DE102006025695A1

DE102006025695A1 - Selektive enzymatische Veresterung und Solvolyse eines Epimeren Vitamin D-Analogen und Trennung und Epimerisierung der Epimeren

Info

Publication number: DE102006025695A1
Application number: DE102006025695A
Authority: DE
Inventors: Chze Siong Louchu Ng; Ching-Peng Louchu Wei
Original assignee: Formosa Laboratories Inc
Current assignee: Formosa Laboratories Inc
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2006-06-01
Publication date: 2006-12-07
Also published as: TW200643172A; US20060275880A1

Abstract

Da das C-24 der Vitamin D-Derivate mit einer C-24-Hydroxylverzweigung ein chirales Zentrum ist, gibt es zwei Epimere, d. h. C-24-R-Hydroxyl und C-24S-Hydroxyl, die gefunden werden können. Jedoch ist nur das Diastereomer mit C-24S-Hydroxyl biologisch aktiv. Ein Verfahren zur selektiv enzymatischen Veresterung oder selektiv enzymatischen Solvolyse eines Gemisches von Epimeren der C-24-Hydroxyl-Vitamin D-Derivate ist hier offenbart. Das Verfahren kann zur Trennung dieser zwei Diastereomeren aus einem Gemisch von deren Epimeren für ein Reinigungsverfahren verwendet werden. Zusätzlich kann das Verfahren zur Isomerisierung des C-24R-Hydroxyl-Epimers für weitere Rückführungszwecke verwendet werden.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Reinigung eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe und insbesondere betrifft sie Verfahren zum selektiv enzymatischen Verestern eines Epimers, selektiv enzymatischen Solvolysieren eines Epimers oder Epimerisieren eines Stereodiastereomers.

Viele bioaktive Derivate von Vitamin D sind kürzlich entwickelt worden. Beispielsweise sind Derivate (oder Analoge) von 1α,25-Dihydroxylvitamin D2 mit einer C-24-Hydroxyl-substituierten Gruppe (anstelle einer C-25-Hydroxylsubstituierten Gruppe) in den letzten Jahren hergestellt worden. Tatsächlich ist die pharmazeutische Aktivität dieser Derivate oder Analogen mit verschiedenen modifizierten Verzweigungen am Hauptskelett von 1α,25-Dihydroxylvitamin D2 verschieden. Da der Kohlenstoff an der C-24-Stelle von dem C-24-Hydroxylsubstituierten Vitamin D ein chirales Zentrum ist, können zwei Diastereomere (oder im folgenden Epimere), wie C-24R und C-24S, gefunden werden. Davon ist das C-24S-Hydroxyl-substituierte Vitamin D-Analoge bioaktiver. Bei der traditionellen Methode zur Herstellung von C-24S-Hydroxyl-substituiertem Vitamin D- Analogem ist die Trennung der zwei Epimeren, wie von C-24S-Hydroxylsubstituiertem Vitamin D-Analogem und C-24R-Hydroxyl-substituiertem Vitamin D-Analogem, ein Schlüsselschritt zur Erhöhung der Ausbeute. Andererseits schlagen einige Forscher die Herstellung von C-24S-Hydroxyl-substituiertem Vitamin D-Analogem durch eine asymmetrische Reduktion vor. Eine weitere Herstellung des C-24S-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen wird durch Kombinieren der richtigen Verzweigung mit dem Vitamin D-Skelett erreicht. Jedoch sind die Bedingungen zur Erreichung dieser Reaktionen, wie eine asymmetrische Reduktion (siehe beispielsweise U.S. Pat. Nr. 6,262,283) oder die Kupplungsreaktion, sehr strikt. Daneben sind die Kosten für die Reagenzien für diese oben veranschaulichten Reaktionen ziemlich hoch. Daher können die oben veranschaulichten Reaktionen nicht einfach für eine Massenproduktion angewandt werden. In der Literatur wurde auch beschrieben, das C-24S-Hydroxylsubstituierte Vitamin D-Analoge durch Chromatographie zu reinigen (vergleiche beispielsweise Calverley, Tetrahedron 4609-4619,1987). Da jedoch der Strukturunterschied zwischen dem C-24S-Hydroxyl-substituierten Vitamin D und dem C-24R-Hydroxyl-substituierten Vitamin D gering ist, ist die Wirksamkeit der Trennung durch direkte Chromatographie niedrig. Darüber hinaus wurde die Herstellung von C-24S-Hydroxyl-substituiertem Vitamin D durch eine Enzymreaktion ebenfalls vorgeschlagen. Jedoch wird das Nebenprodukt C-24R-Hydroxylsubstituiertes Vitamin D verworfen und muss sorgfältig entsorgt werden. Somit sind die Kosten für eine Massenproduktion ebenfalls hoch.

Daher besteht noch ein Bedarf an einem Verfahren zum wirksamen Reinigen von C-24S-Hydroxyl-substituiertem Vitamin D aus einem Gemisch der Diastereomeren. Zudem wäre es wünschenswert, ein Verfahren zum wirksamen Trennen der Diastereomeren, wie eines Gemisches von C-24S-Hydroxyl-substituiertem Vitamin D und C-24R-Hydroxyl-substituiertem Vitamin D, zu haben, welches auch zum Rückführen von C-24R-Hydroxyl-substituiertem Vitamin D zur weiteren Umsetzung angewandt werden kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur selektiv enzymatischen Veresterung eines Epimers in einem Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe bereit, das die Schritte aufweist: (a) Bereitstellen eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe, wobei die Epimeren des Gemisches aus der Gruppe bestehend aus der folgenden Formel (I) und Formel (II) ausgewählt sind:

wobei R₁ Wasserstoff oder eine Hydroxy-Schutzgruppe ist; R₂ C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist; und vorzugsweise R₂ eine Cyclopropylgruppe oder eine Isopropylgruppe ist; (b) Lösen des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe in einem Veresterungsmittel unter Bildung einer Mischungslösung oder Lösen des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe und dem Veresterungsmittel in einem organischen Lösungsmittel unter Bildung einer Mischungslösung; und (c) In-Berührung-Bringen der Mischungslösung mit einer Lipase, um eine selektive enzymatische Veresterung durchzuführen. Durch das oben veranschaulichte Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das Vitamin D-Analoge mit einer C-24(R,S)-Hydroxylgruppe selektiv zu einem Gemisch von Epimeren, das leicht aufgetrennt werden kann, verestert werden.

