DE102007018356A1

DE102007018356A1 - Mikrokapsel

Info

Publication number: DE102007018356A1
Application number: DE200710018356
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. Parak; Maximilian Semmling; Almudena Munoz Javier; Josef Prof. Dr. Käs; Oliver Dr. Kreft; Gleb Prof. Dr. Sukhorukov
Original assignee: Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Current assignee: Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Priority date: 2007-04-18
Filing date: 2007-04-18
Publication date: 2008-10-30

Abstract

Eine Mikrokapsel (9) zur Untersuchung eines Aufnahmeverhaltens einer Mikrostruktur, insbesondere einer lebenden Zelle, aus einem Äußeren der Mikrostruktur in ein Inneres der Mikrostruktur, wobei die Mikrokapsel (9) einen von einer Kapselwand (11) umgebenden Hohlraum (13) aufweist. Die Mikrokapsel (9) weist einen auf einen Analyt empfindlichen ersten Farbstoff (3) auf, um unter Ausnutzung eines Unterschieds der Konzentration des Analyts zwischen Äußerem und Innerem der Mikrostruktur zu ermitteln, ob die Mikrokapsel (9) im Inneren oder im Äußeren der Mikrostruktur vorliegt. Außerdem eine Verwendung der Mikrokapsel zum Nachweis pathologischer oder pathogener Zellen.

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mikrokapsel zur Untersuchung eines Aufnahmeverhaltens einer Mikrostruktur, insbesondere einer lebenden Zelle, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Sie betrifft außerdem ein Verfahren zur Untersuchung eines Aufnahmeverhaltens einer Mikrostruktur, insbesondere einer lebenden Zelle. Weiter betrifft sie die Verwendung der Mikrokapsel oder des Verfahrens zum Nachweis pathologischer oder pathogener Zellen. Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung Farbstoffbeladener Mikrokapseln.
Stand der Technik
Aus W. Parak et al., "Combined atomic force microscopy and optical microscopy measurements as a method to investigate particle uptake by sales", small, 2006, 2, Nr. 3, 394–400 sind Mikrokapseln mit einer Kapselwand aus fünf abwechselnden Doppelschichten negativ geladenem Poly(styrolsulfonat) und positiv geladenem Poly(allylaminhydrochlorid) (PSS/PAH) bekannt. In die Kapselwand wurden grün fluoreszierende CdTe-Nanopartikel eingebettet. Die Aufnahme der fluoreszierenden Kapseln in lebende Zellen wurde mit Hilfe konventioneller Lichtmikroskopie und konfokaler Mikroskopie untersucht.
Bei der Untersuchung der Zellen mit konventioneller Lichtmikroskopie kann es schwierig sein, zu klären, ob eine Mikrokapsel von einer Zelle aufgenommen worden ist oder ob sie der Zelle möglicherweise nur von außen anhaftet. Zwar hat sich gezeigt, dass eine solche Aufklärung mit konfokaler Mikroskopie besser gelingt, jedoch ist die konfokale Mikroskopie ein vergleichsweise aufwändiges Verfahren, das sich darüber hinaus auch nur bedingt oder mit Schwierigkeiten automatisieren lässt.
Weiter sind außerdem aus dem Stand der Technik sogenannte PEBBLEs (Probes Encapsulated By Biologically Localized Embedding) bekannt, um Analytkonzentrationen in kleinen Volumina zu messen. PEBBLEs sind typischerweise 20 bis 400 nm große globuläre Partikel aus einer porösen, biologisch inerten Matrix, in deren Poren Fluoreszenzfarbstoffe eingebettet sind, die auf bestimmte Analyte reagieren. Die Farbstoffe können z. B. mittels mikroskopischer Verfahren nachgewiesen werden. Es sind u. a. PEBBLs bekannt, die auf H⁺-, K⁺-, Ca²⁺-, Mg²⁺-, Zn²⁺- oder Cl- empfindlich sind. PEBBLE-Sensoren werden heute routinemäßig zum Nachweis von Analyten in Zellen eingesetzt.
Der Erfindung zugrundeliegendes Problem
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Mikrokapsel zur Untersuchung eines Aufnahmeverhaltens einer Mikrostruktur, insbesondere einer lebenden Zelle, bereitzustellen. Weiter liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Untersuchung eines Aufnahmeverhaltens einer Mikrostruktur, insbesondere einer lebenden Zelle, bereitzustellen. Die verbesserten Mikrokapseln und das verbesserte Verfahren sollen insbesondere dazu beitragen, bei der Untersuchung des Aufnahmeverhaltens einer Mikrostruktur einen höheren Grad der Automatisierung zu erreichen. Schließlich liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine neue Verwendung der Mikrokapsel oder des Verfahrens bereitzustellen.
Erfindungsgemäße Lösung
Zur Lösung der Aufgabe lehrt die Erfindung eine Mikrokapsel mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 12. Sie lehrt außerdem eine Verwendung der Mikrokapsel oder des Verfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 16 und ein Verfahren zur Herstellung einer Mikrokapsel mit den Merkmalen des Anspruchs 17.
Mikrokapseln im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Kapseln, die sich in Hinblick auf ihre Größe zur lichtmikroskopischen Ermittlung ihrer Farbe eignen. Bevorzugte Mikrokapseln sind größer als 1 um. Außerdem ist die Größe der Mikrokapseln vorzugsweise so gewählt, dass sie von lebenden Zellen aufgenommen werden können. Bevorzugte Mikrokapseln sind kleiner als 1 mm, besonders vorzugsweise kleiner als 100 μm. Besonders bevorzugte Mikrokapseln haben einen Durchmesser kleiner als 10 μm, z. B. zwischen 2 und 7 μm, z. B. 5 μm.
