DE102007013107B4 - Method for determining the sex of birds - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Bestimmung des Geschlechts von Vögeln, dadurch gekennzeichnet, dass DNA-relevantes Zellmaterial des geschlechtlich zu bestimmenden Vogels mit Licht untersucht und die Molekülschwingungen gemessen werden, dass das durch das Licht entstehende Spektrum der Molekülschwingungen erfasst und mit vorgegebenen sowie geschlechtsspezifische DNA-Strukturen der zu untersuchenden Vogelart repräsentierenden Referenzspektren verglichen wird und dass aus diesem Spektralvergleich eine auf Grundlage des DNA-Gehalts des Zellmaterials basierende Geschlechtszuordnung des Vogels getroffen wird.Method for determining the sex of birds, characterized in that DNA-relevant cell material of the sexually determined bird is examined with light and the molecular vibrations are measured, that detects the spectrum of molecular vibrations resulting from the light and with predetermined and gender-specific DNA structures of comparing the reference spectra representing the species of interest and that based on the DNA content of the cell material based on the DNA content of the genetic material of the bird is taken from this spectral comparison.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Geschlechts von Vögeln anhand der Untersuchung DNA-haltigen Zellmaterials, vorzugsweise aus bebrüteten Eiern oder aus dem Schaft bzw. der Scheide von Vogelfedern.The The invention relates to a method for determining sex of birds by examination of DNA-containing cell material, preferably hatched out Eggs or from the shank or scabbard of bird feathers.
Es ist allgemein bekannt, eine Unterscheidung des Geschlechts von Vögeln anhand äußerer Merkmale, wie Körpergröße und morphologische Unterschiede, beispielsweise Stirnhöcker, Gefiederfärbung oder Federlänge, zu treffen.It is well known, a distinction of the sex of birds on the basis of external characteristics, like height and morphological Differences, for example Stirnhöcker, plumage coloring or Spring length, hold true.
In nicht seltenen Fällen bereitet dies jedoch Schwierigkeiten bzw. eine solche Unterscheidung kann (speziell bei jungen Vögeln, bestimmten Vogelarten oder auch im embryonalen Stadium) nicht oder zumindest nicht zuverlässig vorgenommen werden.In not uncommon cases However, this presents difficulties or such a distinction can (especially in young birds, certain bird species or even at the embryonic stage) or not at least not reliable be made.
Möglichkeiten zur Geschlechtsbestimmung beruhen aber auch auf der Untersuchung der DNA von Vögeln. So ist es bekannt (beispielsweise K. B. C. Appa Rao, D. Mohan and S. M. Totey: Polymerase chain reaction and its applications: Special emphasis an its role in embryo sexing, Biotechnology Advances 12, 1994 341–55), bestimmte DNA-Sequenzen durch PCR (Polymerase Ketten Reaktion) zu vervielfältigen und durch Gelelektrophorese zu differenzieren.options but also based on the investigation for sex determination the DNA of birds. Thus it is known (for example K.B.C. Appa Rao, D. Mohan and S.M. Totey: Polymerase chain reaction and its applications: Special emphasis on its role in embryo sexing, Biotechnology Advances 12, 1994 341-55), certain DNA sequences by PCR (polymerase chain reaction) too duplicate and to differentiate by gel electrophoresis.
Es
sind diesbezüglich
zahlreiche Veröffentlichungen
zur Untersuchung an Vögeln
(beispielsweise K. K. De Mattos, S. N. Del Lama, A. R. C. Salles,
M. R. Francisco, A. Medaglia, A. M. Tomasulo, F. M. S. Carmo, J.
M. C. Pereira and M. A. De Oliveira: Sex determination of parrots
Amazona a. aestiva and Amazona amazonica using the polymerase chain
reaction, Journal of Experimental Zoology, 281, 1998, 217–219; T.
Minematsu, M. Sugiyama, Y. Tohma, A. Tajima and Y. Kanai: Simplified
DNA extraction methods for sexing chick embryos, Journal of Poultry
Science, 41, 2004, 147–154;
L. Huynen, C. D. Millar and D. M. Lambert: A DNA test to sex ratite
birds, Molecular Ecology, 11, 2002, 851–856; L. G. Bermudez-Humaran,
A. Garcia-Garcia, C. H. Leal-Garza, V. M. Riojas-Valdes, G. Jaramillo-Rangel
and R. Montes-De-Oca-Luna: Molecular sexing of monomorphic endangered
Ara birds, Journal of Experimental Zoology, 292, 2002 677–680; Y.
Itoh, M. Suzuki, A. Ogawa, I. Munechika, K. Murata and S. Mizuno:
Identification of the sex of a wide range of Carinatae birds by PCR
using primer sets selected from chicken EE0.6 and its related sequences,
Journal of Heredity, 92, 2001, 315–321;
Die DNA-Vervielfältigung gelingt mit verschiedenen Primern und muss je nach Vogelart angepasst werden.The DNA amplification succeeds with different primers and must be adapted depending on the bird species.
