DE102007013107B4

DE102007013107B4 - Verfahren zur Bestimmung des Geschlechts von Vögeln

Info

Publication number: DE102007013107B4
Application number: DE102007013107A
Authority: DE
Inventors: Jürgen Prof. Dr. Popp; Petra Dr. rer. nat Rösch; Thomas Dr. rer. nat. Bartels; Mario Dipl.-Chem. Krause; Michaela Harz
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig De; Agri Advanced Technologies GmbH
Priority date: 2007-03-15
Filing date: 2007-03-15
Publication date: 2011-02-10
Anticipated expiration: 2027-03-16
Also published as: DE102007013107A1

Abstract

Verfahren zur Bestimmung des Geschlechts von Vögeln, dadurch gekennzeichnet, dass DNA-relevantes Zellmaterial des geschlechtlich zu bestimmenden Vogels mit Licht untersucht und die Molekülschwingungen gemessen werden, dass das durch das Licht entstehende Spektrum der Molekülschwingungen erfasst und mit vorgegebenen sowie geschlechtsspezifische DNA-Strukturen der zu untersuchenden Vogelart repräsentierenden Referenzspektren verglichen wird und dass aus diesem Spektralvergleich eine auf Grundlage des DNA-Gehalts des Zellmaterials basierende Geschlechtszuordnung des Vogels getroffen wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Geschlechts von Vögeln anhand der Untersuchung DNA-haltigen Zellmaterials, vorzugsweise aus bebrüteten Eiern oder aus dem Schaft bzw. der Scheide von Vogelfedern.
Es ist allgemein bekannt, eine Unterscheidung des Geschlechts von Vögeln anhand äußerer Merkmale, wie Körpergröße und morphologische Unterschiede, beispielsweise Stirnhöcker, Gefiederfärbung oder Federlänge, zu treffen.
In nicht seltenen Fällen bereitet dies jedoch Schwierigkeiten bzw. eine solche Unterscheidung kann (speziell bei jungen Vögeln, bestimmten Vogelarten oder auch im embryonalen Stadium) nicht oder zumindest nicht zuverlässig vorgenommen werden.
Möglichkeiten zur Geschlechtsbestimmung beruhen aber auch auf der Untersuchung der DNA von Vögeln. So ist es bekannt (beispielsweise K. B. C. Appa Rao, D. Mohan and S. M. Totey: Polymerase chain reaction and its applications: Special emphasis an its role in embryo sexing, Biotechnology Advances 12, 1994 341–55), bestimmte DNA-Sequenzen durch PCR (Polymerase Ketten Reaktion) zu vervielfältigen und durch Gelelektrophorese zu differenzieren.
Es sind diesbezüglich zahlreiche Veröffentlichungen zur Untersuchung an Vögeln (beispielsweise K. K. De Mattos, S. N. Del Lama, A. R. C. Salles, M. R. Francisco, A. Medaglia, A. M. Tomasulo, F. M. S. Carmo, J. M. C. Pereira and M. A. De Oliveira: Sex determination of parrots Amazona a. aestiva and Amazona amazonica using the polymerase chain reaction, Journal of Experimental Zoology, 281, 1998, 217–219; T. Minematsu, M. Sugiyama, Y. Tohma, A. Tajima and Y. Kanai: Simplified DNA extraction methods for sexing chick embryos, Journal of Poultry Science, 41, 2004, 147–154; L. Huynen, C. D. Millar and D. M. Lambert: A DNA test to sex ratite birds, Molecular Ecology, 11, 2002, 851–856; L. G. Bermudez-Humaran, A. Garcia-Garcia, C. H. Leal-Garza, V. M. Riojas-Valdes, G. Jaramillo-Rangel and R. Montes-De-Oca-Luna: Molecular sexing of monomorphic endangered Ara birds, Journal of Experimental Zoology, 292, 2002 677–680; Y. Itoh, M. Suzuki, A. Ogawa, I. Munechika, K. Murata and S. Mizuno: Identification of the sex of a wide range of Carinatae birds by PCR using primer sets selected from chicken EE0.6 and its related sequences, Journal of Heredity, 92, 2001, 315–321; US 5,876,942 A und Säugetieren (wie z. B. US 5,876,942 A , K. Makondo, G. S. Amiridis, I. A: Jeffcoate, P. J. O'Shaughnessy, J. S. Boyd, C. Paterson and L. Robertson: Use of the polymerase chain reaction to sex the bovine fetus using cells recovered by ultrasound-guided fetal fluid aspiration, Animal Reproduction Science, 49, 1997, 125–133) bekannt.