Eine Mikrostruktur im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Struktur, die ein Inneres und ein Äußeres definiert, in denen ein Analyt in verschiedenen Konzentrationen vorliegen kann, und die in Hinblick auf ihre Größe geeignet ist, eine Mikrokapsel aufzunehmen. Die Mikrostruktur kann von einer Grenzschicht, z. B. einer Zellmembran, umgeben sein, die die Grenze zwischen Innerem und Äußerem definiert. Eine bevorzugte Mikrostruktur ist eine lebende Zelle. Während der Durchmesser bevorzugter Mikrostrukturen im Bereich zwischen 1 μm und 1 mm liegt, ist die vorliegende Erfindung nicht auf Mikrostrukturen dieses Größenbereichs beschränkt.
Die Farbe eines Farbstoffs im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Emission durch den Farbstoff von Licht mindestens einer Wellenlänge, z. B. durch Fluoreszenz. Ein Ermitteln einer Farbe im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die quantitative oder qualitative Messung des emittierten Lichts bei mindestens einer Wellenlänge.
Der Erfindung liegt die Überlegung zugrunde, dass sich die Konzentration bestimmter Analyte im Inneren und im Äußeren einer lebenden Zelle häufig unterscheiden. Dadurch, dass die erfindungsgemäße Mikrokapsel einen auf ein Analyt empfindlichen ersten Farbstoff aufweist, kann aus der Farbe der Mikrokapsel auf die Konzentration des Analyts und damit darauf geschlossen werden, ob sich die Mikrokapsel im Inneren oder außerhalb einer Zelle befindet.
Es ist ein erreichbarer Vorteil der Erfindung, dass mit konventionellen lichtmikroskopischen Verfahren zuverlässiger ermittelt werden kann, ob eine Kapsel von einer lebenden Zelle aufgenommen worden ist oder nicht. Das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren und die erfindungsgemäßen Mikrokapseln eignen sich insbesondere zur Verwendung mit Hochdurchsatzverfahren (high throughput-screening). Mit solchen Methoden können eine große Zahl von Zellen gleichzeitig oder in schneller Folge nacheinander untersucht werden. So können mit dem erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren z. B. große Zahlen unterschiedlicher Mikrokapseln hinsichtlich ihrer Aufnahme durch eine große Zahl unterschiedlicher Zellen untersucht werden.
Der Farbstoff kann in der erfindungsgemäßen Kapsel eine höhere Konzentration aufweisen, als es bei einem gewöhnlichen Anfärben der Zellen mit dem freien Farbstoff möglich wäre, weil der Farbstoff in die Kapsel eingeschlossen ist und deshalb nicht durch Diffusion im Plasma zerlaufen kann. Dies kann vorteilhaft eine verbesserte Nachweisbarkeit des Farbstoffs in der Zelle zur Folge haben. Die Erfinder konnten in Experimenten eine um drei und mehr Größenordnungen höhere lokale Farbkonzentration in den Mikrokapseln bereitstellen als bei einfacher Injektion des Farbstoffes in die Zellen. Dabei stellten die Erfinder sowohl eine verbesserte Sensibilität als auch eine verbesserte Sensitivität des eingesetzten Farbstoffs fest.
Es ist ein erreichbarer Vorteil der Erfindung, dass eine Toxizität des Farbstoffes durch ein Einschließen in die Kapsel verringert werden kann. Die Erfinder konnten in Experimenten beobachten, dass Zellen, die die erfindungsgemäßen Mikrokapseln aufgenommen hatten, auch weiterhin zur Zellteilung fähig waren.
Die erfindungsgemäße Verwendung der erfindungsgemäßen Mikrokapseln und des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens zum Nachweis pathologischer oder pathogener Zellen macht sich zunutze, dass Krebszellen, vermutlich wegen einer durch einen erhöhten Stoffwechsel ausgelösten erhöhten unspezifischen Aufnahme, häufig eine größere Anzahl von Mikrokapseln aufnehmen als gesunde Zellen. Es ist deshalb mit der Erfindung erreichbar, Krebszellen auf Grundlage einer erhöhten Aufnahme farbstoffbeladener Mikrokapseln von gesunden Zellen zu unterscheiden. Es ist auch denkbar, im Zusammenhang mit malignen oder entarteten Zellen intrazelluläre Vorgänge zu untersuchen, die mit der Entstehung oder dem Verlauf von Krebserkrankungen einhergehen. Es ist insbesondere denkbar, die erfindungsgemäßen Mikrokapseln und das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren zum routinemäßigen Nachweis pathologischer oder pathogener Zellen einzusetzen.
Der Fachmann erkennt, dass mit Hilfe der erfindungsgemäßen Mikrokapseln und des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens auch enzymatische Reaktionen und Stoffwechselvorgänge, bei denen sich Analytkonzentrationen verändern, untersucht werden können. Es ist ein erreichbarer Vorteil der Erfindung, dass Analytkonzentrationen, insbesondere Innenkonzentrationen, mit einer guten räumlichen und zeitlichen Auflösung in vivo erfasst werden können. Dies kann beispielsweise zur Aufklärung komplexer Wechselbeziehungen zwischen einzelner Innenkonzentrationen und ihrer Rolle beim Vermitteln spezifischer Zellantworten ausgenutzt werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung vorzugsweise in der Zellbiologie eingesetzt wird, z. B. zur Untersuchung pathologischer oder pathogener Zellen, z. B. Krebszellen, ist sie nicht auf Anwendungen in diesem Bereich oder auf Anwendungen im Bereich der klinischen oder analytischen Chemie beschränkt.
