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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der
motorischen Eigenschaften von Tieren. Genauer betrifft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der motorischen Eigenschaften
oder Fähigkeiten
von Tieren, bei denen die Tiere in einem ersten Schritt über einen
ersten Zeitraum in einer Einrichtung gehalten werden, die mit einem
einfachen Laufrad ausgestattet ist und anschließend in einem sich daran anschließenden Schritt über einen
zweiten Zeitraum in einer Einrichtung gehalten werden, die mit einem
komplexen Laufrad ausgestattet ist, um die Laufleistung der Tiere
zu bestimmen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine
Einrichtung zur Bestimmung der motorischen Fähigkeiten von Tieren mit mindestens
einem einfachen Laufrad und mindestens einem komplexen Laufrad,
mindestens einem Sensor zur Messung von Messwerten zum Erhalt von
abgeleiteten Kennwerten zur Bestimmung der Laufleistung der Tiere
und eine daran angeschlossene Messeinheit. Schließlich richtet
sich die Erfindung auf eine Messeinrichtung zur Messung der motorischen
Fähigkeiten
von Tieren.
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Stand der
Technik
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Die
Bestimmung der motorischen und koordinatorischen Fähigkeiten
stellt in der Verhaltensforschung und in der Neurobiologie ein wichtiges
Testsystem dar, um den Einfluss von äußeren Faktoren, wie den Einfluss
von pharmazeutischen Wirkstoffen auf Mensch oder Tier, aber auch
innere Faktoren, wie genetische Veränderungen und deren Auswirkungen auf
motorische und koordinative Fähigkeiten
zu bestimmen. Zur Erfassung des motorischen Verhaltens bzw. die
Messung von motorischen und koordinatorischen Defiziten in Mensch
und Tier, wie bei Mäusen die
eine Erkrankung des zentralen Nervensystems aufweisen, sind entsprechende
Systeme zur Erfassung dieser Fähigkeiten
wesentlich.
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Mäuse werden
in den letzten 10 Jahren zunehmend als Tiermodell für eine große Bandbreite von
neurologischen Erkrankungen herangezogen. Dieses liegt darin begründet, dass
sich der genetische Code im Verhältnis
zu anderen Säugetieren
relativ einfach, z.B. durch gentechnische Verfahren, verändern lässt (Knock-out
Mäuse,
Knock-in Mäuse, konditioneller
Knock-out etc.).
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Laufräder, Drehstabsysteme
und Laufbänder werden
in der Verhaltensforschung vor allem für kleine Versuchstiere, wie
Mäuse,
Ratten usw., verwendet und dienen z.B. der Stimulation der motorischen Aktivität, der Messung
der lokomotorischen Aktivität sowie
der Untersuchung der Wirksamkeit von Arzneimitteln auf die motorische
Koordination. Dabei kommen sowohl aktive Laufräder, die durch das Versuchstier
in Bewegung gesetzt werden und die Messung der Spontanaktivität dienen,
als auch passive Laufräder,
die über
Motoren angetrieben werden und somit das Tier zwingen zu laufen,
zum Einsatz.
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Die
derzeit bei Mäusen
verwendeten Motorik-Tests sind der Rotarod test (Sieve AN, et al.,
J Neuroimmunol. 2004 Oct; 155 (1-2):103-18.), der grip strength
test (Liebetanz D, et al., Eur J Neurosci. 2004 Dec; 20 (11):3115-20),
der beam balance task (Boehm SL 2nd, et al., 2000 Apr; 114 (2):401-9.)
oder auch der grid walking test (Metz GA, et al., Brain Res. 2000
Nov 17; 883 (2):165-77).
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Im
Rotarod test werden Mäuse
oder Ratten auf einem sich drehenden Stange gesetzt. Die Drehgeschwindigkeit
der Stange wird gradual erhöht
und die Fähigkeit
der Maus bzw. der Ratte die Balance auf dem Stab zu waren wird in
Form der zeitlichen Latenz bis zum runterfallen der Maus bzw. Ratte
gemessen.
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Beim
Grip strength (GS) Test wird die Maus an der Basis des Schwanzes
in einer vertikalen Position gehalten und zum Querbalken des GS-Meters gebracht,
bis das Tier die Griff-Stange ergreift. Der Körper des Tieres wird zum Niveau
des Querbalkens in einer horizontalen Position gesenkt und wird
dann in der Horizontalebene vorsichtig weggezogen. Als ein Reflex
hält sich
die Maus an der Stange fest, bis es der zunehmenden Kraft nicht
mehr widerstehen kann und die Stange loslässt. Der GS-Meter gibt dann
die maximale Greifkraft in Newton an.
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In
dem Beam balance Test wird die Maus bzw. Ratte auf eine Stange,
je nach Variante des Tests auch unterschiedliche Stangen mit unterschiedlicher
Form und Durchmesser gesetzt. Dabei können unterschiedliche Parameter
gemessen werden: z.B. kann die benötigte Zeit um von einem Ende der
Stange zur anderen zu gelangen gemessen werden oder aber auch die
Fähigkeit
der Maus bzw. Ratte auf den unterschiedlichen Stangen zu balancieren oder
aber auch die Anzahl Ausrutscher der Maus bzw. der Ratte bei Überqueren
der Stange festgehalten werden.
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Bei
dem Grid walk Test wird die Fähigkeit
gemessen eine horizontal gelegte „Leiter" zu überqueren.
Dabei können
die Querstangen, auf denen das Tier die Vorder- und Hinterpfoten
versucht aufzusetzen, in regelmässigen
oder unregelmässigen
Abständen
vorliegen. Die Anzahl Fehltritte (Schritt zwischen zwei Querstangen)
beim Überqueren
der horizontalen "Leiter" der Tiere gemessen.
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Die
o. g. Testverfahren weisen allerdings einige prinzipielle Nachteile
auf:
- 1. Sie sind personell sehr aufwendig und
sehr zeitintensiv für
das eingesetzte Personal und eignen sich somit nicht als Screening
Methode bei der viele verschiedene Verbindungen untersucht werden
sollen.
- 2. Sie beinhalten immer den Umgang eines Experimentators mit
dem Versuchstier, so dass ein Einfluss des Experimentators auf das
Versuchsergebnis prinzipiell nicht ausgeschlossen werden kann.
