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Die
vorliegende Erfindung betrifft Peptide mit einer modulatorischen
Wirkung auf die proteasomale Aktivität in vitro und in vivo. Die
Peptide weisen ein Aminosäuresequenzmotiv
aus einem humanen Protein, vorzugsweise der humanen Telomerase Reversen
Transkriptase auf. Ferner ist die Erfindung auf Zusammensetzungen
gerichtet, welche die erfindungsgemäßen Peptide enthalten, auf
Polynukleotide und Vektoren, welche für die erfindungsgemäßen Peptide
kodieren, sowie auf Zellen, welche die erfindungsgemäßen Peptide,
Polynukleotide oder Vektoren enthalten. Schließlich betrifft die Erfindung
die Verwendung der Peptide, Polynukleotide und Vektoren sowie Verfahren
zur Modulation der proteasomalen Aktivität in vitro und in vivo.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Ubiquitin/Proteasomen-abhängige
Proteolyse dient der Regulation des Protein-Turnovers und ist damit
an vielen lebenswichtigen Prozessen wie Transkription, Zellzyklus,
Signaltransduktion, Differenzierung und Apoptose beteiligt (Hershko
A. and Ciechanover A. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67:425–79). Insbesondere Regulatoren
der Genexpression wie der NF-κB-Inhibitor
IκBα (Whiteside
S. T. Semin. Cancer Biol. 1997 Apr; 8(2):75–82), der Hypoxie-induzierende
Faktor-1α (HIF-1α)(Salceda
S. J. Biol. Chem. 1997 Sep 5; 272(36): 22642–7), die Protoonkogene c-Fos
(He H. J. Biol. Chem. 1998), c-Jun und c-Mos sowie verschiedene
Cycline (Pahl H. L. Curr. Opin. Cell. Biol. 1996 Jun; 8(3):340–7) sind
dem proteasomalen Abbau unterworfen. Die NF-κB-abhängige Genexpression spielt
eine wichtige Rolle in einer Reihe biologischer Prozesse mit medizinischer
Relevanz, wie z.B. Immun-, Entzündungs-
und anti-apoptotische Antworten (Baeuerle PA Cell 1996 Oct 4; 87(1):13–20).
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Die
Ubiquitin/Proteasomen-abhängige
Proteolyse trägt
ferner zur Degradation missgefalteter Proteine bei (Finley D. Cell.
1987 Mar 27; 48(6):1035–46),
die als DRiPs (defective ribosomal products) bezeichnet werden und
die Hauptquelle proteasomaler Substrate darstellen (Schubert U.
Nature. 2000 Apr 13; 404(6779):770–4). In Vertebraten spielt
das Proteasom eine entscheidende Rolle bei der Generierung MHC Klasse
I-restringierter Peptide (Goldberg A. L. Mol. Immunol. 2002 Oct;
39(3–4):147–64). Es
prozessiert neben Proteinen cytoplasmatischer Pathogene auch zelleigene
Proteine einschließlich
der Tumorantigene. Daher ist das Ubiquitin/Proteasomensystem bei
einer Vielzahl an pathologischen Prozessen wie Entzündung, Autoimmunität, neurodegenerativen
Erkrankungen und malignen Entartungen von entscheidender Bedeutung (Ciechanover
A. and Schwartz A. L. Hepatology. 2002 Jan; 35(1):3–6).
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Das
26S Proteasom besteht aus einem zentralen, proteolytisch aktiven
20S Kernkomplex und zwei peripheren 19S Regulatoren (siehe 1)
(Peters J. M. J Mol Biol. 1993 Dec 20;234(4): 932–7). Es
wird davon ausgegangen, dass der 19S Regulator Proteinsubstrate
erkennt, die durch die kovalente Anheftung von Ubiquitinketten gekennzeichnet
sind (Deveraux Q. J. Biol. Chem. 1994 Mar 11; 269(10):7059–61), und
ihrer Deubiquitinierung, Entfaltung und Translokation in den Kernkomplex
dient (Laney J. D. and Hochstrasser M. Cell. 1999 May 14; 97(4):427–30).
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Der
proteasomale 20S Kernkomplex mit einem Molekulargewicht von 700
kDa weist eine zylinderförmige
Struktur mit drei inneren Kammern auf (Lowe J. Science. 1995 Apr
28; 268(5210):533–9).
Der Komplex besteht aus zwei identischen, heptameren äußeren α-Ringen (α1-α7) und zwei
identischen, heptameren inneren β-Ringen
(β1-β7) (Groll
M. Nature. 1997 Apr 3; 386(6624):463–71). Die beiden α-Ringe bilden
das sogenannte gate und kontrollieren den Zugang zu den inneren
Kavitäten
(Groll M. Nat Struct Biol. 2000 Nov; 7(11):1062–7).
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Die
proteolytische Aktivität
des Proteasoms wird durch die drei Untereinheiten β1, β2 und ß5 ausgeübt, deren
N-terminale Threonin-Hydrolasen in den Innenraum des Zylinders ragen
(Baumeister W. Cell. 1998 Feb 6; 92(3):367–80). Mit Hilfe kurzer fluorogener
Peptidsubstrate wurden den katalytischen Untereinheiten bestimmte
Präferenzen
der peptidspaltenden Hydrolyse zugeschrieben. Sie üben die
Proteolyse mit Caspase-, Trypsin- bzw. Chymotrypsin-ähnlicher
Aktivität
aus und spalten damit bevorzugt nach sauren (β1), basischen (β2) bzw. hydrophoben
(ß5) Resten.
Der Abbau längerer,
physiologischer Peptidsubstrate ist durch eine stärkere Komplexität charakterisiert
und lässt
sich nicht immer eindeutig und spezifisch den verschiedenen Untereinheiten
zuordnen (Kisselev A. F. Biol. Chem. 1999 Feb 5; 274(6):3363–71). Generell
lässt sich
jedoch festhalten, dass das Proteasom üblicherweise durch den bevorzugten
Schnitt nach hydrophoben und basischen Resten solche Peptide generiert,
deren C-Termini besonders effizient mit MHC Klasse I-Molekülen interagieren (Boes
B. J. Exp. Med. 1994 Mar 1; 179(3):901–9; Niedermann G. Immunity.
1995 Mar; 2(3):289–99;
Ossendorp F. Immunity. 1996 Aug; 5(2):115–24). Die Effizienz dieser
Spaltreaktion hängt
nicht nur von der C-terminalen Aminosäure selbst, sondern auch von
der umgebenden Sequenz sowohl innerhalb des Epitops (Kraft R. J. Protein
Chem. 1998 Aug; 17(6):547–8;
Shimbara N. J. Biol. Chem. 1998 Sep 4; 273(36):23062–71) als
auch Epitop-flankierend ab (Beekman N. J. J. Immunol. 2000 Feb 15;
164(4):1898–905.;
Theobald M. J. Exp. Med. 1998 Sep 21; 188(6):1017–28). So
kann z.B. die Spaltung durch kleine Aminosäuren wie Glycin oder Alanin C-terminal
unterstützt
werden (Nussbaum A. K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998 Oct 13;
95(21):12504–9).
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Unter
dem Einfluss von Interferon-γ (IFNγ), eines
im Zuge einer Immunreaktion sezerierten Cytokins, wird die Expression
einiger Komponenten des Antigen-präsentierenden Systems induziert.
Hierzu zählen
auch die proteasomalen Immunountereinheiten iβ1, iβ2 und iβ5. Sie ersetzen bei der de novo
Synthese von Proteasomen die katalytischen β-Untereinheiten und führen zur
Bildung sogenannter Immunoproteasomen (Frentzel S. J. Mol. Biol.
1994 Mar 4; 236(4):975–81).
Die Caspase-ähnliche
Aktivität
scheint in Immunoroteasomen im Vergleich zu konstitutiven Proteasomen
durch den β1 → iß1-Austausch
reduziert zu sein (Gaczynska M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994
Sep 27; 91(20):9213–7;
Kuckelkorn U. Eur. J. Immunol. 1995 Sep; 25(9):2605–11). Die
Auswirkungen der beiden anderen Immunountereinheiten auf die Spaltspezifität lassen sich
insbesondere bei längeren
Peptidsubstraten nicht eindeutig definieren. Generell zeichnen sich
Immunoroteasomen durch eine veränderte
Schnittstellenpräferenz
aus und verbessern in einigen Fällen
die Generierung und Präsentation
immundominanter Epitope (Schwarz K. J. Immunol. 2000 Ju1 15; 165(2):768–78).
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Zur
verbesserten Öffnung
des gates und damit zur „Aktivierung" des Proteasoms trägt eine
weitere IFNγ-induzierbare
Komponente des Proteasomensystems bei: Der Proteasomenaktivator
PA28 (Dubiel W. J. Biol. Chem. 1992 Nov 5; 267(31):22369–77) ist
ein ebenfalls heptamerer Komplex mit α3β4-Stöchiometrie (Knowlton
J. R. Nature. 1997 Dec 11; 390(6660):639–43), der an die α-Ringe des
20S Proteasoms binden kann. In vitro stimuliert PA28 die 20S proteasomale
Hydrolyse von kurzen fluorogenen Peptidsubstraten, indem es vermutlich
den Substratzugang oder den Produktaustritt erleichtert (Stohwasser
R. Eur. J. Biochem. 2000 Oct; 267(20):6221–30). Die Bindung von PA28
scheint Konformationsänderungen
in den α-Untereinheiten des
20S Proteasoms zu induzieren. Neben diesen gating Mechanismen beeinflusst
PA28 auch den Zugang zu den aktiven Zentren von 205.