Das organische Lösungsmittel, das bei dem Verfahren der selektiven enzymatischen Veresterung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein lineares oder verzweigtes Alkan mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, ein Alkylester einer Alkylcarbonsäure, ein Dialkylether oder die Kombination davon. Vorzugsweise kann es sich bei dem organischen Lösungsmittel um Hexan, Diisopropylether, Ethylacetat, Vinylbutyrat, tert-Butylmethylether, Diethylether oder die Kombination davon handeln. Bei dem Veresterungsmittel, das bei dem Verfahren der selektiven enzymatischen Veresterung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, handelt es sich um Acylhalogenide, Säureanhydride, Vinylester von niederen Alkylcarbonsäuren mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen oder die Kombination davon. Vorzugsweise kann das Veresterungsmittel Acylchlorid, Essigsäureanhydrid, Vinylacetat, Vinylbutyrat oder die Kombination davon sein.

Die Lipase, die bei dem Verfahren der selektiven enzymatischen Veresterung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann eine beliebige Lipase sein. Vorzugsweise handelt es sich bei der Lipase, die bei dem Verfahren der selektiven enzymatischen Veresterung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um Alcaligenes sp. Lipase oder Pseudomonas sp. Lipase. Die Lipase kann immobilisiert oder frei sein.

Das Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe, das bei dem Verfahren der selektiven enzymatischen Veresterung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann [5E,7E,22E,24(R,S)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol oder [5Z,7E,22E,24(R,S)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol sein, und bei dem Epimer in dem Gemisch von Epimeren, das selektiv enzymatisch verestert werden kann, handelt es sich um [5E,7E,22E,24(R)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol oder [5Z,7E,22E,24(R)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol.

Um die Anwendungen für das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu steigern oder die Trennung oder Reinigung des Epimers zu erleichtern, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur selektiv enzymatischen Veresterung eines Epimers in einem Gemisch von Epimeren von einem Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe weiterhin einen Schritt umfassen: (d) Verwenden einer Chromatographie, um das veresterte Epimer aus dem Gemisch von Epimeren abzutrennen. Nach Beendigung des obigen Schritts (d) kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin einen Schritt umfassen: (e) Hydrolysieren des veresterten, aus der Chromatographie isolierten Epimers unter Erhalt wenigstens eines Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe.

In einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Vitamin D-Analogen mit einer C-24(R,S)-Hydroxylgruppe um [5E,7E,22E,24(R,S)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol. Nach Reinigung des oben gezeigten Vitamin D-Analogen mit einer C-24(R,S)-Hydroxylgruppe durch enzymatisch selektive Veresterung mit Chromatographie kann [5E,7E,22E,24(R)]-24-Acetoxy-24-cyclopropyl-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen und das Epimer [5E,7E,22E,24(S)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol erhalten werden. Darüber hinaus kann das andere Epimer [5E,7E,22E,24(R)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol ebenfalls erhalten werden, nachdem das oben gezeigte Vitamin D-Analoge mit einer C-24 (R,S)-Hydroxylgruppe hydrolysiert wird.

Mit dem Produkt des obigen Schritts (e) kann mit den folgenden Schritten weiter verfahren werden: (f) Isomerisieren des wenigstens einen Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe in Anwesenheit eines Veresterungsmittels, einer organischen Säure und eines nichtprotischen Lösungsmittels bei einer Temperatur zwischen 30°C und 80°C unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe; und (g) Hydro lysieren oder Reduzieren des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe.

Das bei dem Verfahren der Epimerisierung der vorliegenden Erfindung verwendete Veresterungsmittel umfasst:

(i) ein Phosphin der folgenden Formel: (R)₃-P wobei R C₁-C₄-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist; und
(ii) eine Diazoverbindung der folgenden Formel:
wobei R₉ und R₁₀ jeder unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur selektiv enzymatischen Solvolyse eines Epimers in einem Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe umfasst die folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe, wobei das Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe aus der Gruppe bestehend aus der folgenden Formel (III) und Formel (IV) ausgewählt ist:
wobei R₁ Wasserstoff oder eine Hydroxy-Schutzgruppe ist; R₂ C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist; und vorzugsweise R₂ eine Cyclopropylgruppe oder eine Isopropylgruppe ist;
(b) Lösen des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe in einer Lösung, die eine Lipase, ein Puffermittel und ein Lösungsmittel enthält, um eine selektive enzymatische Solvolyse durchzuführen unter Erhalt eines Produkts, das ein Epimer eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe und ein Epimer eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe enthält; und
(c) Abtrennen des Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe beziehungsweise des Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe von dem Produkt. Ein Beispiel für das bei dem obigen Schritt (c) verwendete Abtrennverfahren ist Chromatographie.

Die bei dem Verfahren der selektiven enzymatischen Solvolyse der vorliegenden Erfindung verwendete Lipase ist vorzugsweise Alcaligenes sp. Lipase oder Pseudomonas sp. Lipase. Die Lipase kann immobilisiert oder frei sein. Das bei dem Verfahren der selektiven enzymatischen Solvolyse der vorliegenden Erfindung verwendete Pufferreagens ist Wasser, Alkanol oder verdünnte Salzsäurelösung. Vorzugsweise ist das Pufferreagens Ethanol, eine wässrige Phosphatlösung oder Wasser. Das oben gezeigte niedere Alkyl bezieht sich auf ein lineares Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen oder ein verzweigtes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen. Darüber hinaus kann das niedere Alkyl Cycloalkyl oder Nicht-Cycloalkyl sein.

Bei dem Lösungsmittel kann es sich um jede Art von Lösungsmittel handeln. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel ein lineares Alkan mit weniger als 12 Kohlenstoffen, ein verzweigtes Alkan mit weniger als 12 Kohlenstoffen, Alkylester von Alkylcarbonsäure, Dialkylester oder die Kombination davon. Stärker bevorzugt ist das Lösungsmittel Hexan, Diisopropylether, Ethylacetat, Vinylbutyrat, tert-Butylmethylether oder die Kombination davon.

Bei dem Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxyruppe, das bei dem Verfahren der selektiven enzymatischen Solvolyse der vorliegenden Erfindung verwendet wird, handelt es sich vorzugsweise um [5E,7E,22E,24(R,S)]-24-Acetoxy-24-cyclopropyl-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen oder [5Z,7E,22E,24(R,S)]-24-Acetoxy-24-cyclopropyl-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen.

Bei dem Epimer in dem Gemisch von Epimeren, das selektiv enzymatisch solvolysiert werden kann, handelt es sich um [5E,7E,22E,24(R)]-24-Acetoxy-24-cyclopropyl-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen oder [5Z,7E,22E,24(R)]-24-Acetoxy-24-cyclopropyl-3ß-(tert-butyldimethylsiloxy)-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen.

