Der
vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem
Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden.
Insbesondere
lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
anzugeben, mit dem eine fixierte biologische Probe, vorzugsweise
eine mit Formaldehyd fixierte biologische Probe unter möglichst
schonenden Bedingungen derart behandelt werden kann, dass die Biomoleküle in einfacher
Weise aus der biologischen Probe isoliert oder in der biologische
Probe nachgewiesen werden können.
Der
vorliegenden Erfindung lag auch die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zur Behandlung einer vorzugsweise mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe
anzugeben, mit dem im Vergleich zu den aus den Stand der Technik
bekannten Verfahren bei einer Behandlungstemperatur von vorzugsweise
weniger als 95°C
die durch das Fixieren entstandenen Vernetzungen in der biologischen
Probe schneller gelöst werden
können.
Einen
Beitrag zur Lösung
der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Verfahren zur Behandlung
einer fixierten biologischen Probe, umfassend die Verfahrensschritte:
- i) Bereitstellen einer fixierten biologischen
Probe,
- ii) In Kontakt bringen der fixierten biologischen Probe mit
einer vorzugsweise wässrigen
Lösung beinhaltend
mindestens ein nukleophiles Reagenz, sowie
- iii) Erhitzen der mit der wässrigen
Lösung
in Kontakt gebrachten biologischen Probe.
Überraschend
wurde festgestellt, dass sich die durch die Fixierung biologischer
Proben, insbesondere durch die Formaldehyd-Fixierung entstandenen
Vernetzungen innerhalb der biologischen Proben in Gegenwart eines
nukleophilen Reagenzes deutlich schneller lösen lassen.
Die
im Verfahrensschritt i) bereitgestellte fixierte biologische Probe
kann ein vollständiger
Organismus, ein Teil eines Organismus, insbesondere ein Gewebefragment
oder ein Gewebeschnitt, eine Körperflüssigkeit,
eine Zelle oder ein Virus sein, wobei Zellen, Gewebefragmente und
insbesondere Gewebeschnitte besonders bevorzugte biologische Proben sind.
Als Organismus kommen wiederum Tiere, Pflanzen oder Mikroorgansimen
wie Bakterien, Hefen oder Pilze in Betracht, wobei eine menschliche
biologische Probe ein besonders bevorzugtes Aus gangsmaterial und
ein menschlicher Gewebeschnitt, eine aus dem Menschen isolierte
Zelle oder eine kultivierte menschliche Zelle am meisten bevorzugte
biologische Proben sind.
Die
Fixierung der biologischen Probe kann mit allen den Fachmann bekannten
Fixativen erfolgen, insbesondere mit Säuren, Alkoholen, Ketonen oder
anderen organischen Substanzen, wie etwa Glutaraldehyd oder Formaldehyd,
wobei mit Formaldehyd fixierte biologische Proben besonders bevorzugt
und mit einer wässrigen
Formaldehyd-Lösung, beinhaltend
1 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 10 Gew.-% Formaldehyd fixierte
biologische Proben am meisten bevorzugt sind.
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens wird
als biologische Probe im Verfahrensschritt i) eine mit Formaldehyd
fixierte, biologische Probe eingesetzt, die in Paraffin eingebettet
ist. Solche Proben werden üblicherweise
als FFPE-Proben bezeichnet. Hergestellt wird eine solche FFPE-Probe
vorzugsweise dadurch, dass eine mit Formalin fixierte biologische
Probe zunächst
entwässert
wird, vorzugsweise mittels einer aufsteigenden Alkoholreihe (also
einer Reihe von Wasser/Alkohol-Mischungen mit zunehmender Alkohol-Konzentration,
wobei letztlich reiner Alkohol zugesetzt wird). Als Alkohole sind
dabei C1- bis C5-Alkohole
besonders bevorzugt, Ethanol, Methanol und Isopropanol darüber hinaus
bevorzugt und Ethanol am meisten bevorzugt. Anschließend wird
die entwässerte
Probe in flüssiges
Paraffin getaucht, welches, nachdem die Probe ausreichend vom Paraffin
durchdrungen ist, ausgehärtet
wird. Mittels geeigneter Schneidevorrichtungen, beispielsweise mittels
eines Mikrotoms, können
dann Gewebeschnitte aus dem Paraffinblock hergestellt werden, wobei
die Dicke dieser Schnitte für
lichtmikroskopische Untersuchung üblicherweise bei etwa 5 bis
20 μm liegt.