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Zu
den bislang bekannten Inhibitoren des Proteasoms zählen synthetische
Peptidderivate wie Boronate (z.B. PS-341), Epoxide, Aldehyde (z.B.
MG132), Vinylsulfone, zyklische Peptide und Lactone. Die beiden natürlichen
Produkte Lactacystin (ein Lacton) und Epoxomicin (ein Epoxyketon)
sind Stoffwechselprodukte aus Pilzen.
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Aufgrund
seiner vielfältigen
zellulären
Funktionen ist das Proteasom auch ein wichtiger Faktor bei verschiedenen
Krankheiten. Hierzu zählen
unter anderem neben malignen (insbesondere hämatoonkologischen), neurodegenerativen
und kardiovaskulären
Erkrankungen auch Autoimmunkrankheiten, Entzündungsprozesse und virale Erkrankungen.
Die Beeinflussung der proteasomalen Aktivität, zum Beispiel durch Inhibition
des Proteasoms, kann sich begünstigend
auf den Krankheitsverlauf auswirken. So sind z.B. Krebszellen sind
in der Regel anfälliger
für die
Apoptose-induzierenden Wirkungen von Proteasomeninhibitoren als
normale Zellen.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht im Bereitstellen von
Peptiden, die in der Lage sind, die Aktivität des Proteasoms in vitro und
in vivo zu beeinflussen.
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Diese
und andere Aufgaben, die sich aus der folgenden Beschreibung ergeben,
werden durch den Gegenstand des Hauptanspruchs und der weiteren
unabhängigen
Patentansprüche
gelöst.
Vorteilhafte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
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Die
Erfinder konnten zeigen, dass verschiedene Peptide eine modulatorische
Wirkung auf die proteasomale Aktivität in vitro und in vivo ausüben. Diese
Peptide umfassen ein Aminosäuresequenzmotiv,
das aus einem humanen Protein stammt.
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Die
Erfindung betrifft somit ein Peptid, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass es mindestens ein Aminosäuresequenzmotiv aus einem humanen
Protein und/oder mindestens ein Fragment und/oder mindestens ein
Derivat dieses Sequenzmotivs umfasst und dass es eine modulatorische
Wirkung auf die proteasomale Aktivität in vitro und/oder in vivo
aufweist.
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Unter
einem Peptid wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung sowohl ein
Oligopeptid verstanden, das aus bis zu etwa 10 Aminosäuren besteht,
als auch ein Polypeptid mit einer Länge von etwa 10 bis zu etwa 100
Aminosäuren.
Auch ein sog. Makropeptid von mehr als etwa 100 Aminosäuren kann
unter die Definition des Peptids im Rahmen der vorliegenden Erfindung
fallen.
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Bevorzugt
liegt die Länge
der erfindungsgemäßen Peptide
in einem Bereich von etwa 5 bis etwa 100 Aminosäuren, ebenfalls bevorzugt von
etwa 8 bis etwa 50 Aminosäuren,
noch mehr bevorzugt von etwa 15 bis etwa 40 Aminosäuren, besonders
bevorzugt von etwa 25 bis etwa 35 Aminosäuren und am meisten bevorzugt bei
etwa 30 Aminosäuren.
Die erfindungsgemäßen Peptide
können
sowohl natürlichen
als auch synthetischen Ursprungs sein.
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Allerdings
umfasst ein erfindungsgemäßes Peptid
nicht die gesamte Aminosäuresequenz
eines humanen Proteins. Bevorzugt umfasst ein erfindungsgemäßes Peptid
nicht mehr als 90 % der gesamten Aminosäuresequenz eines humanen Proteins,
noch mehr bevorzugt nicht mehr als 80 %, noch mehr bevorzugt nicht mehr
als 70 % und am meisten bevorzugt nicht mehr als 60 %, 50 %, 40
%, 30 %, 20 %, 10 %, 8 %, 6 %, 4 % oder 2 % der gesamten Aminosäuresequenz
eines humanen Proteins.
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Unter
einem Fragment eines Peptids wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung
ein N- und/oder C-terminal
verkürzter
Teil aus der Aminosäuresequenz
dieses Peptids verstanden. Fragmente eines Peptids umfassen bevorzugt
noch mindestens 40 % der Aminosäuresequenz
des ursprünglichen
Peptids, noch mehr bevorzugt mindestens 50 %, noch mehr bevorzugt
mindestens 60 % und am meisten bevorzugt mindestens 70 %, 80 %,
90 %, 92 %, 94 %, 96 % oder 98 % der Aminosäuresequenz des ursprünglichen
Peptids.
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Unter
einem Derivat eines Peptids wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung
ein Peptid verstanden, das von einem anderen Peptid durch den Austausch
von Aminosäuren
abgeleitet ist. Der Prozentsatz ausgetauschter Aminosäuren in
einem Peptid beträgt
bevorzugt maximal 60 %, ebenfalls bevorzugt maximal 50 %, noch mehr
bevorzugt maximal 40 % und am meisten bevorzugt maximal 30 %, 20
%, 10 %, 8 %, 6 %, 4 % oder 2 %. Besonders bevorzugt ist der Austausch
von Aminosäuren
mit ähnlichen
Eigenschaften, wie z.B. aliphatische, hydrophobe, saure, basische,
polare oder neutrale Aminosäuren
untereinander. Dem Fachmann sind diese Austauschmöglichkeiten
hinlänglich
bekannt, wie z.B. der Austausch von Lysin gegen Arginin (basisch), Asparaginsäure gegen
Glutaminsäure
(sauer), Leucin gegen Valin (nichtpolar) etc. Sowohl Fragmente als auch
Derivate müssen
gemäß der Erfindung
eine modulatorische Wirkung auf die proteasomale Aktivität in vitro
und/oder in vivo aufweisen.
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Unter
einem Proteasom wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung sowohl
ein konstitutives Proteasom als auch ein Immunoproteasom verstanden.
Auch Mischformen dieser beiden Arten von Proteasomen sind möglich, die
sowohl konstitutive katalytische Untereinheiten (β1, β2 und/oder β5) als auch
induzierte katalytische Untereinheiten (iβ1, iβ2 und/oder iβ5) aufweisen. Ferner betrifft
die vorliegende Erfindung sowohl das 20S-Proteasom (sowohl in eukaryotischen
Zellen als auch in prokaryotischen Zellen) als auch das 26S-Proteasom.
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Unter
der proteasomalen Aktivität
wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Peptid- bzw. Protein-spaltende
Aktivität
des Proteasoms verstanden. Hierunter fällt sowohl die in vitro als
auch die in vivo Aktivität,
also die Aktivität
aufgereinigter bzw. isolierter Proteasomen oder Proteasomen in einem
Zellaufschluss (Lysat) sowie die proteasomale Aktivität innerhalb
von intakten Zellen, in Zellkultur oder im Organismus. Ferner wird
unter der proteasomalen Aktivität
in der Regel die Gesamtaktivität
des Proteasoms verstanden. Falls die spezifische Aktivität einzelner
katalytischer Untereinheiten des Proteasoms (im Gegensatz zur Gesamtaktivität) gemeint
ist, also die Caspase-, Trypsin- bzw. Chymotrypsin-ähnliche
Aktivität,
so wird im Folgenden explizit darauf hingewiesen.
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Die
spezifischen Aktivitäten
einzelner katalytischer Untereinheiten des Proteasoms werden in
der Regel durch Verwendung kurzer fluorogener Peptidsubstrate (z.B.
von Bachem) ermittelt. So wird z.B. die Spaltung von Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC
der Chymotrypsin-ähnlichen
Aktivität
zugeschrieben, die Spaltung von Bz-Val-Gly-Arg-AMC wird der Trypsin-ähnlichen
Aktivität
zugeschrieben, die Spaltung von Z-Leu-Leu-Glu-βNa wird der Caspase-ähnlichen
Aktivität
zugeschrieben, und die Spaltung von Z-Gly-Gly-Leu-AMC wird hauptsächlich der
Chymotrypsin-ähnlichen
Aktivität
zugeschrieben. Zur Spaltung dieses letztgenannten Substrats tragen
jedoch wahrscheinlich alle katalytischen Untereinheiten (wenn auch
einige nur in beschränktem
Maße) bei.
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Verschiedene
Versuchsansätze
erlauben die Ermittlung der proteasomalen Aktivität. Hierzu
können beispielweise
aufgereinigte Proteasomen oder auch kultivierte Zellen herangezogen
werden. Entsprechende Versuchsansätze sind in den Beispielen
3 bis 8 beschrieben.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einer Modulation oder
Beeinflussung der proteasomalen Aktivität verstanden, dass die Aktivität von Proteasomen
unter dem Einfluss der erfindungsgemäßen Peptide im Vergleich zu
unbehandelten Proteasomen bzw. Zellen entweder inhibiert oder aktiviert
bzw. stabilisiert wird. „Unbehandelt" bedeutet, dass die
Zellen oder Proteasomen z.B. nur mit dem Puffer bzw. Lösungsmittel
bzw. Träger
inkubiert werden, in dem die Peptide aufgenommen wurden.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Inhibition oder Hemmung
im Vergleich zu unbehandelten Proteasomen bzw. Zellen ermittelt,
deren Aktivität
mit 100 % (bzw. deren Inhibition mit 0 %) angegeben wird. Beträgt die proteasomale
Aktivität
beispielsweise noch 40 % der Aktivität unbehandelter Proteasomen bzw.
