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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer
Detektoreinrichtung zur spektral auflösenden Strahlungsdetektion, wobei
die Detektoreinrichtung mindestens ein dispersives Element, auf
das ein Strahl der zu detektierenden Strahlung fällt und das diesen Strahl spektral
auffächert,
und eine Detektorzeile aufweist, auf die die spektral aufgefächerte Strahlung
geleitet ist und deren Empfindlichkeit nur einheitlich einstellbar
ist. Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren zur spektral
aufgelösten
Detektion von Strahlung in einem Mikroskop, wobei ein Strahl der
zu detektierenden Strahlung mindestens zu einem Strahlenbündel spektral
aufgefächert
und auf eine Detektorzeile gerichtet wird, deren Empfindlichkeit
nur einheitlich einstellbar ist.
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Im
Stand der Technik ist es für
Laser-Scanning-Mikroskope bekannt, eine spektral auflösende Strahlungsdetektion
dadurch zu erreichen, daß ein Strahl
mit der zu detektierenden Strahlung mittels eines dispersiven Elementes
in ein divergierendes Strahlenbündel
spektral aufgefächert
und dann mittels einer Detektorzeile nachgewiesen wird. Dies ist beispielsweise
in der
DE 10340020
B4 beschrieben, die eine Vorrichtung bzw. ein Verfahren
der eingangs genannten Art offenbart. Gleiches findet sich auch
in der
DE 10102033
A1 sowie bei dem von der Carl Zeiss Jena GmbH unter der
Bezeichnung LSM 510 META vertriebenen Laser-Scanning-Mikroskop.
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Verändert man
die spektrale Auffächerung, d.
h. die Gegebenheiten des dispersiven Elementes nicht, erhält man bei
jeder Aufnahme denselben spektralen Nachweis der Strahlung. Die
spektrale Empfindlichkeit wird wesentlich durch die Empfindlichkeit
der Detektorzeile vorgegeben. In der Laser-Scanning-Mikroskopie
ist man deshalb gegenwärtig
auf sogenannte Photomultiplierarrays (PMT) angewiesen, da diese
eine optimale Intensitätsempfindlichkeit
und damit eine gute spektrale Analyse ermöglichen. Die Nachweisgrenze
für einzelne
spektrale Anteile ist durch die Empfindlichkeit der Detektorzeile,
d. h. der Photomultiplierarrays vorgegeben. Bekanntermaßen kann
man Photomultiplierarrays durch Vorgabe einer Hochspannung, die
eine Betriebsspannung darstellt, in ihrer Grund-Empfindlichkeit
anpassen. Erhöht
man die Hochspannung, steigt die Strahlungsempfindlichkeit der gesamten PMT-Zeile.
Ein beliebiges Erhöhen
der Hochspannung ist jedoch nicht möglich, da ansonsten einzelne Elemente
der Detektorzeile außerhalb
ihres linearen Arbeitsbereiches betrieben würden. Bei Photomultiplierarrays
ist also die Nachweisgrenze für
einzelne Spektralanteile letztlich durch den linearen Arbeitsbereich
und die maximale Intensität
der hellsten Spektrallinie in der nachzuweisenden Strahlung vorgegeben.
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Bis
zu einem gewissen Grad kann man den Linearitätsbereich dadurch verbessert
ausnutzen, daß unerwünschte Spektralbereiche
im spektral aufgefächerten
Strahlenbündel
ausgeblendet werden, bevor sie auf die Detektorzeile fallen. Dieser
Ansatz wird sowohl im Mikroskop LSM 510 META als auch in der
DE 10340020 B4 verfolgt
und dazu eingesetzt, um bei der Fluoreszenzmikroskopie Anregungsspektrallinien
zu unterdrücken.
Es bleibt aber dann immer noch das Problem, daß die Nachweisgrenze für Spektralkomponenten
durch den Linearitätsbereich der
Detektorzeilen, d. h. der Photomultiplierarrays festgelegt ist.