Es
ist auch ein Verfahren bekannt (
Die Präzision und Verifizierung der PCR-Methode an sich werden aber in neuesten Untersuchungen kritisiert (B. C. Robertson and N. J. Gemmell: PCR-based sexing in conservation biology: wrong answers from an accurate methodology?, Conservation Genetics, 7, 2006, 267–271).The precision and verification of the PCR method itself will be in the latest Investigations criticized (B.C. Robertson and N.J. Gemmell: PCR-based sexing in conservation biology: wrong answers from an accurate methodology ?, Conservation Genetics, 7, 2006, 267-271).
Bekannt
sind auch optische Verfahren zur Geschlechtsunterscheidung von Vögeln durch
Differenzierung der Federstruktur mit UV-Licht (
Endoskopische Geschlechtsbestimmungen werden heutzutage in der Regel nur durchgeführt, wenn ohnehin eine Beurteilung innerer Organe von Vögeln aufgrund einer veterinärmedizinischen Indikation durchgeführt wird. Dieses Verfahren birgt die Nachteile, dass es sich um einen operativen (wenngleich minimal invasiven) Eingriff handelt. Hierfür müssen die Tiere zuvor betäubt werden, was einerseits zusätzliche Aufwendungen erfordert; andererseits sind die Tiere bei solcher Behandlung einer extremen Stresssituation ausgesetzt (G. TH. Kaal, Geschlechtsmerkmale bei Vögeln, Verlag M. & H. Scharper Hannover 1982).endoscopic Sexual determinations are nowadays usually only carried out if anyway an evaluation of internal organs of birds due to a veterinary Indication performed becomes. This method has the disadvantages that it is a operative (albeit minimally invasive) intervention. For this the must Stun animals previously be, on the one hand, additional Expenses required; On the other hand, the animals are in such Treatment of an extreme stress situation (G.T.H. Kaal, Sexual characteristics in birds, Publisher M. & H. Scharper Hannover 1982).
Des
Weiteren werden Methoden angewendet zur In-ovo-Geschlechtsbestimmung,
wobei die Geschlechtsdeterminierung bislang lediglich unter experimentellen
Bedingungen an Entwicklungsstadien unterschiedlicher Altersstufen
durchführbar
ist:
Zur In-ovo-Geschlechtsbestimmung am unbebrüteten Ei
mittels molekulargenetischer Verfahren werden die Keimscheibe magnetresonanztomographisch
lokalisiert, einige Blastodermzellen mittels Biopsie aus der Keimscheibe
entnommen und geschlechtsspezifische Sequenzen des W-Chromosoms
mittels PCR oder In-situ-Hybridisierung bestimmt. Die Entwicklung
praktikabler Verfahren werden jedoch allein schon aus Gründen des
für die
Lokalisation der Keimscheibe vergleichsweise hohen technischen und
finanziellen Aufwands in Frage gestellt.Furthermore, methods are used for in ovo sex determination, with the sex determination so far only under experimental conditions at stages of development under different ages is feasible:
For in ovo sex determination of the non-incubated egg by molecular genetic methods, the germinal disc are localized by magnetic resonance tomography, some blastoderm cells are removed from the germinal disc by biopsy and sex-specific sequences of the W chromosome are determined by PCR or in situ hybridization. However, the development of practicable methods are questioned for the mere reason of the relatively high technical and financial expense for the localization of the germinal disc.
Für eine In-ovo-Geschlechtsdifferenzierung
anhand des Hormongehalts in der Allantoisflüssigkeit (z. B. D. V. Gill,
H. A. Robertson and T. W. Betz; In vivo estrogen synthesis by the
developing chicken (Gallus gallus) embryo, General and Comparative
Endocrinology, 49, 1983, 176–86;
Darüber hinaus ist die In-ovo-Geschlechtsdifferenzierung anhand des in Zellen von männlichen und weiblichen Haushühnern unterschiedlichen DNA-Gehalts bekannt (A. Herzog: Klinische Zytogenetik der Haustiere, JF Lehmanns Fachbuchhandlung, 1995, 200–205). Der DNA-Gehalt in Zellen männlicher Individuen (ZZ) ist mit ca. 2,50 pg etwa 2% höher als in Zellen weiblicher Individuen (ZW; ca. 2,45 pg), wobei offenbar rasse- bzw. linienspezifische Unterschiede zu berücksichtigen sind. Die Bestimmung des DNA-Gehalts erfolgt mittels an sich bekannter Durchflusszytometrie. Auf Grund einer bislang unbefriedigenden Präzision in der Geschlechtsbestimmung sowie der hohen Gerätekosten wurde auch dieses Verfahren bislang nicht bis zur Praxisreife weiterentwickelt.Furthermore is the in ovo sex differentiation by means of in cells of male and female domestic chickens different DNA content known (A. Herzog: Clinical Cytogenetics Pets, JF Lehmann's Fachbuchhandlung, 1995, 200-205). Of the DNA content in male cells Individuals (ZZ) is about 2% higher at about 2.50 pg than female Individuals (ZW, about 2.45 pg), apparently racial or lineage specific To consider differences are. The determination of the DNA content takes place by means of known flow cytometry. On reason a hitherto unsatisfactory precision in sex determination as well as the high equipment costs So far, this method has not been further developed to practical maturity.