Zellen, so liegt eine Inhibition von 60 % vor. Vorzugsweise beträgt die Inhibition
durch die erfindungsgemäßen Peptide
mindestens 40 %, noch mehr bevorzugt mindestens 50 %, noch mehr
bevorzugt mindestens 60 % und am meisten bevorzugt mindestens 70
%, 80 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % oder 100 %.
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Aktivierung
oder Stabilisierung bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung,
dass das mit den erfindungsgemäßen Peptiden
behandelte Proteasom bzw. eine spezielle katalytisch aktive Untereinheit
im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle eine höhere Aktivität aufweist.
Diese erhöhte
Aktivität
kann auch daher rühren,
dass das Proteasom unter den Inkubationsbedingungen nicht an Aktivität verliert,
also „stabilisiert" ist. Beträgt die proteasomale
Aktivität
beispielsweise 140 % der Aktivität
unbehandelter Proteasomen bzw. Zellen, so liegt eine Aktivierung
von 40 % vor. Vorzugsweise beträgt
die Aktivierung bzw. Stabilisierung durch die erfindungsgemäßen Peptide
mindestens 40 %, noch mehr bevorzugt mindestens 50 %, noch mehr
bevorzugt mindestens 60 % und am meisten bevorzugt mindestens 70
%, 80 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % oder 100 %.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
hat das erfindungsgemäße Peptid
die Wirkung, dass die Gesamtaktivität des Proteasoms in vitro und/oder
in vivo gehemmt ist. Gemäß einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform
ist durch die Wirkung des Peptids die Chymotrypsinähnliche
Aktivität
und/oder die Caspase-ähnliche
Aktivität
des Proteasoms in vitro und/oder in vivo gehemmt. Gemäß einer
anderen bevorzugten Ausführungsform
ist durch die Wirkung des Peptids die Trypsin-ähnliche Aktivität des Proteasoms
in vitro und/oder in vivo stabilisiert bzw. aktiviert.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
werden entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung nicht proteasomal in vitro und/oder in vivo abgebaut.
Besonders bevorzugt werden die Peptide von keiner zellulären Peptidase
oder Protease mit sofortiger Wirkung degradiert, sondern weisen
sowohl intra- als auch extrazellulär eine gewisse Stabilität auf, die
es ihnen erlaubt, ihre modulatorische Wirkung auf das Proteasom
auszuüben.
Ferner verfügen
die erfindungsgemäßen Peptide
vorzugsweise über
die Fähigkeit,
die Zellmembran zu passieren und so in das Zellinnere zu gelangen,
wo sie das Proteasom beeinflussen können.
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Das
erfindungsgemäße Peptid
weist ein Aminosäuresequenzmotiv
(oder Fragment oder Derivat dieses Motivs) auf, welches entsprechend
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung aus dem Protein humane Telomerase Reverse
Transkriptase stammt. Unter dieses Protein fallen im Rahmen der vorliegenden
Erfindung auch die verschiedenen Telomerase Reverse Transkriptase-Isoformen
1, 2, 3 und 4 sowie die beta- und gamma-Deletions-Isoform der Telomerase Reverse
Transkriptase (vgl. NCBI Accession Numbers BAC11010, NP_003210,
NP_937986, NP_937983, NP_937984, BAC11014).
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Gemäß einer
noch mehr bevorzugten Ausführungsform
ist das Peptid dadurch gekennzeichnet, dass das Aminosäuresequenzmotiv
mindestens die (in der humanen Telomerase Reverse Transkriptase
vorkommende) Sequenz ILAKFLHWL (SEQ ID NO: 1) umfasst.
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Umfasst
ein erfindungsgemäßes Peptid
ein oder mehrere Fragmente oder Derivate eines Aminosäuresequenzmotivs
aus einem humanen Protein (wie z.B. bevorzugt eines Motivs aus der
humanen Telomerase Reversen Transkriptase oder noch mehr bevorzugt
des in SEQ ID NO: 1 dargestellten Motivs), so muss erfindungsgemäß stets
die modulatorische Wirkung des Peptids auf die proteasomale Aktivität in vitro
und/oder in vivo gewährleistet
sein.
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Das
erfindungsgemäße Peptid
ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass es eine oder mehrere
Kopien eines Aminosäuresequenzmotivs
aus der humanen Telomerase Reverse Transkriptase und/oder eines Fragments
und/oder eines Derivats dieses Motivs an beliebiger Position umfasst.
Das heißt,
das Motiv und/oder sein Derivat und/oder sein Fragment kann N- oder C-terminal
oder mittig innerhalb des Peptids vorkommen, in einer, zwei, drei,
vier, fünf,
sechs oder mehr Kopien und in beliebigen Kombinationen aus Motiven, Derivaten
und Fragmenten.
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Besonders
bevorzugt ist das erfindungsgemäße Peptid
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus:
- a) einem Peptid
bestehend aus der Sequenz ILAKFLHWL (SEQ ID NO: 1) in einer, zwei,
drei, vier oder mehr Kopien;
- b) einem Peptid bestehend aus der Sequenz (SEQ ID NO: 2)
AEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVEL;
c) einem Peptid bestehend aus der Sequenz (SEQ ID NO: 3)
MLMYILAKFLHWLGGYILAKFLHWLGGYILAKFLHWL;
d) einem Peptid bestehend aus der Sequenz (SEQ ID NO: 4)
RLMYDILAKFLHWLGPSEKRVWMS;
- e) einem Peptid bestehend aus der Sequenz (SEQ ID NO: 5)
AHGVILAKFLHWLSTAPPAHGVILAKFLHWLSTAPPA;
- f) einem Peptid bestehend aus der Sequenz (SEQ ID NO: 6)
QMNLILAKFLHWLCMTWNQMNLILAKFLHWLCMTW;
- g) einem Peptid bestehend aus der Sequenz (SEQ ID NO: 7)
RLMYILAKFLHWLGPSRLMYILAKFLHWLGPS;
- h) einem Peptid bestehend aus der Sequenz (SEQ ID NO: 8)
VHNVILAKFLHWLSTAPPVHNVILAKFLHWLSTAPPV;
- i) einem Peptid umfassend eines oder mehrere der Peptide aus
a) bis h);
- j) einem Peptid, das ein Fragment eines der Peptide aus a) bis
i) darstellt; und k) einem Peptid, das ein Derivat eines der Peptide
aus a) bis j) darstellt.
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In
den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen ebenso Fragmente von
Derivaten bzw. Derivate von Fragmenten des oben genannten Telomerase
Reverse Transkriptase-Sequenzmotivs oder der erfindungsgemäßen Peptide.
Der Begriff „Derivat" umfasst somit ein
Peptid, das durch den Austausch von Aminosäuren sowohl ausgehend vom Ausgangs-Peptid
als auch ausgehend von einem Fragment des Ausgangs-Peptids gewonnen
wurde. Umgekehrt umfasst der Begriff „Fragment" ebenfalls ein Peptid, das durch die
N- und/oder C-terminale Deletion von Aminosäuren ausgehend vom Ausgangs-Peptid
sowie ausgehend von einem Derivat des Ausgangs-Peptids gewonnen
wurde.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
können
ferner modifizierende Gruppen oder Marker umfassen. Diese Markierung
kann an beliebiger Stelle, z.B. am C- oder am N-Terminus der Peptide
oder innerhalb der Peptide erfolgen. Die Gruppen oder Marker können ausgewählt sein
aus der Gruppe bestehend aus stabilisierenden Gruppen, Gruppen zur
Erhöhung
der Wasserlöslichkeit,
Lumineszenz-Markern, fluoreszierenden Markern, radioaktiven Markern,
Metallmarkern, polymeren Markern, Antikörpern, Enzymen, Epitop-Tags,
Aminosäure analoga,
D- oder L-Aminosäuren,
Serin, Glycin, Aspartat, Zuckergruppen, Glucuronsäure, Sulfatresten
und Polyethylenglycol.
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Beispiele
für Fluoreszenz-Farbstoffe
sind Cy-Farbstoffe (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden),
Alexa-Farbstoffe, Texas-Rot, Fluorescein, Rhodamin (Molecular Probes,
Eugene, Oregon, USA), Lanthanide wie Samarium, Ytterbium und Europium
(EG&G, Wallac,
Freiburg, Deutschland).
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Beispiele
für Aminosäuresequenz-Tags
(Epitop-Tags) sind der FLAG®-Tag (DYKDDDDK, SEQ ID
NO: 9), der z.B. von dem monoklonalen anti-FLAG-Antikörper M1
erkannt wird, oder andere Tags wie z.B. DYKD (SEQ ID NO: 10, Erkennung
durch M1), MDFKDDDDK (SEQ ID NO: 11, Erkennung durch M5), MDYKAFDNL (SEQ
ID NO: 12, Erkennung durch M2) können
zur Modifizierung der erfindungsgemäßen Peptide verwendet werden.
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Die
Gruppen bzw. Marker können
auch über
eine Ankergruppe mit den Peptiden verbunden werden, so z.B. mittels
Biotin, Avidin, Digoxigenin und dergleichen. Weitere mögliche Gruppen
oder Marker sowie die Art und Weise der Verknüpfung dieser Gruppen mit dem
erfindungsgemäßen Peptid
sind dem Fachmann hinlänglich
bekannt.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung sind Zusammensetzungen, enthaltend
eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide und ggf. einen
weiteren Bestandteil ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus einem Lösungsmittel, Puffer, Träger oder
Stabilisator.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen,
enthaltend eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide und ggf. einen
pharmazeutisch akzeptablen Träger.