Des Weiteren kann die paraffinierte Probe auch mittels anderer Verfahren,
etwa durch Stanzen mit einer Hohlnadel oder durch das sogenannte „Laser
Capture"-Verfahren
in kleinere Probenfragmente zerkleinert werden.
Im
Verfahrensschritt ii) wird die im Verfahrensschritt i) bereitgestellte
fixierte biologische Probe dann mit einer vorzugsweise wässrigen
Lösung
beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz in Kontakt gebracht.
Sofern es sich bei der biologischen Probe um eine in Paraffin eingebettete
biologische Probe handelt, ist es bevorzugt, vor dem in Kontakt bringen
der Probe mit der vorzugsweise wässrigen Lösung das
Paraffin zunächst
aus der biologischen Probe zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig zu
entfernen. Das Entfernen des Paraffins aus der biologischen Probe
kann grundsätzlich
durch alle dem Fachmann bekannten Verfahren der Deparaffinierung
von biologischen Proben erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Deparaffinierung
dadurch, dass die Probe zunächst
mit einem hydrophoben organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht
wird, insbesondere mit einem aromatischen Kohlenwasserstoff, am meisten
bevorzugt mit Xylol, um das Paraffin herauszulösen. Dabei kann es auch vorteilhaft
sein, die Mischung aus der biologischen Probe und dem organischen
Lösungsmittel
zu bewegen, beispielsweise auf einem Laborschüttler zu schütteln, um
ein möglichst effektives
Herauslösen
des Paraffins sicherzustellen. Vorteilhafterweise wird die Mischung
dann zentrifugiert und das organische Lösung vom Pellet (= biologische
Probe) abgetrennt. Gegebenenfalls kann dieser Schritt des Herauslösens des
Paraffins aus der biologischen Probe ein-, zwei- drei- oder auch
bis zu zehnmal wiederholt werden. Neben dem Herauslösen des
Paraffins mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels kommen als Verfahren
zur Deparaffinierung auch andere Verfahren, wie beispielsweise das
Schmelzen des Paraffins in Betracht, wie von Banerjee et al., Biotechniques,
18 (1995), Seiten 768-773 beschrieben.
Nach
dem Entfernen des Paraffins kann es bevorzugt sein, die biologische
Probe wieder zu rehydrieren, wobei dieses Rehydrieren vorzugsweise durch
das schritt weise Waschen mit wässrigen
Alkohol-Lösungen
mit fallender Alkoholkonzentration erfolgt (= absteigende Alkoholreihe),
wobei wiederum C1- bis C5-Alkohole
besonders bevorzugt, Ethanol, Methanol und Isopropanol darüber hinaus
bevorzugt und Ethanol am meisten bevorzugt ist. Gemäß einer bevorzugten
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird eine Alkoholreihe mit einem Konzentrationsbereich von 100 Vol-%
bis 70 Vol-% eingesetzt, wobei der Konzentrationsunterschied zwischen
zwei in ihrer Konzentration aufeinanderfolgenden wässrigen
Alkohol-Lösungen
vorzugsweise weniger als 10 Vol-%, besonders bevorzugt höchstens
5 Vol-% beträgt.
Eine erfindungsgemäß geeignete
absteigende Alkoholreihe umfasst beispielsweise die Konzentrationen
100 Vol-%, 95 Vol-%,
90 Vol-%, 80 Vol-% und 70 Vol-%.
Denkbar
ist grundsätzlich
auch, das Deparaffinieren und das Rehydrieren mit einem einzigen Reagenz,
beispielsweise mit dem kommerziell erhältlichen Produkt EZ-DEWAX® der
Firma BioGenex, Kalifornien, USA, durchzuführen.