Bekannt
ist auch eine Untersuchung von extraembryonalen Flüssigkeiten,
insbesondere der Allantoisflüssigkeit,
auf einen erhöhten
Wert eines geschlechtsabhängigen
Hormons (
Dadurch, dass die Untersuchung so spät in der Entwicklung des Embryos stattfindet, kann das bebrütete Ei der männlichen Küken nicht mehr für Lebensmittel verwendet werden und muss ebenso (wie geschlüpfte Küken an sich) „entsorgt” werden.Thereby, that the investigation is so late occurs in the development of the embryo, the incubated egg the male Chick not more for Food must be used and (just like hatched chicks per se) must be "disposed of".
Die
Entnahme von Allantoisflüssigkeit
aus einem bebrüteten
Ei wird beispielsweise in der
Wie
auch die vorgenannte Methode gemäß
Ferner sind auch spektroskopische Verfahren zur Geschlechtsbestimmung von Vögeln bekannt, die nicht auf schwingungsspektroskopischen Methoden beruhen.Further are also spectroscopic methods for sexing of fuck known, which are not based on vibration spectroscopic methods.
So
wird in der
In
der
Die Nachteile bekannter Verfahren zur Geschlechtsbestimmung von Vögeln lassen sich wie folgt zusammenfassen:
- – unzureichende Präzision der DNA-Vervielfältigung
- – hohe Verbrauchskosten in der Routineanalytik (PCR-Primer, Elektrophorese-Gel)
- – späte Diagnose bei bisherigen optischen Verfahren erst nach der Geburt
- – Stresssituation für das Tier bei endoskopischen Untersuchungen
- – hohe Gerätekosten bei der NMR-Analyse
- – Flüssigkeitsentnahme in ovo für die Hormonbestimmung unter Tierschutzgesichtspunkten zu einem problematischen Zeitpunkt
- - insufficient precision of DNA duplication
- - high consumption costs in routine analysis (PCR primer, electrophoresis gel)
- - late diagnosis in previous optical procedures only after birth
- - Stress situation for the animal during endoscopic examinations
- - high equipment costs in the NMR analysis
- - Taking liquid in ovo for the purpose of animal hormone determination at a problematic time
Ferner ist die Raman-Spektroskopie als Untersuchungsmethode zur Charakterisierung von DNA an sich schon seit Jahrzehnten bekannt (beispielsweise J. M. Benevides and G. J. Thomas Jr.: Raman spectral studies of nucleic acids. Part XXV. Characterization of DNA structures by Raman spectroscopy: high-salt and low-salt forms of double helical poly(dG-dC) in water and D2O solutions and application to B, Z and A-DNA, Nucleic Acids Research, 11, 1983, 5747–61).Furthermore, Raman spectroscopy has been known for decades as an assay method for the characterization of DNA per se (for example, JM Benevides and GJ Thomas Jr: Raman spectral studies of nucleic acids.) Part XXV Characterization of DNA structures by Raman spectroscopy: high-salt and low-salt forms of double helical poly (dG-dC) in water and D 2 O solutions and application to B, Z and A DNA, Nucleic Acids Research, 11, 1983, 5747-61).
Diese
wird auch zur Untersuchung von Geschlechtsumwandlungen in der Erbfolge
anhand isoliertem SRY-HMG:DNA-Komplex im humanen Bereich eingesetzt
(beispielsweise J. M. Benevides, G. Chan, X.-J. Lu, W. K. Olson,
M. A. Weiss and G. J. Thomas: Protein-Directed DNA Structure, I. Raman Spectroscopy
of a High-Mobility-Group Box with Application to Human Sex Reversal,
Biochemistry, 39, 2000, 537–547).
Damit werden spezielle Gene auf das Vorhandensein von an sich bekannten
geschlechtsspezifischen Marker für
die Erbfolge geprüft.
Eine weitere Anwendung umschließt
die Bestimmung des Protein/DNA-Gehalts in B- und T-Zellen (beispielsweise
Die Raman-Spektroskopie dient außerdem der Lebensmittelkontrolle von Fleisch (D. I. Ellis, D. Broadhurst, S. J. Clarke and R. Goodacre: Rapid identification of closely related muscle foods by vibrational spectroscopy and machine learning, Analyst (Cambridge, United Kingdom), 130, 2005, 1648–1654) oder auch Pigmentuntersuchungen von Vögeln (M. Veronelli, G. Zerbi and R. Stradi: In situ resonance Raman spectra of carotenoids in bird's feathers, Journal of Raman Spectroscopy, 26, 1995, 683–92).The Raman spectroscopy is also used food control of meat (D.I. Ellis, D. Broadhurst, Clarke and R. Goodacre: Rapid identification of closely related muscle foods by vibrational spectroscopy and machine learning, analyst (Cambridge, United Kingdom), 130, 2005, 1648-1654) or pigment studies of birds (M. Veronelli, G. Zerbi and R. Stradi: in situ resonance Raman spectra of carotenoids in bird's feathers, Journal of Raman Spectroscopy, 26, 1995, 683-92).