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Die
weiteren Bestandteile und Träger
können
z.B. ausgewählt
sein aus der Gruppe bestehend aus:
- – wässrigen
Lösungsmitteln
(enthaltend nur Wasser oder weitere gelöste Bestandteile wie z.B. Salze,
Zucker, DMSO in einer Konzentration von vorzugsweise 1–10 %, am
meisten bevorzugt 5 %, SDS, Tartrate), Puffern, Zellkulturmedien
- – nicht-wässrigen
Lösungsmitteln
(z.B. organische Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol etc.,
Ketone wie Aceton, Polyalkohole wie Glycerol)
- – isotonisierenden
Agenzien (z.B. Glycerin, Aminosäuren
wie Glycin, Proteine wie Albumine, Salze wie NaCl, Zucker wie Dextrose,
Saccharose oder Lactose)
- – Konservierungsmitteln
bzw. Bakteriostatika (z.B. Phenol, m-Cresol, p-Cresol, o-Cresol,
Chlorocresol, Chlorohexidin, Benzylalkohol, Alkylparaben, Thiomersal,
Benzalkoniumchlorid, Natriumdehydroacetat, Benzoesäure)
- – Puffer
(z.B. Phosphatpuffer, Citratpuffer, Acetatpuffer, Succinatpuffer,
Argininpuffer, Histidinpuffer, TRIS-Puffer)
- – Tenside
(z.B. Polysorbate, Polyalkylenglycole, Tween®, Pluronic®)
- – Stabilisatoren
(z.B. Aminosäuren
wie Methionin, Serin, Glycin, Histidin, Proteine wie Albumine)
oder
Mischungen hiervon.
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Die
Konzentration des Peptids in der Zusammensetzung kann je nach erwünschtem
Effekt und in Abhängigkeit
von dem System, in dem das Peptid angewendet werden soll, ausgewählt werden.
So verlangt z.B. ein System wie eine Zellkultur die Verabreichung
einer höheren
Konzentration als ein in vitro-System mit isolierten Proteasomen,
um denselben Effekt zu erzielen. Bevorzugt liegt die Peptidkonzentration
in der Zusammensetzung im Bereich von 0,1 μM bis 1 mM, noch mehr bevorzugt
von 0,5 μM
bis 500 μM,
noch mehr bevorzugt von 1 μM
bis 100 μM,
noch mehr bevorzugt von 2 μM
bis 50 μM,
noch mehr bevorzugt von 5 μM
bis 20 μM
und am meisten bevorzugt im Bereich von etwa 10 μM.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung sind Polynukleotide, umfassend
eine Nukleotidsequenz, die für ein
erfindungsgemäßes Peptid
kodiert. Unter einem Polynukleotid wird im Rahmen der vorliegenden
Erfindung ein doppel- oder einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül verstanden,
z.B. eine DNA, cDNA, genomische DNA, RNA, mRNA etc. Das Nukleinsäuremolekül kann entweder
als kodierender oder als komplementärer Strang vorliegen. Das Polynukleotid
kann aus einer natürlichen
Quelle stammen oder durch einen gentechnologischen Prozess bzw.
ein chemisches Syntheseverfahren hergestellt werden.
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Zur
reversen Translation der Proteinsequenz in eine degenerierte DNA-Sequenz
sind Programme erhältlich,
wie etwa unter http://www.entelechon.com/eng/backtranslation.html.
Für viele
Organismen, von denen die DNA-Sequenz einer größeren Zahl von Genen bekannt
ist, gibt es ferner Tabellen, denen man die Häufigkeit der Verwendung bestimmter
Kodons in dem jeweiligen Organismus entnehmen kann. Mit Hilfe dieser
Tabellen lassen sich Proteinsequenzen mit relativ großer Genauigkeit
in eine DNA-Sequenz zurückübersetzen, welche
die im jeweiligen Organismus bevorzugten Kodons für die verschiedenen
Aminosäuren
des Proteins enthält.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung sind Vektoren, umfassend ein oder
mehrere erfindungsgemäße(s) Polynukleotid(e).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einem Vektor ein
Polynukleotid verstanden, welches dazu dient, das exogene Nukleinsäuremolekül, das für ein oder
mehrere erfindungsgemäße(s) Peptid(e)
kodiert, in eine Wirtszelle einzubringen. Ein Vektor enthält also
ein oder mehrere erfindungsgemäße(s) Polynukleotid(e).
Meistens handelt es sich bei den Vektoren um Plasmide, (modifizierte)
Viren (z.B. Bakteriophagen oder Retroviren), Cosmide oder YACs.
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Bei
den Vektoren kann es sich z.B. um Phage-Display-Vektoren oder um
Expressionsvektoren für
Bakterien-, Pilz-, Hefe-, Algen-, Pflanzen- oder Tierzellen, bevorzugt
für Säugetierzellen,
besonders bevorzugt für humane
Zellen handeln. Typischerweise enthalten Plasmide u.a. die folgenden
Bestandteile: bakterielle Replikationssignale, insbesondere für E.coli
(origin of replication), Markergene zur Selektion transformierter
Zellen (sowohl Bakterienzellen, in denen die Vervielfältigung
der Plasmide stattfindet, als auch diejenigen Zellen, in denen die
Expression stattfindet) wie z.B. Antibiotikaresistenzgene, Restriktionsschnittstellen
(multiple cloning site), einen Promotor und ggf. ein Terminationssignal.
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Die
Methoden der Klonierung einer Nukleinsäuresequenz in einen Vektor,
insbesondere ein Plasmid, die Vervielfältigung von Plasmiden in kultivierten
Bakterienzellen, insbesondere in E.coli, die Selektion der Bakterien
und die Aufreinigung der Plasmide sowie geeignete Verfahren des
Einbringens von Plasmiden in eine Wirtszelle (z.B. transiente oder
stabile Transfektion durch Elektroporation, Lipotransfektion, Kalzium-Phosphat-Präzipitation,
Mikroinjektion, Particle Gun, Schockgefrieren mit Glycerin etc.)
sind dem Fachmann bekannt und können
einschlägiger
Literatur (wie z.B. Sambrook, J.; Maniatis, T.; Russel, DW.: Molecular cloning:
a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition
2001) entnommen werden.
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Die
erfindungsgemäßen Polynukleotide
und Vektoren können
in eine Wirtszelle eingebracht und hier exprimiert werden. Die daraus
entstehenden Peptide sind dann in der Lage, die Aktivität der Proteasomen
in der Zelle wie oben beschrieben zu modulieren.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung sind Zellen, enthaltend ein erfindungsgemäßes Peptid,
ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor.
Bei den Zellen kann es sich um Bakterien-, Pilz-, Hefe-, Algen-,
Pflanzen- oder Tierzellen, bevorzugt Säugerzellen und noch mehr bevorzugt humane
Zellen wie z.B. HeLa- oder SaOs-Zellen handeln.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
können
in die Zellen durch verschiedene Verfahren eingebracht werden. Am
meisten geeignet ist hierfür
die Lipotransfektion. Für
eine Lipotrans fektion stehen verschiedene Systeme zur Verfügung, wie
z.B. FuGene® (Roche),
Lipofectamine® und
Lipofectamine Plus (Invitrogen), Superfect® (Qiagen),
Effectene® (Qiagen),
Lipofectin® (Invitrogen),
DC-30®,
DAC-30®,
Cellfectin® (Invitrogen),
DMRIE-C® (Invitrogen),
GenePorter® (Genlantis),
GeneJammer® (Stratagene)
etc. Besonders bevorzugt ist das FuGene 6-Transfektions-Reagenz.
Die Transfektion erfolgt nach Hersteller-Angaben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung richtet sich auf die Verwendung
der erfindungsgemäßen Peptide,
Zusammensetzungen, Polynukleotide und Vektoren. Ein erster Aspekt
ist hierbei die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide, Zusammensetzungen,
Polynukleotide oder Vektoren zur Modulation der proteasomalen Aktivität in vitro
und/oder in vivo, wobei die Modulation der proteasomalen Aktivität im oder
am menschlichen oder tierischen Körper ausgeschlossen ist.
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Hierbei
ist, wie zuvor beschrieben, in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
die Gesamtaktivität
des Proteasoms gehemmt. In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist die Chymotrypsin-ähnliche
Aktivität
und/oder die Caspase-Aktivität
des Proteasoms gehemmt. In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist die Trypsin-ähnliche
Aktivität
des Proteasoms stabilisiert bzw. aktiviert.
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Ein
zweiter Aspekt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide,
Zusammensetzungen, Polynukleotide oder Vektoren zur Veränderung
der Qualität,
Quantität
und/oder Variabilität
der proteasomal generierten Peptide in vitro und/oder in vivo, wobei
die Veränderung
der Qualität,
Quantität
und/oder Variabilität
der proteasomal generierten Peptide im menschlichen oder tierischen
Körper
ausgeschlossen ist.