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Der
Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung bzw.
ein Verfahren der eingangs genannten Art derart weiterzubilden,
daß bei
gegebenem Linearitätsbereich
der Detektorzeile eine verbesserte Intensitätsauflösung für schwache Spektrallinien erreicht
ist.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einer
Vorrichtung der eingangs genannten Art gelöst, bei der mindestens zwei
Detektorzeilen in der Detektoreinrichtung vorgesehen sind, die mit
spektral aufgefächerter
Strahlung unterschiedlicher spektraler Zusammensetzung bestrahlt
sind, wobei bei der Empfindlichkeitseinstellung der Detektorzeilen
die jeweilige spektrale Zusammensetzung der Strahlung und die jeweilige
spektrale Grund-Empfindlichkeit der Detektorzeile berücksichtigt
ist. Die erfindungsgemäße Lösung sieht
weiter ein Verfahren der eingangs genannten Art vor, bei dem mindestens
zwei Detektorzeilen verwendet werden und deren Empfindlichkeit unter
Berücksichtigung
der jeweiligen spektralen Zusammensetzung der Strahlung und der
jeweiligen spektralen Grund-Empfindlichkeit der Detektorzeile eingestellt
wird.
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Die
Erfindung geht von der im Stand der Technik bislang nicht angesprochenen
Erkenntnis aus, daß durch
Aufteilung der spektral aufgefächerten
Strahlung auf zwei Detektorzeilen jede Detektorzeile für sich hinsichtlich
ihrer nur einheitlich einstellbaren Grund-Empfindlichkeit und somit
hinsichtlich ihres Linearitätsbereiches
optimal auf die Intensitätsverteilung
im jeweiligen spektral aufgefächerten Strahlenbündel angepaßt werden
kann. Damit ist es nun möglich,
eine Eigenschaft gängiger
Photomultiplierarrays auszunützen,
die sich ansonsten bislang nachteilig auswirkte. Photomultiplierarrays
weisen nämlich,
wie andere Detektorzeilen im übrigen
auch, eine spektral abhängige
Grund-Empfindlichkeit auf, die üblicherweise
durch eine den Einzel-Photomultipliern
vorgeordnete Szintillatorschicht bedingt ist. Diese systembedingt
bei Photomultiplierarrays erforderliche Szintillatorschicht setzt
die einfallenden Photonen in Elektronen um, die dann von den Einzel-Photomultipliern
nachgewiesen werden. Eine als Konvertierungsfaktor wirkende Quantenausbeute
(oder Photonenausbeute) ist dabei von der Photonenfrequenz, d. h.
von der Wellenlänge
der einfallenden Strahlung abhängig.
Die spektral abhängige Grund-Empfindlichkeit
führte
im Stand der Technik dazu, daß auch
bei spektraler Auffächerung
von Weißlicht,
d. h. von Strahlung, in der alle Spektralkomponenten annähernd gleich
verteilt sind, einzelne Spektralanteile mit höherer Intensität nachgewiesen
wurden, als andere. Die mit höherer
Photonenausbeute nachgewiesenen Spektralanteile stellen deshalb
naturgemäß relativ
schnell eine Obergrenze für
den linearen Arbeitsbereich dar. Das erfindungsgemäße Konzept
erlaubt es nun, für
die einzelnen Detektorzeilen unterschiedliche spektrale oder spektral-unabhängige Grund-Empfindlichkeiten,
z.B. Szintillatorschichten und/oder Hochspannungseinstellungen,
zu verwenden, wodurch der lineare Arbeitsbereich zusätzlich vergrößert ist.
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Es
ist deshalb eine Ausgestaltung der Erfindung bevorzugt, daß die Detektorzeilen
jeweils eine Szintillatorschicht mit nachgeordneten Photomultiplier-Einzelelementen
aufweisen, wobei die Szintillatorschichten der Detektorzeilen sich
in ihrer spektralen Empfindlichkeit unterscheiden. Für das Verfahren
ist analog bevorzugt, daß für die Detektorzeilen
Photomultiplierarrays verwendet werden, die jeweils eine Szintillatorschicht
aufweisen, wobei die spektrale Empfindlichkeit der Szintillatorschichten
unterschiedlich gewählt
wird.
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Die
mehreren Detektorzeilen können
nun prinzipiell auf zwei unterschiedliche Arten eingesetzt werden.