Um das Vitamin D-Analoge mit einer C-24(S)-Hydroxylgruppe zu erhalten, kann das Verfahren der selektiven enzymatischen Solvolyse der vorliegenden Erfindung nach Schritt (c) weiter einen Schritt umfassen: (d1) Hydrolysieren des Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe unter Erhalt wenigstens eines Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24- Hydroxylgruppe. Nach Beendigung der Reaktion von Schritt (d1) kann das Verfahren weiter einen Schritt umfassen: (d2) Isomerisieren des wenigstens einen Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe in Anwesenheit eines Veresterungsmittels, einer organischen Säure und eines nichtprotischen Lösungsmittels bei einer Temperatur zwischen –30°C und 80°C unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe; und (e) Hydrolysieren oder Reduzieren des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe.

Jedoch kann zur Rückführung des Vitamin D-Analogen mit einer C-24(R)-Hydroxylgruppe nach der enzymatisch selektiven Veresterung das Verfahren der vorliegenden Erfindung selektiv weiter einen Schritt umfassen, bei dem mit dem Vitamin D-Analogen mit einer C-24(R)-Hydroxylgruppe eine Mitsunobu-Reaktion durchgeführt wird, um ein Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24(R)-Estergruppe zu erzeugen. Das bei dem obigen Schritt (d2) der selektiven enzymatischen Solvolyse der vorliegenden Erfindung verwendete Veresterungsmittel umfasst vorzugsweise:

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Isomerisierung eines Stereoisomers bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen eines Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe, wobei das Epimer aus der Gruppe bestehend aus der folgenden Formel (Ia) und Formel (IIa) ausgewählt ist:
wobei R₁ Wasserstoff oder eine Hydroxy-Schutzgruppe ist; R₂ C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist;
(b) Isomerisieren des Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe in Anwesenheit eines Veresterungsmittels, einer organischen Säure und eines nichtprotischen Lösungsmittels bei einer Temperatur zwischen –30°C und 80°C unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe; und
(c) Hydrolysieren oder Reduzieren des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe.

Das bei dem obigen Schritt (b) der Epimerisierung eines Stereodiastereomers der vorliegenden Erfindung verwendete Veresterungsmittel umfasst vorzugsweise:

(i) ein Phosphin der folgenden Formel: (R₁₁)₃-P wobei R₁₁ C₁-C₄-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist; und
(ii) eine Diazoverbindung der folgenden Formel:
wobei R₉ und R₁₀ jeder unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist. Vorzugsweise ist die Diazoverbindung der vorliegenden Erfindung Diisopropylazodicarboxylat (DIAD), Diethylazodicarboxylat (DEAD) oder die Kombination davon.

Darüberhinaus unterliegt die organische Säure des Verfahrens der vorliegenden Erfindung keinen Beschränkungen. Vorzugsweise handelt es sich bei der organischen Säure um eine Verbindung, die funktionelle Carboxylgruppen enthält. Stärker bevorzugt ist die organische Säure eine gesättigte aliphatische C₁-C₆-Säure, eine aromatische Säure mit einer Struktur der folgenden Formel:

wobei R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander H, NO₂, OCH₃, CH₃ oder Halogen sind. Am meisten bevorzugt ist die organische Säure Benzoesäure, Chloressigsäure, o-Anissäure, 3-Nitrobenzoesäure, 3,5-Nitrobenzoesäure oder die Kombination davon.

Darüber hinaus unterliegt das nichtprotische Lösungsmittel keinen Beschränkungen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem nichtprotischen Lösungsmittel um Tetrahydrofuran, Toluol, N,N-Dimethylformamid oder die Kombination davon.

Die Hydrolyse bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann unter der Bedingung entweder einer sauren Lösung oder einer basischen Lösung durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Hydrolyse in einer basischen Lösung durchgeführt. Stärker bevorzugt wird die Hydrolyse mit Alkalimetallhydroxid oder Erdalkalihydroxid durchgeführt.

Die Reduktion des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann mit einem beliebigen Reduktionsmittel durchgeführt werden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Reduktionsmittel um Boran oder ein Metallhydrid. Stärker bevorzugt handelt es sich bei dem Reduktionsmittel um NaBH₄, LiAlH₄ oder die Kombination davon.

Darüber hinaus unterliegt die Temperatur der enzymatisch selektiven Veresterung oder der enzymatisch selektiven Solvolyse der vorliegenden Erfindung keinen Beschränkungen. Vorzugsweise liegt die Temperatur zur Durchführung der enzymatisch selektiven Veresterung oder der enzymatisch selektiven Solvolyse der vorliegenden Erfindung in einem Bereich von 10°C bis 60°C. Stärker bevorzugt liegt die Temperatur zur Durchführung der enzymatisch selektiven Veresterung oder der enzymatisch selektiven Solvolyse der vorliegenden Erfindung in einem Bereich von 20°C bis 40°C. Die Reaktionszeit zur Durchführung der enzymatisch selektiven Veresterung oder der enzymatisch selektiven Solvolyse der vorliegenden Erfindung unterliegt keinen Beschränkungen. Vorzugsweise liegt die Reakti onszeit zur Durchführung der enzymatisch selektiven Veresterung oder der enzymatisch selektiven Solvolyse der vorliegenden Erfindung in einem Bereich von 1 bis 100 Stunden. Stärker bevorzugt liegt die Reaktionszeit zur Durchführung der enzymatisch selektiven Veresterung oder der enzymatisch selektiven Solvolyse der vorliegenden Erfindung in einem Bereich von 42 bis 72 Stunden.

In einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann man bei der selektiv enzymatischen Veresterung eines Epimers in einem Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe ein Gemisch mit einem Epimer zu mehr als 80% und dem anderen zu weniger als 20% (d.h. Diastereomer-Verhältnis 80:20) erhalten. Zusätzlich können die Reaktionsparameter das Diastereomer-Verhältnis bestimmen. In einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das Diastereomer-Verhältnis auf mehr als 90:10 eingestellt werden. In einer der stärker bevorzugten Ausführungsformen kann das Diastereomer-Verhältnis auf mehr als 95:5 eingestellt werden.

In einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann man bei der selektiv enzymatischen Solvolyse eines Epimers in einem Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe ein Gemisch mit einem Epimer zu mehr als 80% und dem anderen zu weniger als 20% (d.h. Diastereomer-Verhältnis 80:20) erhalten. Zusätzlich können die Reaktionsparameter das Diastereomer-Verhältnis bestimmen. In einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das Diastereomer-Verhältnis auf mehr als 90:10 eingestellt werden. In einer der stärker bevorzugten Ausführungsformen kann das Diastereomer-Verhältnis auf mehr als 95:5 eingestellt werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann wirksam C-24S-Hydroxylsubstituierte Vitamin D-Analoge aus einem Gemisch der C-24S-Hydroxylsubstituierten Vitamin D-Analogen und C-24R-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen abtrennen oder reinigen. Darüber hinaus können die C-24R-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen zur weiteren Umwandlung von R-Form- und S-Form-C-24-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen rückge führt werden. Somit kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Kosten zur Herstellung erniedrigen, die Menge an Abfallnebenprodukten verringern und die Gesamtausbeute zur Herstellung von C-24R-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen erhöhen.

GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Die Reaktion der vorliegenden Erfindung kann durch HPLC und/oder TLC überwacht oder erfasst werden. In den Beispielen der vorliegenden Erfindung werden Normal-Phasen-Säulen (si-60, 250 × 4mm; 5 μm) und Ethylacetat/Hexan = 1/10 bei der HPLC-Analyse verwendet. Durch Analysieren des Diastereomer-Überschusses bzw. diastereomeren Überschusses (das heißt d.e.) des Produkts, wie C-24R (oder S)-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen durch HPLC kann der Endpunkt der Reaktion bestimmt werden. Wenn d.e. 80% erreicht, kann die Reaktion gequenched werden. Vorzugsweise wird die Reaktion gestoppt, wenn d.e. 95% übersteigt. Das Enzym wird durch traditionelle Filtration (z.B. Zentrifugation oder Vakuumfiltration) nach Durchführung der Reaktion abgetrennt. Das Filtrat wird unter Erhalt eines Rohprodukts aufkonzentriert. Schließlich werden die reinen Isomere (oder die Epimeren) durch Chromatographie gereinigt.

A. Enzymatisches Verestern eines Epimers

Die enzymatische Veresterung wird über den Syntheseweg, wie er in Schema 1 gezeigt ist, erreicht. Wie gezeigt konkurriert die Hydroxylgruppe (-OH) am A-Ring der C-24-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen nicht mit der C-24(R)-Hydroxylgruppe zur gleichen Zeit zur Veresterung. Mit anderen Worten, die C-24(R)-Hydroxylgruppe wird selektiv verestert. Unabhängig davon, ob die Hydroxylgruppe am A-Ring der C-24-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen geschützt ist oder nicht, beeinflusst sie daher nicht die enzymatisch selektive Veresterung der C-24-Hydroxylgruppe. (Vergleiche Beispiel 12 der vor liegenden Erfindung). Somit verläuft die enzymatische Veresterung nur mit der C-24(R)-Hydroxylgruppe im Verfahren der vorliegenden Erfindung.

Schema 1

B. Selektive enzymatische Solvolyse

Vor Durchführung der Solvolyse der C-24-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das Gemisch der Epimeren der C-24-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen verestert, um ein Gemisch der Epimeren von C-24-Acetoxy-substituierten Vitamin D-Analogen zu erhalten. Die Alternative besteht in der Verwendung eines Gemisches von Epimeren von C-24-Acetoxy-substituierten Vitamin D-Analogen direkt als Ausgangsmaterialien zur enzymatisch selektiven Solvolyse. Der Syntheseweg ist in Schema 2 gezeigt. Wie in Schema 2 gezeigt, wird Verbindung I in Verbindung III durch herkömmliche Veresterung überführt. Mit einem beliebigen Veresterungsmittel kann die oben gezeigte herkömmliche Veresterung erreicht werden. In einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Veresterungsmittel für die herkömmliche Veresterung um Essigsäureanhydrid. In ähnlicher Weise wird Verbindung (II) in Verbindung (IV) durch herkömmliche Veresterung überführt.

Schema 2: Selektive enzymatische Solvolyse

C. Epimerisierung

Das R-Form-Epimer und das S-Form-Epimer der C-24-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen können erfolgreich durch Chromatographie getrennt werden, nachdem die enzymatisch selektive Veresterung und die anschließende enzymatische Solvolyse durchgeführt worden sind. Darüber hinaus können die C-24(R)-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen von niedrigem wirtschaftlichem Wert zu einem Gemisch von R-Form-Epimer und dem S-Form-Epimer der C-24-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen durch andere weitere Schritte epimerisiert werden, d.h. Mitsunobu-Reaktion und anschließende Hydrolyse (oder anschließende Reduktion) bei dem alternativen Verfahren der vorliegenden Erfindung. Durch das alternative Verfahren der vorliegenden Erfindung können die C-24(R)-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen rückgeführt werden, um in ein Gemisch von Epimeren (R und S) der C-24-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen zur weiteren Reinigung überführt zu werden. Das oben gezeigte alternative Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch die Kosten und die Menge an Abfallnebenprodukten, die sich aus der Herstellung der C-24(S)-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen ergeben, verringern, und die Ausbeute zur Herstellung des C-24(S)-Hydroxyl-substituierten Vitamin D-Analogen erhöhen. Der Syntheseweg zur Epimerisierung des alternativen Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist in Schema 3 gezeigt.