Aufbau und Weiterbildung der erfindungsgemäßen Lösung
Vorteilhafte Aus- und Weiterbildungen, welche einzeln oder in Kombination eingesetzt werden können, sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist der Farbstoff auf Ionen als Analyt, besonders vorzugsweise solche Ionen, die in der Biologie von Bedeutung sind, empfindlich. Ein besonders bevorzugter Analyt sind Wasserstoffionen (H⁺). Der bevorzugte Farbstoff ist ein pH-sensitiver Farbstoff. Mit dieser Ausführung der Erfindung ist erreichbar, dass ein pH-Unterschied zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Mikrostruktur, insbesondere einer lebenden Zelle, ausgenutzt werden kann, um zu ermitteln, ob die Mikrokapsel im Inneren oder im Äußeren der Mikrostruktur vorliegt. Es ist bekannt, dass lebende Zellen in ihrem Inneren, z. B. in ihren Endosomen oder Lysosomen, häufig einen niedrigeren pH-Wert aufweisen als ein Kulturmedium, das die Zellen umgibt.
Ein bevorzugter Farbstoff ist ein Fluoreszenzfarbstoff. In dieser Ausführung der Erfindung ist es möglich, das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren mit Hilfe Fluoreszenzlichtmikroskopischer und/oder Fluoreszenzspektroskopischer Methoden auszuführen.
Vorzugsweise ändert der erste Farbstoff seine Farbe in Abhängigkeit der Analytkonzentration, besonders vorzugsweise des pH-Werts. Eine Farbänderung im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Veränderung der Intensität des von dem Farbstoff emittierten Lichts bei mindestens einer Wellenlänge. Bei einem besonders bevorzugten Farbstoff ist die Farbänderung eine Änderung des Verhältnisses der Intensität des von dem Farbstoff emittierten Lichts bei mindestens einer Wellenlänge zu der Intensität bei mindestens einer anderen Wellenlänge. Es ist ein erreichbarer Vorteil dieser Ausführung der Erfindung, dass aus dem Intensitätsverhältnis auf die Konzentration des Analyts geschlossen werden kann. Ein besonders bevorzugter Farbstoff ist SNARF^®. Der Farbstoff liegt vorzugsweise an ein Polysaccharid gebunden vor, z. B. als SNARF^®-1-Dextran.
Eine bevorzugte Mikrokapsel weist genau eine Kapselwand auf. Die Kapselwand umfasst vorzugsweise ein Polymermaterial, besonders vorzugsweise ein polyelektrisches Polymermaterial, z. B. Poly(styrolsulfonat) (PSS) und/oder Poly(allylaminhydrochlorid) (PAH). Eine besonders bevorzugte Kapselwand ist zwiebelschalenartig aus einer Mehrzahl von Schichten, vorzugsweise 5 bis 20 Schichten, aufgebaut. In einer Ausführung der Erfindung umfasst die Kapsel alternierende Schichten zweier unterschiedlicher Materialien, vorzugsweise Polymermaterialien, besonders vorzugsweise mit unterschiedlicher Ladung. Die Materialien sind vorzugsweise polyelektrolytische Polymermaterialien, z. B. negativ geladenes PSS und positiv geladenem PAH. Die bevorzugte Mikrokapsel weist genau einen Hohlraum auf, der besonders vorzugsweise von der Kapselwand eingeschlossen wird.
Durch die Ausgestaltung der Mikrokapsel als Kapsel mit Hohlraum und Kapselwand ist es erreichbar, zwei voneinander getrennte Bereiche der Mikrokapsel zu schaffen, den Hohlraum und die Kapselwand, von denen jede zur Aufnahme eines Farbstoffs geeignet ist. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung liegt der erste Farbstoff in dem Hohlraum der Mikrokapsel vor. Es sind aber auch Ausführungen der Erfindung denkbar, bei denen der erste Farbstoff in der Kapselwand vorliegt.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung weist die Kapsel neben dem ersten Farbstoff mindestens einen von diesem unterschiedlichen zweiten Farbstoff auf. Der zweite Farbstoff kann im Hohlraum und/oder in der Kapselwand angeordnet sein. Vorzugsweise ist auch der zweite Farbstoff ein auf ein Analyt empfindlicher Farbstoff. Insoweit sind die oben beschriebenen Ausführungen des ersten Farbstoffs auch mögliche Ausführungen des zweiten Farbstoffs. Besonders vorzugsweise ist der zweite Farbstoff auf einen anderen Analyt empfindlich als der erste Farbstoff, um mit der erfindungsgemäßen Mikrokapsel die Konzentration mehrerer Analyte gleichzeitig zu ermitteln. Es ist aber auch denkbar, dass der erste und der zweite Farbstoff auf den gleichen Analyt empfindlich sind, z. B. um die Messgenauigkeit bei der Bestimmung der Analytkonzentration durch die Mikrokapsel zu verbessern.