Zum einen kann man die Detektorzeilen einem gemeinsamen dispersiven
Element nachordnen. Die Detektorzeilen liegen dann im aufgefächerten
Strahlenbündel
nebeneinander. Alternativ ist es möglich, mehrere spektral aufgefächerte Strahlenbündel zu
erzeugen, in denen jeweils ein oder mehrere Detektorzeilen liegen,
wobei die spektrale Auffächerung
in den einzelnen Bündeln
unterschiedlich ist. Vorzugsweise ist die Auffächerung so gewählt, daß die Spektralbereiche
der einzelnen Bündel
aneinander anschließen.
Natürlich
kann man in jedem Bündel eine
Detektorzeile oder zwei, drei, vier (oder sogar mehr) nebeneinanderliegende
Detektorzeilen verwenden.
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Neben
der Erweiterung des Linearitätsbereichs
bei gleichbleibenden Detektorzeileneigenschaften, ermöglicht die
Erfindung zusätzlich
noch, den erfaßten
Spektralbereich oder die spektrale Auflösung über das bekannte Maß zu steigern.
Der ausgewählte
Spektralbereich kann zwischen 350 und 1000 nm liegen, und die spektrale
Auflösung,
d. h. der von den Einzelelementen der Detektorzeilen erfaßte Spektralbereich,
kann zwischen 1 und 100 nm, vorzugsweise zwischen 20 und 50 nm,
idealerweise zwischen 30 und 40 nm liegen.
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Die
Erfindung ermöglicht
mit handelsüblichen
Detektorzeilen, deren Grund-Empfindlichkeit lediglich nur einheitlich,
z. B. durch Vorgabe der Hochspannung, einstellbar ist, in getrennten
Spektralbereichen eine unterschiedliche Empfindlichkeitseinstellung
vorzunehmen. Damit ist nicht nur der Linearitätsbereich erhöht, auch
kann eine bessere Gleichförmigkeit
der spektralen Empfindlichkeit über
den erfaßten
Spektralbereich hinweg erreicht werden, da die einzelnen Detektorzeilen
entweder mit unterschiedlicher spektraler Empfindlichkeit ausgestattet sind/werden
und/oder eine variierende spektrale Empfindlichkeit durch entsprechende
Verstärkungseinstellung
ausgeglichen werden kann. PMT-Zeilen sind hier als ein Beispiel
für hochempfindliche
Detektorzeilen genannt, die die Eigenschaften haben, daß die Grund-Empfindlichkeit im
Betrieb eingestellt werden kann – allerdings nur für die gesamte
Zeile einheitlich und nicht zellenindividuell. Unter einer Detektorzeile
ist hier weiter ein Nachweiselement für Strahlung verstanden, das
2 bis n entlang einer Linie aufgereihte Einzelzellen hat, die jeweils
Strahlung detektieren und ein entsprechendes Signal ausgeben, wobei
die Einzelzellen nur einheitlich in ihrer Grund-Empfindlichkeit
einstellbar sind. Die Einzelzellen sind dabei in einem Bauteil zusammengefaßt und üblicherweise
auf einem gemeinsamen Substrat hergestellt, da aus Kostengründen vorteilhafterweise halbleitertechnische
Produktion verwendet wird.
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Die
Einzelelemente können
grundsätzlich unabhängig ausgelesen
werden. Es ist deshalb als unter Umständen eigenständige Realisierung
vorgesehen, zwei oder mehr Einzelelemente, die in einer oder mehr
Detektorzeilen liegen können,
bezüglich der
Signalauslesung zusammenzufassen. Dies reduziert den Auswerteaufwand
auf die wirklich benötigten
Spektralkanäle.
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Ein
wesentlicher Vorteil der Erfindung liegt also darin, daß handelsübliche Detektorzeilen,
beispielsweise in Form von PMT, beibehalten werden können und
dennoch eine verbesserte spektrale Nachweisleistung erzielt wird.
Aufwendig herzustellende und damit kostenträchtige Spezial-Detektorzeilen
sind nicht nötig.