Die DNA-Vervielfältigung gelingt mit verschiedenen Primern und muss je nach Vogelart angepasst werden.
Es ist auch ein Verfahren bekannt ( WO 9749806 A1 ), welches mit geschlechtsspezifischen Markern das Geschlecht von Vögeln unabhängig ihrer Art differenziert.
Die Präzision und Verifizierung der PCR-Methode an sich werden aber in neuesten Untersuchungen kritisiert (B. C. Robertson and N. J. Gemmell: PCR-based sexing in conservation biology: wrong answers from an accurate methodology?, Conservation Genetics, 7, 2006, 267–271).
Bekannt sind auch optische Verfahren zur Geschlechtsunterscheidung von Vögeln durch Differenzierung der Federstruktur mit UV-Licht ( US 6,396,938 B1 ) oder des Gewebes mit NIR-Licht ( US 6,493,566 B1 ). Da es sich bei diesem Verfahren um die Dickenmessung der Dermis und der subkutanen Fettschicht handelt, können die Ergebnisse durch den Ernährungszustand der Vögel beeinflusst werden.
Endoskopische Geschlechtsbestimmungen werden heutzutage in der Regel nur durchgeführt, wenn ohnehin eine Beurteilung innerer Organe von Vögeln aufgrund einer veterinärmedizinischen Indikation durchgeführt wird. Dieses Verfahren birgt die Nachteile, dass es sich um einen operativen (wenngleich minimal invasiven) Eingriff handelt. Hierfür müssen die Tiere zuvor betäubt werden, was einerseits zusätzliche Aufwendungen erfordert; andererseits sind die Tiere bei solcher Behandlung einer extremen Stresssituation ausgesetzt (G. TH. Kaal, Geschlechtsmerkmale bei Vögeln, Verlag M. & H. Scharper Hannover 1982).
Des Weiteren werden Methoden angewendet zur In-ovo-Geschlechtsbestimmung, wobei die Geschlechtsdeterminierung bislang lediglich unter experimentellen Bedingungen an Entwicklungsstadien unterschiedlicher Altersstufen durchführbar ist:
Zur In-ovo-Geschlechtsbestimmung am unbebrüteten Ei mittels molekulargenetischer Verfahren werden die Keimscheibe magnetresonanztomographisch lokalisiert, einige Blastodermzellen mittels Biopsie aus der Keimscheibe entnommen und geschlechtsspezifische Sequenzen des W-Chromosoms mittels PCR oder In-situ-Hybridisierung bestimmt. Die Entwicklung praktikabler Verfahren werden jedoch allein schon aus Gründen des für die Lokalisation der Keimscheibe vergleichsweise hohen technischen und finanziellen Aufwands in Frage gestellt.
Für eine In-ovo-Geschlechtsdifferenzierung anhand des Hormongehalts in der Allantoisflüssigkeit (z. B. D. V. Gill, H. A. Robertson and T. W. Betz; In vivo estrogen synthesis by the developing chicken (Gallus gallus) embryo, General and Comparative Endocrinology, 49, 1983, 176–86; WO 9814781 ) werden beispielsweise am 15. bis 17. Bebrütungstag 20 μl Allantoisflüssigkeit entnommen. Die Estrogenbestimmung kann dabei u. a. mit einem sog. „LiveSensor^TM”-Assay erfolgen. Das Verfahren ist jedoch nicht für einen kommerziellen Einsatz verfügbar. Außerdem wird der relative späte Zeitpunkt der Probenentnahme (15. bis 17. Bebrütungstag) unter Tierschutzgesichtspunkten als problematisch angesehen.
Darüber hinaus ist die In-ovo-Geschlechtsdifferenzierung anhand des in Zellen von männlichen und weiblichen Haushühnern unterschiedlichen DNA-Gehalts bekannt (A. Herzog: Klinische Zytogenetik der Haustiere, JF Lehmanns Fachbuchhandlung, 1995, 200–205). Der DNA-Gehalt in Zellen männlicher Individuen (ZZ) ist mit ca. 2,50 pg etwa 2% höher als in Zellen weiblicher Individuen (ZW; ca. 2,45 pg), wobei offenbar rasse- bzw. linienspezifische Unterschiede zu berücksichtigen sind. Die Bestimmung des DNA-Gehalts erfolgt mittels an sich bekannter Durchflusszytometrie. Auf Grund einer bislang unbefriedigenden Präzision in der Geschlechtsbestimmung sowie der hohen Gerätekosten wurde auch dieses Verfahren bislang nicht bis zur Praxisreife weiterentwickelt.