Schema 3

Viele Beispiele sind zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung verwendet worden. Die unten gezeigten Beispiele sollen nicht als beschränkend für den Umfang der Erfindung angesehen werden. Bei den folgenden Beispielen beziehen sich, sofern es nicht spezifisch angegeben ist, die eingesetzten Prozentsätze auf das Gewicht und die Temperatur ist in Grad Celsius (°C) angegeben.
Beispiel 1: Selektive enzymatische Veresterung
Zu einer gerührten Lösung eines epimeren C-24-Alkohol-Gemisches (56:36 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (I) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl] (10 g, 19,5 mmol) und Vinylacetat (10 ml, 107,5 mmol) in Hexan (10 ml) wird 1,0 g Alcaligenes sp. Lipase zugegeben. Das Gemisch wird 48 Stunden bei 35 ± 5°C gerührt, woraufhin die HPLC-Analyse eine im Wesentlichen vollständige Umsetzung des Epimers C-24(R) zum Acetat zeigt. Der verbleibende nicht-veresterte C-24(S)-Alkohol zeigt > 90 % Diastereomer-Überschuss (gemäß HPLC). Die Lösung wird filtriert und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird auf vorbehandeltem Silicagel mit 6,0 % Ethylacetat in Hexan und anschließend Ethylacetat chromatographiert unter Erhalt von C-24-Acetoxy-Verbindung (IIIa) (5,4 g) und C-24-Alkohol-Verbindung (Ib) (2,3 g).
C-24-Acetoxy-Verbindung (IIIa): NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 2,05(s, 3H, CH₃), 3,80 ~ 3,85 (m, 1H, 3-H), 4,62 ~ 4,70 (m, 2H, 19-H & 24-H), 4,90(s, 1H, 19-H), 5,28 5,39 (m, 1H, 22-H), 5,41 ~ 5,63 (m, 1H, 23-H), 5,82 (d, 1H, J = 11,4 Hz, 6-H), 6,44 (d, 1H, J = 11,4 Hz, 7-H).
C-24-Alkohol-Verbindung (Ib): NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 3,42 ~ 3,44 (br, 1H, 24-H), 3,82 ~ 3,84 (m, 1H, 3-H), 4,62 (s, 1H, 19-H), 4,90 (s, 1H, 19-H), 5,42 5,54 (m, 2H, 22-H & 23-H), 5,83 (d, 1H, J = 11,4 Hz, 6-H), 6,44 (d, 1H, J = 11,4 Hz, 7-H).
Beispiel 2: Selektive enzymatische Veresterung
Die Vorgehensweise von Beispiel 1 wird wiederholt, außer dass 1,0 g Alcaligenes sp. Lipase auf 4 g Eupergit C (Rohm, Deutschland) gemäß einer bekannten, vom Lieferanten empfohlenen Arbeitsweise immobilisiert wird und dass die molaren Mengen der Reagenzien geändert werden. Bei diesem Beispiel sind 0,6 g (1,17 mmol) der Verbindung der Formel (I), 1,0 ml (10,8 mmol) Vinylacetat, 1 ml Hexan und 1 g immobilisiertes Enzym in dem Gemisch enthalten. Das Gemisch wird 6 Stunden bei 35°C gerührt, woraufhin die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 30 % C-24(R) Epimer-Alkohol-Gemisch (Ia), 35 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IIIa) und 35 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (Ib) zeigt.
Beispiel 3: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, verwendet aber 2 ml Diisopropylether, um das in Beispiel 1 verwendete organische Lösungsmittel zu ersetzen. In diesem Beispiel sind 1 g (1,95 mmol) der Verbindung der Formel (I), 2 ml (21,6 mmol) Vinylacetat, 2 ml Diisopropylether und 100 mg Alcaligenes sp. Lipase in dem Gemisch enthalten. Das Gemisch wird 42 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 56 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IIIa) und 35 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (Ib).
Beispiel 4: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, verwendet aber 20 ml (216 mmol) Vinylacetat, um sowohl das Acetylierungsmittel als auch das organische Lösungsmittel, die in Beispiel 1 verwendet werden, zu ersetzen. In diesem Beispiel sind 1 g (1,95 mmol) der Verbindung der Formel (I), 20 ml (216 mmol) Vinylacetat, 100 mg Alcaligenes sp. Lipase in dem Gemisch enthalten. Das Gemisch wird 42 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 56 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IIIa) und 35 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (Ib).
Beispiel 5: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, verwendet aber 2 ml tert-Butylmethylether, um das in Beispiel 1 verwendete organische Lösungsmittel zu ersetzen. In diesem Beispiel sind 1 g (1,95 mmol) der Verbindung der Formel (I), 2 ml (21,6 mmol) Vinylacetat, 2 ml tert-Butylmethylether und 100 mg Alcaligenes sp. Lipase in dem Gemisch enthalten. Das Gemisch wird 42 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 56 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IIIa) und 35 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (Ib).
Beispiel 6: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, verwendet aber 15 ml Tetrachlorkohlenstoff, um das in Beispiel 1 verwendete organische Lösungsmittel zu ersetzen. In diesem Beispiel sind 1 g (1,95 mmol) der Verbindung der Formel (I), 4,4 ml (47,5 mmol) Vinylacetat, 15 ml Tetrachlorkohlenstoff und 100 mg Alcaligenes sp. Lipase in dem Gemisch enthalten. Das Gemisch wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 54 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IIIa) und 34 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (Ib).
Beispiel 7: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, außer dass 100 mg Alcaligenes sp. Lipase zu 100 mg Pseudomonas sp. Lipase umgeändert wird und das organische Lösungsmittel zu Tetrachlorkohlenstoff umgeändert wird. In diesem Beispiel sind in dem Gemisch 1 g (1,95 mmol) der Verbindung der Formel (I), 2 ml (21,6 mmol) Vinylacetat, 2 ml Tetrachlorkohlenstoff und 100 mg Pseudomonas sp. Lipase enthalten. Das Gemisch wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 54 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IIIa) und 34 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (Ib).
Beispiel 8: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, aber in diesem Beispiel enthält das Gemisch 5 g (9,7 mmol) der Verbindung der Formel (I), 10 ml (0,109 mol) Vinylbutyrat, 87 ml Hexan und 500 mg Pseudomonas sp. Lipase. Das Gemisch wird 50 Stunden bei 35°C gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 54 % C-24(R)-Butanoat-Verbindung und 34 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (Ib).
Beispiel 9: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, aber in diesem Beispiel enthält das Gemisch 5 g (9,7 mmol) der Verbindung der Formel (I), 2 ml (21,6 mmol) Vinylacetat, 10 ml Ethylacetat (EA) und 500 mg Pseudomonas sp. Lipase. Das Gemisch wird 8 Stunden bei 35°C gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 30 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IIIa), 34 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (Ib) und 26 % nicht umgesetzte C-24(R)-Alkohol-Verbindung (Ia).
Beispiel 10: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, aber in diesem Beispiel enthält das Gemisch 5 g (9,7 mmol) der Verbindung der Formel (I), 10 ml (108 mmol) Vinylacetat, 10 ml tert-Butylmethylether und 500 mg Pseudomonas sp. Lipase. Das Gemisch wird 80 Stunden bei 35°C gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 99 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IIIa).