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Die
Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielhalber
noch näher erläutert. In
den Zeichnungen zeigt:
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1 ein
Mikroskop mit einem Detektormodul gemäß einer ersten Ausführungsform
der Erfindung,
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2 ein
Mikroskop mit einem Detektormodul gemäß einer zweiten Ausführungsform,
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3 verschiedene
Empfindlichkeitskurven für
Detektorzeilen, die in den Ausführungsformen
gemäß 1 oder 2 zur
Anwendung kommen können,
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4 schematisch
Einzelheiten des Anschlusses der Detektorzeilen und
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5 ein
Mikroskop mit einem Detektormodul nach dem Stand der Technik.
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Vor
der Erläuterung
der Erfindung soll zur Verdeutlichung ein Mikroskop M mit einem
Detektormodul 1 nach dem Stand der Technik geschildert werden,
wie es in 5 gezeigt ist. Das Detektormodul 1 greift
das im LSM 510 META der Carl Zeiss Jena GmbH realisierte Prinzip
auf. Die im Mikroskop M zu detektierende Strahlung liegt in Form
eines Strahls 2 vor und wird mittels eines Gitters 3 in
einen Strahl-Fächer 4 spektral
aufgeteilt, der ein divergierendes Strahlenbündel darstellt. Die Strahlen
des Fächers 4 haben
abhängig
vom Winkel zur optischen Achse des einfallenden Strahls 2 unterschiedlich spektrale
Zusammensetzung.
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In
den Fächer 4 ist
eine PMT-Zeile 5 gestellt, die als Detektorzeile dient.
Die Zeile 5 wird durch ein Elektronikmodul 6 mit
Betriebsspannung versorgt, und die Meßwerte der Zeile 5 werden
vom Elektronikmodul 6 ausgelesen. Das Elektronikmodul 6 ist
seinerseits mit einem Steuergerät 7 verbunden,
das im Mikroskop M zumindest den Betrieb des Detektormoduls 1 steuert,
die entsprechenden Meßwerte
sammelt und gegebenenfalls für
andere Einheiten bereitstellt.
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Die
PMT-Zeile 5 verfügt über einzelne PMT-Zellen 8,
die nach dem bekannten Photomultiplier-Prinzip arbeiten und denen eine gemeinsame Szintillatorschicht 9 vorgeordnet
ist. Die Szintillatorschicht 9 wandelt die Photonen des
Fächers 4 in Elektronen
um, die von den PMT-Zellen 8 nachgewiesen
werden. Die zum Nachweis erfolgende Elektronen-Verstärkung ist
durch eine Hochspannung eingestellt, die vom Elektronikmodul 6 vorgegeben und
der PMT-Zeile 5 nur einheitlich zugeführt werden kann. Eine individuelle
Einstellung der Verstärkung und
damit der Nachweisempfindlichkeit der PMT-Zellen 8 ist
prinzipbedingt nicht möglich.
Dies gilt für
eine Vielzahl an Detektorzeilen, für die exemplarisch hier eine
PMT-Zeile erwähnt
ist.
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Im
Mikroskop nach dem Stand der Technik stellt das Steuergerät 7 die
Verstärkung,
die vom Elektronikmodul 6 durch die Hochspannungseinstellung
bewirkt wird, also so ein, daß an
der intensivsten Spektrallinie, die auf die PMT-Zeile 5 fällt, die
entsprechenden PMT-Zelle 8 gerade noch nicht in der Sättigung
ist. Dadurch ist die Nachweisgrenze für schwache Spektralanteile
im Fächer 4 vorgegeben.
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Das
erfindungsgemäße Mikroskop
M ist hinsichtlich seines Detektormoduls 1 in 1 schematisch
dargestellt und unterscheidet sich vom Detektormodul 1 der 5 dahingehend, daß mehrere PMT-Zeilen 5 vorgesehen
sind. Die entsprechenden mehrfach vorgesehenen Bauteile sind in
der Darstellung in der 1 durch die Anfügung ".1" bzw. ".2" gekennzeichnet und
ansonsten mit denselben Bezugszeichen wie in 4 versehen.
Bauteile mit identischer Funktion tragen ebenfalls das gleiche Bezugszeichen
wie in 5, so daß auf
ihre Erläuterung
hier weitgehend verzichtet werden kann. Im Detektormodul 1 der 1 liegen
zwei PMT-Zeilen 5.1 und 5.2 im Fächer 4 nebeneinander.