Bekannt ist auch eine Untersuchung von extraembryonalen Flüssigkeiten, insbesondere der Allantoisflüssigkeit, auf einen erhöhten Wert eines geschlechtsabhängigen Hormons ( DE 697 11 943 T2 ). Die Untersuchung wir relativ spät bei Hühnern zwischen dem 11. und 19. Tag durchgeführt. Die Untersuchung wird beispielsweise mittels IR-Absoptions-Spektroskopie durch die Eischale oder innere Schalenmembran, durch einen Biosensor in der Allantoisflüssigkeit oder durch Entnahme der Flüssigkeitsprobe (Allantoisflüssigkeit) durchgeführt.
Dadurch, dass die Untersuchung so spät in der Entwicklung des Embryos stattfindet, kann das bebrütete Ei der männlichen Küken nicht mehr für Lebensmittel verwendet werden und muss ebenso (wie geschlüpfte Küken an sich) „entsorgt” werden.
Die Entnahme von Allantoisflüssigkeit aus einem bebrüteten Ei wird beispielsweise in der US 7,041,439 B2 beschrieben. Diese wird anschließend mittels Absorptions-Spektroskopie analysiert. Es ist bekannt, dass die Konzentration unterschiedlicher Hormone wie beispielsweise Estradiol mit dem Geschlecht der Föten im Ei korreliert. Die Absorptions-Spektroskopie kann Variationen in der molekularen Zusammensetzung analysieren. Allerdings sinkt die Überlebenswahrscheinlichkeit der Küken durch die Entnahme der Allantoisflüssigkeit in Abhängigkeit mit dem Entnahmevolumen, weshalb diese Methode kein nicht-invasives Verfahren darstellt. Dies kann je nach Menge der entnommenen Flüssigkeit zu einer erhöhten Absterberate der Eier führen. Im weiteren Verlauf werden die Eier mit weiblichen Embryonen regulär bebrütet. Für die Eier mit männlichen Embryonen wird eine Verwendung zur Vakzinherstellung vorgeschlagen. Zusätzlich wird eine Vorrichtung beschrieben, die Eier für die Entnahme der Allantoisflüssigkeit entsprechend zu lagern und zu positionieren.
Wie auch die vorgenannte Methode gemäß US 7,041,439 B2 verwendet ein Verfahren nach US 7,154,594 B2 die IR-Spektroskopie lediglich zur Vitalitätsbestimmung von Eiern. Bei der US 7,154,594 B2 wird das Ei mittels NIR-Bestrahlung ausgeleuchtet, um festzustellen, ob der Embryo im Ei lebt (Detektion des Herzschlags) und wie weit dieser entwickelt ist. Es findet keine Geschlechtsdifferenzierung statt.
Ferner sind auch spektroskopische Verfahren zur Geschlechtsbestimmung von Vögeln bekannt, die nicht auf schwingungsspektroskopischen Methoden beruhen.
So wird in der US 6,029,080 A die Verwendung der Kernmagnetischen Resonanz-Tomographie (NMR) zur Detektion der Geschlechtsorgane bei Embryonen beschrieben. Hier können die Eierstöcke bzw. Hoden der Embryonen sichtbar gemacht werden und eine entsprechende Sortierung vorgenommen werden. Die Methode ist sehr selektiv und nicht-invasiv, allerdings müssen die Embryonen nachteiliger Weise wiederum bereits relativ alt sein.
In der US 6,365,339 B1 wird die Entnahme der Allantoisflüssigkeit aus dem bebrüteten Ei beschrieben. Diese wird anschließend mittels einer Ionen-Mobilitäts-Spektroskopie (IMS) analysiert, wodurch das Geschlecht der Vögel bestimmt wird. Wie vorgenannt, korreliert die Konzentration unterschiedlicher Hormone, wie beispielsweise Estradiol, mit dem Geschlecht der Föten im Ei. Die IMS ist in der Lage, gezielt solche molekularen Zusammensetzungen zu analysieren. Allerdings sinkt hier wiederum die Überlebenswahrscheinlichkeit der Küken durch die Entnahme der Allantoisflüssigkeit in Abhängigkeit mit dem Entnahmevolumen, weshalb auch diese Methode als invasiv zu bewerten ist.
Die Nachteile bekannter Verfahren zur Geschlechtsbestimmung von Vögeln lassen sich wie folgt zusammenfassen:

– unzureichende Präzision der DNA-Vervielfältigung
– hohe Verbrauchskosten in der Routineanalytik (PCR-Primer, Elektrophorese-Gel)
– späte Diagnose bei bisherigen optischen Verfahren erst nach der Geburt
– Stresssituation für das Tier bei endoskopischen Untersuchungen
– hohe Gerätekosten bei der NMR-Analyse
– Flüssigkeitsentnahme in ovo für die Hormonbestimmung unter Tierschutzgesichtspunkten zu einem problematischen Zeitpunkt

Ferner ist die Raman-Spektroskopie als Untersuchungsmethode zur Charakterisierung von DNA an sich schon seit Jahrzehnten bekannt (beispielsweise J. M. Benevides and G. J. Thomas Jr.: Raman spectral studies of nucleic acids. Part XXV. Characterization of DNA structures by Raman spectroscopy: high-salt and low-salt forms of double helical poly(dG-dC) in water and D₂O solutions and application to B, Z and A-DNA, Nucleic Acids Research, 11, 1983, 5747–61).
Diese wird auch zur Untersuchung von Geschlechtsumwandlungen in der Erbfolge anhand isoliertem SRY-HMG:DNA-Komplex im humanen Bereich eingesetzt (beispielsweise J. M. Benevides, G. Chan, X.-J. Lu, W. K. Olson, M. A. Weiss and G. J. Thomas: Protein-Directed DNA Structure, I. Raman Spectroscopy of a High-Mobility-Group Box with Application to Human Sex Reversal, Biochemistry, 39, 2000, 537–547). Damit werden spezielle Gene auf das Vorhandensein von an sich bekannten geschlechtsspezifischen Marker für die Erbfolge geprüft. Eine weitere Anwendung umschließt die Bestimmung des Protein/DNA-Gehalts in B- und T-Zellen (beispielsweise WO 2006130728 ).
Die Raman-Spektroskopie dient außerdem der Lebensmittelkontrolle von Fleisch (D. I. Ellis, D. Broadhurst, S. J. Clarke and R. Goodacre: Rapid identification of closely related muscle foods by vibrational spectroscopy and machine learning, Analyst (Cambridge, United Kingdom), 130, 2005, 1648–1654) oder auch Pigmentuntersuchungen von Vögeln (M. Veronelli, G. Zerbi and R. Stradi: In situ resonance Raman spectra of carotenoids in bird's feathers, Journal of Raman Spectroscopy, 26, 1995, 683–92).
Über Untersuchungen des DNA-Gehalts des Zellmaterials von Vögeln mit der Raman-Spektroskopie, um das Geschlecht zu bestimmen, ist in der Fachwelt nichts bekannt geworden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, das anhand äußerer Merkmale nicht oder wenig erkennbare Geschlecht von Vögeln auf möglichst einfache Weise, schnell, zuverlässig sowie ohne nennenswerte und auch aus Tierschutzgründen problematische Belastung der Tiere (beispielsweise durch Betäubung) zu bestimmen.
Erfindungsgemäß wird das Geschlecht der Vögel bestimmt, indem DNA-relevantes Zellmaterial des Vogels (nicht einzelne Chromosomen) durch Lichteinwirkung, beispielsweise eines Laserstrahls, untersucht und die Molekülbewegungen gemessen werden. Das Spektrum der durch die Molekülbewegungen entstehenden Strahlung wird erfasst und mit vorgegebenen sowie geschlechtsspezifische DNA-Strukturen der zu untersuchenden Vogelart repräsentierenden Referenzspektren verglichen. Diese Referenzspektren, die beispielsweise in einer Datenbank vorliegen, beinhalten insbesondere eine statistisch erfasste geschlechtsspezifische Zuordnung von DNA-Merkmalen der jeweils zu untersuchenden Vogelart.
Aus dem spektralen Vergleich des auszuwertenden Zellmaterials mit den besagten Referenzdaten wird vorzugsweise rechentechnisch eine auf Grundlage des DNA-Gehalts des Zellmaterials basierende Geschlechtszuordnung des Vogels getroffen.
Überraschend wurde festgestellt, dass auf Grund des unterschiedlichen DNA-Gehalts zwischen männlichen und weiblichen Vögeln bei der Anwendung von schwingungsspektroskopischen Verfahren spezifische und unterscheidbare Spektren zwischen beiden Geschlechtern auftreten, die von hoher diagnostischer Relevanz sind. Als schwingungsspektroskopische Verfahren finden insbesondere die Raman-Spektroskopie, die UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie, die IR-Spektroskopie und die Absorptionsmethode der Terahertz-Spektroskopie Anwendung, wobei das DNA-relevante Zellmaterial jeweils durch Licht entsprechender Wellenlänge zur Molekül- bzw. Gerüstschwingung angeregt wird.
Das Zellmaterial kann auf einfache und für das Tier verträgliche Weise aus dem Schaft einer jungen Feder des Vogels entnommen und auf einem Träger, vorzugsweise einem Quarzglas oder einem CaF₂-Glas, präpariert werden. Auf die Trägeroberfläche mit dem besagten Präparat wird das Licht zur Messung der Molekülbewegung fokussiert.