Der zweite Farbstoff kann auch dazu dienen, die Mikrokapsel zu markieren, um bei der Verwendung mehrerer Fraktionen unterschiedlicher Mikrokapseln diese voneinander zu unterscheiden, z. B. indem eine Fraktion mit einem zweiten Farbstoff einer ersten Farbe und eine andere Fraktion mit einem zweiten Farbstoff einer anderen Farbe markiert ist. Diese Ausführung der Erfindung erlaubt es vorteilhaft, Untersuchungen mit verschiedenen Fraktionen von Mikrokapseln gleichzeitig durchzuführen. Mikrokapseln, die beispielsweise denselben ersten Farbstoff aufweisen oder an ihrer Oberfläche mit denselben Liganden ausgestattet sind, können mit demselben zweiten Farbstoff markiert sein. Auf diese Weise kann erreicht werden, dass bei gleichzeitiger Erfassung des ersten und zweiten Farbstoffs einer bestimmten Mikrokapsel nicht nur festgestellt werden kann, ob diese von der Zelle aufgenommen wurde (erster Farbstoff), sondern auch welchen Liganden diese Mikrokapsel trägt (zweiter Farbstoff). Die Markierung kann bei entsprechender Versuchsplanung auch eine Aussage darüber machen, auf welchen Analyt die entsprechende Mikrokapsel empfindlich ist. Bei Verwendung des zweiten Farbstoffs als Markierung ist dieser vorzugsweise nicht auf den Analyt empfindlich. Die Erfindung ist nicht auf Mikrokapsel mit nur zwei Farbstoffen beschränkt. Vielmehr sind auch Mikrokapseln denkbar, die mit drei oder mehr Farbstoffen ausgerüstet sind.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung umfasst der zweite oder einer der zweiten Farbstoffe wenigstens einen Halbleiternanokristall, z. B. einen Quantum-Dot, zur Markierung der Mikrokapsel. Besonders vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße Mikrokapsel mehrere Quantum-Dots als zweiten Farbstoff, besonders vorzugsweise mehrere Quantum-Dots unterschiedlicher Farbe. Durch die Kombination mehrerer Farben, lässt sich ein Satz einzigartiger Markierungen, in ihrer Funktion vergleichbar mit Barcodes, erzeugen. Es ist ein erreichbarer Vorteil dieser Ausführung der Erfindung, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Mikrokapseln voneinander unterschieden werden können. Die zur Markierung der Mikrokapsel verwendeten Farbstoffe sind vorzugsweise in der Kapselwand untergebracht.
Die erfindungsgemäßen Mikrokapseln weisen vorzugsweise mindestens einen magnetischen Partikel auf, der grundsätzlich an beliebiger Stelle der Mikrokapsel vorgesehen sein kann, z. B. in der Kapselwand. Es ist ein erreichbarer Vorteil dieser Ausführung der Erfindung, dass die Mikrokapseln mittels des magnetischen Partikels aus einem sie umgebenden Medium separiert werden können, beispielsweise im Verlauf ihrer Herstellung. Insbesondere können auf diese Weise Herstellungsschritte vermieden werden, bei denen die Mikrokapseln zur Agglomeration neigen. Ein geeignetes Material für die magnetischen Partikel ist z. B. Magnetit.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist die Mikrokapsel auf ihrer Außenseite mit mindestens einem Liganden ausgestattet. Bevorzugt sind solche Liganden, die die Aufnahme der Mikrokapsel in die Mikrostruktur, insbesondere eine lebende Zelle, beeinflussen, oder von denen dies vermutet wird. Besonders bevorzugt sind Liganden, die an Rezeptoren einer Zellmembran binden oder von denen dieses vermutet wird. Mit dieser Ausführung der Erfindung kann eine Rezeptor-vermittelte Aufnahme der Mikrokapseln untersucht werden. Von besonderem Interesse können Liganden sein, die die Aufnahme der Mikrokapseln in die Zelle erhöhen oder solche, von denen dies vermutet wird.
Zur Untersuchung, ob ein bestimmter Ligand oder eine Kombination bestimmter Liganden die Aufnahme von Partikeln in bestimmte Zellen verbessert, werden in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung mit dem oder den Liganden auf Ihrer Außenseite ausgestattete Mikrokapseln mit den Zellen in Kontakt gebracht, z. B. indem sie einem Medium, in dem die Zellen sich befinden, zugegeben werden, sodass sie durch Diffusion zu den Zellen gelangen können. Die Mikrokapseln sind vorzugsweise mit einem pH-empfindlichen ersten Farbstoff, z. B. SNARF^®-1-Dextran ausgestattet, sodass aufgrund eines unterschiedlichen pH-Werts innerhalb und außerhalb der Zelle die Farbe einer Mikrokapsel davon abhängt, ob sie sich innerhalb oder außerhalb einer Zelle befindet. Aus dem Verhältnis der Anzahl mit einer Zelle ko-lokalisierter Mikrokapseln der Farbe, die dem pH-Wert außerhalb der Zelle entspricht, zu der Anzahl mit einer Zelle ko-lokalisierter Mikrokapseln der Farbe, die dem pH-Wert innerhalb der Zelle entspricht, kann zwischen adhärierten und aufgenommenen Zellen unterscheiden werden und daraus auf die Wirkung des oder der Liganden geschlossen werden.