Sie weisen gegenüber
der PMT-Zeile 5 der 5 die halbe
Anzahl an PMT-Zellen 8.1 bzw. 8.2 auf, so daß insgesamt das
erfaßte
Spektralband und die erzielte spektrale Auflösung unverändert bleibt. Der in 1 dargestellte
Spalt zwischen den PMT-Zeilen 5.1 und 5.2 ist lediglich
zur Verdeutlichung und Unterscheidung der Detektorzeilen eingezeichnet – in Wirklichkeit
schließen
die Detektorzeilen möglichst
nahtlos aneinander.
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Jede
Detektorzeile im Detektormodul 1 der 1 ist
mit einem eigenen Elektronikmodul 6.1 bzw. 6.2 verbunden,
so daß die
Verstärkungseinstellung individuell
für die
Detektorzeilen (für
jede Detektorzeile dann natürlich
wieder nur einheitlich) eingestellt ist. Hierzu wertet das Steuergerät 7 beispielsweise
die jeweils hellsten Spektrallinien in den Bildsignalen der Detektorzeilen
aus und stellt die Verstärkung über die
Hochspannungsvorgabe des jeweiligen Elektronikmoduls 6.1 und 6.2 geeignet
ein.
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Eine
alternative Bauweise zeigt 2. Hier wird
der nachzuweisende Strahl 10 des Mikroskops M zuerst über einen
Strahlteiler 11 aufgeteilt, so daß er als Strahl 2.1 bzw.
Strahl 2.2 (letzterer gegebenenfalls unter Zwischenschaltung
eines Umlenkspiegels 12) auf ein Gitter 3.1 bzw. 3.2 fällt. Jedes
Gitter erzeugt dann wieder einen Strahlfächer 4.1 bzw. 4.2, der
auf eine PMT-Zeile 5.1 bzw. 5.2 gerichtet ist,
welche von einem Elektronikmodul 6.1 bzw. 6.2 versorgt wird.
Im Unterschied zur Bauweise gemäß 1 ist also
bei der Variante der 2 die Erzeugung von zwei spektral
aufgefächerten
Strahlenbündeln
in Form der Fächer 4.1 und 4.2 vorgesehen,
wodurch gegenüber
der Bauweise der 1 der erfaßte Spektralbereich oder die
erreichte Auflösung
verdoppelt ist, wenn die Anzahl an Einzelelementen der Detektorzeilen
gegenüber
der Bauweise gemäß 4 gleich
bleibt. Der Nachteil dieser Bauweise liegt darin, daß der nachzuweisende
Strahl 10 zuerst mit einem Strahlteiler 11 aufgeteilt
werden muß,
was naturgemäß einen
gewissen Intensitätsverlust
in den dann auf die Gitter 3.1 und 3.2 fallenden
Strahlen 2.1 und 2.2 zur Folge hat. Die Verwendung
eines geeigneten dichroitischen Strahlteilers kann dies zu einem
gewissen Maß ausgleichen
bzw. vermeiden.
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Für die Bauweisen
der 1 und 2 kann in den Szintillatorschichten 9.1 bzw. 9.2 eine
auf den Spektralbereich, der auf die jeweilige Detektorzeile fällt, angepaßte spektrale
Grund-Empfindlichkeit
gewählt
werden. 3 zeigt exemplarisch und stark
vereinfacht zwei Empfindlichkeitskurven 13 und 14 für unterschiedliche
Szintillatormaterialien, die abhängig
von der Wellenlänge λ eine unterschiedliche
spektrale Empfindlichkeit S aufweisen, d. h. sie konvertieren einfallende
Photonen mit spektral abhängiger
Quantenausbeute in Elektronen. Die Verwendung von mindestens zwei
Detektorzeilen erlaubt es nun, die Detektorzeilen zum einen mit
einem Szintillatormaterial zu versehen, das für den jeweiligen (Teil-)Spektralbereich
optimale Quantenausbeute liefert. Zum anderen kann durch die Einstellung
der Verstärkung
eine unterschiedliche Quantenausbeute im Spektralbereich, der auf
die Detektorzeile 5.1 bzw. 5.2 fällt, besser
ausgeglichen werden.