- 3. Bei durch die o. g. Testverfahren gemessenen Unterschiede
zwischen zwei Mausgruppen (Therapie gegenüber Kontrolle) können diese
Unterschiede nicht zwanglos auf einen Unterschied innerhalb des
ZNS zurückgeführt werden,
da kardiopulmonale und muskoloskeletale Trainingseffekte nur schwer
abzugrenzen sind.
- 4. Die Durchführung
der derzeit verwendeten Testverfahren obliegt meist wissenschaftlichen Mitarbeitern,
Doktoranden oder entsprechend geschultem technischem Personal, da
dieses Personal die Untersuchungstiere spezifisch auf die Testvorrichtungen
setzen muss und bestimmte Parameter erfassen muss. Da die Parameter
teilweise durch den Menschen erfasst werden, ist eine objektive
Beurteilung nicht immer gewährleistet.
- 5. Sie sind beim Versuchstier Maus nicht sehr sensitiv. Dies
hat zur Folge, dass für
bestimmte Mausmodelle neurologischer Erkrankungen, wie beispielsweise
das Cuprizone Modell der Multiplen Sklerose oder auch das MPTP-Mausmodell für M. Parkinson
kein motorisches Verhaltensdefizit nachgewie sen werden kann, obgleich
histologische Untersuchungen krankheitsspezifische Merkmale aufzeigen.
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Die
Verwendung dieser Mausmodelle zur Untersuchung der Ursachen und
der Therapie, wie die Suche nach neuen Wirkstoffen, von zwei volkswirtschaftlich
in erheblichem Maße
relevanten Krankheiten, geht derzeit mit einem beträchtlichen
personellen Aufwand einher, da Therapieerfolge in gewissen Tiermodellen
bis dato nur histopathologisch gemessen werden können.
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Wie
oben dargestellt sind wirtschaftliche Verfahren zur Bestimmung der
motorischen Fähigkeiten nicht
vorhanden.
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Der
Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und Testsystem
bereitzustellen, das es erlaubt, möglichst einfach und kostengünstig die
motorischen Eigenschaften von Tieren zu bestimmen. Dabei sollen
die obigen Nachteile, insbesondere der bisher notwendige Umgang
mit einem Experimentator und damit die Einbeziehung subjektiv bestimmter
Parameter überwunden
werden.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren bereitgestellt mit den Schritten:
- a.
halten der Tiere in einer Einrichtung, die mit einem einfachen Laufrad
ausgestattet ist über
einen ersten Zeitraum ausreichend, um die Tiere auf eine stabile
Laufleistung zu bringen und anschließend
- b. halten der Tiere in einer Einrichtung, die mit einem komplexen
Laufrad ausgestattet ist über
einen zweiten Zeitraum ausreichend, um die stabile Laufleistung
der Tiere zu bestimmen.
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Dabei
wird in einer bevorzugten Ausführungsform
als einfaches Laufrad eines verwendet, bei dem die Sprossen in regelmäßigen Abständen angeordnet
sind und als komplexes Laufrad eines verwendet, bei dem die Sprossen
in unregelmäßigen Abständen angeordnet
sind. Ein solches komplexes Laufrad ist z.B. in Schalomon, P.M.
and D.Wahlsten. 2002, Brain Res.Bull. 57, 27-33 beschrieben.
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In
einer weiter bevorzugten Ausführungsform
wird mit einer Messeinrichtung mit einer Messeinheit mit Sensor
und einer Auswerteeinheit die erhaltenen Messwerte gemessen und
als abgeleitete Kennwerte ausgewertet und damit die Laufleistung der
Tiere bestimmt.
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Diese
Messeinrichtung selbst ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden
Erfindung. Mit Hilfe dieser Messeinrichtung mit Auswerteeinheit
können die
erhaltenen abgeleiteten Kennwerte miteinander in Bezug gesetzt werden
und so die Laufleistung und daraus abgeleitet die motorischen Fähigkeiten
bestimmt werden.
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Schließlich betrifft
die vorliegende Erfindung eine Einrichtung zur Bestimmung der motorischen Fähigkeiten
von Tieren mit mindestens einem einfachen und mindestens einem komplexen
Laufrad, mindestens einem Sensor zur Messung von Messwerten zur
Bestimmung der Laufleistung der Tiere und eine daran angeschlossene
Messeinheit.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 zeigt
die Laufleistung einer Gruppe von Tieren (n = 10), ausgedrückt durch
die Maximalgeschwindigkeit in U/min für ein Versuchstier über 23 Tage.
Dabei wurde nach 14 Tagen das einfache Laufrad durch ein komplexes
Laufrad ersetzt.
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2 zeigt
die abgeleiteten Kennwerte der Versuchstiere nach Entmarkung durch
Behandlung mit Cuprizone und der Kontrolltiere. Links sind die Kennwerte
für den
ersten Zeitraum im einfachen oder Trainingslaufrad gezeigt und auf
der rechten Seite die Werte im komplexen Laufrad. Dargestellt sind
die Anzahl Läufe
pro 24 Stunden (Nrun), maximale ununterbrochene Laufzeit innerhalb
24 Stunden (Dmax), total zurückgelegte
Distanz innerhalb 24 Stunden (Distac) und die maximal erreichte
Geschwindigkeit innerhalb von 24 Stunden (vmax).
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3 stellt
die Laufleistung der Versuchstiere nach Remyelinisierung dar. Auf
der linken Seite die Kennwerte für
den ersten Zeitraum (Trainingsrad) und auf der rechten Seite die
Kennwerte für
den zweiten Zeitraum (komplexes Rad). Dargestellt sind die Anzahl
Läufe pro
24 Stunden (Nrun), maximale ununterbrochene Laufzeit innerhalb 24
Stunden (Dmax), total zurückgelegte
Distanz innerhalb 24 Stunden (Distac) und die maximal erreichte
Geschwindigkeit innerhalb von 24 Stunden (vmax)
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4 zeigt
eine Ausbildung der erfindungsgemäßen Einrichtung und der erfindungsgemäß verwendbaren
Laufräder.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der
motorischen Fähigkeiten von
Tieren mit den Schritten:
- a. halten der Tiere
in einer Einrichtung, die mit einem einfachen Laufrad ausgestattet
ist über
einen ersten Zeitraum ausreichend, um die Tiere auf eine stabile
Laufleistung zu bringen und anschließend
- b. halten der Tiere in einer Einrichtung, die mit einem komplexen
Laufrad ausgestattet ist über
einen zweiten Zeitraum ausreichend, um die stabile Laufleistung
auf diesem komplexen Laufrad der Tiere zu bestimmen.