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Der
Begriff der Veränderung
der Qualität,
Quantität
und/oder Variabilität
bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass unter dem Einfluss
der erfindungsgemäßen Peptide
(im Vergleich zu unbehandelten Proteasomen bzw. Zellen) die durch
das Proteasom gene rierte Gesamtheit an Abbauprodukten (Peptiden)
von veränderter
Natur ist. Es können
z.B. unter dem Einfluss der erfindungsgemäßen Peptide weniger proteasomale
Abbauprodukte generiert werden, im maximalen Fall ist die proteasomale
Aktivität
nahezu oder gänzlich gehemmt.
Es kann auch die Länge
der vom Proteasom generierten Peptide variieren, d.h. längere oder
kürzere
Produkte entstehen. Ferner kann die Anzahl der unterschiedlichen
Abbauprodukte modifiziert, also reduziert oder vergrößert sein.
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Ein
dritter Aspekt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide,
Zusammensetzungen, Polynukleotide oder Vektoren zur Untersuchung
des Zellstoffwechsels in vitro und/oder in vivo, wobei die Untersuchung
des Zellstoffwechsels im menschlichen oder tierischen Körper ausgeschlossen
ist.
-
Der
Begriff „Untersuchung
des Zellstoffwechsels" bedeutet
im Rahmen der Erfindung, dass die Aktivität, der Wirkungsmechanismus,
die Regulation und/oder die Wechselwirkung des Proteasoms mit anderen Komponenten
z.B. anhand von isolierten Proteasomen oder anhand von Zellen untersucht
wird. Dabei können die
erfindungsgemäßen Peptide
dazu verwendet werden, die Wirkungsweise des Proteasoms zu analysieren, proteasomale
Substrate zu identifizieren, Wechselwirkungen des Proteasoms mit
anderen zellulären
Komponenten zu untersuchen, Aktivatoren oder Inhibitoren des Proteasoms
zu identifizieren oder charakterisieren, die Bindungsorte solcher
Substanzen zu identifizieren, Kinetiken durchzuführen. Bei diesen Untersuchungen können weitere
Substanzen wie z.B. Proteine, Peptide, Enzyme, Proteasomen-Aktivatoren
oder -Inhibitoren, Nukleinsäuren
oder anderen chemischen Substanzen wie z.B. SDS anwesend sein.
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Ein
vierter Aspekt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide,
Zusammensetzungen, Polynukleotide oder Vektoren zur Transfektion
einer Zelle in Zellkultur.
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Unter
Transfektion wird das Einbringen von Fremd-Nukleisäuren (exogene
Nukleinsäuren)
in Zellkulturzellen verstanden. Dabei unterscheidet man zwischen
dem nur zeitweiligen Einbringen des Vektors bzw. Plasmids in die
Wirtszelle (transiente Transfektion) und dem dauerhaften Einbau
in das Genom (stabile Transfektion). Je nach Zellart eignen sich
verschiedene Verfahren chemischer (z.B. Kalzium-Phosphat-Präzipitation),
physikalischer (z.B. Elektroporation, Mikroinjektion, Particle Gun,
Schockgefrieren mit Glycerin) oder molekularbiologischer (z.B. Lipotransfektion)
Natur.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einer Transfektion
außerdem
das Einbringen von Peptiden in eine Zellkulturzelle verstanden.
Ein geeigneter Mechanismus hierfür
ist die Lipotransfektion. Beispiele für geeignete Reagenzien wurden
zuvor genannt. Besonders geeignet ist Fugene 6 (Roche), siehe auch Beispiel
6.
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Aufgrund
der Fähigkeit
der erfindungsgemäßen Peptide
zur Interaktion mit dem Proteasom können die erfindungsgemäßen Peptide
ferner zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung verschiedener
Krankheiten verwendet werden. Dasselbe gilt für die erfindungsgemäßen Polynukleotide
und Vektoren, die in eine Zielzelle eingebracht werden können und
deren Expressionsprodukte in Form von Peptiden mit den Proteasomen
interagieren.
-
Im
Folgenden sollen einige der Zusammenhänge zwischen der proteasomalen
Aktivität
und der Krankheitsentstehung bzw. dem Krankheitsverlauf und dem
Einsatz Proteasomenmodulatorischer Substanzen bei der Therapie erläutert werden
(siehe hierzu auch Schwartz A. L. und Ciechanover A. Annu Rev Med.
1999; 50:57–74.
Review):
So ist z.B. die Apoptose-induzierende Wirkung von
Proteasomeninhibitoren ein wichtiger Faktor bei der Bekämpfung von
Krankheiten, insbesondere von Tumoren. Das Ubiquitin-Proteasomen-System
kontrolliert die Genexpression durch Degradation von Transkriptionsfaktoren
(p53, cJun, cFos, NFκB,
cMyc, STAT3), Tumorsuppressorgenprodukten (β-catenin, p53, retinoblastoma,
Hippel-Lindau-Protein), Protoonkogenen (Raf, Myc, Myb, Rel, Mos)
sowie Cyclinen, CDKs und CDK-Inhibitoren. Außerdem ist die zentrale Rolle
des Proteasoms bei der Generierung von MHC Klasse I-restringierten
Peptidepitopen (aus zellulären
sowie viralen oder intrazellulären
bakteriellen Proteinen oder aus Proteinen anderer intrazellulärer Parasiten)
ein wichtiger Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten wie Autoimmunkrankheiten
oder Infektionen.
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Proteasomeninhibitoren
können
in einigen malignen Zelltypen im Vergleich zu den entsprechenden normalen
Zellen selektiv eine Apoptose induzieren. Die so induzierte Apoptose
steht im Zusammenhang mit der Inhibition des klassischen und des
alternativen NF-κB-Signalwegs, der Hochregulierung
der Tumorsuppressorgene p53, p21 und p27 und/oder der Aktivierung
der Caspasen-Kaskade.
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Die
Inhibition von NF-κB
(durch den verminderten proteasomalen Abbau des NF-κB-Inhibitors IκBα) steht im
Zusammenhang mit der anschließenden
Inhibition des Wachstums von Tumorzellen, der Apoptose-Induktion
und der Inhibition von Angiogenese und zellulärer Adhäsion und ist somit ein wesentlicher
Faktor bei der Behandlung von malignen Erkrankungen.
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Die
mit der Parkinson-Krankheit assoziierten Gene umfassen Parkin, DJ-1,
das Ubiquitin C-terminale Hydrolase-Isoenzym
L1 (UCH-L1), den nuclear receptor-related factor 1, und alpha-Synuklein.
Letzteres aggregiert und stellt die Hauptkomponente von Lewy-Körperchen
(Lewy bodies, LBs) dar. Da auch Ubiquitin in den LBs akkumuliert
und Parkin und UCH-L1 ebenfalls mit dem Ubiquitin/Proteasomensystem
interagieren, wird davon ausgegangen, dass die proteasomale Dysfunktion
zur Pathophysiologie der Parkinson-Krankheit (und ähnlichen
Krankheiten) beiträgt.
-
Der
Typ 1-Diabetes ist eine T-Zell-assozüerte Autoimmunkrankheit, wobei
Insulin ein wichtiges Ziel der Autoimmunantwort ist, die zur Beta-Zell-Zerstörung führt. Ein
Peptidepitop aus der Insulin B-Kette (insB10–18) mit besonderer Affinität zu HLA-A2
wird von den meisten Typ 1-Diabetes-Patienten exprimiert. Dieses
Peptid wird vom Proteasom generiert (Pinkse G. G. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2005 Dec 20; 102(51):18425–30). Eine Modifizierung der
proteasomalen Aktivität
kann somit bei Autoimmunkrankheiten eine Linderung der Zellzerstörung bewirken.
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Der
Schlaganfall löst
eine progressive vaskuläre
Dysfunktion aus, die zur Entwicklung von Schädigungen im Gehirn beiträgt. Proteasomeninhibitoren
können
vaskuläre
thrombotische und inflammatorische Ereignisse reduzieren und somit
die vaskulären
Funktionen schützen.
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TGF-beta
1 ist einer der potentesten endogenen Negativ-Regulatoren von Entzündungsreaktionen. Der
Faktor hat u.a. einen negativ regulierenden Einfluss auf die NF-κB-Aktivierung. Ein
endogener Inhibitor des TGF-beta 1-Signalwegs ist das Protein Smad7,
das im menschlichen Darm vorkommt. Die posttranslationale Smad7-Acetylierung
verhindert die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau und führt somit
zur Stabilisierung dieses Proteins bei Patienten mit chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen, zu denen z.B. der Morbus Crohn gehört. Über diesen
Mechanismus wird TGF-beta 1 im Krankheitsfall negativ reguliert
und kann seine entzündungshemmende
Funktion nicht mehr ausüben.
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Viren
interagieren auf verschiedenen Ebenen mit dem Ubiquitin/Proteasomensystem
und beeinflussen somit die proteasomale Aktivität zu ihren Gunsten und in unterschiedlichen
Phasen der viralen Replikation.
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Ein
vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung
der erfindungsgemäßen Peptide,
Zusammensetzungen, Polynukleotide oder Vektoren zur Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, deren Verlauf
und/oder Ausmaß durch
die Modulation der proteasomalen Aktivität beeinflusst werden kann.
Diese Beeinflussung ist positiver Natur, d.h. durch den Einsatz
der Peptide wird der Krankheitsverlauf verzögert und/oder das Ausmaß der Krankheitsausprägung verringert.