Vorteilhaft erscheint hier die Fokussierung eines Laserstrahls über das Objektiv eines Mikroskops. Die Fokussierung kann jedoch auch Faser-gekoppelt erfolgen, was besonders für eine In-ovo-Geschlechtsbestimmung interessant ist.
Bei ungeschlüpften Vögeln kann das Licht durch einen kleinen Zugang durch die Eierschale unmittelbar auf die Keimscheibe als Zellmaterial fokussiert werden. Durch den gleichen oder einen anderen Zugang geringer Öffnungsgröße wird eine Sonde geführt, mittels derer das Spektrum der durch die vorgenannte Molekülbewegung im Innern vom Ei gemessen wird.
Die erhaltenen spektralen Informationen werden in einem zweiten Schritt mit Referenzdaten einer Datenbank verglichen. Diese repräsentieren vorzugsweise statistisch gewonnene Daten über die zu untersuchende Spezies. Aus diesem Vergleich wird erfindungsgemäß die Geschlechtszuordnung des untersuchten DNA-Materials getroffen.
Im Gegensatz zum Stand der Technik ist die Geschlechtsbestimmung mit hoher Zuverlässigkeit, Spezifität, Sensitivität, Schnelligkeit und vergleichsweise geringem Aufwand durchführbar.
Mit der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, welches eine wesentlich verbesserte und spezifischere Bestimmung des Geschlechts von Vögeln wie Ziervögeln (Papageien, etc.), Greifvögel oder Lege- bzw. Masthennen sogar in ovo erlaubt und damit eine immens verbesserte Diagnosemöglichkeit bietet.
Die vorliegende Erfindung beruht auf Messergebnissen des DNA-Materials, die durch Anwendung an sich bekannten Verfahren der Schwingungsspektroskopie (vorzugsweise UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie, Raman-Spektroskopie, IR-Spektroskopie und THz-Spektroskopie) gewonnen wurden, sowie auf einem vorzugsweise rechentechnischen Vergleich der ermittelten spektroskopischen Daten des DNA-Zellmaterials mit Referenzwerten einer Datenbank.
Es zeigte sich, dass in DNA reichem Zellmaterial von Vögeln, mit hoher Sensitivität und Spezifität im Unterschied zur selben Vogelart des anderen Geschlechts veränderte Signale im Spektrum gefunden wurden. Die spezifischen Referenzspektren sind damit von hoher Relevanz zur Geschlechtsbestimmung, was dieses Verfahren für die Geschlechtsunterscheidung (selbst in ovo) prädestiniert. Diese Unterschiede im Raman-Spektrum zwischen männlichen und weiblichen Vögeln derselben Art, waren der Fachwelt bisher nicht bekannt.
Im Folgenden wird das spezielle Verfahren der schwingungsspektroskopischen Methoden beispielhaft anhand der bereits erwähnten UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie erläutert.
Die Raman-Spektroskopie bietet vorteilhaft die Möglichkeit, biologisches Material zerstörungsfrei zu untersuchen.
Durch Ausnutzen des Resonanz-Effekts unter Anregung im UV-Wellenlängenbereich lassen sich wichtige Signale der DNA und Proteine selektiv verstärken und das Signalrausch-Verhältnis aufgrund einer Intensitätserhöhung um etwa 10⁶ verbessern. Somit reichen bereits geringe Konzentrationen von DNA-haltigen Zellbestandteilen aus, um diese UV-Resonanz-Raman-spektroskopisch zu untersuchen. Demzufolge eignet sich diese Methode, um Raman-Spektren von DNA-haltigem Zellmaterial der zu untersuchenden Vögel zu charakterisieren. Obwohl sich die Raman-Spektren des untersuchten DNA-haltigen Zellmaterials sehr ähnlich sehen, enthält die komplexe Schwingungsstruktur wichtige Informationen, die sich zwischen den Geschlechtern unterscheiden. Die wesentlichen Schwingungsbanden zur Geschlechtsbestimmung sind im Wellenzahlbereich unter 1800 cm^–1 (fingerprint-Bereich) zu finden.
Es konnte gezeigt werden, dass die Komponenten, die hauptsächlich zum Raman-Spektrum von DNA-haltigen Zellmaterial beitragen, von DNA-Basen, wie Guanin, Adenin, Cytosin und Thymin, resultieren. Da im untersuchten Zellmaterial außerdem Proteine vorhanden sind, ergeben sich weitere wichtige Banden im Raman-Spektrum von Signalen der aromatischen Aminosäuren, wie Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin, sowie von Amid I, II und III Schwingungen.