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Dabei
bedeuten die Ausdrücke "einfaches Laufrad" und "komplexes Laufrad", dass für das komplexe
Laufrad von dem Tier eine größere motorische Fähigkeit
beim Laufen notwendig ist im Vergleich zu dem einfachen Laufrad.
So stellt ein Laufrad, bei dem die Sprossen in regelmäßigen Abständen angeordnet
sind, ein einfaches Laufrad dar. Als Beispiel für ein komplexes Laufrad sei
ein Laufrad genannt, bei denen die Sprossen in unregelmäßigen Abständen angeordnet
sind. In einer weiteren Ausführungsform ist
das einfache Laufrad eines mit unregelmäßigen Sprossen und das komplexe
Laufrad ebenfalls ein Laufrad mit unregelmäßigen Sprossen, wobei in dem komplexen
Laufrad die Sprossen so angeordnet sind, dass bei dem Tier eine
größere koordinative Leistung
notwendig ist.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet eine "stabile Laufleistung", dass das Tier oder
eine Gruppe von Tieren über
mindestens zwei Tage hinweg im Mittel eine gleiche Laufleistung
aufzeigt, dass heißt
die Abweichung der Laufleistung variiert nur um maximal 10 %, bevorzugt
maximal 5 %, insbesondere maximal 3 % zwischen den Tagen. D.h. über einen
Zeitraum von mindestens zwei Tagen ist bei Gruppen von Tieren im
Mittel im Wesentlichen kein Ansteigen der Laufleistung beobachtbar.
Bevorzugt ist die stabile Laufleistung die maximale stabile Laufleistung.
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Bei
Mäusen
ist z.B. dieser Zeitraum bis zum Erreichen einer stabilen Laufleistung
für das
einfache Laufrad im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
(der erste Zeitraum) ein Zeitraum von mindestens 7 Tage, insbesondere
mindestens 10 Tage, wie mindestens 11, 12, 13 oder 14 Tage. Der
Zeitraum im Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn ein komplexes
Laufrad verwendet wird (der zweite Zeitraum), ist mindestens 4,
insbesondere mindestens 5 Tage, wie mindestens 6 oder 7 Tage.
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Üblicherweise
werden die Versuchstiere in Einzelhaltung gehalten. Alternativ können die
Tiere aber auch zu mindestens zwei Tieren in einem Käfig sein.
Dies erfordert aber, dass eine Möglichkeit
gegeben ist, die Laufleistung bzw. die verschiedenen Laufradkennwerte
der einzelnen Tiere individuell zu bestimmen. Dieses kann z.B. mit
Hilfe einer individuellen Kennung der Tiere erfolgen. Eine solche
individuelle Kennung kann z.B. über
einen implantierten Chip, ein Halsband oder andere Markierungen
des Tieres oder auch über
die Bestimmung geeigneter Erkennungsmerkmale der Tiere selbst erfolgen.
Mit Hilfe eines Detektionsgerätes,
das mit der Mess- und/oder
Auswerteeinrichtung verbunden ist, kann dann für das individuelle Tier die
verschiedenen Laufradkennwerte bestimmt werden.
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Die
verschiedenen Laufkennwerte umfassen u.a. die Distanz, die Zeit
im Laufrad, die Maximalgeschwindigkeit, die Durchschnittsgeschwindigkeit,
die Anzahl der einzelnen Läufe,
die maximale Distanz der Einzelläufe,
die maximale Dauer der Einzelläufe, die
durchschnittliche Distanz der Einzelläufe und die durchschnittliche
Dauer der Einzelläufe.
Dabei werden die Kennwerte zur Bestimmung der Laufleistung bzw.
der Leistungsfähigkeit
der Versuchstiere sowohl identisch für die Bestimmung der Laufleistung
mit dem ersten einfachen Laufrad als auch zur Bestimmung der Laufleistung
mit einem zweiten komplexen Laufrad bestimmt. Bevorzugt werden dabei
mindestens zwei Kennwerte genutzt, um die Laufleistung zu bestimmen.
Weiterhin bevorzugt ist einer der herangezogenen Kennwerte, die
Maximalgeschwindigkeit, die Maximaldistanz der Einzelläufe, die
maximale Dauer der Einzelläufe,
die durchschnittliche Distanz der Einzelläufe und die durchschnittliche
Dauer der Einzelläufe.
Insbesondere ist bevorzugt, dass als Kennwert die Maximalgeschwindigkeit
bestimmt wird. Es stellte sich heraus, dass insbesondere die Maximalgeschwindigkeit
ein geeigneter Kennwert zur Bestimmung der Laufleistung und somit
für eine Aussage über die
motorischen Fähigkeiten
der Versuchstiere geeignet ist.
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Diese
oben genannten neuen Kennwerte und insbesondere die Bestimmung der
Maximalgeschwindigkeit stellten sich als bessere Kennwerte als die
bisher verwendeten Kennwerte, wie die Bestimmung der zurückgelegten
Distanz, heraus. So zeigte sich z.B. im Mausmodell der Amyotrophen
Lateralsklerose (SOD-1-Maus), dass bei Verwendung der Laufleistung
im Laufrad als Maß für den Fortschritt der
Motorneurodegeneration der Kennwert der zurückgelegten Distanz im Laufrad
erst in einem fortgeschrittenen Erkrankungsstadium relevant reduziert ist.
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Im
Gegensatz dazu zeigte sich, dass z.B. die Nutzung der Maximalgeschwindigkeit
als Maß für die Laufleistung
eine sensitivere Quantifizierung der Motorneurodegeneration erlaubt.