Über Untersuchungen des DNA-Gehalts des Zellmaterials von Vögeln mit der Raman-Spektroskopie, um das Geschlecht zu bestimmen, ist in der Fachwelt nichts bekannt geworden.About investigations of the DNA content of the cell material of birds with Raman spectroscopy Determining sex is not known in the professional world become.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, das anhand äußerer Merkmale nicht oder wenig erkennbare Geschlecht von Vögeln auf möglichst einfache Weise, schnell, zuverlässig sowie ohne nennenswerte und auch aus Tierschutzgründen problematische Belastung der Tiere (beispielsweise durch Betäubung) zu bestimmen.Of the Invention is based on the object, the basis of external features not or little recognizable gender of birds in the simplest possible way, fast, reliable as well as without significant and problematic animal welfare reasons To determine the load on the animals (for example by anesthesia).
Erfindungsgemäß wird das Geschlecht der Vögel bestimmt, indem DNA-relevantes Zellmaterial des Vogels (nicht einzelne Chromosomen) durch Lichteinwirkung, beispielsweise eines Laserstrahls, untersucht und die Molekülbewegungen gemessen werden. Das Spektrum der durch die Molekülbewegungen entstehenden Strahlung wird erfasst und mit vorgegebenen sowie geschlechtsspezifische DNA-Strukturen der zu untersuchenden Vogelart repräsentierenden Referenzspektren verglichen. Diese Referenzspektren, die beispielsweise in einer Datenbank vorliegen, beinhalten insbesondere eine statistisch erfasste geschlechtsspezifische Zuordnung von DNA-Merkmalen der jeweils zu untersuchenden Vogelart.According to the invention Gender of the birds determined by using DNA-relevant cell material of the bird (not individual Chromosomes) by the action of light, for example a laser beam, examined and the molecular movements be measured. The spectrum of the molecule movements resulting radiation is detected and given as well as gender-specific Representing DNA structures of the bird species to be examined Reference spectra compared. These reference spectra, for example in a database, include in particular a statistical recorded gender-specific assignment of DNA features of the each to be examined bird species.
Aus dem spektralen Vergleich des auszuwertenden Zellmaterials mit den besagten Referenzdaten wird vorzugsweise rechentechnisch eine auf Grundlage des DNA-Gehalts des Zellmaterials basierende Geschlechtszuordnung des Vogels getroffen.Out the spectral comparison of the evaluated cell material with the said reference data is preferably a computational on Based on the DNA content of the cell material based sex allocation hit the bird.
Überraschend wurde festgestellt, dass auf Grund des unterschiedlichen DNA-Gehalts zwischen männlichen und weiblichen Vögeln bei der Anwendung von schwingungsspektroskopischen Verfahren spezifische und unterscheidbare Spektren zwischen beiden Geschlechtern auftreten, die von hoher diagnostischer Relevanz sind. Als schwingungsspektroskopische Verfahren finden insbesondere die Raman-Spektroskopie, die UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie, die IR-Spektroskopie und die Absorptionsmethode der Terahertz-Spektroskopie Anwendung, wobei das DNA-relevante Zellmaterial jeweils durch Licht entsprechender Wellenlänge zur Molekül- bzw. Gerüstschwingung angeregt wird.Surprisingly, it was found that due to the different DNA content between male and female birds in the application of vibrational spectroscopic procedures speci fish and distinguishable spectra between both genders, which are of high diagnostic relevance. In particular, Raman spectroscopy, UV resonance Raman spectroscopy, IR spectroscopy and the absorption method of terahertz spectroscopy are used as oscillation spectroscopy methods, the DNA-relevant cell material being excited in each case by light of appropriate wavelength for molecular or skeletal oscillation becomes.
Das Zellmaterial kann auf einfache und für das Tier verträgliche Weise aus dem Schaft einer jungen Feder des Vogels entnommen und auf einem Träger, vorzugsweise einem Quarzglas oder einem CaF2-Glas, präpariert werden. Auf die Trägeroberfläche mit dem besagten Präparat wird das Licht zur Messung der Molekülbewegung fokussiert.The cell material can be removed from the shaft of a young bird's feather in a simple and animal-compatible manner and prepared on a support, preferably a quartz glass or a CaF 2 glass. On the support surface with the said preparation, the light is focused to measure the molecular motion.
Vorteilhaft erscheint hier die Fokussierung eines Laserstrahls über das Objektiv eines Mikroskops. Die Fokussierung kann jedoch auch Faser-gekoppelt erfolgen, was besonders für eine In-ovo-Geschlechtsbestimmung interessant ist.Advantageous Here, the focus of a laser beam on the Lens of a microscope. However, the focus can also be fiber-coupled done, which is especially for an in ovo sex determination is interesting.
Bei ungeschlüpften Vögeln kann das Licht durch einen kleinen Zugang durch die Eierschale unmittelbar auf die Keimscheibe als Zellmaterial fokussiert werden. Durch den gleichen oder einen anderen Zugang geringer Öffnungsgröße wird eine Sonde geführt, mittels derer das Spektrum der durch die vorgenannte Molekülbewegung im Innern vom Ei gemessen wird.at unhatched fuck The light can pass through a small access through the eggshell directly be focused on the germinal disc as a cell material. By the same or another access small opening size, a probe is guided, by means of derer the spectrum of the above-mentioned molecular motion inside the egg is measured.