Bevor
nun die gegebenenfalls deparaffinierte und rehydrierte biologische
Probe im Verfahrensschritt ii) mit der vorzugsweise wässrigen
Lösung
beinhaltend das nukleophile Reagenz in Kontakt gebracht wird, kann
es weiterhin vorteilhaft sein, die Probe zuvor noch zu trocknen,
beispielsweise durch das Stehenlassen an der Luft oder das Inkubieren
in einem Trockenschrank.
Weiterhin
kann es erfindungsgemäß bevorzugt
sein, die gegebenenfalls deparaffinierte und rehydrierte biologische
Probe vor dem in Kontakt bringen mit der vorzugsweise wässrigen
Lösung
im Verfahrensschritt ii) noch zu homogenisieren, was insbesondere
bei größeren Gewebefragmenten
von Vorteil sein kann. Diese Homogenisierung kann durch jede dem
Fachmann bekannte Vorrichtung zur Zerkleinerung einer biologischen
Probe erfolgen, insbesondere mittels Hochdruckzellaufschluss, mittels
einer mechanischen Zerkleinerungsvorrichtung, beispiels weise einer
Mühle,
einem Rotor-Stator-Homogenisator, einem Ultra-Turrax-Homogenisator oder
einer feinen Kanüle,
oder durch Ultraschall-Homogenisatoren.
Im
Verfahrensschritt ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun die
fixierte biologische Probe mit einer vorzugsweise wässrigen
Lösung
beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz in Kontakt gebracht.
Als
nukleophiles Reagenz sind dabei alle Lewis-Basen geeignet, die in
der Lage sind, Elektronen in ein Leeres Orbital bzw. in Leere Orbitale
einer Lewis-Säure
zu transferrieren. Unter diesen Lewis-Basen besonders bevorzugt
sind Reagenzien, welche mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen,
die eine negative Ladung trägt,
die negativ polarisiert ist oder die mindestens ein freies Elektronenpaar
aufweist.
Verbindung
umfassend eine funktionelle Gruppe mit einer negativen Ladung sind
beispielsweise Alkali- oder Erdalkalialkoxide, Alkali- oder Erdalkalihydroxide,
Alkali- oder Erdalkalihalogenide, Alkali- oder Erdalkalicyanide
und dergleichen.
Reagenzien,
welche mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen, die negativ
polarisiert ist, sind insbesondere solche Reagenzien, die mindestens
eine funktionelle Gruppe aufweisen, in der zwei kovalent miteinander
verbundene Atome vorliegen, die sich in ihrer Elektronegativität nach Alfred
und Rochow um mindestens 0,25, besonders bevorzugt um mindestens
0,5 und darüber
hinaus bevorzugt um mindestens 1,0 unterscheiden.