-
Die
Krankheit ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus
-
- – soliden
Tumorerkrankungen wie z.B. Lungenkrebs, Brustkrebs, Ovarialkrebs,
Gebärmutterhalskrebs,
Nierenkrebs, Darmkrebs, Prostatakrebs und Melanomen,
- – hämatoonkologischen
Erkrankungen wie z.B. Leukämien,
AML, CML, Lymphomen, dem Multiplen Myelom, dem Non-Hodgkin-Lymphom,
dem follikulären
Lymphom, dem Mantelzelllymphom und T-Zell-Leukämien,
- – Autoimmunkrankheiten
wie z.B. Lupus erythematodes, Autoimmunhepatitis und dem Sjögren Syndrom,
- – Entzündungen
wie z.B. Myositis oder chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen wie
z.B. Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Indeterminate Colitis,
- – kardiovaskulären Erkrankungen
wie z.B. dem Schlaganfall,
- – viralen
Infektionen wie z.B. der HIV-, HCMV- und EBV-Infektion,
- – Erkrankungen
des zentralen Nervensystems und neurodegenerativen Erkrankungen
wie z.B. Alzheimer, der Parkinson-Krankheit, der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit,
Multipler Sklerose und Muskelschwund,
- – Stoffwechselerkrankungen
wie z.B. Diabetes,
- – gastro-intestinalen
Erkrankungen, sowie
- – sonstigen
Erkrankungen wie z.B. zystischer Fibrose, dem Angelman's Syndrom und dem
Liddle Syndrom.
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Bei
den oben genannten Krankheiten konnte bereits ein Zusammenhang mit
der proteasomalen Aktivität
gezeigt werden.
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Vorteilhafterweise
weisen die erfindungsgemäßen Peptide
in Form eines Medikaments eine gute Löslichkeit, eine hohe Zellpermeabilität, keine
oder nur geringe Nebenwirkungen, eine hohe Stabilität, also
z.B. keine oder eine verminderte Protease-Sensitivität sowie
eine deutlich reduzierte bis gar keine Immunogenität auf.
-
Die
erfindungsgemäßen Peptide,
Zusammensetzungen, Polynukleotide oder Vektoren können oral, nasal,
intravenös,
intratumoral, subkutan, intradermal, transdermal, topikal, intraperitoneal
oder intramuskulär verabreicht
werden. Ferner können
die Zusammensetzungen, die ein oder mehrere erfindungsgemäße(s) Peptid(e)
bzw. Polynukleotide oder Vektoren und einem pharmazeutisch akzeptablen
Träger
enthalten, weitere Wirkstoffe enthalten, welche zur Behandlung der
jeweiligen Krankheit geeignet sind, wie z.B. Proteasomeninhibitoren,
Chemotherapeutika, Antikörper
oder Cytokine.
-
Verfahren
zur Stabilisierung, Formulierung und Verabreichung von Peptiden
sind im Stand der Technik bekannt, siehe z.B.: Ajay K. Banga: Therapeutic
Peptides and Proteins:
Formulation, Processing, and Delivery
Systems. 2nd edition 2005, CRC Press; Witt K. A. AAPS J. 2006 Feb 24;8(1):E76–88; Hansen
J. E. Scientific World Journal. 2005 Sep 16; 5:782–8. Review;
Patton J. S. Proc. Am. Thorac. Soc. 2004; 1(4):338–44. Review;
Hamman J. H. Bio Drugs. 2005; 19(3):165–77. Review; Lien S. Trends
Biotechnol. 2003 Dec; 21(12):556–62. Review; Chourasia M. K.
J. Pharm. Pharm. Sci. 2003 Jan-Apr; 6(1):33–66. Review; Qian Z. M. Pharmacol.
Rev. 2002 Dec; 54(4):561–87.
Review; Bernkop-Schnurch A. J. Control. Release. 1998 Mar 2; 52(1–2):1–16. Review;
Lipka E. J. Control. Release. 1996 May; 39(2–3):121–9. Review.
-
Die
erfindungsgemäßen Peptide
können
ebenfalls in Form von Lebensmittelzusätzen eingesetzt werden. Durch
die orale Aufnahme gelangen die Peptide dann z.B. an ihren Wirkungsort
im Darm, was insbesondere bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen wie
z.B. Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Indeterminate Colitis eine
geeignete Form der Verabreichung darstellt.
-
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Modulation der proteasomalen Aktivität in vitro und/oder in vivo,
dadurch gekennzeichnet, dass ein isoliertes Proteasom, ein Zellaufschluss,
eine Zelle oder ein Organismus mit einem erfindungsgemäßen Peptid
oder einer Zusammensetzung behandelt wird oder dass ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
oder ein erfindungsgemäßer Vektor
in eine Zelle oder einen Organismus eingebracht wird, wobei ein
Verfahren zur Modulation der proteasomalen Aktivität im oder
am menschlichen oder tierischen Körper ausgeschlossen ist.
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Hierbei
ist, wie zuvor beschrieben, in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
die Gesamtaktivität
des Proteasoms gehemmt. In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist die Chymotrypsin-ähnliche
Aktivität
und/oder die Caspase-Aktivität
des Proteasoms gehemmt. In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist die Trypsin-ähnliche
Aktivität
des Proteasoms stabilisiert bzw. aktiviert.
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BEISPIELE
-
Die
vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen erläutert, die
nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise
als Einschränkung
zu verstehen sind. Beispiel
1: Aufreinigung von 20S Proteasomen
| DEAE-Puffer
A: | 80
mM KAc, 5 mM MgAc, 10 mM HEPES pH 7,2 |
| DEAE-Puffer
B: | 500
mM KAc, 5 mM MgAc, 10 mM HEPES pH 7,2 |
| FPLC-Puffer
A: | 100
mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM HEPES pH 7,2,
steril filtriert |
| FPLC-Puffer
B: | 1
M KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM HEPES pH 7,2, steril
filtriert |
-
Zellaufschluß
-
Konstitutive
Proteasomen wurden aus humanen T2-Zellen isoliert. Bei dieser Zellinie
handelt es sich um eine Deletionsmutante, die sich durch das Fehlen
des MHC Klasse II-Locus auszeichnet und die daher unter anderem
defizient für
die Gene LMP-2 und LMP-7 ist. Immunoproteasomen entstammten aus
72.27-Zellen, die stabil mit den Genen für diese beiden Immunountereinheiten
transfiziert und durch einen verstärkten Einbau der MECL1-Untereinheit
charakterisiert sind. Die Präparation
von 20S-Proteasom erfolgte aus 5 × 108 kultivierten
Zellen. Das Zellpellet wurde in 10 ml eiskaltem DEAE-Puffer A, 0,1
% TritonX-100 resuspendiert, in einen Dounce-Homogenisator überführt, mit
30 Stößen aufgeschlossen,
30 min auf Eis inkubiert und im Sorvall-SS 34-Rotor für 30 min
bei 16000 rpm und 4°C
zentrifugiert.
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DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie
-
Zur Äquilibrierung
des Säulenmaterials
wurden 10 ml DEAE-Sephacel in 40 ml DEAE-Puffer A aufgenommen, durchmischt und
sedimentieren gelassen. Der Überstand
wurde abgenommen und die Prozedur zweimal wiederholt mit anschließender Zentrifugation
für 5 min
bei 800 g. Der Überstand
des Zellysats wurde mit DEAE-Sephacel für 1 h bei 4°C auf dem Drehschüttler inkubiert.
Das Gemisch wurde in eine Chromatographie-Säule überführt, sedimentieren gelassen
und mit ca. 40 ml DEAE-Puffer A gewaschen, bis kein Protein mehr
eluierte (Tropfen auf Nitrocellulose-Membran mit Amidoschwarz getestet).
Die Elution erfolgte mit 30 ml eiskaltem DEAE-Puffer B, wobei Fraktionen à 1,5 ml
gesammelt wurden, welche auf einer Nitrocellulose-Membran mit Amidoschwarz
auf ihren Proteingehalt getestet wurden. Die Fraktionen mit dem
höchsten
Proteingehalt wurden gepoolt und in einer Ultrafiltrations-Zelle
(Filtermembran XM-300, 3 × 30
min in Aqua bidest. äquilibriert)
bei einem Druck von 2–4
bar und einer Durchlaufgeschwindigkeit von max. 1 Tropfen/sec auf
ein Endvolumen von 2 ml eingeengt.
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Dichtegradienten-Zentrifugation
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Im
Gradientenmischer wurden 2 Gradienten aus je 6,3 ml 10 % Saccharose
und 6,5 ml 40 % Saccharose in DEAE-Puffer B angesetzt. Pro Gradient
wurde 1 ml Protein-Probe aufgetragen. Die Zentrifugation erfolgte
für 16
h bei 40000 rpm und 4°C
im Sorvall-SV 40-Rotor.
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Fraktionierung,
Aktivitäts-Test,
Umpufferung und Einengung Pro Gradient wurden 20 Fraktionen à 630 μl von oben
abpipettiert. 10 μl
jeder Fraktion wurden einem Protease-Assay mit dem fluorogenen Substrat Z-Gly-Gly-Leu-AMC
in einer Endkonzentration von 50 μM
unterzogen. Die 5 aktivsten Fraktionen wurden gepoolt, mit FPLC-Puffer
A auf ein Volumen von 50 ml aufgefüllt und einer Einengung in
einer Ultrafiltrations-Zelle auf ein Endvolumen von 5 ml unterzogen.
Diese Umpufferung wurde zweimal wiederholt und die Proteinlösung in
einem Endvolumen von 10 ml steril filtriert (Filtereinheit FP 30/0,2).