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4 verdeutlicht,
daß die
Signalauslesung bei den Detektorzeilen nicht auf die Verteilung
der Einzelzellen 8.1 bzw. 8.2 auf die beiden Detektorzeilen
Rücksicht
nehmen muß.
Die zwei oder mehr Detektorzeilen sind zwar hinsichtlich der Einstellung
der Gund-Empfindlichkeit, d. h. im geschilderten Ausführungsbeispiel
hinsichtlich der Elektronikmodule 6 separat. 4 zeigt,
daß aber
für jede
Detektorzeile hinsichtlich des Signal-Abgriffs bzw. der Signalauswertung
die Zellen 8.1 bzw. 8.2 in beliebiger Weise zusammengefaßt werden
können.
Im Beispiel der 4 sind drei PMT-Zellen, die
im spektralen Fächer 4 nahe
des Randes liegen, zusammengefaßt.
Jede Einzelzelle 8.1 bzw. 8.2 ist über eine
Auswerteleitung 15 mit einer Auswerteschaltung verbunden.
Die übrigen
Zellen werden von einer ersten Auswerteschaltung 16 und
die randnahen Zellen von einer zweiten Auswerteschaltung 17 ausgelesen.
Beide Auswerteschaltungen erfassen also Einzelzellen aus beiden Detektorzeilen.
Jede Auswerteschaltung 16, 17 ist weiter mit dem
Steuergerät 7 verbunden,
das so für die
individuell ausgelesenen Einzelzellen jeweils eigene Auswertesignale
sowie für
die zusammengefaßten
Einzelzellen ein gemeinsames Auswertesignal erhält. Das Zusammenfassen von
Einzelzellen ist nicht auf randnahe Zellen beschränkt; beliebige Kombinationen
sind möglich.
Auch muß das
Zusammenfassen nicht, wie in 5 schematisch
dargestellt, durch elektrisches Verbinden von Ausleseleitungen erfolgen,
sondern kann auch datentechnisch in der jeweiligen Auswerteschaltung
auf Signalverarbeitungsebene erfolgen.
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Die
auswertungsmäßige Zusammenfassung von
Einzelzellen hat den Vorteil, daß Spektralbereiche, die im
zu detektierenden Lichtstrahl nicht voneinander unterschieden werden
müssen,
jedoch für eine
Bildgewinnung von Interesse sind, auf einfache Weise summiert nachgewiesen
werden können, ohne
dafür unnötigen Aufwand
zu betreiben. Die Zahl der spektralen Kanäle ist dann auf das anwendungserforderliche
begrenzt. Wendet man dieses Prinzip, wie in 4 dargestellt,
auf die erfindungsgemäße Verwendung
mehrerer Detektorzeilen an, können, wie 4 am
Beispiel der zweiten Auswerteschaltung 17 verdeutlicht,
die zusammengefaßten
Spektralkanäle,
d. h. die auswertetechnisch zusammengeschalteten Einzelzellen beliebig
auf die Detektorzeilen verteilt seien. Man wird dabei zweckmäßigerweise
immer diejenigen Einzelzellen zusammenfassen, die spektrale Anteile
im Fächer 4 erhalten, welche
nicht einzeln unterschieden werden müssen.
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Insbesondere
bei PMT-Zeilen ist es vorteilhaft, wenn die zusammengefaßten Einzelzellen
nicht nur hinsichtlich ihrer Signalauswertung zusammengelegt sind,
sondern auch hinsichtlich der Ansteuerung, die bei PMT-Zellen relativ
aufwendig und bei einer schnellen Auslesung auch zeitkritisch sein
kann. Die Zusammenfassung reduziert dann insbesondere die zeitlichen
Anforderungen, die für
einen schnellen Betrieb einzuhalten sind.
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4 verdeutlicht
schließlich
zusätzlich
exemplarisch, daß ganz
allgemein die mehreren Detektorzeilen eine unterschiedliche Anzahl
an Einzelzellen enthalten können.
Wesentlich ist lediglich, daß Detektorzeilen
im eingangs genannten Sinne verwendet werden, da eine Aggregation
von Einzelempfängern
einen vergleichsweise sehr viel höheren Aufwand, insbesondere
bei der Justage, mit sich brächte.