Beispiel 11: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, aber in diesem Beispiel enthält das Gemisch 1 g (1,95 mmol) epimeres C-24-Alkohol-Gemisch bzw. C-24-Epimer-Alkohol-Gemisch (56:36 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (II) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl], 2 ml (21,6 mmol) Vinylacetat, 2 ml Hexan und 100 mg Pseudomonas sp. Lipase. Das Gemisch wird 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, woraufhin die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 54 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IIIa) und 34 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (IIb) zeigt.
Beispiel 12: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, aber in diesem Beispiel enthält das Gemisch 0,1 g (0,195 mmol) epimeres C-24-Alkohol-Gemisch (56:36 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (II) [wobei R₁ = H und R₂ = Cyclopropyl], 2 ml (21,6 mmol) Vinylacetat, 2 ml Ethylacetat und 1 g Pseudomonas sp. Lipase. Das Gemisch wird 80 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 56 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IVa) und 35 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (IIb).
Beispiel 13: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, aber in diesem Beispiel enthält das Gemisch 1 g (1,95 mmol) epimeres C-24-Alkohol-Gemisch (56:36 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (II) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl], 2 ml (21,6 mmol) Vinylacetat, 2 ml tert-Methylbutylether und 100 mg Pseudomonas sp. Lipase. Das Gemisch wird 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, woraufhin die HPLC-Analyse zeigt, dass die C-24(R)-Alkohol-Verbindung größtenteils in die C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IVa) umgewandelt wird. Der Diastereomer-Überschuss-Wert [(S-R/S + R) × 100%] der verbleibenden nicht veresterten C-24(S)-Alkohol-Verbindung (IIb) ist > 80 %, wobei „S" C-24(S)-Alkohol-Verbindung (IIb) bedeutet und „R" C-24(R)-Alkohol-Verbindung (IIa) bedeutet. Die Reaktionsprodukte werden durch Silicagel-Säulenchromatographie getrennt, wobei 6,0 % EA in Hexan als Elutionslösung verwendet werden. Die vereinigten Eluate werden aufkonzentriert unter Erhalt von 0,54 g C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IVa) und 0,23 g C-24(S)-Alkohol-Verbindung (IIb).
Beispiel 14: Selektive enzymatische Veresterung
Man wiederholt die Vorgehensweise von Beispiel 1, aber in diesem Beispiel enthält das Gemisch 0,1 g (0,195 mmol) epimeres C-24-Alkohol-Gemisch (55:32 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (II) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Isopropyl], 2 ml (21,6 mmol) Vinylacetat, 2 ml Hexan und 100 mg Pseudomonas sp. Lipase. Das Gemisch wird 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 52 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IVa) und 30 % C-24(S)-Alkohol-Verbindung (IIb).
Beispiel 15: Selektive enzymatische Solvolyse
Essigsäureanhydrid (0,4 ml, 4,2 mmol) wird zu einer Lösung von 1 g (19,7 mmol) epimeres C-24-Alkohol-Gemisch (56:36 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (I) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl] in 8 ml Pyridin zugefügt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann wird es mit 10 ml Hexan extrahiert und die organische Phase wird verdampft. 0,8 g epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch der Formel (III) wird erhalten.
Zu einem Glasfläschchen enthaltend 100 mg (0,23 mmol) epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch (R:S =56:36 Diastereomer-Verhältnis) werden 0,2 ml Ethanol, 2 ml Hexan und 500 mg Pseudomonas sp. Lipase zugegeben. Das Gemisch wird 180 Stunden bei 35°C gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 50 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IVa) und 34 % C-24(S)-Acetoxy-Verbindung (IIIb).
Beispiel 16: Selektive enzymatische Solvolyse
Ein Gemisch von 100 mg (0,23 mmol) epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch (R:S = 56:36 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (III) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl], 5 ml Wasser, 1,5 ml Hexan und 250 mg immobilisiertem Enzym (Pseudomonas sp. Lipase) wird zugegeben. Das Gemisch wird 500 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 50 % C-24(R)-Alkohol-Verbindung (Ia) und 34 % C-24(S)-Acetoxy-Verbindung (IIIb).
Beispiel 17: Selektive enzymatische Solvolyse
Zu einem Rundbodenkolben enthaltend 1 g (1,95 mmol) epimeres C-24-Alkohol-Gemisch (56:36 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (I) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl] gelöst in 10 ml Pyridin werden DMAP (4-Dimethylaminopyridin, 0,05 g, 0,39 mmol) und Essigsäureanhydrid (0,4 ml, 4,2 mmol) zugegeben, während die Temperatur unter 20°C gehalten wird. Das Gemisch wird dann mit 10 ml Hexan extrahiert und die organische Phase verdampft unter Erhalt von 0,8 g epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch der Formel (III).
Zu einem Glasfläschchen enthaltend 100 mg (0,23 mmol) epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch (R:S = 56:36 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (III) werden 1,2 ml Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 2 ml Aceton oder 2 ml THF, und 200 mg Pseudomonas sp. Lipase zugegeben. Das Gemisch wird 78 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 56 % C-24(R)-Acetoxy-Verbindung (IVa) und 34 % C-24(S)-Acetoxy-Verbindung (IIIb).
Beispiel 18: Selektive enzymatische Solvolyse
Zu einem Rundbodenkolben enthaltend 1 g (1,0 mmol) epimeres C-24-Alkohol-Gemisch (54:32 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (I) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Isopropyl] gelöst in 8 ml Pyridin werden Essigsäureanhydrid (0,4 ml, 4,2 mmol) zugegeben, während das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur gehalten wird. Das Gemisch wird dann mit 10 ml Hexan extra hiert und die organische Phase wird verdampft zu 0,8 g epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch der Formel (III).
Zu einem Glasfläschchen enthaltend 100 mg (0,23 mmol) epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch (R:S = 56:36 Diastereomer-Verhältnis) der Formel (III) werden 0,2 ml Ethanol, 2 ml Hexan und 500 mg Pseudomonas sp. Lipase zugegeben. Das Gemisch wird 180 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin zeigt die HPLC-Analyse die Anwesenheit von 50 % epimeres C-24(R)-Alkohol-Gemisch (Ia) und 34 % C-24(S)-Acetoxy-Verbindung (IIIb).