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Diese
Sensitivierung des Tests wird insbesondere dadurch erreicht, dass
die Tiere erfindungsgemäß in einem
ersten Schritt in einer Einrichtung gehalten werden, wie in einem
Käfig,
die mit einem einfachen Laufrad ausgestattet ist, über einen
ersten Zeitraum ausreichend, um die Tiere auf eine stabile Laufleistung
zu bringen. In diesem ersten Schritt steigern die Tiere über diesen
ersten Zeitraum, der mindestens 7 Tage umfasst, ihrer Laufkapazität kontinuierlich,
so dass sie in den folgenden Wochen in ihren Laufkennwerten eine
im Wesentlichen stabile Leistung aufzeigen, d.h. dass die Schwankungen
bei einer Gruppe von Tieren im Mittel nicht größer als 10 %, bevorzugt nicht
größer als
5 % und insbesondere nicht größer als
3 % sind.
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Durch
dieses Training in einem einfachen Laufrad, wie in einem Laufrad
mit regelmäßigen Sprossenabständen, ist
es möglich,
die Tiere so zu trainieren, dass bei Versuchsfortsetzung ein Einfluss der
kardiopulmonalen oder muskuloskeletalen Parameter auf eine Minimum
reduziert wird. Vielmehr können
Veränderungen
der Laufleistung alleine auf die Leistung des Zentralen Nervensystems
zurückgeführt werden.
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Erfindungsgemäß wird also
bei dem Verfahren bzw. dem Testsystem zur Bestimmung der motorischen
Fähigkeiten
von Tieren vor dem komplexen Laufrad ein erster Zeitraum vorgeschaltet,
in dem die Tiere in einem normalen oder einfachen Laufrad trainiert
werden, um Trainingseinflüsse
auszuschließen. Die
sequentielle Abfolge der eingesetzten Laufräder ermöglicht eine voll automatische
und sensitive Quantifizierung von spezifischen, motorischen und koordinatorischen
Leistungen des Zentralen Nervensystems (ZNS). Im Folgenden wird
dieses Verfahren bzw. dieses Testsystem auch als Motor Skill Sequence
(MOSS) bezeichnet.
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Diese
oben beschriebene Adaption der Tiere, d.h. das Antrainieren der
Tiere auf eine stabile Laufleistung schließt mögliche Fehlerquellen, wie den
Einfluss von kardiopulmonalen oder muskuloskeletalen Unterschieden
bei dem sich anschließenden
Schritt, dem Testen der Laufleistungen im komplexen Laufrad, aus.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
weiterhin den Schritt des Auswertens der Messwerte. Dabei werden
bevorzugt im Schritt a) und Schritt b) Gruppen von Tieren untersucht,
bei denen jeweils ein Teil dieser Gruppen von Tieren einer Behandlung
unterworfen wurde oder wird. Es ist weiterhin möglich genetische Veränderungen,
wie sie bei Mäusen
als knock out, knock in oder transgene Veränderungen möglich sind, im Vergleich zu
wild-typ Tieren zu erfassen.
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Eine
solche Behandlung kann z.B. die Gabe von pharmazeutisch wirksamen
Bestandteilen vor und/oder während
des erfindungsgemäßen Verfahrens
sein. Unter dem Ausdruck „Behandlung" fällt weiterhin
eine vor oder während
des Untersuchungszeitraumes durchgeführte physische Veränderung der
Tiere, wie operative Eingriffe. Durch die Bestimmung der Laufleistung
von mindestens einem Kontrolltier und einem behandelten Tier ist
es möglich, die
motorischen Fähigkeiten
der Tiere zu vergleichen und somit auch den Einfluss der Behandlung
auf die motorischen Fähigkeiten
zu bestimmen. Die Laufleistungen bzw. die abgeleiteten Kennwerte
werden mit einer entsprechenden Messeinrichtung mit Messeinheit
und Auswerteeinheit bestimmt. Bevorzugt werden dabei mindestens
zwei der oben genannten Kennwerte bestimmt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird der Schritt b) mit dem gleichen oder einem anderen komplexen
Laufrad unmittelbar im Anschluss an den zweiten Zeitraum oder nach
einer Unterbrechung wiederholt. Dieses Wiederholen ermöglicht bei
Vergleich mit den vorherigen Untersuchungsergebnissen festzustellen,
festzustellen i) ob und ii) in welchem Ausmaß eine Beeinträchtigung
bzw. auch eine Verbesserung der motorischen und koordinativen Fähigkeiten
vorliegt.
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Bei
der Messung der Messwerte ist z.B. mindestens ein Sensor so angeordnet,
dass er zur Detektion der Umdrehung der Achse des Laufrades geeignet
ist. Hieraus lassen sich die oben genannten Kennwerte, wie die Maximalgeschwindigkeit,
bestimmen.
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Dieses
oben beschriebene Verfahren lässt sich
in einem entsprechenden Testsystem durchführen. Dieses Verfahren bzw.
dieser Test stellt ein sehr sensitives Werkzeug zur Bestimmung der
motorischen und koordinatorischen Defizite sowie für das motorische
Lernen der Versuchstiere dar. Anwendungsmöglichkeiten liegen vor allem
im Bereich der neurologischen Forschung. Dabei umfassen die Anwendungen
neben Therapiestudien auch solche im Rahmen einer Phänotyp-Bestimmung
von genetisch veränderten
Mausvarianten. Weiterhin ist aufgrund seines hohen Automatisierungsgrades
und der damit verbundenen geringen Personalintensität das Testsystem
bzw. das Verfahren (MOSS) insbesondere zur Durchführung von
Screening-Untersuchungen geeignet.
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In
der Pharma-Industrie können
beispielsweise mit 500 Laufradeinheiten bei einer Gruppenstärke von
15 Tieren in einem Monat ca. 30 Substanzen bzw. Dosierungen auf
einen therapeutischen Effekt hin im Mausmodell der Multiplen Sklerose
oder auch des M. Parkinson getestet werden. Aufwendige morphologische
bzw. histologische Untersuchungen können dann im Falle eines positiven
MOSS Ergebnisses nachgeschaltet werden.