Bei der Untersuchung einer Rezeptor-spezifischen Aufnahme der Mikrokapseln kann eine unspezifische Aufnahme der Mikrokapseln durch die Zelle hinderlich sein. Deshalb ist die erfindungsgemäße Mikrokapsel in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung mit Poly(ethylenglycol)(PEG) beschichtet. Die Liganden sind vorzugsweise an die PEG-Schicht gebunden. Es ist ein erreichbarer Vorteil dieser Ausführung der Erfindung, dass die unspezifische Aufnahme der Mikrokapsel in die Mikrostruktur herabgesetzt wird und dadurch besondere Aussagen darüber möglich sind, ob und in welchem Umfang eine durch den Liganden vermittelte Rezeptor-spezifische Aufnahme der Mikrokapsel in die Mikrostruktur stattfindet.
Die Experimente der Erfinder haben gezeigt, dass Zellen die Mikrokapseln vorzugsweise in Endosomen oder Lysosomen einschließen. Bei manchen Anwendungen kann es jedoch wünschenswert sein, dass sich die erfindungsgemäßen Mikrokapseln im Zytosol der Zelle befinden, z. B. um die Konzentration eines bestimmten Analyts in der Zelle festzustellen. Zu diesem Zweck können die erfindungsgemäßen Mikrokapseln an ihrer Oberfläche mit einem Endosom-auflösenden Mittel, vorzugsweise einem Peptid, ausgestattet oder das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren so modofiziert sein, dass die endosomale Membran durch ein kontrolliertes lokales Erhitzen, z. B. mittels Infrarotstrahlung oder einem oder mehrerer in die Mikrokapsel, vorzugsweise deren Kapselwand, eingeschlossener Metallpartikel, aufgelöst wird.
In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt im Schritt des Ermittelns der Farbe der Mikrokapseln ein Hochdurchsatzverfahren zum Einsatz. Solche Verfahren erlauben die Untersuchung einer Vielzahl von Mikrostrukturen gleichzeitig oder in schneller Folge. Zum Beispiel kann ein flusszytometrisches Verfahren zum Einsatz kommen. Ein flusszytometrisches Verfahren im Sinne der vorliegenden Erfindung ist nicht auf Zellen beschränkt, sondern betrifft allgemein die Untersuchung von in einem fließenden Medium suspendierter Mikrostrukturen. Bei einem bevorzugten flusszytometrischen Verfahren werden die zu untersuchenden Mikrostrukturen und Mikrokapseln durch einen Kanal geleitet und mit einer Lichtquelle, besonders vorzugsweise einer Laserlichtquelle, beleuchtet. Vorzugsweise wird durch eine spektroskopische Analyse des emittierten Lichts auf die Farbe der Mikrokapseln geschlossen. Hierzu sind besonders vorzugsweise mit Farbfiltern ausgestattete Lichtdetektoren vorgesehen. Das von den Detektoren abgegebene Signal wird vorzugsweise mit Hilfe einer Datenverarbeitungseinrichtung ausgewertet. In einer anderen Ausführung der Erfindung wird zum Ermitteln der Farbe der Mikrokapseln ein von einer Datenverarbeitungseinrichtung gesteuertes Lichtmikroskop eingesetzt. Vorzugsweise wird das von dem Lichtmikroskop erzeugte Bild von einer Kamera aufgenommen und von einer Datenverarbeitungseinrichtung weiterverarbeitet.
Die erfindungsgemäßen Mikrokapseln und das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich auch dafür, zeitaufgelöste Veränderungen von Analytkonzentration, insbesondere pH-Werten, aufzunehmen und darzustellen.
Bei dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren einer mit einem Farbstoff (3) beladenen Mikrokapsel ist der Farbstoff vorzugsweise ein Fluoreszenzfarbstoff, besonders vorzugsweise SNARF^®. Das bevorzugte Polysaccharid ist Dextran und der bevorzugte Farbstoffmolekül-Polysaccharid-Komplex ist SNARF^®-1-Dextran. Die Polymerschicht umfasst vorzugsweise PSS und/oder PAH. Die Polymerschicht ist vorzugsweise eine Polymermultischicht, besonders vorzugsweise mit alternierenden Schichten entgegengesetzt geladener Polyelektrolyte, z. B. alternierenden Schichten von PSS und PAH. Der Calciumcarbonatpartikel wird vorzugsweise mit Hilfe von EDTA aus der Mikrokapsel herausgelöst.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
Die Erfindung wird im Folgenden anhand schematischer Zeichnungen an Ausführungsbeispielen mit weiteren Einzelheiten näher erläutert.
Es zeigen:
1: Schematisch die Schritte der Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrokapsel;
2: Eine mit dem Verfahren aus 1 hergestellte erfindungsgemäße Mikrokapsel;
3: Das Fluoreszenz-Emissionsspektrum des bevorzugten Fluoreszenzfarbstoffs SNARF^®-1-Dextran;
4: Das Verhältnis der roten (650 nm Wellenlänge) zur grünen (580 nm Wellenlänge) Fluoreszenz von SNARF^®-1-Dextran; und
5: Schematisch den Aufbau einer weiteren erfindungsgemäßen Mikrokapsel.
Zur Verkapselung des SNARF®-1-Dextrans wird im Wesentlichen das in Petrov et al., "Proteine-calciumcarbonate coprecipitation: a tool for Proteine encapsulation", Biotechnol. Proc. 2005, Nr. 21, S. 918–925 entsprechend angepasst verwendet, mit dem Unterschied, dass nicht gleiche Volumina 0,33-molarer CaCl₂- und Na₂CO₃-Lösungen miteinander gemischt werden, wobei die CaCl₂-Lösung zusätzlich die zu verkapselnde Substanz enthält, sondern zur Verkapselung von SNARF^®-1-Dextran 2,5 ml einer wässrigen SNARF^®-1-Dextran-Lösung vorgelegt werden und dann je 0,615 ml 1-molarer CaCl₂- und 1-molarer Na₂CO₃- Lösung dazugegeben werden. Der das Herstellungsverfahren betreffende Inhalt der vorgenannten Schrift ist durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung.