Die erhaltenen spektralen Informationen werden in einem zweiten Schritt mit Referenzdaten einer Datenbank verglichen. Diese repräsentieren vorzugsweise statistisch gewonnene Daten über die zu untersuchende Spezies. Aus diesem Vergleich wird erfindungsgemäß die Geschlechtszuordnung des untersuchten DNA-Materials getroffen.The obtained spectral information in a second step compared with reference data of a database. These represent preferably statistically obtained data on the species to be examined. From this comparison, according to the invention, the gender assignment of the examined DNA material.
Im Gegensatz zum Stand der Technik ist die Geschlechtsbestimmung mit hoher Zuverlässigkeit, Spezifität, Sensitivität, Schnelligkeit und vergleichsweise geringem Aufwand durchführbar.in the Contrary to the state of the art sexing is with high reliability, specificity, Sensitivity, Speed and comparatively little effort feasible.
Mit der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, welches eine wesentlich verbesserte und spezifischere Bestimmung des Geschlechts von Vögeln wie Ziervögeln (Papageien, etc.), Greifvögel oder Lege- bzw. Masthennen sogar in ovo erlaubt und damit eine immens verbesserte Diagnosemöglichkeit bietet.With The invention provides a method which is an essential improved and more specific determination of the sex of birds such as pet birds (Parrots, etc.), birds of prey or laying or masthead even allowed in ovo and thus an immense improved diagnostics option offers.
Die vorliegende Erfindung beruht auf Messergebnissen des DNA-Materials, die durch Anwendung an sich bekannten Verfahren der Schwingungsspektroskopie (vorzugsweise UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie, Raman-Spektroskopie, IR-Spektroskopie und THz-Spektroskopie) gewonnen wurden, sowie auf einem vorzugsweise rechentechnischen Vergleich der ermittelten spektroskopischen Daten des DNA-Zellmaterials mit Referenzwerten einer Datenbank.The present invention is based on measurement results of the DNA material, the known by application of vibration spectroscopy (preferably UV resonance Raman spectroscopy, Raman spectroscopy, IR spectroscopy and THz spectroscopy) were obtained, and on a preferably computational Comparison of the determined spectroscopic data of the DNA cell material with Reference values of a database.
Es zeigte sich, dass in DNA reichem Zellmaterial von Vögeln, mit hoher Sensitivität und Spezifität im Unterschied zur selben Vogelart des anderen Geschlechts veränderte Signale im Spektrum gefunden wurden. Die spezifischen Referenzspektren sind damit von hoher Relevanz zur Geschlechtsbestimmung, was dieses Verfahren für die Geschlechtsunterscheidung (selbst in ovo) prädestiniert. Diese Unterschiede im Raman-Spektrum zwischen männlichen und weiblichen Vögeln derselben Art, waren der Fachwelt bisher nicht bekannt.It showed that in DNA rich cell material of birds, with high sensitivity and specificity in contrast to the same bird species of the opposite sex changed signals were found in the spectrum. The specific reference spectra are thus of high relevance to sexing, what this procedure for the Sex discrimination (even in ovo) predestined. Those differences in the Raman spectrum between male and female birds of the same kind, the experts were previously unknown.
Im Folgenden wird das spezielle Verfahren der schwingungsspektroskopischen Methoden beispielhaft anhand der bereits erwähnten UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie erläutert.in the Following is the special procedure of the vibrational spectroscopic Methods exemplified by the already mentioned UV resonance Raman spectroscopy explained.
Die Raman-Spektroskopie bietet vorteilhaft die Möglichkeit, biologisches Material zerstörungsfrei zu untersuchen.The Raman spectroscopy advantageously offers the possibility of biological material destructively to investigate.
Durch Ausnutzen des Resonanz-Effekts unter Anregung im UV-Wellenlängenbereich lassen sich wichtige Signale der DNA und Proteine selektiv verstärken und das Signalrausch-Verhältnis aufgrund einer Intensitätserhöhung um etwa 106 verbessern. Somit reichen bereits geringe Konzentrationen von DNA-haltigen Zellbestandteilen aus, um diese UV-Resonanz-Raman-spektroskopisch zu untersuchen. Demzufolge eignet sich diese Methode, um Raman-Spektren von DNA-haltigem Zellmaterial der zu untersuchenden Vögel zu charakterisieren. Obwohl sich die Raman-Spektren des untersuchten DNA-haltigen Zellmaterials sehr ähnlich sehen, enthält die komplexe Schwingungsstruktur wichtige Informationen, die sich zwischen den Geschlechtern unterscheiden. Die wesentlichen Schwingungsbanden zur Geschlechtsbestimmung sind im Wellenzahlbereich unter 1800 cm–1 (fingerprint-Bereich) zu finden.By exploiting the resonance effect under excitation in the UV wavelength range, important signals of the DNA and proteins can be selectively amplified and the signal-to-noise ratio improved by about 10 6 due to an increase in intensity. Thus, even low concentrations of DNA-containing cell components are sufficient to investigate these UV resonance Raman spectroscopy. Accordingly, this method is suitable for characterizing Raman spectra of DNA-containing cell material of the birds to be examined. Although the Raman spectra of the investigated DNA-containing cell material are very similar, the complex vibrational structure contains important information that varies between the sexes. The main vibrational bands for gender determination can be found in the wavenumber range below 1800 cm -1 (fingerprint area).