Beispiel 19 Epimerisierung von [5E,7E,22E,24(R)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol
Zu einem 20 ml Rundbodenkolben enthaltend eine Lösung von 1,10 g (2,15 mmol) epimeres C-24(R)-Alkohol-Gemisch (Ia) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl, d.e. > 92 %], Triphenylphosphin (1,13 g, 4,31 mmol) und Chloressigsäure (0,41 g, 4,33 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (10 ml) wird eine Lösung von Diisopropylazodicarboxylat (0,87 g, 4,30 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (3 ml) zugegeben. Das Gemisch wird auf –10°C abgekühlt, 1 Stunde gerührt und dann mit Hexan (20 ml × 3) extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und unter verringertem Druck verdampft, um 1,5 g Rohprodukt enthaltend epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch der Formel (III) zu ergeben, was durch NMR bestätigt wird.
Der Rückstand wird in einer Lösung von Ethylacetat (5 ml) und Methanol (10 ml) gelöst. Wasser (2 ml) und Kaliumcarbonat (0,2 g) werden dann zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und die organische Schicht wird unter verringertem Druck verdampft, um ein Rohprodukt (1,0 g) enthaltend etwa 71 % epimeres C-24(R,S)-Alkohol-Gemisch der Formel (I) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl], d.e. = –1.41 %, zu ergeben.
Beispiel 20 Epimerisierung
Zu einem 20 ml Rundbodenkolben enthaltend eine Lösung von 1,0 g (1,95 mmol) epimeres C-24(R)-Alkohol-Gemisch (Ia) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl, d.e. > 92 %], Triphenylphosphin (1,03 g, 3,92 mmol) und o-Anissäure (0,60 g, 3,92 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (5 ml) wird eine Lösung von Diisopropylazodicarboxylat (0,79 g, 3,92 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (3 ml) zugegeben. Das Gemisch wird auf –10°C abgekühlt, 1 Stunde gerührt und dann mit Hexan (20 ml × 3) extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und unter verringertem Druck verdampft, um 1,5 g Rohprodukt enthaltend epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch der Formel (III) zu ergeben.
Der Rückstand wird in Tetrahydrofuran (5 ml) und Methanol (10 ml) gelöst. Wasser (2 ml) und Kaliumhydroxid (0,2 g) werden zugegeben und das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und die organische Schicht wird unter verringertem Druck verdampft, um ein Rohprodukt (1,0 g) enthaltend etwa 70 % epimeres C-24(R,S)-Alkohol-Gemisch der Formel (I) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl], d.e. = –26 %, zu ergeben.
Beispiel 21 Epimerisierung
Zu einem 20 ml Rundbodenkolben enthaltend eine Lösung von 1,0 g (1,95 mmol) epimeres C-24(R)-Alkohol-Gemisch (Ia) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl] mit d.e. > 92 %, Triphenylphosphin (1,03 g, 3,92 mmol) und 0,48 g (3,90 mmol) Benzoesäure in wasserfreiem Tetrahydrofuran (5 ml) wird eine Lösung von Diisopropylazodicarboxylat (0,79 g, 3,92 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (3 ml) zugefügt. Das Gemisch wird auf –10°C abgekühlt, 1 Stunde gerührt und dann mit Hexan (20 ml × 3) extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und unter verringertem Druck verdampft, um 1,35 g Rohprodukt enthaltend epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch der Formel (III) zu ergeben.
Der Rückstand wird in Ethylacetat (5 ml) und Methanol (10 ml) gelöst. Wasser (2 ml) und Kaliumhydroxid (0,2 g) werden zugefügt und das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und die organische Schicht wird unter verringertem Druck verdampft, um ein Rohprodukt (1,1 g) enthaltend etwa 87,6 % epimeres C-24(R,S)-Alkohol-Gemisch der Formel (I) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl], d.e. = –24,9 %, zu ergeben.
Beispiel 22 Epimerisierung
Zu einem 20 ml Rundbodenkolben enthaltend eine Lösung von 1,0 g (1,95 mmol) epimeres C-24(R)-Alkohol-Gemisch (Ia) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl] mit d.e. > 92 %, Triphenylphosphin (1,03 g, 3,92 mmol) und 0,65 g (3,90 mmol) 3-Nitrobenzoesäure in wasserfreiem Tetrahydrofuran (5 ml) wird eine Lösung von Diisopropylazodicarboxylat (0,79 g, 3,92 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (3 ml) zugefügt. Das Gemisch wird auf –10°C abgekühlt, 1 Stunde gerührt und dann mit Hexan (20 ml × 3) extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und unter verringertem Druck verdampft, um 1,5 g Rohprodukt enthaltend epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch der Formel (III) zu ergeben.
Der Rückstand wird in wasserfreiem Tetrahydrofuran (5 ml) gelöst und 0,5 ml LiAlH₄ in THF (Konzentration: 1 M) wird zugefügt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. 10 ml 5 %ige KOH-Lösung werden dann zum Gemisch zugegeben, um die Reaktion zu quenchen. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und die organische Schicht wird unter verringertem Druck verdampft, um ein Rohprodukt (0,8 g) enthaltend etwa 99 % epimeres C-24(R,S)-Alkohol-Gemisch der Formel (I) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R, = Cyclopropyl], d.e. = –16,77 %, zu ergeben.
Beispiel 23 Epimerisierung
Zu einem 20 ml Rundbodenkolben enthaltend eine Lösung von 1,10 g (2,15 mmol) epimeres C-24(R)-Alkohol-Gemisch (IIa) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl] mit d.e. > 92 % werden Triphenylphosphin (1,13 g, 4,31 mmol), eine Lösung von 0,41 g ( 4,33 mmol) Chloressigsäure in wasserfreiem Tetrahydrofuran (10 ml) und eine Lösung von Diisopropylazodicarboxylat (0,87 g, 4,30 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (3 ml) zugegeben. Das Gemisch wird auf –10°C abgekühlt, eine l Stunde gerührt und dann mit Hexan (20 ml × 3) extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und unter verringertem Druck verdampft, um 1,5 g Rohprodukt enthaltend epimeres C-24(R,S)-Acetoxy-Gemisch der Formel (IV) zu ergeben.
Der Rückstand wird in 5 ml Ethylacetat, 10 ml Methanol und 2 ml Wasser unter Bildung eines Gemisches gelöst. 0,2 g K₂CO₃ wird dann zum Gemisch zugegeben und das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, um eine Hydrolysereaktion durchzuführen. Das organische Lösungsmittel wird dann unter verringertem Druck verdampft. Der Rückstand wird mit Ethylacetat (5 ml) und Wasser (5 ml) extrahiert. Die Extrakte werden getrennt und die organische Schicht wird unter verringertem Druck verdampft, um ein Rohprodukt (0,85 g) enthaltend etwa 65 % epimeres C-24(R,S)-Alkohol-Gemisch der Formel (I) ) [wobei R₁ = tert-Butyldimethylsilyl und R₂ = Cyclopropyl], d.e. = –1,0 %, zu ergeben.
Beispiele 24 bis 41
Die Reaktionsvorgehensweisen der folgenden Beispiele 24 bis 41 sind die gleichen wie die in Beispiel 19 beschriebenen Verfahren. Die Reaktionsbedingungen und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

