitstellung einer Nucleinsäurelösung erforderliche Zeitraum wurde bestimmt durch die Messung des Startpunktes, welcher der Zeitpunkt war, wenn nach dem Zugeben der Enzymlösung und der chaotropen Lösung zu der Probe und dem Inkubieren eine Mischlösung hergestellt wurde, indem das organische Lösungsmittel zugegeben wurde.
14 zeigt die experimentellen Ergebnisse, wobei das Nucleinsäureisolierverfahren, bei dem die erfindungsgemäße Nucleinsäureisoliervorrichtung und die Nucleinsäureisolierverfahren 1 und 2, bei denen die für das jeweilige Verfahren angepaßte Nucleinsäureisoliervorrichtung eingesetzt wurde, wobei sich diese Verfahren von dem erfindungsgemäßen Verfahren unterscheiden, verglichen wurden.
Im Vergleich mit dem Verfahren 1 stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine gleiche oder höhere Konzentration und Reinheit der Nucleinsäure bereit. Die für die Nucleinsäureisolierung erforderliche Zeit war 8 Minuten für die vorliegende Erfindung, während sie 16 Minuten für das Verfahren 1 war, was eine Verringerung von 50 % bedeutete. Ein solcher Unterschied in dem erforderlichen Zeitraum ist hauptsächlich auf die Zeitdauer zurückzuführen, während der die Mischlösung, die einen starken Fluidwiderstand aufweist, durch die feste Phase hin- und herbewegt wird.
Da genauer gesagt das erfindungsgemäße Verfahren bewirkt, daß ein Druckunterschied durch Ausüben eines positiven Drucks und eines negativen Drucks gleichzeitig an den Enden der Lösung erzeugt wird, wenn diese durch die feste Phase hin- und herbewegt wird, kann die Geschwindigkeit der Bewegung der Lösung erhöht werden. Andererseits wird in dem Verfahren 1 entweder in positiver Druck oder ein negativer Druck allein an einem Ende der Lösung erzeugt, wenn diese durch die feste Phase hin- und herbewegt wird, mit dem Ergebnis, daß der Druckunterschied gering ist. Insbesondere ist, wenn nur ein negativer Druck ausgeübt wird, der Druckunterschied geringer als höchstens ein Atmosphärendruck, so daß die Ansaugkraft eingeschränkt ist und die Geschwindigkeit der Bewegung der Lösung abnimmt.
Im Vergleich mit dem Verfahren 2 stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine 2,6 mal höhere Konzentration und eine gleiche oder bessere Reinheit der Nucleinsäure bereit. Die für die Nucleinsäureisolierung erforderliche Zeit war jedoch für das erfindungsgemäße Verfahren 1,6 mal länger als für das Verfahren 2, welches 5 Minuten benötigte. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Effizienz der Bindung der Nucleinsäure und der festen Phase und die Effizienz der Elu tion dadurch verbessert, daß bewirkt wird, daß die Mischlösung, welche die Probe und die chaotrope Substanz enthält, und das Eluat durch die feste Phase hin- und herbewegt werden, wodurch die Nucleinsäureausbeute verbessert wird.
Andererseits wird in dem Verfahren 2 bewirkt, daß die Lösung durch die feste Phase in nur einer Richtung strömt, so daß, obwohl der erforderliche Zeitraum verringert werden kann, die Bindungseffizienz und die Elutionseffizienz verringert werden, was zu einer Absenkung der Nucleinsäureausbeute führt.
Außerdem wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren, da die Hin- und Herbewegung der Lösung innerhalb des versiegelten Behälters stattfindet, der von der Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung getrennt ist, nicht zugelassen, daß Tröpfchen oder dergleichen der Lösung nach außen entweichen, während die Lösung bewegt wird, wodurch die Gefahr verringert wird, daß die Umwelt verschmutzt wird.
Andererseits werden in den Verfahren 1 und 2 Tropfen der Lösung bei der Abgabe der Lösung aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung nach außen erzeugt, so daß die Gefahr der Umweltverschmutzung erhöht wird.
Somit umfaßt in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Nucleinsäureisoliervorrichtung 11. die zwei Behälterteile 13 und 15, die jeweils eine Öffnung aufweisen.
Die Behälter 13 und 15 sind an ihren Böden über den Verbindungskanal 17 verbunden, worin sich die feste Phase 16 für die Adsorption der Nucleinsäure befindet. Die Probenlösung wird in einem der Behälter 13 und 15 gegeben, und ein Behälter wird unter Druck gesetzt, während der Druck in den anderen Behälter mit Hilfe der Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung 43 wiederholt abgebaut wird, so daß zugelassen wird, daß die Probenlösung durch die feste Phase innerhalb des versiegelten Behälters rasch hin- und herbewegt wird.