Es konnte gezeigt werden, dass die Komponenten, die hauptsächlich zum Raman-Spektrum von DNA-haltigen Zellmaterial beitragen, von DNA-Basen, wie Guanin, Adenin, Cytosin und Thymin, resultieren. Da im untersuchten Zellmaterial außerdem Proteine vorhanden sind, ergeben sich weitere wichtige Banden im Raman-Spektrum von Signalen der aromatischen Aminosäuren, wie Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin, sowie von Amid I, II und III Schwingungen.It could be shown that the components mainly for Raman spectrum of DNA-containing Contribute to cellular material, from DNA bases, such as guanine, adenine, cytosine and thymine, result. As in the examined cell material also proteins are present, there are other important bands in the Raman spectrum of aromatic amino acid signals, such as tryptophan, tyrosine and phenylalanine, as well as amide I, II and III vibrations.
Aufgrund der Komplexität der Spektren sind Unterschiede im Spektrum zwischen den Geschlechtern nur schwer zu visualisieren, weshalb insbesondere chemometrische Methoden zum Einsatz gebracht wurden. Chemometrik beinhaltet die Anwendung statistischer und mathematischer Methoden zur Datenanalyse. Chemometrische Methoden können angewendet werden, um chemische Verfahren und Experimente zu planen, zu entwickeln oder mit maximaler Information auszuwerten. Insbesondere bei sehr großen oder sehr ähnlichen Datensätzen sind chemometrische Methoden hilfreich. So werden derartige Verfahren zur Klassifizierung von Proben anhand analytischer Daten, wie beispielsweise der Erkennung von Krankheiten mit Hilfe der Raman-Spektren des Gewebes, genutzt. Hierbei können sowohl überwachte und unüberwachte Klassifizierungsmethoden zum Einsatz kommen. Unüberwachte Klassifizierungsmethoden sind die hierarchische Clusteranalyse (HCA) und die Hauptkomponentenanalyse (PCA – Principal Component Analysis). Bei überwachten Klassifizierungsmethoden wird im Gegensatz zu den unüberwachten Methoden die Klassenzugehörigkeit berücksichtigt. Diese Verfahren werden in der Regel eingesetzt, wenn im Anschluss an die Klassifizierung unbekannte Proben identifiziert werden sollen. Hierzu muss das Modell zuerst mit bekannten Proben erstellt und anschließend validiert werden. Dabei könnten vorzugsweise die bekannten Verfahren K-Nearest-Neighbour-Klassifikation (KNN), Nearest Mean Classifier (NMC), lineare Diskriminanzanalyse (LDA), künstliche neuronale Netze (ANN – Artificial Neural Networks) sowie Support-Vector-Maschinen (SVM) zum Einsatz kommen.by virtue of the complexity The spectra are differences in spectrum between the sexes only difficult to visualize, which is why especially chemometric methods were brought into use. Chemometrics includes the application statistical and mathematical methods for data analysis. chemometrics Methods can can be applied to plan chemical processes and experiments, too develop or evaluate with maximum information. Especially at very large or very similar datasets chemometric methods helpful. Such are the methods for the classification of samples using analytical data, such as the detection of diseases using the Raman spectra of the tissue, used. Here you can both monitored and unsupervised Classification methods are used. Unmonitored classification methods are the hierarchical cluster analysis (HCA) and the principal component analysis (PCA Principal Component Analysis). In supervised Classification methods will be unlike the unsupervised ones Methods class membership considered. These procedures are usually used when following to identify unknown samples for classification. For this, the model must first be created with known samples and subsequently be validated. It could preferably the known methods K Nearest Neighbor Classification (KNN), Nearest Mean Classifier (NMC), linear discriminant analysis (LDA), artificial neural networks (ANN - Artificial Neural Networks) and Support Vector Machines (SVM) come.
Für eine Klassifizierung zur erfindungsgemäßen Auswertung ist es notwendig, einen großen Datensatz von DNA-haltigen Zellmaterial von Vogelarten unterschiedlichen Geschlechts UV-Resonanz-Raman-spektroskopisch zu untersuchen, wobei diese Spektren als Referenzwerte in einer Datenbank verwendet werden. Dabei wird ein chemometrisches Modell aufgestellt, um zwischen diesen Proben zu unterscheiden. Nach Komplettierung der Spektrensammlung in der Datenbank und der Erstellung eines Klassifikationsmodells, wird dies als Grundlage genutzt, nach der Aufnahme eines UV-Resonanz-Raman-Spektrums einer unbekannten Probe unter Verwendung des ausgearbeiteten Modells das Spektrum dieser Probe unmittelbar als männlich oder weiblich zu klassifizieren.For a classification for the evaluation according to the invention it is necessary a big one Record of DNA-containing cell material of bird species different Sex UV resonance Raman spectroscopically examine, where these spectra are used as reference values in a database. In doing so, a chemometric model is set up to distinguish between them To distinguish samples. After completing the spectra collection in the database and the creation of a classification model, this is taken as a basis after recording a UV resonance Raman spectrum of an unknown Sample using the elaborated model the spectrum this sample immediately as male or classify female.