Erfindungsgemäß besonders
bevorzugte nukleophile Reagenzien sind jedoch solche, die mindestens
eine funktionelle Gruppe mit einem oder zwei, besonders bevorzugt
mit einem freien Elektronenpaar aufweisen, wobei unter diesen Verbin dungen
wiederum solche am meisten bevorzugt sind, die mindestes eine primäre, sekundäre oder
tertiäre
Amino-Gruppe der Struktur I
aufweisen, in der
R
1 eine C
1- bis C
20-Kohlenwasserstoff-Gruppe, besonders bevorzugt
eine C
2- bis
C
15-Kohlenwasserstoff-Gruppe und darüber hinaus
bevorzugt eine C
2 bis C
10-Kohlenwasserstoffgruppe,
eine mindestens ein Heteroatom aufweisende C
1-
bis C
20-Kohlenwasserstoff-Gruppe, eine mindestens
ein Heteroatom aufweisende C
2- bis C
15-Kohlenwasserstoff-Gruppe und darüber hinaus
bevorzugt eine mindestens ein Heteroatom aufweisende C
2-
bis C
10-Kohlenwasserstoff-Gruppe
oder ein gegebenenfalls Heteroatom substituiertes aromatisches Ringsystem
ist,
R
2 eine C
1-
bis C
20-Alkylgruppe, besonders bevorzugt eine
C
1- bis C
10-Alkylgruppe und darüber hinaus
bevorzugt eine C
1- bis C
2-Alkylgruppe,
insbesondere eine Methyl-Gruppe oder eine Ethyl-Gruppe, eine C
1- bis C
20-Hydroxyalkylgruppe,
besonders bevorzugt eine C
1- bis C
10-Hydroxyalkylgruppe
und darüber
hinaus bevorzugt eine C
1- bis C
2-Hydroxyalkyl-Gruppe oder
ein Wasserstoffatom ist, wobei ein Wasserstoffatom am meisten bevorzugt
ist, und
R
3 eine C
1-
bis C
20-Alkylgruppe, besonders bevorzugt eine
C
1- bis C
10-Alkylgruppe und darüber hinaus
bevorzugt eine C
1- bis C
2-Alkylgruppe,
insbesondere eine Methyl-Gruppe oder eine Ethyl-Gruppe, eine C
1- bis C
20- Hydroxyalkylgruppe,
besonders bevorzugt eine C
1- bis C
10-Hydroxyalkylgruppe
und darüber
hinaus bevorzugt eine C
1- bis C
2-Hydroxyalkyl-Gruppe oder
ein Wasserstoffatom ist, wobei ein Wasserstoffatom am meisten bevorzugt
ist.
Erfindungsgemäß besonders
bevorzugte nukleophile Reagenzien mit einer funktionellen Gruppe der
vorstehend dargestellten Struktur I sind insbesondere diejenigen,
welche mindestens eine funktionelle Gruppe der Struktur I aufweisen,
in der mindestens einer der Reste R
2 und
R
3, am meisten bevorzugt beide Reste R
2 und R
3 ein Wasserstoffatom
ist bzw. sind. Darüber
hinaus sind insbesondere solche nukleophilen Reagenzien bevorzugt,
die mindestens eine funktionelle Gruppe der Struktur I aufweisen,
in der das Stickstoffatom nur mit solchen Atomen in den Resten R
1, R
2 und R
3 kovalent verknüpft ist, die sp
3-Hybridisiert
sind. Insbesondere sollten keiner der Reste R
1,
R
2 oder R
3 in der
Lage sein, das freie Elektronenpaar am Stickstoffatom über die
Reste R
1, R
2 bzw.
R
3 hinweg zu delokalisieren. Somit ist es
insbesondere bevorzugt, dass keiner der Reste R
1,
R
2 und R
3 beispielsweise
die Struktur II
aufweist.
Erfindungsgemäß besonders
bevorzugte nukleophile Reagenzien mit mindestens einer funktionellen
Gruppe der Struktur I sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Methylamin, Ethylamin, Ethanolamin, n-Propylamin, n-Butylamin,
iso-Butylamin, tert-Butylamin,
Dimethylamin, Diethylamin, Diethanolamin, di-n- Propylamin, di-iso-Propylamin, Dibutylamin,
Trimethylamin, Triethylamin, Triethanolamin, Hexamethylenetetramin,
2-Ethylhexylamin, 2-Amino-1,3-propandiol,
Hexylamin, Cyclohexylamin, 1,2-di-Methoxypropanamin, 1-Aminopentan, 2-Methyloxypropylamin,
Tri(hydroxymethyl)-aminomethan, Aminocarbonsäuren, insbesondere Glycin oder Histidin,
oder Aminoguanidin, wobei unter diesen Ethanolamin, Diethanolamin,
Triethanolamin, Amino-1,3-propandiol,
Aminoguanidin und Tri(hydroxymethyl)aminomethan am meisten bevorzugt
sind. Weiterhin sind als nukleophile Reagenzien mit mindestens einer
funktionellen Gruppe der Struktur I aromatische Amine ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Anilin, Toluidin, Naphthylamin, Benzylamin, Xyliden,
Xyloldiaminen, Naphthalendiaminen, Toluoldiaminen, 3,3'-dimethyl-4,4'-diphenyldiamin, Phenylendiaminen, 2,4'-Methylendianilin,
4,4'-Methylendianilin,
Sulfonyldianilin, und Dimethylbenzylamin bevorzugt.