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Auch
funktionelle Beeinträchtigungen
im Rahmen anderer neurologischer Erkrankungen (z. B. Nerventrauma,
Rückenmarksläsion, Schlaganfall, Restless
legs, Dystonie, Ataxie, Polyneuropathie etc.) können mit MOSS untersucht werden.
In Mausmodellen, bei welchem die krankheitsbedingten Defizite weniger
diskret ausge prägt
sind (z. B. bei Mausmodellen der Amyotrophen Lateralsklerose) kann MOSS
selbstverständlich
ebenfalls als automatisiertes Messverfahren verwendet werden.
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In
Verbindung mit genetisch varianten Knockout-Mäusen könnten darüber hinaus diejenigen Mechanismen
aufgedeckt werden, die in dem Krankheitsmodell zu einer verbesserten
Neuroregeneration oder zu einer Neuroprotektion durch die entsprechenden
Substanzen führen.
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Da
MOSS mit dem komplexen Laufrad letztendlich die Fähigkeit
des Versuchstieres testet, motorische Fertigkeiten im Sinne von
motorischem Lernen an neue Bedingungen über die Zeit anzupassen, ist
MOSS das einzige System, mit dem es möglich ist, die Fähigkeit
des motorischen Lernens bzw. der adaptiven Lokomotion in der Maus
zu messen bzw. zu untersuchen. Aufgrund der vollständigen Automatisierung
können
pharmakologische Substanzen auf ihr Potential hin gescreent werden,
ob sie motorisches Lernen verbessern können. Substanzen mit solch
einem Potential könnten
die Möglichkeiten
der neurologischen Rehabilitation entscheidend verbessern.
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Darüber hinaus
könnte
mit Hilfe von MOSS und der Verwendung von verschiedenen Knockout-Varianten
in Verbindung mit pharmakologischen Interventionen die molekularen
Mechanismen des motorischen Lernens aufgeklärt werden. Dieses Wissen würde ebenfalls
die Möglichkeiten
der neurologischen Rehabilitation entscheidend optimieren.
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Da
MOSS auf einem „freiwilligen" bzw. spontanen Verhalten
der Versuchstiere basiert, wird MOSS allein aus tierethischer Sicht
auf eine höhere Akzeptant
treffen, als bisher durchgeführte
motorische Untersuchungen, bei welchen den Versuchstieren ein Verhalten
aufgezwängt
werden muss (z.B. Schwimmtest, Rotarod-Test, Treadmill-Test).
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Erfindungsgemäß eignet
sich das Verfahren besonders für
die Bestimmung der motorischen Fähigkeiten
bei Tieren, wie Nager, insbesondere bei Maus, Ratte, Gerbil, Hamster
oder Meerschweinchen.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich weiterhin auf eine Einrichtung
zur Bestimmung der motorischen Fähigkeit
von Tieren mit mindestens einem einfachen und mindesten einem komplexen
Laufrad, mindestens einem Sensor zur Messung von Messwerten zur
Bestimmung der Laufleistung der Tiere und eine daran angeschlossene
Messeinheit.
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Diese
Einrichtung, wie ein Käfig,
umfasst bevorzugt dabei weiterhin eine Auswerteeinheit. D.h, in einer
bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Einrichtung zur Bestimmung der motorischen Fähigkeiten
von Tieren mindestens ein einfaches und mindestens ein komplexes
Laufrad und eine Messeinrichtung zur Messung der motorischen Fähigkeiten
von Tieren, wobei diese Messeinrichtung eine Messeinheit mit angeschlossenem
Sensor(en) zur Messung von Messwerten und eine Auswerteeinheit umfasst. Das
einfache Laufrad ist dabei bevorzugt ein Laufrad mit regelmäßigen Abständen der
Sprossen, während in
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
das komplexe Laufrad ein Laufrad mit unregelmäßigen Abständen der Sprossen ist. Die
Aufnahmevorrichtung für
das Laufrad, die bevorzugt in der Einrichtung vorhanden ist, ist
so ausgebildet, dass die Laufräder einfach
ausgetauscht werden können.
Die Einrichtung selbst kann eine Einrichtung zur Haltung von Tieren
sein. Alternativ kann die Einrichtung auch mit Einheiten zur Haltung
von Tieren, wie Tierkäfigen, verbindbar
sein.
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Die
Einrichtung ist zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
geeignet. Wenn mehrere Tiere in der Einrichtung gemessen werden
sollen, so weist die Einrichtung weiterhin eine Einheit zum Erfassen
einer individuellen Kennung eines Tieres auf. Diese Einheit ist
dabei entsprechend mit der Messeinrichtung verbunden.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich weiterhin auf ein Testsystem
zur Bestimmung der motorischen Fähigkeiten
von Tieren umfassend eine erfindungsgemäße Einrichtung zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin die Messeinrichtung zur Bestimmung
der Messwerte und der abgeleiteten Kennwerte selbst. Die Messeinrichtung
ist eine Messeinrichtung zur Messung der motorischen Fähigkeiten
von Tieren mit einer Messeinheit mit angeschlossenem Sensor(en)
zur Messung von Messwerten und einer Auswerteeinheit, wobei die
Auswerteeinheit die Messwerte in die abgeleiteten Kennwerte als Maß für die Laufleistung
der Tiere umwandelt, um aus dieser Laufleistung eine Aussage über die motorischen
Fähigkeiten
der Tiere machen zu können.
Bevorzugt wird dabei eine Kombination von mindestens zwei vorbestimmten
verschiedenen Kennwerten bestimmt. Insbesondere bevorzugt ist die Messeinrichtung
in der Lage, einen abgeleiteten Kennwert ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Maximalgeschwindigkeit, Maximaldistanz der Einzelläufe, maximale
Dauer der Einzelläufe,
durchschnittliche Distanz der Einzelläufe und durchschnittliche Dauer
der Einzelläufe
zu bestimmen, wobei insbesondere bevorzugt ist, dass der Kennwert
der Maximalgeschwindigkeit bestimmt wird.
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Die
erfindungsgemäße Messeinrichtung
umfasst weiterhin eine Vorrichtung zum Erkennen einer Kennung der
Versuchstiere.