Somit stellt die vorliegende Erfindung einen Apparat, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Nucleinsäureisolierung bereit, wobei die Nucleinsäure aus der Nucleinsäure enthaltenden Probe mit hoher Nucleinsäureausbeute und Reinheit innerhalb einer versiegelten Vorrichtung rasch isoliert werden kann.

Claims

Vorrichtung zum Isolieren einer Nucleinsäure aus einer Probenlösung, welche umfaßt: eine feste Phase für die Adsorption von Nucleinsäure in der Probenlösung; eine Nucleinsäureisoliervorrichtung, die einen ersten Behälterteil und einen zweiten Behälterteil umfaßt, die über die feste Phase miteinander in Verbindung stehen, wobei eine Lösung in die Nucleinsäureisoliervorrichtung hinein und aus dieser heraus geleitet wird; und eine Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung zum Druckaufbau im Inneren des ersten Behälterteils oder des zweiten Behälterteils der Nucleinsäureisoliervorrichtung, während im Inneren des anderen Behälterteils Druck abgebaut wird.
Nucleinsäureisoliervorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung eine erste Spritzenpumpe, die mit dem ersten Behälterteil in Verbindung steht, und eine zweite Spritzenpumpe umfaßt, die mit dem zweiten Behälterteil in Verbindung steht.
Nucleinsäureisoliervorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Probenlösung in die Nucleinsäureisoliervorrichtung geleitet wird und aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung nach dem Druckaufbau/Druckabbauvorgang durch die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung geleitet wird, wobei eine Waschlösung in die Nucleinsäureisoliervorrichtung geleitet wird, und die Waschlösung aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung nach dem Druckaufbau/Druckabbauvorgang durch die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung geleitet wird, und wobei ein Eluat in die Nucleinsäureisoliervorrichtung geleitet wird und das Eluat aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung nach dem Druck aufbau/Druckabbauvorgang durch die Druckaufbau/Druckabbauvorrichtung geleitet wird.
Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer Probenlösung, welches umfaßt: das Leiten einer Probenlösung in entweder einen ersten Behälterteil oder einen zweiten Behälterteil, die über eine feste Phase für die Adsorption von Nucleinsäure in der Probenlösung in Verbindung stehen; Aufbauen eines Drucks im Inneren des ersten Behälterteils oder des zweiten Behälterteils, während im anderen Behälterteil Druck abgebaut wird, um zu bewirken, daß die Probenlösung zwischen dem ersten Behälterteil und dem zweiten Behälterteil durch das Adsorptionsmittel hin- und herbewegt wird, so daß zugelassen wird, daß die Nucleinsäure in der Probenlösung auf der festen Phase adsorbiert wird; und Isolieren der Nucleinsäure, die an die feste Phase adsorbiert worden ist.
Nucleinsäureisolierverfahren nach Anspruch 4, welches umfaßt: Einleiten einer Waschlösung in den ersten Behälterteil oder den zweiten Behälterteil, nachdem die Nucleinsäure an die feste Phase adsorbiert worden ist; Durchführen eines Druckaufbau/Druckabbauvorgangs durch Aufbauen eines Drucks im Inneren des ersten oder des zweiten Behälterteils, während im Inneren des anderen Behälterteils Druck abgebaut wird, so daß bewirkt wird, daß die Waschlösung zwischen dem ersten Behälterteil und dem zweiten Behälterteil durch die feste Phase bewegt wird; Ausleiten der Waschlösung aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung, weiche den ersten Behälterteil und den zweiten Behälterteil aufweist; Leiten eines Eluats in den ersten Behälterteil oder den zweiten Behälterteil; Ausleiten des Eluats aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung, die den ersten Behälterteil und den zweiten Behälterteil aufweist, nach dem Druckaufbau/Druckabbauvorgang; und Isolieren der Nucleinsäure.
Vorrichtung zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer Probenlösung, welche umfaßt: einen Behälter; eine Trennwand, die den Behälter in einen ersten Behälterteil mit einem ersten Öffnungsteil und einen zweiten Behälterteil mit einem zweiten Öffnungsteil unterteilt, wobei die Trennwand eine darin gebildete Verbindungsöffnung aufweist, welche den ersten Behälterteil und den zweiten Behälterteil miteinander verbindet; und eine feste Phase für die Adsorption von Nucleinsäure, wobei die feste Phase innerhalb der in der Trennwand gebildeten Verbindungsöffnung angebracht ist.
Nucleinsäureisoliervorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Verbindungsöffnung an einer Position gebildet ist, die dem Boden des ersten Behälterteils und des zweiten Behälterteils entspricht.