Aufgrund der Komplexität der Spektren sind Unterschiede im Spektrum zwischen den Geschlechtern nur schwer zu visualisieren, weshalb insbesondere chemometrische Methoden zum Einsatz gebracht wurden. Chemometrik beinhaltet die Anwendung statistischer und mathematischer Methoden zur Datenanalyse. Chemometrische Methoden können angewendet werden, um chemische Verfahren und Experimente zu planen, zu entwickeln oder mit maximaler Information auszuwerten. Insbesondere bei sehr großen oder sehr ähnlichen Datensätzen sind chemometrische Methoden hilfreich. So werden derartige Verfahren zur Klassifizierung von Proben anhand analytischer Daten, wie beispielsweise der Erkennung von Krankheiten mit Hilfe der Raman-Spektren des Gewebes, genutzt. Hierbei können sowohl überwachte und unüberwachte Klassifizierungsmethoden zum Einsatz kommen. Unüberwachte Klassifizierungsmethoden sind die hierarchische Clusteranalyse (HCA) und die Hauptkomponentenanalyse (PCA – Principal Component Analysis). Bei überwachten Klassifizierungsmethoden wird im Gegensatz zu den unüberwachten Methoden die Klassenzugehörigkeit berücksichtigt. Diese Verfahren werden in der Regel eingesetzt, wenn im Anschluss an die Klassifizierung unbekannte Proben identifiziert werden sollen. Hierzu muss das Modell zuerst mit bekannten Proben erstellt und anschließend validiert werden. Dabei könnten vorzugsweise die bekannten Verfahren K-Nearest-Neighbour-Klassifikation (KNN), Nearest Mean Classifier (NMC), lineare Diskriminanzanalyse (LDA), künstliche neuronale Netze (ANN – Artificial Neural Networks) sowie Support-Vector-Maschinen (SVM) zum Einsatz kommen.
Für eine Klassifizierung zur erfindungsgemäßen Auswertung ist es notwendig, einen großen Datensatz von DNA-haltigen Zellmaterial von Vogelarten unterschiedlichen Geschlechts UV-Resonanz-Raman-spektroskopisch zu untersuchen, wobei diese Spektren als Referenzwerte in einer Datenbank verwendet werden. Dabei wird ein chemometrisches Modell aufgestellt, um zwischen diesen Proben zu unterscheiden. Nach Komplettierung der Spektrensammlung in der Datenbank und der Erstellung eines Klassifikationsmodells, wird dies als Grundlage genutzt, nach der Aufnahme eines UV-Resonanz-Raman-Spektrums einer unbekannten Probe unter Verwendung des ausgearbeiteten Modells das Spektrum dieser Probe unmittelbar als männlich oder weiblich zu klassifizieren.
Die vorliegende Erfindung liefert somit eine schnelle und zuverlässige Methode zur Geschlechtsbestimmung von Vögeln auch in ovo.
Die Molekül- bzw. Gerüstschwingungen des untersuchten DNA-Materials können insbesondere durch die UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie, Raman-Spektroskopie, IR-Spektroskopie und die THz-Spektroskopie erfasst werden.
Wie die IR- und THz-Spektroskopie ist die Raman-Spektroskopie eine schwingungsspektroskopische Untersuchungsmethode. Während jedoch bei der IR-Spektroskopie die Licht-Absorption beim Durchgang durch eine Probe gemessen wird, wird bei der Raman-Spektroskopie das Streulicht analysiert. Wenn das Streulicht dieselbe Frequenz und damit dieselbe Energie hat wie das Anregungslicht, liegt ein elastischer Lichtstreuprozess, Rayleigh-Streuung vor. Daneben werden einige wenige Lichtquanten des Laserlichts inelastisch gestreut. Hierbei erfahren die Lichtquanten eine Wechselwirkung mit den Molekülen einer Probe in der Weise, dass die Streustrahlung eine höhere oder niedrigere Energie besitzt als das Anregungslicht. Man beobachtet dann neben dem elastisch gestreuten Licht der Rayleigh-Streuung auf beiden Seiten der Anregungslinie eine frequenzverschobene inelastische Streustrahlung, die Raman-Streuung.
Die Energie der THz-Strahlung oder des fernen Infrarot entspricht der Energie schwacher intramolekularer Wechselwirkungen, wie beispielsweise der Gerüstschwingungen von Proteinen, die wesentlich für deren Faltung und Funktion sind. Bei der THz-Spektroskopie unterscheidet man die Absorptionsspektroskopie und die Emissionsspektroskopie. Bei der Emissionsspektroskopie misst man die Strahlung, die jeder Körper ausstrahlt. Hierbei muss keine weitere Anregung stattfinden. Die Zustände sind bereits thermisch angeregt und müssen mit einem sehr empfindlichen Detektor gemessen werden. Dies wäre eine passive Messung. Das Ganze kann auch aktiv erfolgen in Form eines Absorptionsexperimentes mit Hilfe einer Strahlungsquelle (vorzugsweise mit Germaniumlasern und Quantenkaskadenlasern) und Detektor. Hierbei ist es auch möglich, durch die Schale eines bebrüteten Eies zu messen.
Das Verfahren soll nachstehend anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels mit UV-Resonanz-Raman-spektroskopischer Untersuchung näher erläutert werden.
Es zeigen:
1: 1. Ableitung von UV-Resonanz-Raman-Spektren aus Federpulpamaterial von männlichen (hell dargestellten) und weiblichen (dunkel dargestellten) Legehybriden.