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Das
erfindungsgemäße Testsystem
bzw. das erfindungsgemäße Verfahren
(MOSS) basiert auf der Messung von Messwerten zum Erhalt von abgeleiteten
Kennwerten, für
die spontanen Laufleistungen, die Mäuse im Laufrad erbringen. Die
Laufräder
sind somit aktive Laufräder.
Dabei weist das erfindungsgemäße Verfahren
und das erfindungsgemäße Testsystem
insbesondere die folgenden Vorteile auf:
- Ad
1) Sämtliche
Messwerte und daraus abgeleitete Kennwerte werden kontinuierlich
voll automatisiert aufgezeichnet, somit ist der personelle Aufwand
maximal reduziert.
- Ad 2) Während
der Messung kommt es zu keinem Zeitpunkt zu einem Kontakt eines
Experimentators mit dem Versuchstier, so dass ein Einfluss des Experimentators
auf das Versuchsergebnis prinzipiell ausgeschlossen werden kann.
- Ad 3) Durch die Verwendung einer Laufradsequenz (zunächst z.B.
2 Wochen in einem normalen Laufrad, dann z.B. 1 Woche in einem komplexen
Laufrad) wird sichergestellt, dass die Mäuse in den ersten 2 Wochen
maximale Laufwerte erreichen. Somit sind Steigerungen der Laufradleistungen
auf dem komplexen Laufrad in der 3. Woche auf Leistungen des zentralen
Nervensystems zurückzuführen.
- Ad 4) Durch die einfache Handhabung der Hardware (Laufräder, Vorrichtung
zur Aufnahme des Laufrads (Laufradchassis) und Sensoren) und den
hohen Automati sierungsgrad des Systems können die anfallenden Aufgaben
im Tierstall (Bestücken
der Käfige
mit Laufrädern,
Austausch und Reinigung der Laufräder, Austausch der Käfige und
Umsetzen der Tiere) nach kurzer Instruktion von Tierpflegern durchgeführt werden.
- Ad 5) Durch Auslassen einiger Sprossen in einem komplexen Rhythmus,
wird das Laufen in diesen Laufrädern
erheblich erschwert und den Mäusen eine
erhebliche koordinative Leistung abverlangt. Hierdurch werden auch
geringe koordinative Defizite (u. a. auch in der re. li. Koordination)
aufgedeckt.
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Die
Laufräder
können
aus verschiedenen Materialien sein, z.B. können die Laufräder aus
Plexiglas mit Edelstahlsprossen bestehen. Dabei können die
Laufräder
so ausgebildet sein, dass die Sprossen einfach herausnehmbar und
versetzbar sind. Dadurch können
die komplexen Laufräder
neue Muster von Sprossenabständen
aufzeigen und so eine neue Überprüfung der
motorischen Fähigkeit
zu erlauben. Durch Variation der Abstände durch herausnehmbare Sprossen
ist ein wiederholtes Messen möglich.
Die Laufräder
können
in eine Aufnahmevorrichtung eingehängt werden, diese Aufnahmevorrichtung
kann z.B. aus Edelstahl bestehen. Sie erlaubt ein wiederholtes und
unkompliziertes Austauschen der Laufräder. Diese Aufnahmevorrichtung
ist ebenfalls so ausgebildet, dass sie einfach in Standardtierkäfige eingehängt oder
in anderer Weise befestigt werden kann, ohne dass die Standardtierkäfige in
irgendeiner Weise modifiziert werden müssen. Hierdurch ist es möglich, dass
technisch nicht geschulte Personen die Käfige mit den Aufnahmevorrichtungen bestücken können bzw.
den Austausch der Laufräder durchführen können. Die
Laufräder
selbst sind so ausgebildet, dass sie mit geringstem Aufwand gepflegt
und gewartet werden können.
In einem besonderen Aspekt sollten die Laufräder so ausgebildet sein, dass
das einfache Laufrad und das komplexe Laufrad ein identisches Gewicht
aufzeigen. Das Gewicht der Laufräder
selbst sollte möglichst
gering sein, um eine langes Nachlaufen der Laufräder zu verhindern und den Tieren
das Starten und Stoppen eines Laufes zu erleichtern. Beispielhaft
zeigt 4 ein einfaches Laufrad (im Hintergrund) und ein
komplexes Laufrad (im Vordergrund). Wie man der 4 entnehmen
kann, sind in dem komplexen Laufrad einige der Edelstahlsprossen
entfernt wurden, so dass ein unregelmäßiges Muster an Sprossen vorliegt.
Im Gegensatz dazu sind bei dem einfachen Laufrad die Abstände der
Sprossen re gelmäßig. Durch
einfaches Herausnehmen der Sprossen lässt sich ein einfaches Laufrad
und ein komplexes Laufrad umwandeln. Weiterhin ist eine Einrichtung zur
Bestimmung der motorischen Fähigkeit
von Tieren dargestellt, 4 oben. Wie in der Abbildung gezeigt,
lässt sich
das Laufrad einfach in einen Standardkäfig einhängen. Die Aufnahmevorrichtung
für das
Laufrad ist so ausgebildet, dass sie einerseits ein Bestücken des
Standardkäfigs
z.B. durch Einhängen erlaubt,
andererseits kann das Laufrad einfach aus der Aufnahmevorrichtung
entfernt werden.
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Der
Sensor zum Messen der Messwerte, wie z.B. der Umläufe des
Laufrads ist so ausgebildet, dass er einfach an das Laufrad an-
und abgebracht werden kann. Durch eine hohe zeitliche Auflösung des
Sensors ist es weiterhin möglich,
Geschwindigkeitsunterschiede der Mäuse kontinuierlich abzubilden.
Bevorzugt wird das Laufradsystem so ausgebildet, dass der Sensor
einfach auf die Achse des Laufrads gesteckt wird. Dies erlaubt einerseits
einen schnellen Austausch der Laufräder, andererseits kann so einfach
die Umdrehung der Achse des Laufrads bestimmt werden. Bevorzugt
haben die Sensoren eine Auflösung
von mindestens 1/16 Umdrehung des Laufrads.
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Die
Messeinrichtung mit der Messeinheit mit angeschlossenem Sensor und
der Auswerteeinheit weist dabei ein Auswerteprogramm auf, das aus
drei Komponenten besteht (MOSS-Software).