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ÄKTA-FPLC
(Amersham)
-
Die
Proteinlösung
wurde über
den Superloop auf die MonoQ-Säule
geladen und ein Gradient von 0 auf 20 % FPLC-Puffer B in 4 min,
von 20 auf 40 % FPLC-Puffer B in 20 min und von 40 auf 100 % FPLC-Puffer B
in 2 min bei einer Flußrate
von 1 ml/min, einem Maximaldruck von 4 MPa und einer Fraktionsgröße von 1
ml gefahren (ÄFTA
FPLC Amersham). Anschließend
wurde erneut ein Aktivitäts-Test
durchgeführt
und die aktivsten Fraktionen auf Eis gelagert. Die Reinheit der
Proteasomen wurde über
SDS-PAGE und Coomassiefärbung überprüft (2)
und die Proteinkonzentration durch Absorptionsmessung bei 280 nm
bestimmt.
-
Beispiel 2: Peptidsynthese
-
Die
Synthese der Peptide wurde von der Peptidsynthese-Gruppe des Instituts
für Biochemie
der Charite Berlin durchgeführt
und erfolgte über
Festphasen-Synthese durch einen Applied Biosystems 433 A automatisierten
Synthesizer (Norwalk, CT). Der Reinigung mittels HPLC folgte eine
Massenanalyse über
MALDI-TOF (Reinheit > 90
%). Die Peptide wurden zunächst
in DMSO gelöst,
dann wurde Aqua bidest. dazugegeben, so dass eine Endkonzentration
von 5–10
% DMSO und eine Endkonzentration der Peptide von 1 mM erreicht wurde.
Es wurden verschiedene Einzelepitope bestehend aus 9 Aminosäuren sowie
Polyepitope einer Länge
von 24 bis 37 Aminosäuren
synthetisiert:
Pep 105 MLRMDSTAPPVHNVSTAPPVHNVSTAPPVHNV (SEQ
ID NO: 13)
Pep 161 ILAKFLHWLILAKFLHWLILAKFLHWLILAKFLHWL (SEQ
ID NO: 14)
Pep 165 AEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVEL (SEQ ID NO: 2)
Pep
166 MLMYILAKFLHWLGGYILAKFLHWLGGYILAKFLHWL (SEQ ID NO: 3)
Pep
169 ILAKFLHWL (-COOH)(SEQ ID NO: 1)
Pep 170 RLMYDILAKFLHWLGPSEKRVWMS
(SEQ ID NO: 4)
Pep 171 AHGVILAKFLHWLSTAPPAHGVILAKFLHWLSTAPPA
(SEQ ID NO: 5)
Pep 173 QMNLILAKFLHWLCMTWNQMNLILAKFLHWLCMTW
(SEQ ID NO: 6)
Pep 174 STAPPAHGV (-COOH)(SEQ ID NO: 15)
Pep
175 CMTWNQMNL (-COOH)(SEQ ID NO: 16)
Pep 181 RLMYILAKFLHWLGPSRLMYILAKFLHWLGPS
(SEQ ID NO: 7)
Pep 186 MLMYSTAPPAHGVSTAPPAHGVSTAPPAHGV (SEQ
ID NO: 17)
Pep 194 VHNVILAKFLHWLSTAPPVHNVILAKFLHWLSTAPPV (SEQ
ID NO: 8)
Pep 241 STAPPVHNV (-COOH)(SEQ ID NO: 18) Beispiel
3: Durchführung
proteolytischer in vitro Verdaue
| 10 × Verdaupuffer: | 200
mM HEPES pH 7,8 |
| | 20
mM MgAc2 |
| | 20
mM DTT |
| Verdauansatz: | 1 μg 20S Proteasom
(aus Beispiel 1) |
| | 5 μg Peptid
(aus Beispiel 2) |
| | 10 μl 10 × Verdau-Puffer |
| | Bidest
ad 100 μl |
-
Der
in vitro Verdau erfolgte bei 37°C
für die
angegebene Zeitdauer (Kinetik: 30 Minuten bis 48 Stunden). Der Verdau
wurde durch Zugabe von 0,1 % TFA und Einfrieren bei –20°C gestoppt.
-
Beispiel 4: Analyse proteolytischer in
vitro Verdaue
-
Die
Analyse der Verdauprodukte aus Beispiel 3 erfolgte über HPLC.
20 μl Probe
wurden auf eine Micra NPS ODS-I-Säule (Bischoff Chromatography)
aufgetragen und bei einer Flußrate
von 1 ml/min nach folgendem Gradienten aufgetrennt:
| HPLC-Puffer
A: | HPLC-Wasser,
0,1 % TFA |
| HPLC-Puffer
B: | HPLC-Acetonitril,
0,1 % TFA |
| Gradient: | 0–45 % HPLC-Puffer
B in 45 min |
| | 45–100 % HPLC-Puffer
B in 3 min |
-
Keines
der erfindungsgemäßen Peptide
(Pep 161, 165, 166, 169, 170, 171, 173, 181, 194) wurde in vitro
proteasomal degradiert, weder von 20S konstitutiven noch von 20S
Immunoproteasomen. Es wurden Kinetiken durchgeführt, die aufzeigten, dass selbst
nach 48 Stunden keine Degradation der Peptide erfolgte. Das Positivkontroll-Peptid
Pep 105 wurde hingegen von beiden Proteasomentypen sehr effizient
abgebaut: Ein Substratabbau von 50 % konnte bei Immunoproteasomen
nach 1 h und bei konstitutiven Proteasomen nach 2 h verzeichnet
werden.
-
Da
die Generierung einiger Epitope PA28-abhängig erfolgt, wurden einige
der Peptide, unter anderem Pep 194, exemplarisch zusätzlich zum
20S Proteasom mit dem Proteasomenaktivator PA28 inkubiert. Auch
in diesem Fall wurde kein Abbau verzeichnet.
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Die
Anwesenheit der erfindungsgemäßen Peptide
(Pep 161, 165, 166, 169, 170, 171, 173, 181, 194) in einem in vitro
20S-Verdau inhibierte außerdem
den Abbau des Positivkontroll-Peptids
Pep 105. Das erfindungsgemäße Peptid
und das abzubauende Peptid wurden in denselben Konzentrationen (je
30 μM) dem
Verdauansatz zugegeben. Auch nach drei Stunden konnte kein Substratabbau
von Pep 105 verzeichnet werden. Beispiel
5: Proteaseassay mit fluorogenen Substraten
| Fluorogene
Peptidsubstrate (Bachem): | Stocklösungen 10
mM in DMF |
| | Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC |
| | Bz-Val-Gly-Arg-AMC |
| | Z-Leu-Leu-Glu-βNa |
| | Z-Gly-Gly-Leu-AMC |
| Substratpuffer: | 50
mM Tris-HCl pH 7,5 |
| | 25
mM KCl |
| | 10
mM NaCl |
| | 1
mM MgCl2 |
| | 0,1
mM EDTA |
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Der
Versuchs-Ansatz erfolgte auf Eis. Pro Messung wurden 50–100 ng
Proteasom (aus Beispiel 1) mit dem Substrat in der angegebenen Konzentration
für die
angegebene Zeitdauer (siehe 3 und 4)
bei 37°C
in einer 96 well Mikrotiterplatte inkubiert. Es wurden stets Dreifachwerte
ermittelt. Für
jedes Substrat wurden Leerwerte ohne Proteasom angesetzt, für das Arg-Substrat
mit einer Eigenfluoreszenz in allen verwendeten Arg-Konzentrationen,
für die
anderen Substrate in nur einer Konzentration. Die Fluoreszenz der
durch das Proteasom vom Substrat abgespaltenen chromophoren Gruppe
wurde im Fluorimeter (SLT) bei einer Anregung von 390 mit (AMC)
bzw. 355 nm (βNa)
und einer Emission von 460 nm (AMC) bzw. 405 nm (βNa) gemessen.
Die Verstärkung
(gain) betrug 30, die Anzahl der Blitze 10. Die Leerwerte wurden
als Hintergrund von den Werten abgezogen, die in den Proben mit
Proteasom gemessen wurden.
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Es
konnte anhand dieser in vitro Untersuchungen mit kurzen fluorogenen
Peptidsubstraten gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Peptide
einen differentiellen Einfluss auf die einzelnen Aktivitäten des 20S
Immunoproteasoms ausüben.
Während
die Chymotrypsinähnliche
Aktivität
einer bis zu 95 %igen Inhibition unterlag (Substrat: Tyr, 3),
wurde gleichzeitig die Trypsin-ähnliche
Aktivität
im Verlauf einer 6 h Verdaukinetik stabilisiert (Substrat: Arg).
Dieser Effekt wurde nicht durch steigende Substratkonzentrationen
aufgehoben, d.h. die Peptide konkurrieren wahrscheinlich nicht mit
dem fluorogenen Substrat um das aktive Zentrum im 20S-Lumen.
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Die
Funktionsweise der Modulation des Proteasoms durch die erfindungsgemäßen Peptide
ist nicht vollständig
geklärt.