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens,
bei dem das nukleophile Reagenz mindestens eine primäre Aminogruppe
der Struktur I aufweist, handelt es sich bei dem nukleophilen Reagenz
um ein C1- bis C6-Alkylamin,
um ein C1- bis C6-Alkyldiamin,
um ein C1- bis C6-Alkyltriamin,
um einen C1- bis C15 Aminoalkohol um
einen C1- bis C15 Aminodiol,
oder um eine C1- bis C15 Aminocarbonsäure.
Gemäß einer
anderen besonderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist das nukleophile Reagenz eine heterozyklische, ein Stickstoffatom
beinhaltende Verbindung ausgewählt aus
der Gruppe umfassend Pyrrol, Pyridin, Chinolin, Indol, Aza-Cyclopentan,
Aza-Cyclohexan, Morpholin, Piperidin, Imidazol oder einem Derivat
dieser Verbindungen, wobei unter einem Derivat dieser Verbindungen
vorzugsweise ein Derivat verstanden ist, bei dem an ein oder mehr
Kohlenstoffatomen oder an dem Stickstoffatomen in den vorstehend
genannten Verbindungen eine C1- bis C3-Alkylgruppe, besonders bevorzugt eine Methyl-Gruppe oder Ethyl-Gruppe anstelle
eines Wasserstoffatoms gebunden ist.
Unter
den vorstehend genannten nukleophilen Reagenzien sind insbesondere
diejenigen besonders bevorzugt, die wasserlöslich sind, insbesondere diejenigen,
die in Wasser bei einer Temperatur von 25°C und bei einem pH-Wert von
7 eine Löslichkeit von
mindestens 1 g/L, besonders bevorzugt mindestens 10 g/L und darüber hinaus
bevorzugt mindestens 100 g/L aufweisen.
Die
vorzugsweise wässrige
Lösung
beinhaltend das vorstehend beschriebene nukleophile Reagenz kann
auf reinem, vorzugsweise entionisiertem Wasser basieren oder aber
auch auf anderen, wässrigen
Systemen, insbesondere auf Mischungen aus Wasser und organischen
Lösungsmitteln
wie Alkoholen, insbesondere Mischungen aus Wasser und Ethanol oder
Methanol, wobei die Menge an Wasser vorzugsweise mindestens 50 Gew.-%,
besonders bevorzugt mindestens 75 Gew.-% und am meisten bevorzugt mindestens
90 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht aus Wasser und
organischem Lösungsmittel,
beträgt,
physiologischen Kochsalzlösungen,
auf Puffern, insbesondere Puffer beinhaltend dem Fachmann bekannt
Pufferkomponenten wie beispielsweise TRIS, HEPES, PIPES, CAPS, CHES,
AMP, AMPD oder MOPS in einer Menge in einem Bereich von 0,1 bis
1.000 mMol/l, besonders bevorzugt 1 bis 500 mMol/l und am meisten
bevorzugt 10 bis 200 mMol/l, wobei gegebenenfalls eine solche Pufferkomponente,
je nach deren Struktur, zugleich auch als nukleophiles Reagenz dienen
kann. Weiterhin können
auch Nährmedien,
wie etwa MEM-Medium und DMEM-Medium als wässriges System eingesetzt werden.
