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Die Erfindung bezieht sich auf ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Detektoreinrichtung zur spektral auflösenden Strahlungsdetektion, wobei die Detektoreinrichtung mindestens ein dispersives Element, auf das ein Strahl der zu detektierenden Strahlung fällt und das diesen Strahl spektral auffächert, und eine Detektorzeile aufweist, auf die die spektral aufgefächerte Strahlung geleitet ist und deren Empfindlichkeit nur einheitlich einstellbar ist. Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren zur spektral aufgelösten Detektion von Strahlung in einem Mikroskop, wobei ein Strahl der zu detektierenden Strahlung mindestens zu einem Strahlenbündel spektral aufgefächert und auf eine Detektorzeile gerichtet wird, deren Empfindlichkeit nur einheitlich einstellbar ist.
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Im Stand der Technik ist es für Laser-Scanning-Mikroskope bekannt, eine spektral auflösende Strahlungsdetektion dadurch zu erreichen, daß ein Strahl mit der zu detektierenden Strahlung mittels eines dispersiven Elementes in ein divergierendes Strahlenbündel spektral aufgefächert und dann mittels einer Detektorzeile nachgewiesen wird. Dies ist beispielsweise in der
DE 10340020 B4 beschrieben, die eine Vorrichtung bzw. ein Verfahren der eingangs genannten Art offenbart. Gleiches findet sich auch in der
DE 10102033 A1 sowie bei dem von der Carl Zeiss Jena GmbH unter der Bezeichnung LSM 510 META vertriebenen Laser-Scanning-Mikroskop.
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Verändert man die spektrale Auffächerung, d. h. die Gegebenheiten des dispersiven Elementes nicht, erhält man bei jeder Aufnahme denselben spektralen Nachweis der Strahlung. Die spektrale Empfindlichkeit wird wesentlich durch die Empfindlichkeit der Detektorzeile vorgegeben. In der Laser-Scanning-Mikroskopie ist man deshalb gegenwärtig auf sogenannte Photomultiplierarrays (PMT) angewiesen, da diese eine optimale Intensitätsempfindlichkeit und damit eine gute spektrale Analyse ermöglichen. Die Nachweisgrenze für einzelne spektrale Anteile ist durch die Empfindlichkeit der Detektorzeile, d. h. der Photomultiplierarrays vorgegeben. Bekanntermaßen kann man Photomultiplierarrays durch Vorgabe einer Hochspannung, die eine Betriebsspannung darstellt, in ihrer Grund-Empfindlichkeit anpassen. Erhöht man die Hochspannung, steigt die Strahlungsempfindlichkeit der gesamten PMT-Zeile. Ein beliebiges Erhöhen der Hochspannung ist jedoch nicht möglich, da ansonsten einzelne Elemente der Detektorzeile außerhalb ihres linearen Arbeitsbereiches betrieben würden. Bei Photomultiplierarrays ist also die Nachweisgrenze für einzelne Spektralanteile letztlich durch den linearen Arbeitsbereich und die maximale Intensität der hellsten Spektrallinie in der nachzuweisenden Strahlung vorgegeben.
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Bis zu einem gewissen Grad kann man den Linearitätsbereich dadurch verbessert ausnutzen, daß unerwünschte Spektralbereiche im spektral aufgefächerten Strahlenbündel ausgeblendet werden, bevor sie auf die Detektorzeile fallen. Dieser Ansatz wird sowohl im Mikroskop LSM 510 META als auch in der
DE 10340020 B4 verfolgt und dazu eingesetzt, um bei der Fluoreszenzmikroskopie Anregungsspektrallinien zu unterdrücken. Es bleibt aber dann immer noch das Problem, daß die Nachweisgrenze für Spektralkomponenten durch den Linearitätsbereich der Detektorzeilen, d. h. der Photomultiplierarrays festgelegt ist.
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Ferner ist aus der
WO 03/033995 A1 eine Messvorrichtung mit optimierten getrennten Strahlengängen bekannt.
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Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung bzw. ein Verfahren der eingangs genannten Art derart weiterzubilden, daß bei gegebenem Linearitätsbereich der Detektorzeile eine verbesserte Intensitätsauflösung für schwache Spektrallinien erreicht ist.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.
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Die erfindungsgemäße Lösung sieht weiter ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 6 vor.