2: Dendrogramm als Ergebnis der Hierarchischen Clusteranalyse hell: männlich – dunkel: weiblich.
3: Hauptkomponentenanalyse 3D-Darstellung: x – PC1; y – PC2; z – PC3, hell: männlich – dunkel: weiblich.
Die UV-Resonanz-Raman-spektroskopischen Untersuchungen werden exemplarisch an aus der Federscheide gewonnenen Federpulpa von verschiedenen Vogelarten unterschiedlichen Geschlechts bei einer Laseranregungswellenlänge von 244 nm aufgezeigt. Die Proben präparation der Federpulpa erfolgt durch Ausquetschen aus der Federscheide auf einen Substratträger aus Quarz. In 1 sind die 1. Ableitungen verschiedener UV-Resonanz-Raman-Spektren von Federpulpa männlicher und weiblicher Legehybride dargestellt. Für die Spektren wurde jeweils eine Integrationszeit. von 60 s gewählt, wobei die verwendete Laserleistung bei etwa 1 mW liegt.
Die Bestimmung des Geschlechts anhand des Raman-Spektrums erfolgt mit Hilfe von chemometrischen Methoden. Unüberwachte Verfahren, wie die Hierarchische Clusteranalyse und die Hauptkomponentenanalyse, liefern dabei Informationen über natürliche Gruppierungen im Datensatz. Daneben werden auch überwachte Klassifizierungsmethoden wie beispielsweise eine Support-Vektor-Maschine zur Geschlechtsbestimmung verwendet, mit der es möglich ist, im Anschluss an die Klassifizierung unbekannte Proben zu identifizieren.
In 2 ist das von einer Hierarchischen Clusteranalyse resultierende Dendrogramm dargestellt. Als Datenvorbehandlung wird eine Ableitung der 1. Ordnung sowie eine Vektornormierung durchgeführt. Zur Berechnung der spektralen Distanzen dient die Methode Factorization. Die Clusterbildung erfolgt mit Ward's Algorithmus. Es wurde der Spektralbereich von 1140 bis 1730 cm^–1 verwendet. Je geringer die spektralen Abstände (Heterogenität) zwischen zwei Spektren oder Cluster sind, desto ähnlicher sind sich diese.
Anhand der Gruppierung wird deutlich, dass eine gute Unterscheidung zwischen Spektren von weiblichen und männlichen Legehybriden anhand von DNA-Material der Federpulpa möglich ist.
Das Dendrogramm zeigt die Aufspaltung in zwei Cluster, wobei eine Gruppe von Spektren aus weiblichen Legehybriden (dunkel dargestellt) gebildet wird, während die andere Gruppe hauptsächlich aus Spektren von männlichen Legehybriden stammt. Allerdings wurden einige Spektren dem anderen Geschlecht zugeordnet. Es ist festzustellen, dass Probe 9 und 13 als männlich deklariert, aber immer – auch mit diversen Datenvorbehandlungen – im Cluster „weiblich” eingeordnet werden. Weiterhin wird Probe 27 als weiblich deklariert aber immer im „männlichen” Cluster eingeordnet.
Das Ergebnis der Clusteranalyse konnte mit Hilfe einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) bestätigt werden. Auch hier wird die Ableitung der Spektren verwendet und es erfolgt eine Vektornormierung. In 3 ist ein dreidimensionaler Scores-Plot dargestellt, wobei die erste Hauptkomponente auf der x-, die zweite auf der y- und die dritte auf der z-Achse aufgetragen ist. Es wird deutlich, dass sich Federpulpapräparate von weiblichen Legehybriden (dunkel dargestellt) zu denen männlicher (heller dargestellt) unterscheiden. Mit wenigen Hauptkomponenten lassen sich die beiden Geschlechter separieren, wobei die Streuung jeder Gruppe hoch ist und sich auch teilweise überschneidet.
Weiterhin wurden die Spektren mit Hilfe einer Support-Vector-Maschine (SVM; Kernel-Funktion: Radialbasisfunktion (RBF); Cost-Faktor 1.5·10⁶, γ = 1·10^–6) ausgewertet. Dabei werden die Spektralbereiche von 3545–2532 cm^–1 und 1809–913 cm^–1 einbezogen. Bei dieser Klassifizierungsmethode werden den Spektren Attribute zugeordnet, in diesem Fall das Attribut ”Geschlecht”. Der Rechenalgorithmus versucht die Spektren, die durch die Attribute in die festgelegten Klassen unterteilt werden müssen, optimal durch eine Trennebene zu separieren. Dazu wird die Datenmatrix in den höherdimensionalen „Hyperspace” überführt. Eine bildliche Darstellung der Ergebnisse ist wegen der höheren Dimensionen nicht mehr möglich.
Als Ergebnis erhält man ein Modell, das durch die Leave-one-out-Methode validiert wird.
Dabei wird ein Spektrum bei Modellerstellung herausgelassen und durch das berechnete Modell wieder eine Zuordnung versucht. Das Resultat ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Ergebnis der SVM-Analyse mittels Leave-one-out Methode