1. Verbindung Ia D.E. (Diastereomer-Überschuss): 92%
2. Verbindung IIa D.E.: 92%
3. THF: Tetrahydrofuran, Tol: Toluol, DMF: N,N-Dimethylformamid
4. D.E. (%) : [(Ia – Ib)/(Ia + Ib)] × 100%
5. D.E. (%) : [(IIa – IIb)/(IIa + IIb)] × 100%

Aus der vorhergehenden Beschreibung kann der Fachmann leicht die wesentlichen Eigenschaften dieser Erfindung ermitteln und, ohne von deren Umfang ab zuweichen, verschiedene Änderungen und Modifizierungen der Erfindung durchführen, um sie verschiedenen Verwendungen und Bedingungen anzupassen. Somit liegen andere Ausführungsformen ebenfalls im Bereich der Ansprüche.

Claims

Verfahren zur selektiv enzymatischen Veresterung eines Epimers in einem Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe, wobei die Epimeren des Gemisches aus der Gruppe bestehend aus der folgenden Formel (I) und Formel (II) ausgewählt sind:
wobei R₁ Wasserstoff oder eine Hydroxy-Schutzgruppe ist; R₂ C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist; (b) Lösen des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe in einem Veresterungsmittel unter Bildung einer Mischungslösung oder Lösen des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe und des Veresterungsmittels in einem organischen Lösungsmittel unter Bildung einer Mischungslösung; und (c) In-Berührung-Bringen der Mischungslösung mit einer Lipase, um eine selektive enzymatische Veresterung durchzuführen; wobei es sich bei dem organischen Lösungsmittel um ein lineares oder verzweigtes Alkan mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, einen Alkylester einer Alkylcarbonsäure, einen Dialkylether oder die Kombination davon handelt; und es sich bei dem Veresterungsmittel um Acylhalogenide, Säureanhydride, Vinylester von niederen Alkylcarbonsäuren mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen oder die Kombination davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lipase Alcaligenes sp. Lipase oder Pseudomonas sp. Lipase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe [5E,7E,22E,24(R,S)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol oder [5Z,7E,22E,24(R,S)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Epimer in dem Gemisch von Epimeren, das selektiv enzymatisch verestert werden kann, [5E,7E,22E,24(R)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol oder [5Z,7E,22E,24(R)]-24-Cyclopropyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-24-ol ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Veresterungsmittel Acylchlorid, Essigsäureanhydrid, Vinylacetat, Vinylbutyrat oder die Kombination davon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend einen Schritt: (d) Verwenden einer Chromatographie, um das veresterte Epimer aus dem Gemisch von Epimeren zu trennen.
Verfahren nach Anspruch 6, weiter umfassend einen Schritt: (e) Hydrolysieren des veresterten, aus der Chromatographie isolierten Epimers unter Erhalt wenigstens eines Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe.
Verfahren nach Anspruch 7, weiter umfassend einen Schritt: (f) Isomerisieren des wenigstens einen Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe in Anwesenheit eines Veresterungsmittels, einer organischen Säure und eines nichtprotischen Lösungsmittels bei einer Temperatur zwischen –30°C und 80°C unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe; und (g) Hydrolysieren oder Reduzieren des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Veresterungsmittel umfasst: (i) ein Phosphin der folgenden Formel: (R)₃-P wobei R C₁-C₄-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist; und (ii) eine Diazoverbindung der folgenden Formel:
wobei R₉ und Rio jeder unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist.
Verfahren zur selektiv enzymatischen Solvolyse eines Epimers in einem Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe, wobei das Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe aus der Gruppe bestehend aus der folgenden Formel (III) und Formel (IV) ausgewählt ist:
wobei R₁ Wasserstoff oder eine Hydroxy-Schutzgruppe ist; R₂ C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist; (b) Lösen des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe in einer Lösung enthaltend eine Lipase, ein Puffermittel und ein Lösungsmittel, um eine selektive enzymatische Solvolyse durchzuführen unter Erhalt eines Produkts enthaltend ein Epimer eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe und ein Epimer eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe; und (c) Trennen des Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe beziehungsweise des Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe von dem Produkt; wobei die Lipase Alcaligenes sp. Lipase oder Pseudomonas sp. Lipase ist; und das Puffermittel Wasser, Alkanol, verdünnte Salzsäurelösung oder die Kombination davon ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Gemisch von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe [5E,7E,22E,24(R,S)]-24-Acetoxy-24-cyclopropyl-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen oder [5Z,7E,22E,24(R,S)]-24-Acetoxy-24-cyclopropyl-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Epimer in dem Gemisch von Epimeren, das selektiv enzymatisch solvolysiert werden kann, [5E,7E,22E,24(R)]-24-Acetoxy-24-cyclopropyl-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen oder [5Z,7E,22E,24(R)]-24-Acetoxy-24-cyclopropyl-3β-(tert-butyldimethylsiloxy)-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen ist.
Verfahren nach Anspruch 10, weiter umfassend einen Schritt: (d 1) Hydrolysieren des Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Acetoxygruppe unter Erhalt wenigstens eines Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe.
Verfahren nach Anspruch 10, weiter umfassend einen Schritt: (d2) Isomerisieren des wenigstens einen Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe in Anwesenheit eines Veresterungsmittels, einer organischen Säure und eines nichtprotischen Lösungsmittels bei einer Temperatur zwischen –30°C und 80°C unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe; und (e) Hydrolysieren oder Reduzieren des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Veresterungsmittel umfasst: (i) ein Phosphin der folgenden Formel: (R)₃-P wobei R C₁-C₄-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist; und (ii) eine Diazoverbindung der folgenden Formel:
wobei R₉ und R₁₀ jeder unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das in Schritt (c) verwendete Trennverfahren Chromatographie ist.
Verfahren zur Isomerisierung eines Stereoisomers umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe, wobei das Epimer aus der Gruppe bestehend aus der folgenden Formel (Ia) und Formel (IIa) ausgewählt ist:
wobei R₁ Wasserstoff oder eine Hydroxy-Schutzgruppe ist; R₂ C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist; (b) Isomerisieren des Epimers eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe in Anwesenheit eines Veresterungsmittels, einer organischen Säure und eines nichtprotischen Lösungsmittels bei einer Temperatur zwischen –30°C und 80°C unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe; und (c) Hydrolysieren oder Reduzieren des Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Estergruppe unter Erhalt eines Gemisches von Epimeren eines Vitamin D-Analogen mit einer C-24-Hydroxylgruppe.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Veresterungsmittel umfasst: (i) ein Phosphin der folgenden Formel: (R₁₁)₃-P wobei R₁₁ C₁-C₄-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist; und (ii) eine Diazoverbindung der folgenden Formel:
wobei R₉ und R₁₀ jeder unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl oder C₆-C₁₂-Aryl ist.