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Die Erfindung geht von der im Stand der Technik bislang nicht angesprochenen Erkenntnis aus, daß durch Aufteilung der spektral aufgefächerten Strahlung auf zwei Detektorzeilen jede Detektorzeile für sich hinsichtlich ihrer nur einheitlich einstellbaren Grund-Empfindlichkeit und somit hinsichtlich ihres Linearitätsbereiches optimal auf die Intensitätsverteilung im jeweiligen spektral aufgefächerten Strahlenbündel angepaßt werden kann. Damit ist es nun möglich, eine Eigenschaft gängiger Photomultiplierarrays auszunützen, die sich ansonsten bislang nachteilig auswirkte. Photomultiplierarrays weisen nämlich, wie andere Detektorzeilen im übrigen auch, eine spektral abhängige Grund-Empfindlichkeit auf, die üblicherweise durch eine den Einzel-Photomultipliern vorgeordnete Szintillatorschicht bedingt ist. Diese systembedingt bei Photomultiplierarrays erforderliche Szintillatorschicht setzt die einfallenden Photonen in Elektronen um, die dann von den Einzel-Photomultipliern nachgewiesen werden. Eine als Konvertierungsfaktor wirkende Quantenausbeute (oder Photonenausbeute) ist dabei von der Photonenfrequenz, d. h. von der Wellenlänge der einfallenden Strahlung abhängig. Die spektral abhängige Grund-Empfindlichkeit führte im Stand der Technik dazu, daß auch bei spektraler Auffächerung von Weißlicht, d. h. von Strahlung, in der alle Spektralkomponenten annähernd gleich verteilt sind, einzelne Spektralanteile mit höherer Intensität nachgewiesen wurden, als andere. Die mit höherer Photonenausbeute nachgewiesenen Spektralanteile stellen deshalb naturgemäß relativ schnell eine Obergrenze für den linearen Arbeitsbereich dar. Das erfindungsgemäße Konzept erlaubt es nun, für die einzelnen Detektorzeilen unterschiedliche spektrale oder spektral-unabhängige Grund-Empfindlichkeiten, z. B. Szintillatorschichten und/oder Hochspannungseinstellungen, zu verwenden, wodurch der lineare Arbeitsbereich zusätzlich vergrößert ist.
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Es ist deshalb eine Ausgestaltung der Erfindung bevorzugt, daß die Detektorzeilen jeweils eine Szintillatorschicht mit nachgeordneten Photomultiplier–Einzelelementen aufweisen, wobei die Szintillatorschichten der Detektorzeilen sich in ihrer spektralen Empfindlichkeit unterscheiden. Für das Verfahren ist analog bevorzugt, daß für die Detektorzeilen Photomultiplierarrays verwendet werden, die jeweils eine Szintillatorschicht aufweisen, wobei die spektrale Empfindlichkeit der Szintillatorschichten unterschiedlich gewählt wird.
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Den mehreren Detektorzeilen ist dabei ein gemeinsames dispersives Element zuzuordnen. Die Detektorzeilen liegen dann im aufgefächerten Strahlenbündel nebeneinander. Es wäre auch möglich, mehrere spektral aufgefächerte Strahlenbündel zu erzeugen, in denen jeweils ein oder mehrere Detektorzeilen liegen, wobei die spektrale Auffächerung in den einzelnen Bündeln unterschiedlich ist. Vorzugsweise ist die Auffächerung so gewählt, daß die Spektralbereiche der einzelnen Bündel aneinander anschließen. Natürlich kann man in jedem Bündel eine Detektorzeile oder zwei, drei, vier (oder sogar mehr) nebeneinanderliegende Detektorzeilen verwenden.
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Neben der Erweiterung des Linearitätsbereichs bei gleichbleibenden Detektorzeileneigenschaften, ermöglicht die Erfindung zusätzlich noch, den erfaßten Spektralbereich oder die spektrale Auflösung über das bekannte Maß zu steigern. Der ausgewählte Spektralbereich kann zwischen 350 und 1000 nm liegen, und die spektrale Auflösung, d. h. der von den Einzelelementen der Detektorzeilen erfaßte Spektralbereich, kann zwischen 1 und 100 nm, vorzugsweise zwischen 20 und 50 nm, idealerweise zwischen 30 und 40 nm liegen.