Die Herstellung der wässrigen
Lösung beinhaltend
das nukleophile Reagenz erfolgt vorzugsweise durch einfaches Vermischen
von Wasser oder einem entsprechenden wässrigen System mit dem nukleophilen
Reagenz.
Die
Konzentration des nukleophilen Reagenzes in der wässrigen
Lösung
liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 10.000 mMol/l, darüber hinaus
bevorzugt von 1 bis 5.000 mMol/l, darüber hinaus noch mehr bevorzugt
von 5 bis 2.500 mMol/l und am meisten bevorzugt von 20 bis 1.000
mMol/l. Gemäß einer
besonders vorteilhaften Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
liegt die Konzentration des nukleophilen Reagenzes in der wässrigen
Lösung
bei mehr als 20 mMol/l, besonders bevorzugt bei mehr als 50 mMol/l
und am meisten bevorzugt bei mehr als 100 mMol/l.
Der
pH-Wert der wässrigen
Lösung
liegt vorzugsweise in einem Bereich von 2 bis 12, besonders bevorzugt
von 4 bis 9 und am meisten bevorzugt von 5 bis 8, jeweils gemessen
bei Raumtemperatur.
Das
in Kontakt bringen der wässrigen
Lösung
mit der biologischen Probe erfolgt vorzugsweise dadurch, dass die
biologische Probe in einfacher Weise in eine ausreichende Menge
der wässrigen Lösung eingetaucht
wird. Befindet sich die biologische Probe beispielsweise in Form
eines Gewebeschnittes und in Form einer adhärenten Zelle auf einem Substrat,
so erfolgt das in Kontakt bringen der biologischen Probe mit der
wässrigen
Lösung
vorzugsweise durch das einfache Beschichten des Substrates mit der
wässrigen
Lösung.
Im
Verfahrensschritt iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun die
mit der wässrigen
Lösung
in Kontakt gebrachte biologische Probe erhitzt, wobei vorzugsweise
auf eine Temperatur in einem Bereich von 50 bis 100°C, besonders
bevorzugt von 55 bis 95°C,
darüber
hinaus bevorzugt von 60 bis 90°C
und am meisten bevorzugt 65 bis 85°C erhitzt wird. Insbesondere
kann es erfindungsgemäß vorteilhaft
sein, die mit der wässrigen
Lösung
in Kontakt gebrachte biologische Probe auf eine Temperatur von weniger
als 95°C,
besonders bevorzugt weniger als 90°C und am meisten bevorzugt weniger
als 80°C
zu erhitzen.
Die
Dauer des Erhitzens hängt
im wesentlichen von der Temperatur und der Reaktivität des nukleophilen
Reagenzes ab und der Fachmann wird durch einfache Routineversuche
feststellen können, wann
unter den gegebenen Behandlungsbedingungen eine ausreichende Zerstörung der
Vernetzung der biologischen Probe eingetreten ist. Üblicherweise liegt
die Dauer des Erhitzens jedoch in einem Bereich von 60 Sekunden
bis 10 Stunden, besonders bevorzugt von 2 Minuten bis 5 Stunden
und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 10 Minuten bis 2 Stunden.
Je
nach Art und Zusammensetzung der im Verfahrensschritt i) eingesetzten
biologischen Probe kann es nach dem Erhitzen im Verfahrensschritt
iii) auch vorteilhaft sein, die biologische Probe zu zerkleinern
(insbesondere dann, wenn die Probe vor der Behandlung mit dem nukleophilen
Reagenz noch nicht zerkleinert worden ist), wobei zum Zerkleinern wiederum
jede dem Fachmann zur Zerkleinerung biologischer Proben bekannte
Vorrichtung eingesetzt werden kann. Insbesondere kann die Zerkleinerung mittels
Hochdruckzellaufschluss, mittels einer mechanischen Zerkleinerungsvorrichtung,
beispielsweise Rotor-Stator-Homogenisator,
einer Mühle,
einem Ultra-Turrax-Homogenisator oder einer feinen Kanüle, oder
durch Ultraschall-Homogenisatoren erfolgen.