Das Herstellungsverfahren der Mikrokapseln ist in 1 schematisch in einzelnen Schritten dargestellt. Globuläre Calciumcarbonat-Mikropartikel 1 mit Durchmessern zwischen 1 und 10 μm, in die SNARF^®-1-Dextran-Moleküle 3 eingebettet sind, werden durch Präzipitation von übersättigter CaCl₂- und Na₂CO₃-Lösung in Anwesenheit von SNARF^®-1-Dextran-Molekülen 3 (Kopräzipitation) hergestellt. Nach schichtweisem Aufbringen von sechs Doppelschichten PSS/PAH in Anwesenheit von Magnetit-Nanopartikeln 7 wurde das CaCO₃ durch Behandlung mit EDTA extrahiert. Zur Vereinfachung sind in 3 nur drei Doppellagen 5 von negativ geladenem PSS und positiv geladenem PAH dargestellt. Die Kapseln 9 sind in den Figuren rein schematisch und nicht maßstabsgetreu wiedergegeben.
Eine mit dem in 1 dargestellten Verfahren hergestellte Mikrokapsel 9 ist in 2 schematisch wiedergegeben. Die Wand 11 der Mikrokapsel 9 ist aus zwiebelschalenartig angeordneten aufeinanderfolgenden Schichten 15 und 17 entgegengesetzt geladener Polymere aufgebaut, wobei die positiv geladenen Polymerschichten mit 15, die negativ geladenen Polymere mit 17 bezeichnet sind. In die Kapselwand 11 sind negativ geladene Magnetit-Nanopartikel 7 eingebettet. In dem von der Kapselwand 11 eingeschlossenen Kapselhohlraum 13 liegen die SNARF^®-1-Dextran-Molekülen 3 vor. Wasserstoffionen können die Kapselwand 11 durchdringen. Mit zunehmendem pH-Wert der Umgebung der SNARF^®-1-Dextran-Moleküle ändert sich deren Fluoreszenzfarbe von Rot zu Grün.
3 zeigt ein Fluoreszenz-Emissionsspektrum von SNARF^®-1-Dextran-Molekülen 3 (MW = 70,000 g/mol, 10 μg/ml) in wässriger Lösung bei den angegebenen pH-Werten. Die Moleküle 3 wurden mit Licht einer Wellenlänge um 488 nm angeregt. Die eingezeichneten Kurven 19, 21, 23 und 25 geben hierbei Messergebnisse bei einem pH von 6,0 (Kurve 19), 7,0 (Kurve 21), 8,0 (Kurve 23) bzw. 9,0 (Kurve 25) wieder. Die Kurvenverläufe spiegeln die dualen Fluoreszenz-Emissionseigenschaften der SNARF^®-1-Dextran-Moleküle 3 wider: Je alkalischer die Lösung ist, in der die SNARF^®-1-Dextran-Moleküle 3 vorliegen, desto niedriger ist die Fluoreszenzintensität bei 580 nm und desto höher ist die Fluoreszenzintensität bei 650 nm.
Das Verhältnis r/g von roter (bei einer Wellenlänge um 650 nm) zu grüner (bei einer Wellenlänge um 580 nm) Fluoreszenz von SNARF^®-1-Dextran ist in 4 zu sehen. Dabei zeigt die gestrichelte Kurve 27 das Verhältnis, wie es sich aus 3 ergibt, der Fluoreszenzintensitäten von SNARF^®-1-Dextran-Molekülen, die in wässriger Lösung aufgelöst sind. Die durchgehende Kurve 29 gibt das Verhältnis r/g der roten und grünen Fluoreszenzintensitäten von SNARF^®-1-Dextran-Molekülen 3 an, die in das Innere der Mikrokapseln 9 eingebettet sind. Die geringere Steigung der Kurve lässt sich möglicherweise mit der höheren lokalen Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs erklären.
Herstellung von Kapseln mit zwei Farbstoffen
Die Mikrokapsel 9 kann an unterschiedlichen Stellen mit unterschiedlichen Farbstoffen 3, 31 markiert sein. Um dies zu zeigen, haben die Erfinder Kapseln 9 hergestellt, bei denen SNARF^®-1-Dextran 3 in ihrem Hohlraum 13 eingebettet vorliegt, und welche einen organischen Fluorophor 31 in ihrer Wand 11 aufweisen.
Hierzu wurden um SNARF^®-1-Dextran enthaltende CaCO₃-Partikel 1 herum wie oben beschrieben alternierende Schichten von PSS und PAH angeordnet. Für mittlere Schichten wurde anstelle von PAH entweder PAH-TRITC oder PAH-Alexa-Fluor 488 verwendet. PAH-TRITC und PAH-Alexa-Fluor 488 wurden durch kovalente Bindung von Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC, roter Fluorophor), oder NHS-Alexa-Fluor 488 (grüner Fluorophor) jeweils an PAH nach dem in G. B. Sukhorukov et al., „Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating", Biomacromolecules, 2004, 5 (5), S. 1962–1972 offenbarten Verfahren hergestellt. Der gesamte diesbezügliche Inhalt der genannten Veröffentlichung ist durch Verweis jeweils Teil der vorliegenden Offenbarung. Nach dem Aufbau der einzelnen Schichten waren die markierten Polymere stabil in das Polyelektrolyt-Netzwerk integriert. In einem letzten Schritt wurde das Calziumcarbonat durch Behandlung mit EDTA aufgelöst.