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Software:
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Die
MOSS-Software besteht aus 3 Komponenten
- 1)
Die Hauptkomponente basierend auf der graphischen Software LabViewTM entwickelt und verarbeitet kontinuierlich
die Signale der Sensoren und berechnet für jedes Tier folgende Daten:
Distanz,
Zeit im Laufrad, Maximalgeschwindigkeit, Durchschnittsgeschwindigkeit,
Anzahl der einzelnen Läufe,
maximale Distanz der Einzelläufe,
maximale Dauer der Einzelläufe,
durchschnittliche Distanz der Einzelläufe und durchschnittliche Dauer
der Einzelläufe.
Diese
Daten (Kennwerte) werden kontinuierlich gemessen, z.B. stündlich,
und addiert (Distanz, Zeit) bzw. miteinander verglichen (Maximalgeschwindigkeit)
und die Ergebnisse in definierten Zeitintervallen gespeichert (üblicherweise
alle 24 Stunden). Das zeitliche Intervall der Aufzeichnung kann
aber auch variert werden, so z.B. auch in mehrstündigen oder täglichen
Intervallen. Dadurch lassen sich z.B. auch Unterschiede in den Tag-Nachtzyklen
der Laufleistung darstellen.
- 2) Die zweite weitere, ebenfalls auf LabViewTM basierende Software-Komponente „sammelt" in einem zu definierenden
Zeitintervall alle Daten, die von der Hauptkomponente berechnet
wurde, von jedem Laufrad und speichert alle Laufdaten in ein einziges
Datenblatt pro Zeiteinheit. D.h. bei einem Zeitintervall von 1 Stunde
werden täglich
24 Datenblätter
erstellt, welche zu jedem Tier die Laufdaten der vorangegangen Stunde
enthält. Somit
lässt sich
eine zeitlich hohe Auflösung
der Laufleistung erreichen. Alternativ können die Daten aber auch in
beliebigen Intervallen (d.h. z.B. 24 Stundenwerte) mittels eines
Mat-Lab® basierten
Programms dargestellt werden. Pro Tier und Zeitintervall werden
z.B. 9 Daten aufgezeichnet, die die Laufleistungen des gesamten
Zeitintervalls abbilden. Hierdurch wird die ursprünglich riesige Datenmenge
auf ein Minimum reduziert, um eine effektive Auswertung der Daten
erst zu ermöglichen.
Wenn
einmal gestartet, arbeiten die beiden Softwarekomponenten (1 und
2) kontinuierlich. Die Daten werden täglich bzw. je nach Einstellung
in stündlichen
Intervallen generiert und aufgezeichnet und Datenblätter werden
täglich
generiert. In jedem Fall wird pro Tag ein Datenblatt generiert, dessen
Dateiname das jeweilige Datum und die Uhrzeit enthält, so dass
die Daten für
immer eindeutig zugeordnet werden können.
Die zweite Software-Komponente
dient auch der Generierung von sogenannten Warnmeldungen. Es können bestimmte
Filter eingestellt werden, die dafür sorgen, dass, wenn ein Tier
beispielsweise nur mangelnde Laufleistungen (absolut, im Vergleich
zu den Leistungen der Vortage oder im Vergleich zur Gruppenleistung)
aufweist, automatisch eine entsprechende Nachricht z.B. als e-mail oder
als SMS ans Telefon, versendet wird.
Darüber hinaus können die
generierten Datenblätter
selbst automatisch an beliebige e-mail-Adressen versendet werden.
In jedem Fall werden alle Datenblätter chronologisch auf einem Server
gesichert.
- 3) Die dritte Software-Komponente dient der automatisierten
Datenauswertung und Präsentation. Auf
Basis sämtlicher
auf dem Server abgelegten Datenblätter kann jeder Nutzer der
Laufradeinrichtung die Laufdaten abrufen. Hierzu kann er sich über einen
beliebigern Browser und von einem beliebigen Ort (im Falle eines
Internetanschlusses) einwählen. Über ein
Menü kann
er jedes Tier einer Gruppe zuordnen (z. B. Therapie, Placebo, Knockout,
Wildtyp etc.) und die gewünschte
Zeitperiode eingeben. Die Daten werden dann im Browser graphisch
dargestellt, entweder für
jedes Tier einzeln oder die Gruppendaten werden einander gegenübergestellt.
Die jeweiligen Tier- bzw. Gruppenzuordnungen werden von dem System
gespeichert, so dass die Daten sofort in der gewünschten Anordnung erscheinen. Dies
ermöglicht
mehreren Nutzern (z. B. bei einer Anlage von 500 Einheiten) sich
täglich
die aktuellen Studienverläufe
auf dem aktuellsten Stand anzeigen zu lassen bzw. einen Ausfall
oder eine Erkrankung eines Versuchstieres sofort zu erfassen.
-
Im
Falle der browser-basierten Lösung
wird eine in Filmaker programmierte Software verwendet, die auf
der Generierung einer Datenbank basiert. Eine Einzellösung (nicht
browser-basiert) wurde auf der Basis von MathLab programmiert. Hier
werden die Datenblätter
von der Software direkt ausgelesen, ohne eine Datenbank zu erzeugen.
In jedem Fall bleiben die originalen Datenblätter unverändert und besitzen somit Dokumentencharakter.
-
Im
Folgenden wird beispielhaft die Erfindung dargestellt. Es ist klar,
dass diese Beispiele nicht den Schutzumfang der Anmeldung begrenzen
sollen.
-
Beispiel 1
-
Bestimmung der Motor-skill-sequence
(MOSS) von Mäusen
-
Mäuse (C57/BL6N,
weiblich, 7 Wochen alt), die keiner Behandlung unterworfen wurden,
wurden in einer erfindungsgemäßen Einrichtung
trainiert. Dargestellt ist die Messsequenz unter Verwendung der
zwei verschiedenen Laufradtypen. Zunächst werden die Mäuse für zwei Wochen
(erster Zeitraum) mit einem einfachen Laufrad, dem so genannten
Trainingslaufrad, mit regelmäßigen Sprossenabständen bestückt. Danach
werden die Tierkäfige
mit komplexen Laufrädern
(unregelmäßige Sprossenabstände) ausgestattet
und die Laufleistung der Mäuse
wird für eine
weitere Woche festgehalten. Dargestellt ist die Laufleistung in
Umdrehungen pro Minute als Maximalgeschwindigkeit.