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die biologische Probe während
des Erhitzens im Verfahrensschritt iii), vor dem Verfahrensschritt
ii) oder aber nach dem Verfahrensschritt iii) mit Verbindungen in Kontakt
gebracht, vorzugsweise inkubiert, welche die Zerstörung eines
biologischen Gewebes und/oder die Lyse von Zellen fördert, wobei
es sich bei dieser Verbindung vorzugsweise um ein Enzym, ein Detergenz,
eine chaotrope Substanz oder eine Mischung aus mindestens zwei dieser
Komponenten handelt.
In
diesem Zusammenhang bevorzugte Enzyme sind insbesondere Proteasen,
wobei unter diesen Trypsin, Proteinase K, Chymotrypsin, Papain,
Pepsin, Pronase und Endoproteinase Lys-C. besonders bevorzugt und
Proteinase K am meisten bevorzugt ist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann jedoch als Enzym auch eine hitzestabile Protease eingesetzt
werden, wie sie etwa in der WO-A-91/19792 (isoliert aus Thermococcus
celer, Thermococcus sp.AN1, Thermococcus stetteri oder Thermococcus
litoralis) oder in der WO-A-91/19792 (isoliert aus Staphylothermus marinus)
beschrieben ist. Der Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften hinsichtlich
hitzestabiler Proteasen wird hiermit als Referenz eingeführt und
bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.
Die
Konzentration des Enzyms in der wässrigen Lösung liegt vorzugsweise in
einem Bereich von 0,001 bis 5 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,01 bis 2,5
Gew.-% und am meisten bevorzugt 0,05 bis 0,2 Gew.-%, jeweils bezogen
auf das Gesamtgewicht der wässrigen
Lösung.
Als
Detergenzien werden bevorzugt Verbindungen ausgewählt aus
der Gruppe umfassend Natriumdodecylsulfat (SDS), Polyethylenglykol-phenolether
wie beispielsweise Triton-X-100, Tween, NP-40 oder Mischungen hieraus
eingesetzt, wobei SDS und Triton-X-100 als Detergenzien besonders
bevorzugt sind. Die Menge an Detergenz, welche zur Lyse der in der
biologischen Probe enthaltenen Zellen eingesetzt wird, ist von der
Art und der Menge der biologischen Probe abhängig und kann vom Fachmann durch
einfache Routineversuche ermittelt werden.
Als
chaotrope Substanzen sind insbesondere Guanidiniumisothiocyanat
oder Guanidinium-Hydrochlorid bevorzugt, wobei Guanidiniumisothiocyanat
besonders bevorzugt ist. Chaotrope Substanzen werden insbesondere
dann eingesetzt, wenn aus der biologischen Probe nach der erfindungsgemäßen Behandlung
Nukleinsäuren
isoliert werden sollen. In diesem Zusammenhang ist es weiterhin
bevorzugt, dass neben der chaotropen Verbindung auch reduzierende
Verbindungen, insbesondere Dithiothretil (DTT) oder β-Mercaptoethanol,
eingesetzt werden. Die Konzentration an chaotroper Verbindung bei
der Behandlung der biologischen Probe liegt vorzugsweise in einem
Bereich von 0,1 bis 50 Mol/l, besonders bevorzugt 0,5 bis 20 Mol/l
und am meisten bevorzugt 1 bis 10 Mol/l.
Das
Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym, dem Detergenz
oder der chaotropen Verbindung, kann, wie vorstehend dargelegt,
vor, während
des Erhitzens im Verfahrensschritt iii), vor dem Verfahrensschritt
ii) oder aber nach dem Verfahrensschritt iii) erfolgen.