5 zeigt den schematisch vereinfachten Aufbau einer so hergestellten Mikrokapsel 9 mit zwei Farbstoffen 3, 31. Die Mikrokapsel 9 dieser Ausführungsform unterscheidet sich von der Mikrokapsel 9 der 1 und 2 im Wesentlichen dadurch, dass dieser anstelle der Magnetit-Nanopartikel 7 einen zweiten Farbstoff 31 (Alexa-Fluor 488 oder TRITC) in seiner Kapselwand 11 aufweist.
Verwendung der Mikrokapsel zum Nachweis von Zellen
MDA-MB 435s-Brustkrebs-Zellen (ATTC, USA) wurden in L-15 Leibovitz-Medium (Biochrom AG, n° F1315) unter Zusatz von 1% L-Glutamin (Biochrom AG, n° K0282), 1% Penicillin/Streptomycin (GIBCO. n° 15140-122), 10% fetalem Schweineserum (Biochrom AG, n° S0115) und 0,1% Insulin (SIGMA, n° I0516) gezüchtet und bei 37°C in feuchter Atmosphäre kultiviert. NRK-Fibroplastenzellen (ATTC, USA) wurden in D-MEM-Medium (GIBCO, n° 41965-039) unter Zusatz von 1% Penicillin/Streptomycin (GIBCO, n° 1540-122) und 10% fetalem Schweineserum (Biochrom AG, n° S0115) gezüchtet und bei 37°C in feuchter Atmosphäre kultiviert, welche 5% CO₂ enthielt.
Zur Bestimmung der Aufnahme der Mikrokapseln 9 in die Zellen wurden 10⁴ Zellen pro cm² in sterile Mikroskopiekammern (μ-slide 8 Well IbiTreat von Ibidi, n° 80826) ausgebracht. Wenn die Zellen anwuchsen, wurden sie mit 32 SNARF^®-1-Dextran 3 enthaltenden Mikrokapseln 9 pro Zelle über je nach Experiment unterschiedliche Zeitspannen inkubiert. Die Kapselkonzentration wurde unter Verwendung einer Zellkammer (Neubauer improved, von Paul Marienfeld GmbH, Lauda-Königshofen, Deutschland) bestimmt. Zur Darstellung der Zellen und Kapseln wurde ein Fluoreszenz-Transmissionsmikroskop (Axiovert 200M mit HAL-100 und FluoArc Lampen, Zeiss, Jena, Deutschland) verwendet. Um die Temperatur auf 37°C zu halten, wurde eine am Mikroskop angebrachte temperaturgesteuerte Inkubatorstufe verwendet (Tempcontrol 37-2 digital, Heizeinheit, Inkubator XL, alles von Zeiss, Jena, Deutschland). Um die CO₂-Konzentrationen für die Experimente mit den NRK-Zellen auf 5% zu halten, wurde dem Mikroskop ein CO₂-Inkubator (Zeiss, Jena, Deutschland) angefügt.
Es konnte beobachtet werden, dass Mikrokapseln 9, welche außerhalb der Zellmembranen lagen, stets rot fluoreszierten. Nach langer Inkubationszeit kann die Fluoreszenz von Mikrokapseln 9, die mit den Zellen kolokalisiert waren, von grün nach rot umschlagen. Ein entgegengesetztes Verhalten wurde nicht beobachtet. Mikrokapseln 9, die innerhalb von Zellen vorgefunden wurden, fluoreszierten grün.
Flusszytometrie (FACS)
Zur flusszytometrischen Ermittlung des Verhältnisses von an Zellen adhärierten zu von den Zellen aufgenommenen Mikrokapseln wurde eine Suspension mit Zellen und SNARF^®-1-Dextran beladenen Mikrokapseln durch einen engen Kanal eines Flusszytometers geleitet und mit einem Argonlaser beleuchtet, sodass sich im Allgemeinen jeweils nur eine Zelle in dem vom Laser beleuchteten Bereich befand. Das Fluoreszenzlicht wurde mit Detektoren aufgenommen, die mit Filtern ausgestattet waren. Die Analyse des reflektierten Lichts wurde in drei Schritten durchgeführt: (1) Abtrennen der Zell-Ereignisse, (2) Trennen verschiedener Partikelpopulationen und (3) Statistik der verschiedenen Populationen.
Im ersten Schritt wurden aller von den Detektoren detektierten Ereignisse gemäß ihrer Vorwärts-(FSC, forward scattering intensity) und Seitwärtsstreuintensitäten SSC (sideward scattering intensity) in einem zweidimensionalen Graphen aufgetragen. Weil die suspendierten Zellen größer als Kapseln oder Schmutz sind, bilden sie eine isolierte Population 30, 32, 33, 34, 35, die im Folgenden „Zellereignisse" genannt wird.