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Die Erfindung ermöglicht mit handelsüblichen Detektorzeilen, deren Grund-Empfindlichkeit lediglich nur einheitlich, z. B. durch Vorgabe der Hochspannung, einstellbar ist, in getrennten Spektralbereichen eine unterschiedliche Empfindlichkeitseinstellung vorzunehmen. Damit ist nicht nur der Linearitätsbereich erhöht, auch kann eine bessere Gleichförmigkeit der spektralen Empfindlichkeit über den erfaßten Spektralbereich hinweg erreicht werden, da die einzelnen Detektorzeilen entweder mit unterschiedlicher spektraler Empfindlichkeit ausgestattet sind/werden und/oder eine variierende spektrale Empfindlichkeit durch entsprechende Verstärkungseinstellung ausgeglichen werden kann. PMT-Zeilen sind hier als ein Beispiel für hochempfindliche Detektorzeilen genannt, die die Eigenschaften haben, daß die Grund-Empfindlichkeit im Betrieb eingestellt werden kann – allerdings nur für die gesamte Zeile einheitlich und nicht zellenindividuell. Unter einer Detektorzeile ist hier weiter ein Nachweiselement für Strahlung verstanden, das 2 bis n entlang einer Linie aufgereihte Einzelzellen hat, die jeweils Strahlung detektieren und ein entsprechendes Signal ausgeben, wobei die Einzelzellen nur einheitlich in ihrer Grund-Empfindlichkeit einstellbar sind. Die Einzelzellen sind dabei in einem Bauteil zusammengefaßt und üblicherweise auf einem gemeinsamen Substrat hergestellt, da aus Kostengründen vorteilhafterweise halbleitertechnische Produktion verwendet wird.
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Die Einzelelemente können grundsätzlich unabhängig ausgelesen werden. Es ist deshalb als unter Umständen eigenständige Realisierung vorgesehen, zwei oder mehr Einzelelemente, die in einer oder mehr Detektorzeilen liegen können, bezüglich der Signalauslesung zusammenzufassen. Dies reduziert den Auswerteaufwand auf die wirklich benötigten Spektralkanäle.
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Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung liegt also darin, daß handelsübliche Detektorzeilen, beispielsweise in Form von PMT, beibehalten werden können und dennoch eine verbesserte spektrale Nachweisleistung erzielt wird. Aufwendig herzustellende und damit kostenträchtige Spezial-Detektorzeilen sind nicht nötig.
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Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielhalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:
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1 ein Mikroskop mit einem Detektormodul gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung,
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2 ein Mikroskop mit einem Detektormodul gemäß einer alternativen Bauweise,
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3 verschiedene Empfindlichkeitskurven für Detektorzeilen, die in den Ausführungsformen gemäß 1 oder 2 zur Anwendung kommen können,
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4 schematisch Einzelheiten des Anschlusses der Detektorzeilen und
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5 ein Mikroskop mit einem Detektormodul nach dem Stand der Technik.
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Vor der Erläuterung der Erfindung soll zur Verdeutlichung ein Mikroskop M mit einem Detektormodul 1 nach dem Stand der Technik geschildert werden, wie es in 5 gezeigt ist. Das Detektormodul 1 greift das im LSM 510 META der Carl Zeiss Jena GmbH realisierte Prinzip auf. Die im Mikroskop M zu detektierende Strahlung liegt in Form eines Strahls 2 vor und wird mittels eines Gitters 3 in einen Strahl-Fächer 4 spektral aufgeteilt, der ein divergierendes Strahlenbündel darstellt. Die Strahlen des Fächers 4 haben abhängig vom Winkel zur optischen Achse des einfallenden Strahls 2 unterschiedlich spektrale Zusammensetzung.
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In den Fächer 4 ist eine PMT-Zeile 5 gestellt, die als Detektorzeile dient. Die Zeile 5 wird durch ein Elektronikmodul 6 mit Betriebsspannung versorgt, und die Meßwerte der Zeile 5 werden vom Elektronikmodul 6 ausgelesen. Das Elektronikmodul 6 ist seinerseits mit einem Steuergerät 7 verbunden, das im Mikroskop M zumindest den Betrieb des Detektormoduls 1 steuert, die entsprechenden Meßwerte sammelt und gegebenenfalls für andere Einheiten bereitstellt.
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Die PMT-Zeile 5 verfügt über einzelne PMT-Zellen 8, die nach dem bekannten Photomultiplier-Prinzip arbeiten und denen eine gemeinsame Szintillatorschicht 9 vorgeordnet ist. Die Szintillatorschicht 9 wandelt die Photonen des Fächers 4 in Elektronen um, die von den PMT-Zellen 8 nachgewiesen werden. Die zum Nachweis erfolgende Elektronen-Verstärkung ist durch eine Hochspannung eingestellt, die vom Elektronikmodul 6 vorgegeben und der PMT-Zeile 5 nur einheitlich zugeführt werden kann. Eine individuelle Einstellung der Verstärkung und damit der Nachweisempfindlichkeit der PMT-Zellen 8 ist prinzipbedingt nicht möglich. Dies gilt für eine Vielzahl an Detektorzeilen, für die exemplarisch hier eine PMT-Zeile erwähnt ist.