Die vorliegende Erfindung liefert somit eine schnelle und zuverlässige Methode zur Geschlechtsbestimmung von Vögeln auch in ovo.The The present invention thus provides a fast and reliable method for the sex determination of birds also in ovo.
Die Molekül- bzw. Gerüstschwingungen des untersuchten DNA-Materials können insbesondere durch die UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie, Raman-Spektroskopie, IR-Spektroskopie und die THz-Spektroskopie erfasst werden.The Molecule- or framework vibrations of the examined DNA material in particular by UV resonance Raman spectroscopy, Raman spectroscopy, IR spectroscopy and the THz spectroscopy are detected.
Wie die IR- und THz-Spektroskopie ist die Raman-Spektroskopie eine schwingungsspektroskopische Untersuchungsmethode. Während jedoch bei der IR-Spektroskopie die Licht-Absorption beim Durchgang durch eine Probe gemessen wird, wird bei der Raman-Spektroskopie das Streulicht analysiert. Wenn das Streulicht dieselbe Frequenz und damit dieselbe Energie hat wie das Anregungslicht, liegt ein elastischer Lichtstreuprozess, Rayleigh-Streuung vor. Daneben werden einige wenige Lichtquanten des Laserlichts inelastisch gestreut. Hierbei erfahren die Lichtquanten eine Wechselwirkung mit den Molekülen einer Probe in der Weise, dass die Streustrahlung eine höhere oder niedrigere Energie besitzt als das Anregungslicht. Man beobachtet dann neben dem elastisch gestreuten Licht der Rayleigh-Streuung auf beiden Seiten der Anregungslinie eine frequenzverschobene inelastische Streustrahlung, die Raman-Streuung.As IR and THz spectroscopy is Raman spectroscopy, a vibrational spectroscopic investigation method. While however, in IR spectroscopy, the light absorption on passage through a sample is measured, the scattered light is analyzed in Raman spectroscopy. When the stray light has the same frequency and therefore the same energy has like the excitation light, lies an elastic light scattering process, Rayleigh scattering before. Next to it are a few light quanta of the laser light inelastically scattered. Hereby the light quanta learns interacting with the molecules of a sample in such a way that the scattered radiation is higher or lower energy than the excitation light. You then watch next to the elastically scattered light of Rayleigh scattering on both Sides of the excitation line a frequency-shifted inelastic Scattered radiation, the Raman scattering.
Die Energie der THz-Strahlung oder des fernen Infrarot entspricht der Energie schwacher intramolekularer Wechselwirkungen, wie beispielsweise der Gerüstschwingungen von Proteinen, die wesentlich für deren Faltung und Funktion sind. Bei der THz-Spektroskopie unterscheidet man die Absorptionsspektroskopie und die Emissionsspektroskopie. Bei der Emissionsspektroskopie misst man die Strahlung, die jeder Körper ausstrahlt. Hierbei muss keine weitere Anregung stattfinden. Die Zustände sind bereits thermisch angeregt und müssen mit einem sehr empfindlichen Detektor gemessen werden. Dies wäre eine passive Messung. Das Ganze kann auch aktiv erfolgen in Form eines Absorptionsexperimentes mit Hilfe einer Strahlungsquelle (vorzugsweise mit Germaniumlasern und Quantenkaskadenlasern) und Detektor. Hierbei ist es auch möglich, durch die Schale eines bebrüteten Eies zu messen.The Energy of the THz radiation or the far infrared corresponds to the Energy of weak intramolecular interactions, such as the framework vibrations of proteins that are essential for whose folding and function are. Differentiates in THz spectroscopy one the absorption spectroscopy and the emission spectroscopy. Emission spectroscopy measures the radiation that everyone has Body radiates. There is no need for further stimulation. The states are already thermally stimulated and need be measured with a very sensitive detector. This would be one passive measurement. The whole thing can also be done actively in the form of a Absorption experiment using a radiation source (preferably with germanium lasers and quantum cascade lasers) and detector. in this connection it is also possible through the shell of a hatched Eikes to measure.
Das Verfahren soll nachstehend anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels mit UV-Resonanz-Raman-spektroskopischer Untersuchung näher erläutert werden.The Method will be described below with reference to an illustrated in the drawing Embodiment with UV resonance Raman spectroscopic investigation.
Es zeigen:It demonstrate:
Die
UV-Resonanz-Raman-spektroskopischen Untersuchungen werden exemplarisch
an aus der Federscheide gewonnenen Federpulpa von verschiedenen
Vogelarten unterschiedlichen Geschlechts bei einer Laseranregungswellenlänge von
244 nm aufgezeigt. Die Proben präparation
der Federpulpa erfolgt durch Ausquetschen aus der Federscheide auf
einen Substratträger
aus Quarz. In
Die Bestimmung des Geschlechts anhand des Raman-Spektrums erfolgt mit Hilfe von chemometrischen Methoden. Unüberwachte Verfahren, wie die Hierarchische Clusteranalyse und die Hauptkomponentenanalyse, liefern dabei Informationen über natürliche Gruppierungen im Datensatz. Daneben werden auch überwachte Klassifizierungsmethoden wie beispielsweise eine Support-Vektor-Maschine zur Geschlechtsbestimmung verwendet, mit der es möglich ist, im Anschluss an die Klassifizierung unbekannte Proben zu identifizieren.The Determination of sex based on the Raman spectrum is carried out with Help of chemometric methods. Unmonitored procedures, like the Hierarchical cluster analysis and principal component analysis doing information about natural Groupings in the record. In addition, there are also supervised classification methods such as a support vector machine for sexing used with which it is possible is to identify unknown samples after classification.