In einem zweiten Schritt wurde die Fluoreszenz aller Ereignisse analysiert und die durch einen Filter mit einer Durchlasswellenlänge um 590 nm aufgenommenen Intensitäten (FL2 in 6 und 7) und die von einem Filter mit einer Durchlasswellenlänge um 630 nm aufgenommenen Intensitäten (FL3 in 6 und 7) wurden in einem Dichtegraphen dargestellt, der im Folgenden „Fluoreszenzgraph" genannt wird. Die Ereignisse mit markierten Mikrokapseln 30, 32, 34, 35 unterscheiden sich von unmarkierten Objekten 33, z. B. Zellen ohne Mikrokapseln und Schmutz durch ihre hohe Fluoriszenzintensität. Wie in
6 und 7 dargestellt, können hinsichtlich des Fluoreszenzgraphen zwei linienartige Populationen, eine mit roten Mikrokapseln 30, 34, die außen an der Zelle anhaften, und grüne Mikrokapseln 32, 35, die sich im Inneren der Zelle befinden, unterschieden werden.
Im dritten und letzten Schritt wurde jede der beiden linienartigen Populationen statistisch untersucht, um die absoluten Prozentzahlen der Ereignisse der jeweiligen Populationen zu erhalten.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- W. Parak et al., "Combined atomic force microscopy and optical microscopy measurements as a method to investigate particle uptake by sales", small, 2006, 2, Nr. 3, 394–400 [0002]
- "Proteine-calciumcarbonate coprecipitation: a tool for Proteine encapsulation", Biotechnol. Proc. 2005, Nr. 21, S. 918–925 [0041]
- „Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating", Biomacromolecules, 2004, 5 (5), S. 1962–1972 [0047]

Claims

Mikrokapsel (9) zur Untersuchung eines Aufnahmeverhaltens einer Mikrostruktur, insbesondere einer lebenden Zelle, aus einem Äußeren der Mikrostruktur in ein Inneres der Mikrostruktur, wobei die Mikrokapsel (9) einen von einer Kapselwand (11) umgebenden Hohlraum (13) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokapsel (9) einen auf einen Analyt empfindlichen ersten Farbstoff (3) aufweist, um unter Ausnutzung eines Unterschieds der Konzentration des Analyts zwischen Äußerem und Innerem der Mikrostruktur zu ermitteln, ob die Mikrokapsel (9) im Inneren oder im Äußeren der Mikrostruktur vorliegt.
Mikrokapsel (9) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Der Analyt Wasserstoffionen (H⁺) sind und der erste Farbstoff (3) ein pH-empfindlicher Farbstoff ist.
Mikrokapsel (9) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Farbstoff (3) ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
Mikrokapsel (9) nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokapsel (9) genau eine Kapselwand (11) und genau einen Hohlraum (13) aufweist.
Mikrokapsel (9) nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Farbstoff (3) in dem Hohlraum (13) der Mikrokapsel (9) vorliegt.
Mikrokapsel (9) nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapsel wenigstens einen zweiten Farbstoff (31) aufweist.
Mikrokapsel (9) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Farbstoff (31) auf ein Analyt empfindlich ist.
Mikrokapsel (9) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Farbstoff (31) wenigstens einen Quantenpunkt umfasst.
Mikrokapsel (9) nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch wenigstens einen magnetischen Partikel (7).
Mikrokapsel (9) nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch wenigstens einen Liganden.
Mikrokapsel (9) nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Poly(ethylenglycol) aufweisende Schicht.
Verfahren zur Untersuchung eines Aufnahmeverhaltens einer Mikrostruktur, insbesondere einer lebenden Zelle, aus einem Äußeren der Mikrostruktur in ein Inneres der Mikrostruktur unter Ausnutzung eines Unterschieds der Konzentration eines Analyts zwischen Äußerem und Innerem der Mikrostruktur, das die Schritte umfasst: – Bereitstellen einer Mehrzahl von Mikrokapseln (9), die jeweils einen von einer Kapselwand (11) umgebenden Hohlraum (13) und einen auf den Analyt empfindlichen ersten Farbstoff (3) aufweisen; – Ermitteln mindestens einer Farbe der Mikrokapseln (9); – Bestimmen aus der ermittelten Farbe, ob die Mikrokapsel (9) im Inneren oder im Äußeren der Mikrostruktur vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Ermittelns der Farbe der Mikrokapseln (9) mit Hilfe eines Hochdurchsatzverfahrens ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Ermittelns der Farbe der Mikrokapseln (9) mittels eines flusszytometrisches Verfahrens oder ein Verfahrens, bei dem ein von einer Datenverarbeitungseinrichtung gesteuertes Lichtmikroskop zum Einsatz kommt, erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Ermittelns der Farbe der Mikrokapseln (9) mittels spektroskopischer Analyse von den Mikrokapseln (9) emittierten Lichts erfolgt.
Verwendung einer Mikrokapsel (9) nach einem der Ansprüche 1 bis 11, oder eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 12 bis 15 zum Nachweis pathologischer oder pathogener Zellen eingesetzt werden, insbesondere Krebszellen wie Karzinomzellen, Sarkomzellen, präkanzeröser Zellen oder Carcinoma-in-situ-Zelle.
Verfahren zur Herstellung einer mit einem Farbstoff (3) beladenen Mikrokapsel (9), das die Schritte umfasst: – Binden von Fluoreszenzfarbstoffmolekülen an Polysaccharidmoleküle; – Einbetten der Farbstoffmolekül-Polysaccharid-Komplexe in einen Calciumcarbonatpartikel; – Umhüllen des Calciumcarbonatpartikels mit einer Polymerschicht; und – Herauslösen des Calciumcarbonatpartikels aus der Mikrokapsel (9).