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Im Mikroskop nach dem Stand der Technik stellt das Steuergerät 7 die Verstärkung, die vom Elektronikmodul 6 durch die Hochspannungseinstellung bewirkt wird, also so ein, daß an der intensivsten Spektrallinie, die auf die PMT-Zeile 5 fällt, die entsprechenden PMT-Zelle 8 gerade noch nicht in der Sättigung ist. Dadurch ist die Nachweisgrenze für schwache Spektralanteile im Fächer 4 vorgegeben.
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Das erfindungsgemäße Mikroskop M ist hinsichtlich seines Detektormoduls 1 in 1 schematisch dargestellt und unterscheidet sich vom Detektormodul 1 der 5 dahingehend, daß mehrere PMT-Zeilen 5 vorgesehen sind. Die entsprechenden mehrfach vorgesehenen Bauteile sind in der Darstellung in der 1 durch die Anfügung ”.1” bzw. ”.2” gekennzeichnet und ansonsten mit denselben Bezugszeichen wie in 4 versehen. Bauteile mit identischer Funktion tragen ebenfalls das gleiche Bezugszeichen wie in 5, so daß auf ihre Erläuterung hier weitgehend verzichtet werden kann. Im Detektormodul 1 der 1 liegen zwei PMT-Zeilen 5.1 und 5.2 im Fächer 4 nebeneinander. Sie weisen gegenüber der PMT-Zeile 5 der 5 die halbe Anzahl an PMT-Zellen 8.1 bzw. 8.2 auf, so daß insgesamt das erfaßte Spektralband und die erzielte spektrale Auflösung unverändert bleibt. Der in 1 dargestellte Spalt zwischen den PMT-Zeilen 5.1 und 5.2 ist lediglich zur Verdeutlichung und Unterscheidung der Detektorzeilen eingezeichnet – in Wirklichkeit schließen die Detektorzeilen möglichst nahtlos aneinander.
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Jede Detektorzeile im Detektormodul 1 der 1 ist mit einem eigenen Elektronikmodul 6.1 bzw. 6.2 verbunden, so daß die Verstärkungseinstellung individuell für die Detektorzeilen (für jede Detektorzeile dann natürlich wieder nur einheitlich) eingestellt ist. Hierzu wertet das Steuergerät 7 beispielsweise die jeweils hellsten Spektrallinien in den Bildsignalen der Detektorzeilen aus und stellt die Verstärkung über die Hochspannungsvorgabe des jeweiligen Elektronikmoduls 6.1 und 6.2 geeignet ein.
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Eine alternative Bauweise zeigt 2. Hier wird der nachzuweisende Strahl 10 des Mikroskops M zuerst über einen Strahlteiler 11 aufgeteilt, so daß er als Strahl 2.1 bzw. Strahl 2.2 (letzterer gegebenenfalls unter Zwischenschaltung eines Umlenkspiegels 12) auf ein Gitter 3.1 bzw. 3.2 fällt. Jedes Gitter erzeugt dann wieder einen Strahlfächer 4.1 bzw. 4.2, der auf eine PMT-Zeile 5.1 bzw. 5.2 gerichtet ist, welche von einem Elektronikmodul 6.1 bzw. 6.2 versorgt wird. Im Unterschied zur Bauweise gemäß 1 ist also bei der Variante der 2 die Erzeugung von zwei spektral aufgefächerten Strahlenbündeln in Form der Fächer 4.1 und 4.2 vorgesehen, wodurch gegenüber der Bauweise der 1 der erfaßte Spektralbereich oder die erreichte Auflösung verdoppelt ist, wenn die Anzahl an Einzelelementen der Detektorzeilen gegenüber der Bauweise gemäß 4 gleich bleibt. Der Nachteil dieser Bauweise liegt darin, daß der nachzuweisende Strahl 10 zuerst mit einem Strahlteiler 11 aufgeteilt werden muß, was naturgemäß einen gewissen Intensitätsverlust in den dann auf die Gitter 3.1 und 3.2 fallenden Strahlen 2.1 und 2.2 zur Folge hat. Die Verwendung eines geeigneten dichroitischen Strahlteilers kann dies zu einem gewissen Maß ausgleichen bzw. vermeiden.