Ohne die Erfindung darauf beschränken
zu wollen, wird zur Zeit davon ausgegangen, dass der Mechanismus
der Interaktion zwischen den Peptiden und dem Proteasom an den α-Ringen des
Proteasoms stattfindet, da eine Kompetition mit dem Proteasomenaktivator
PA28 in vitro beobachtet wurde (4). Dieser
kompetitive Effekt tritt dann ein, wenn das Proteasom mit den Peptiden
vorinkubiert und anschließend PA28
zu dem Reaktionsansatz zugegeben wird. Eine Vorinkubation des Proteasoms
mit PA28 hingegen verhindert den durch die Peptide ausgelösten Effekt
in vitro. Es wird vermutet, dass eine Konformationsänderung an
den α-Ringen
infolge der Wechselwirkung des Proteasoms mit den Peptiden dafür zuständig ist,
dass die proteolytische Funktionsweise des Proteasoms beeinflusst
ist.
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Eine ähnliche
Beobachtung konnte anhand von Zellysat aus HeLa-Zellen gemacht werden.
HeLa-Zellen wurden in einer 24 well Zellkulturplatte kultiviert
und mit 20 μM
verschiedener erfindungsgemäßer Peptide lipotransfiziert
oder mit 20 μM
des Proteasomen-Inhibitors Lactacystin behandelt. Die Zellen wurden
pelletiert und in 100 μl
schonendem Lysepuffer lysiert. 20 μl des Lysats wurden mit 0,1
M ATP versetzt und einem Protease-Assay mit den fluorogenen Substraten
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC und Z-Gly-Gly-Leu-AMC in einer Endkonzentration
von 50 μM
unterzogen (wie zuvor beschrieben). Es konnte eine Inhibition der
proteasomalen Aktivität
beobachtet und somit gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Peptide
nicht nur die Aktivität
isolierter Proteasomen, sondern auch die Aktivität von Proteasomen in der Zelle
beeinflussen. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide war annähernd so
stark wie die des Proteasomeninhibitors Lactacystin.
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Beispiel 6: Zellkultur und Lipotransfektion
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Humane
HeLa- und SaOs-Zellen wurden unter Standardbedingungen in RPMI-1640
mit 10 % FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin
kultiviert. Lipotransfektionsexperimente von Peptiden (aus Beispiel
2) wurden bei den angegebenen Konzentrationen (0,2–20 μM) mit FuGene
6 (Roche Molecular Biochemicals) entsprechend den Herstellerangaben
durchgeführt
(Volumenangaben siehe folgende Tabelle).
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Der
Nachweis der erfolgreichen Lipotransfektion der Peptide in die Zellen
erfolgte über
FLAG®-Tag (DYKDDDDK,
SEQ ID NO: 9)-gekoppelte Peptide. Die Peptide Pep 165 und Pep 169
wurden mit einem solchen Tag versehen. HeLa-Zellen wurden mit je
20 μM der
beiden Peptide lipotransfiziert und in einer 10 cm Zellkulturplatte
mit einem autoklavierten Multitest-Objektträger kultiviert. Nach Erreichen
von ca. 70 % Konfluenz wurden die Zellen auf dem Objektträger mit
PBS gewaschen und 10 min bei RT mit 3,7 % PFA fixiert. Anschließend wurden
die Zellen mit 50 mM NH4Cl für 5 min
bei RT gequencht und dann 3 × 5
min mit 1x Waschlösung
gewaschen. Es folgte die Permeabilisierung der Zellen mit 0,1 %
NP40 in 1x Waschlösung
für 30
min bei RT und erneutes Waschen. Die Zellen wurden mit 15 μl des Anti-FLAG
M2 monoklonalen Antikörpers
in einer Verdünnung
von 1:200 in PBS/10 % FCS für
1 h bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen erfolgte die Inkubation
mit 15 μl
des zweiten Antikörpers
Anti-Maus IgG-FITC in einer Verdünnung
von 1:100 in PBS/10 % FCS für
1 h bei RT in einer feuchten Kammer im Dunkeln. Nach erneutem dreimaligem
Waschen wurden die Zellen in Mowiol eingebettet, mit einem Deckglas
versehen, mit 3 % Agarose versiegelt und am Fluoreszenzmikroskop
untersucht.
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Beispiel 7: In vivo Proteasomenaktivitäts-Assays.
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Für in vivo
Proteasomenaktivitäts-Assays
wurden die Zellen in schwarze μ-Clear
96 Well Mikrotiterplatten (Greiner) bei einer Dichte von 10000 Zellen/Kavität ausplattiert
und in 200 μl
Medium ü.N.
kultiviert. Am nächsten
Tag erfolgte die Lipotransfektion verschiedener erfindungsgemäßer Peptide
bzw. der Negativkontrolle Pep 105 in den Konzentrationen von 2 bis
20 μM in
100 μl Medium
Gesamtvolumen in Dreifachansätzen (siehe
Beispiel 6). Die Positivkontrolle war Epoxomycin. Einen Tag nach
der Lipotransfektion der erfindungsgemäßen Peptide wurden die Zellen
zweimal mit PBS gewaschen und 100 μl einer Z-Gly-Gly-Leu-AMC-Lösung einer
Endkonzentration von 50 μM
in PBS zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert und die Fluoreszenz
wie oben angegeben alle 15 min in einem Fluorimeter gemessen.
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Die
Transfektion der erfindungsgemäßen Polypeptide
(SEQ ID NOs: 1–8
und 14) in HeLa-Zellen
führte zu
einer starken Beeinträchtigung
der proteasomalen Aktivität
in vivo, gemessen am Umsatz des fluorogenen Peptids Z-Gly-Gly-Leu-AMC.
Dieses zellmembrangängige
Peptid wird nach derzeitigem Wissensstand hauptsächlich von der β5-Untereinheit
des Proteasoms gespalten, allerdings tragen vermutlich auch die
beiden anderen Untereinheiten (in geringerem Maße) zur Spaltung bei.
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Beispiel 8: Hemmung des in vivo Abbaus
von IκBα
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Um
die Hemmung der physiologischen Funktionen des Proteasoms nachzuweisen,
wurde untersucht, ob auch der proteasomale Abbau von IκBα durch die
erfindungsgemäßen Peptide
inhibiert wird. Die Stimulation von Zellen mit TNFα führt in einer
Signalkaskade zur Phosphorylierung von IκBα. Dadurch dissoziiert IκBα von NFκB ab und
wird proteasomal abgebaut. Ist das Proteasom inhibiert, so kann
keine Degradation erfolgen, und IκBα wird in
der Immundetektion identifiziert.
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HeLa-
und SaOs-Zellen wurden wie in Beispiel 6 beschrieben mit den erfindungsgemäßen Peptiden in
einer Konzentration von 20 μM
lipotransfiziert. Die Zellen wurden geerntet, gewaschen, pelletiert,
in 100 μl Medium
aufgenommen und anschließend
mit 20 ng/ml mTNFα für 30 min
bei 37°C
inkubiert.
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Dann
wurde 1 ml kaltes PBS zugegeben und die Zellen für 2 min bei 3500 g abzentrifugiert
und lysiert. Das Zellysat wurde auf ein 12%iges SDS-Gel aufgetragen
und ein Western-Blot mit einem Kaninchen-anti IκBα-Antikörper durchgeführt. Nach
Inkubation mit einem Ziegeanti Kaninchen-Antikörper erfolgte eine ECL-Detektion
der IκBα-Bande.
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Die
Ergebnisse dieses experimentellen Ansatzes zeigen auf, dass Pep
165 eine inhibitorische Wirkung auf das Proteasom in der Zellkultur
ausübt:
Durch die Inhibition des Proteasoms wurde das proteasomale Substrat
IκBα nicht degradiert
(5).
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BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
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1:
Aufbau des 26S Proteasoms aus dem 20S Kernkomplex und zwei 19S Regulatoren.
(Abb. nach Kloetzel P. M. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001 Mar; 2(3):179–87).
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2:
SDS-PAGE und Coomassie-Färbung
der aus T2- und T2.27-Zellen isolierten Proteasomen. Es wurden keine
kontaminierenden Banden detektiert. Die verschiedenen Bandenstärken beruhen
auf unterschiedlichen Mengen des eingesetzten Proteins (0,5 μg T2 bzw.
1,5 μg T2.27).
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3:
Inhibierender Einfluß verschiedener
Peptide auf die chymotryptische Aktivität des Proteasoms. Ergebnisse
nach 210 Minuten Inkubation mit dem fluorogenen Tyrosin-Substrat
in einer Konzentration von 100 μM.
Dasselbe Ergebnis kann mit einer Tyr-Konzentration von 50 μM erzielt
werden. Die Bezeichnung „Kloe" der Peptide entspricht
der Bezeichnung „Pep".
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4:
In vitro Einfluß des
Polypeptids Pep 194 (SEQ ID NO: 8) auf die Chymotrypsin- und die
Trypsin-ähnliche
Aktivität
des Immunoproteasoms sowie Kompetiton des Polypeptids mit PA28.
50ng Proteasom wurden mit 10 μM
des Polypeptids 30 min bei RT präinkubiert,
bevor die Zugabe von PA28 und jeweils 50 μM der Substrate Suc-LLVY-AMC
(TYR) bzw. Bz-VGR-AMC (ARG) erfolgte. Die Inkubation erfolgte bei
37°C und die
Messung der Fluoreszenz in Zeitintervallen von 15–30 min.
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5:
Western Blot gegen IκBα aus den
Zellysaten lipotransfizierter HeLa-Zellen. Das Peptid Pep 165 wurde
in einer Konzentration von 20 μM
lipotransfiziert. Die Positivkontrolle Epoxomycin wurde in einer Konzentration
von 2 μM
auf die Zellen gegeben. Als Negativkontrolle dienten unbehandelte
und DMSO-behandelte
Zellen (siehe Bsp. 8).
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Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