Nucleinsäureisoliervorrichtung nach Anspruch 7, wobei der Boden des ersten Behälterteils zum Boden des zweiten Behälterteils hin geneigt ist.
Nucleinsäureisoliervorrichtung nach Anspruch 8, welche eine scheibenförmige Rippe aufweist, die an dem Öffnungsteil des ersten Behälterteils und des zweiten Behälterteils angebracht ist.
Vorrichtung zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer Probenlösung, welche umfaßt: einen Behälter; eine Trennwand, die den Behälter in einen ersten Behälterteil mit einem ersten Öffnungsteil und einen zweiten Behälterteil mit einem zweiten Öffnungsteil unterteilt, und eine feste Phase für die Adsorption von Nucleinsäure, wobei der erste Behälterteil eine auf dem Boden des ersten Behälterteils gebildete Verbindungsöffnung aufweist, wobei die Verbindungsöffnung den ersten Behälterteil und den zweiten Behälterteil miteinander verbindet und wobei die feste Phase innerhalb der Verbindungsöffnung angebracht ist.
Nucleinsäureisoliervorrichtung nach Anspruch 10, die eine scheibenförmige Rippe aufweist, die an den Öffnungsteilen des ersten Behälterteils und des zweiten Behälterteils angebracht ist.
Vorrichtung zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer Probenlösung, welche umfaßt: einen ersten Behälter mit einem Öffnungsteil; einen zweiten Behälter mit einem Öffnungsteil; und eine feste Phase für die Adsorption von Nucleinsäure, wobei eine Verbindungsöffnung vorhanden ist, über die der erste Behälter und der zweite Behälter miteinander verbunden sind, wobei die feste Phase innerhalb der Verbindungsöffnung angebracht ist.
Nucleinsäureisoliervorrichtung nach Anspruch 12, die eine scheibenförmige Rippe aufweist, die an den Öffnungsteilen des ersten Behälters und des zweiten Behälters angebracht ist.
Vorrichtung zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer Probenlösung, welche umfaßt: eine feste Phase für die Adsorption von Nucleinsäure; einen ersten Behälter mit einem ersten Öffnungsteil, wobei der erste Behälter außerdem eine in seinem Bodengebildete Öffnung aufweist, wo das Nucleinsäureadsorptionsmittel angebracht ist; und einen zweiten Behälter mit einem zweiten Öffnungsteil, wobei der zweite Behälter so angepaßt ist, daß er an den ersten Behälter angepaßt ist.
Nucleinsäureisoliervorrichtung nach Anspruch 14, die eine scheibenförmige Rippe aufweist, die sich an den Öffnungsteilen des ersten Behälters und des zweiten Behälters befindet.
Vorrichtung zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer Probenlösung, welche umfaßt: ein Adsorptionsmittel für die Adsorption von Nucleinsäure in der Probenlösung; ein Nucleinsäureisoliermittel, welches einen ersten Behälterteil und einen zweiten Behälterteil aufweist, die über das Adsorptionsmittel miteinander verbunden sind; Mittel zum Einleiten und Ausleiten einer Lösung in und aus der Nucleinsäureisoliervorrichtung; und Druckaufbau/Druckabbaumittel zum Aufbauen von Druck im Inneren des ersten Behälterteils oder des zweiten Behälterteils des Nucleinsäureisoliermittels, während der Druck im Inneren des anderen Behälterteils abgebaut wird.
Nucleinsäureisoliervorrichtung nach Anspruch 16, wobei das Druckaufbau/Druckabbaumittel eine erste Spritzenpumpe umfaßt, die mit dem ersten Behälterteil verbunden ist, und eine zweite Spritzenpumpe, die mit dem zweiten Behälterteil verbunden ist.
Nucleinsäureisoliervorrichtung nach Anspruch 16, wobei das Einleiten/Ausleiten bedeutet: Einleiten der Probe lösung in das Nucleinsäureisoliermittel Ausleiten der Lösung aus dem Nucleinsäureisoliermittel nach einem Druckaufbau/Druckabbauvorgang durch das Druckaufbau/Druckabbaumittel; Einleiten einer Waschlösung in das Nucleinsäureisoliermittel; Ausleiten der Waschlösung aus dem Nucleinsäureisoliermittel nach einem Druckaufbau/Druckabbauvorgang durch das Druckaufbau/Druckabbaumittel; Einleiten eines Eluats in das Nucleinsäureisoliermittel; und Ausleiten des Eluats aus dem Nucleinsäureisoliermittel nach dem Druckaufbau/Druckabbauvorgang durch das Druckaufbau/Druckabbaumittel.