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Für die Bauweisen der 1 und 2 kann in den Szintillatorschichten 9.1 bzw. 9.2 eine auf den Spektralbereich, der auf die jeweilige Detektorzeile fällt, angepaßte spektrale Grund-Empfindlichkeit gewählt werden. 3 zeigt exemplarisch und stark vereinfacht zwei Empfindlichkeitskurven 13 und 14 für unterschiedliche Szintillatormaterialien, die abhängig von der Wellenlänge λ eine unterschiedliche spektrale Empfindlichkeit S aufweisen, d. h. sie konvertieren einfallende Photonen mit spektral abhängiger Quantenausbeute in Elektronen. Die Verwendung von mindestens zwei Detektorzeilen erlaubt es nun, die Detektorzeilen zum einen mit einem Szintillatormaterial zu versehen, das für den jeweiligen (Teil-)Spektralbereich optimale Quantenausbeute liefert. Zum anderen kann durch die Einstellung der Verstärkung eine unterschiedliche Quantenausbeute im Spektralbereich, der auf die Detektorzeile 5.1 bzw. 5.2 fällt, besser ausgeglichen werden.
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4 verdeutlicht, daß die Signalauslesung bei den Detektorzeilen nicht auf die Verteilung der Einzelzellen 8.1 bzw. 8.2 auf die beiden Detektorzeilen Rücksicht nehmen muß. Die zwei oder mehr Detektorzeilen sind zwar hinsichtlich der Einstellung der Gund-Empfindlichkeit, d. h. im geschilderten Ausführungsbeispiel hinsichtlich der Elektronikmodule 6 separat. 4 zeigt, daß aber für jede Detektorzeile hinsichtlich des Signal-Abgriffs bzw. der Signalauswertung die Zellen 8.1 bzw. 8.2 in beliebiger Weise zusammengefaßt werden können. Im Beispiel der 4 sind drei PMT-Zellen, die im spektralen Fächer 4 nahe des Randes liegen, zusammengefaßt. Jede Einzelzelle 8.1 bzw. 8.2 ist über eine Auswerteleitung 15 mit einer Auswerteschaltung verbunden. Die übrigen Zellen werden von einer ersten Auswerteschaltung 16 und die randnahen Zellen von einer zweiten Auswerteschaltung 17 ausgelesen. Beide Auswerteschaltungen erfassen also Einzelzellen aus beiden Detektorzeilen. Jede Auswerteschaltung 16, 17 ist weiter mit dem Steuergerät 7 verbunden, das so für die individuell ausgelesenen Einzelzellen jeweils eigene Auswertesignale sowie für die zusammengefaßten Einzelzellen ein gemeinsames Auswertesignal erhält. Das Zusammenfassen von Einzelzellen ist nicht auf randnahe Zellen beschränkt; beliebige Kombinationen sind möglich. Auch muß das Zusammenfassen nicht, wie in 5 schematisch dargestellt, durch elektrisches Verbinden von Ausleseleitungen erfolgen, sondern kann auch datentechnisch in der jeweiligen Auswerteschaltung auf Signalverarbeitungsebene erfolgen.
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Die auswertungsmäßige Zusammenfassung von Einzelzellen hat den Vorteil, daß Spektralbereiche, die im zu detektierenden Lichtstrahl nicht voneinander unterschieden werden müssen, jedoch für eine Bildgewinnung von Interesse sind, auf einfache Weise summiert nachgewiesen werden können, ohne dafür unnötigen Aufwand zu betreiben. Die Zahl der spektralen Kanäle ist dann auf das anwendungserforderliche begrenzt. Wendet man dieses Prinzip, wie in 4 dargestellt, auf die erfindungsgemäße Verwendung mehrerer Detektorzeilen an, können, wie 4 am Beispiel der zweiten Auswerteschaltung 17 verdeutlicht, die zusammengefaßten Spektralkanäle, d. h. die auswertetechnisch zusammengeschalteten Einzelzellen beliebig auf die Detektorzeilen verteilt seien. Man wird dabei zweckmäßigerweise immer diejenigen Einzelzellen zusammenfassen, die spektrale Anteile im Fächer 4 erhalten, welche nicht einzeln unterschieden werden müssen.
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Insbesondere bei PMT-Zeilen ist es vorteilhaft, wenn die zusammengefaßten Einzelzellen nicht nur hinsichtlich ihrer Signalauswertung zusammengelegt sind, sondern auch hinsichtlich der Ansteuerung, die bei PMT-Zellen relativ aufwendig und bei einer schnellen Auslesung auch zeitkritisch sein kann. Die Zusammenfassung reduziert dann insbesondere die zeitlichen Anforderungen, die für einen schnellen Betrieb einzuhalten sind.
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4 verdeutlicht schließlich zusätzlich exemplarisch, daß ganz allgemein die mehreren Detektorzeilen eine unterschiedliche Anzahl an Einzelzellen enthalten können. Wesentlich ist lediglich, daß Detektorzeilen im eingangs genannten Sinne verwendet werden, da eine Aggregation von Einzelempfängern einen vergleichsweise sehr viel höheren Aufwand, insbesondere bei der Justage, mit sich brächte.