Haushuhn männlich Haushuhn weiblich correct wrong

Haushuhn männlich 168 3 98.3 1.7

Haushuhn weiblich 10 145 93.6 6.4

95.9 4.1
Eine andere Art der Validierung des Modells gelingt mit einem Test-Datensatz. Der Originaldatensatz wird zufällig in einen Datensatz zur Erstellung des Modells (215 Spektren) und in einen Datensatz zur Validierung des Modells (111 Spektren) geteilt. Das Ergebnis der Validierung ist in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Ergebnis der SVM-Analyse mittels Testset Methode

Haushuhn männlich Haushuhn weiblich correct wrong

Haushuhn männlich 56 1 98.2 1.8

Haushuhn weiblich 4 48 92.3 7.7

95.4 4.6
Die beschriebene Methode, welche auf die Anwendung an sich bekannter schwingungsspektroskopischen Methoden sowie chemometrischen Verfahren zurückgreift (hier beispielhaft anhand der Hierarchischen Clusteranalyse, Hauptkomponentenanalyse und Support-Vektor-Maschine von UV-Resonanz-Raman-Spektren), bietet somit die Möglichkeit, aufgrund spektraler Unterschiede von DNA-Material (im vorliegenden Beispiel Federpulpapräparate von Legehybriden) zwischen den Geschlechtern von Vögeln zu unterscheiden.

Claims

Verfahren zur Bestimmung des Geschlechts von Vögeln, dadurch gekennzeichnet, dass DNA-relevantes Zellmaterial des geschlechtlich zu bestimmenden Vogels mit Licht untersucht und die Molekülschwingungen gemessen werden, dass das durch das Licht entstehende Spektrum der Molekülschwingungen erfasst und mit vorgegebenen sowie geschlechtsspezifische DNA-Strukturen der zu untersuchenden Vogelart repräsentierenden Referenzspektren verglichen wird und dass aus diesem Spektralvergleich eine auf Grundlage des DNA-Gehalts des Zellmaterials basierende Geschlechtszuordnung des Vogels getroffen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülschwingungen durch Anwendung der Raman-Spektroskopie gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülschwingungen durch Anwendung der UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülschwingungen durch Anwendung der IR-Spektroskopie gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülschwingungen durch Anwendung der Absorptionsmethode der Terahertz-Spektroskopie gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-relevante Zellmaterial aus dem Schaft einer jungen Feder des Vogels entnommen wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-relevante Zellmaterial auf einem Träger, beispielsweise einem Quarzsubstrat, einem CaF₂-Substrat bzw. Silizium-Träger für Raman-spektroskopische Untersuchungen oder KRS5, CaF₂-Substrat, ZnSe-Träger bzw. Silizium-Träger für IR-spektroskopische Untersuchungen, präpariert wird, auf dessen Oberfläche das Licht zur Messung der Molekülschwingungen fokussiert wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Lichtquelle zur Messung der Molekülschwingungen Laserstrahlung für Raman-spektroskopische Untersuchungen und MIR-Globar bzw. Nernst-Stift für IR-spektroskopische Untersuchungen eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht zur Messung der Molekülschwingungen des DNA-relevanten Zellmaterials von ungeschlüpften Vögeln durch die Eierschale hindurch auf den Embryo bzw. die Keimscheibe fokussiert wird und dass das Spektrum der durch die Molekülschwingungen entstehenden Strahlung im Ei mit einer durch dessen Schale hindurchgeführten Sonde gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass für das Licht zur Messung der Molekülschwingungen des DNA-relevanten Zellmaterials sowie für die Hindurchführung der Sonde zur Messung des Spektrums wenigstens ein mikroskopisch kleines Loch durch die Eierschale gebohrt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Messung der Molekülschwingungen des DNA-relevanten Zellmaterials Laserstrahlung mit einer Wellenlänge vorzugsweise von 244 nm oder 257 nm verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-relevante Zellmaterial zur Vermeidung dessen thermischer Überbeanspruchung während der Messung der Molekülschwingungen, beispielsweise durch Drehung und Verschiebung oder Schwingung, bewegt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das gemessene Spektrum des DNA-relevanten Zellmaterials mit Referenzspektren verglichen wird, die in Bezug auf die zu treffende Geschlechtszuordnung statistisch ermittelt wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleich des gemessenen Spektrums mit den Referenzspektren sowie die Geschlechtszuordnung rechentechnisch erfolgen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale, (das Signalmuster) der Spektren des DNA-relevanten Zellmaterials zum Vergleich mit den Referenzspektren mit Hilfe unüberwachter Klassifizierungsmethoden, die insbesondere die Hierarchische Clusteranalyse und die Hauptkomponentenanalyse beinhalten, analysiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale, (das Signalmuster) der Spektren des DNA-relevanten Zellmaterials zum Vergleich mit den Referenzspektren mit Hilfe überwachter Klassifizierungsmethoden, die insbesondere die Verfahren K-Nearest-Neighbour-Klassifikation (KNN), Nearest Mean Classifier (NMC), lineare Diskriminanzanalyse (LDA), künstliche neuronale Netze (ANN – Artificial Neural Networks) sowie Support-Vector-Maschinen (SVM) beinhalten, analysiert werden.