-
Durch
die unregelmäßigen Sprossenabstände im komplexen
Laufrad werden die Mäuse
gezwungen, die Schrittlänge
kontinuierlich an die Sprossenabstände zu adaptieren, was supraspinale
Leistungen des ZNS voraussetzt. Diese komplexere Anforderung spiegelt
sich zunächst
in einer verminderten maximalen Laufgeschwindigkeit wider. Im weiteren Verlauf
lernen die Tiere auf dem komplexen Laufrad zunehmend höhere Geschwindigkeiten
zu erreichen. Aufgrund des vorausgegangenen kardiopulmonalen und
muskuloskeletalen Trainings auf dem einfachen Laufrad, siehe 1,
Tage 1 bis Tage 14, ist jede Verbesserung der Laufgeschwindigkeit
auf dem komplexen Laufrad ausschließlich durch motorisches Lernen
des Zentralen Nervensystems (ZNS) zurückzuführen.
-
Beispiel 2
-
Untersuchungen von behandelten
oder unbehandelten Mäusen
an Beispiel des Cuprizone Modells der Multiplen Sklerose
-
Die
Versuchsreihen wurden mit 48 weiblichen C57/BL6-Mäusen (19,2 ± 1,1 g)
durchgeführt. Die
Tiere wurden einzeln unter Standardbedingungen mit Futter und Wasser
ad libitum gehalten. Die Tiere wurden zufällig in zwei Behandlungs- und
zwei Kon trollgruppen mit jeweils 12 Tieren geteilt. Mit einem Alter
von 7 Wochen beginnend wurden die Behandlungsgruppen mit 0,2 % Cuprizone
(Sigma, St. Louis, MO, USA) im Basiszuchtfutter für 6 Wochen gefüttert. C57/BL6-Mäuse unter
Cuprizone Diät
zeigten deutliche Demyelisierung (Entmarkung) im Bereich des Corpus
Callosum nach 4 bis 5 Wochen Cuprizone-Behandlung.
-
Zwei
Versuchsreihen wurden begonnen. In einem ersten Versuchsaufbau wurde
die MOSS nach 3 Wochen Cuprizone-Behandlung durchgeführt. Im zweiten
Versuchsaufbau wurde die Cuprizone-Diät nach 6 Wochen beendet und
die Tiere (n = 12) wurden für
weitere 4 Wochen bei normaler Diät
gehalten, um spontane Remyelisierung zu erlauben. Die Tiere wurden
anschließend
für 3 Wochen
dem erfindungsgemäßen Verfahren
unterworfen. In beiden Versuchsaufbauten dienten entsprechende alters-
und geschlechtspassende Tiere ohne Cuprizone-Behandlung als Kontrolle
(n = 2 × 12).
-
In
der 2 sind die Ergebnisse für die Versuchsreihe dargestellt,
bei dem die Tiere 3 Wochen nach Cuprizone-Behandlung direkt dem
erfindungsgemäßen Verfahren
und dem erfindungsgemäßen Test
unterworfen wurden. Dargestellt sind die Werte für das Trainingslaufrad (erster
Zeitraum) und das komplexe Laufrad (zweiter Zeitraum) Die Laufleistung
ist mit den Kennwerten dargestellt: die Anzahl der Läufe, 2a;
die maximale Dauer der Einzelläufe
in Sekunden, 2b; die totale zurückgelegte Distanz
in einem Zeitintervall von 24 Stunden, 2c; und
die Maximalgeschwindigkeit, 2d. Bei
einem Vergleich der Kontrollgruppe mit der Cuprizone behandelten
Gruppe ist deutlich zu erkennen, dass die motorischen Fähigkeiten
dargestellt durch die verschiedenen Kennwerte zum Aufzeigen der Laufleistung
der Tiere sich signifikant unterscheiden. Dieses ist besonders gut über die
innerhalb von 24 Stundenzurückgelegte
Distanz, 2c, und der Maximalgeschwindigkeit, 2d,
zu erkennen. Zu beachten ist dabei insbesondere der Unterschied
zwischen den Daten erhalten mit Hilfe des Trainingslaufrads und
den auf der rechten Seite der Abbildung dargestellten Daten erhalten
mit dem komplexen Laufrad. Im Trainingslaufrad zeigen Mäuse mit
Entmarkung eine geringere maximale Laufgeschwindigkeit im Vergleich
zu den behandelten Mäusen.
Dieser Unterschied der Laufleistung wird aber deutlicher sichtbar,
wenn die Mäuse
auf dem komplexen Laufrad laufen müssen.
-
In
der 3 sind die Werte der zweiten Versuchsreihe dargestellt.
Hier wurden die Tiere nach einer 6-wöchigen Diät mit Cuprizone für weitere
4 Wochen unter normalen Bedingungen gehalten, so dass eine spontane
Remyelinisierung stattfinden konnte. Wiederum sind die Zahl der
Läufe (3a),
die maximale Dauer der Einzelläufe, 3b;
die totale zurückgelegte
Distanz in einem Zeitintervall von 24 Stunden, 3c und
die Maximalgeschwindigkeit, 3d dargestellt,
auf der linken Seite die Werte mit dem einfachen Laufrad (Trainingslaufrad),
auf der rechten Seite die Werte mit dem komplexen Laufrad. Nach
Remyelinisierung wird im Trainingslaufrad kein Unterschied in den
dargestellten Laufradparametern zwischen behandelten und unbehandelten
Mäusen (rechte
Spalte, 3a-d) festgestellt. Dieses steht
im Gegensatz zu dem mit dem komplexen Laufrad erhaltenen Daten.
Hier ist ein Restdefizit trotz Remyelinisierung nach Absetzen von
Cuprizone nachweisbar.
-
Aus
diesen Daten wird deutlich, dass das erfindungsgemäße Verfahren
bzw. das Testsystem MOSS ein sehr sensitives Verfahren zur Bestimmung der
motorischen Fähigkeiten
von Tieren darstellt.