In
Anhand der Gruppierung wird deutlich, dass eine gute Unterscheidung zwischen Spektren von weiblichen und männlichen Legehybriden anhand von DNA-Material der Federpulpa möglich ist.Based the grouping becomes clear that a good distinction between Spectra of female and male Leihybriden based on DNA material of the spring pulp is possible.
Das
Dendrogramm zeigt die Aufspaltung in zwei Cluster, wobei eine Gruppe
von Spektren aus weiblichen Legehybriden (dunkel dargestellt) gebildet
wird, während
die andere Gruppe hauptsächlich
aus Spektren von männlichen
Legehybriden stammt. Allerdings wurden einige Spektren dem anderen
Geschlecht zugeordnet. Es ist festzustellen, dass Probe 9 und 13
als männlich
deklariert, aber immer – auch
mit diversen Datenvorbehandlungen – im Cluster „weiblich” eingeordnet
werden. Weiterhin wird Probe 27 als weiblich deklariert aber immer
im „männlichen” Cluster
eingeordnet.The
Dendrogram shows the splitting into two clusters, with one group
of spectra from female laying hybrids (shown in dark)
will, while
the other group mainly
from spectra of males
Laying hybrid originates. However, some spectra became the other
Assigned to gender. It should be noted that
Das
Ergebnis der Clusteranalyse konnte mit Hilfe einer Hauptkomponentenanalyse
(PCA) bestätigt werden.
Auch hier wird die Ableitung der Spektren verwendet und es erfolgt
eine Vektornormierung. In
Weiterhin wurden die Spektren mit Hilfe einer Support-Vector-Maschine (SVM; Kernel-Funktion: Radialbasisfunktion (RBF); Cost-Faktor 1.5·106, γ = 1·10–6) ausgewertet. Dabei werden die Spektralbereiche von 3545–2532 cm–1 und 1809–913 cm–1 einbezogen. Bei dieser Klassifizierungsmethode werden den Spektren Attribute zugeordnet, in diesem Fall das Attribut ”Geschlecht”. Der Rechenalgorithmus versucht die Spektren, die durch die Attribute in die festgelegten Klassen unterteilt werden müssen, optimal durch eine Trennebene zu separieren. Dazu wird die Datenmatrix in den höherdimensionalen „Hyperspace” überführt. Eine bildliche Darstellung der Ergebnisse ist wegen der höheren Dimensionen nicht mehr möglich.Furthermore, the spectra were evaluated using a support vector machine (SVM; kernel function: radial basis function (RBF); cost factor 1.5 × 10 6 , γ = 1 × 10 -6 ). The spectral ranges of 3545-2532 cm -1 and 1809-913 cm -1 are included. In this classification method, attributes are assigned to the spectra, in this case the attribute "gender". The computational algorithm optimally tries to separate the spectra, which have to be subdivided by the attributes into the specified classes, by a separation plane. For this, the data matrix is transferred to the higher-dimensional "hyperspace". A visual representation of the results is no longer possible because of the higher dimensions.
Als Ergebnis erhält man ein Modell, das durch die Leave-one-out-Methode validiert wird.When Result receives a model that is validated by the leave-one-out method.
Dabei
wird ein Spektrum bei Modellerstellung herausgelassen und durch
das berechnete Modell wieder eine Zuordnung versucht. Das Resultat
ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Ergebnis der SVM-Analyse mittels
Leave-one-out Methode
Eine
andere Art der Validierung des Modells gelingt mit einem Test-Datensatz.
Der Originaldatensatz wird zufällig
in einen Datensatz zur Erstellung des Modells (215 Spektren) und
in einen Datensatz zur Validierung des Modells (111 Spektren) geteilt.
Das Ergebnis der Validierung ist in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Ergebnis der SVM-Analyse mittels
Testset Methode
Die beschriebene Methode, welche auf die Anwendung an sich bekannter schwingungsspektroskopischen Methoden sowie chemometrischen Verfahren zurückgreift (hier beispielhaft anhand der Hierarchischen Clusteranalyse, Hauptkomponentenanalyse und Support-Vektor-Maschine von UV-Resonanz-Raman-Spektren), bietet somit die Möglichkeit, aufgrund spektraler Unterschiede von DNA-Material (im vorliegenden Beispiel Federpulpapräparate von Legehybriden) zwischen den Geschlechtern von Vögeln zu unterscheiden.The described method, which is based on the application known per se vibration spectroscopic methods and chemometric methods recourse (here by way of example using the hierarchical cluster analysis, principal component analysis and support vector machine of UV resonance Raman spectra) thus the possibility due to spectral differences of DNA material (in the present Example Federpulpapräparate of laying hybrids) between the sexes of birds differ.
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