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym, dem
Detergenz oder der chaotropen Verbindung vor dem Verfahrensschrittes
ii). Dazu wird beispielsweise vor dem Verfahrensschritt ii) die
biologische Probe mit einer wässrigen
Lösung
beinhaltend das Enzym, das Detergenz, die chaotrope Verbindung oder
mindestens zwei davon, gegebenenfalls zusammen mit einer reduzierenden
Verbindung wie β-Mercaptoethanol,
in Form eines Lysepuffers in Kontakt gebracht, auf eine für eine ausreichende
Enzymaktivität erforderliche
Temperatur erwärmt
und anschließend dieser
Lysepuffer durch die wässrige
Lösung
beinhaltend das nukleophile Reagenz ersetzt oder aber diesem Lysepuffer
eine entsprechende Menge an nukleophilem Reagenz zugesetzt.
Gemäß einer
anderen besonderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym,
dem Detergenz oder der chaotropen Verbindung nach dem Verfahrensschritt
iii). Dazu kann entweder nach dem Erhitzen im Verfahrensschritt
iii) die wässrige
Lösung beinhaltend
das nukleophile Reagenz von der biologischen Probe entfernt und
diese biologische Probe dann mit dem Lysepuffer in Kontakt gebracht
werden, oder aber es wird der wässrigen
Lösung
beinhaltend das nukleophile Reagenz das Enzym, das Detergenz, die
chaotrope Verbindung oder mindestens zwei davon, gegebenenfalls
in Form einer konzentrierten Lösung, zugesetzt.
Anschließend
erfolgt ein Erhitzen auf eine für
eine ausreichende Lyse erforderliche Temperatur. Insbesondere bei
der Verwendung chaotroper Substanzen ist es bevorzugt, wenn diese
erst nach dem Verfahrensschritt iii) zugesetzt werden.
Gemäß einer
weiteren besonderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym,
dem Detergenz oder der chaotropen Verbindung während des Verfahrensschrittes
iii). Dazu wird als wässrige
Lösung
im Verfahrensschritt ii) eine wässrige
Lösung
eingesetzt, welche neben dem nukleophilen Reagenz das Enzym, das
Detergenz, die chaotrope Verbindung oder mindestens zwei davon beinhaltet,
oder aber es wird der wässrigen
Lösung
vor dem Erhitzen im Verfahrensschritt iii) das Enzym, das Detergenz,
die chaotrope Verbindung oder mindestens zwei davon, gegebenenfalls
in Form einer konzentrierten wässrigen
Lösung,
zugesetzt wird. In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt,
als Enzym eine der vorstehend genannten hitzestabilen Proteasen
ein zusetzen, da auf diese Weise die für eine zufrieden stellende
Lösung der
Vernetzungen Temperatur von vorzugsweise 50 bis 100°C, besonders
bevorzugt von 55 bis 95°C, darüber hinaus
bevorzugt von 60 bis 90°C
und am meisten bevorzugt 65 bis 85°C ohne Beeinträchtigung
der Enzymaktivität
beibehalten werden kann.
Unabhängig von
der Art und Weise der Behandlung des Gewebes in den Verfahrensschritten
i) bis iii) liegt jedoch im Anschluss an das Erhitzen der biologischen
Probe in der Regel eine wässrige
Lösung
vor, in der zumindest ein Teil der durch die erfindungsgemäße Behandlung
aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküle gelöst ist.
Diese wässrige
Lösung
kann neben den herausgelösten
Biomolekülen
auch weitere Komponenten umfassen, wie etwa das nukleophile Reagenz,
Enzyme, Detergenzien, chaotrope Verbindungen und dergleichen.
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst dieses neben den Verfahrensschritten i) bis iii) auch den
Verfahrensschritt iv) Analyse eines aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküls, wobei
es sich bei dem Biomoleküls
vorzugsweise um ein Protein, eine Glykoprotein, ein Lipid, ein Glykolipid,
eine RNA oder eine DNA, am meisten bevorzugt jedoch um RNA handelt.
Dabei
kann als Ausgangszusammensetzung für die Analyse des aus der biologischen
Probe herausgelösten
Biomoleküls
- A1) die wässrige
Lösung
beinhaltend das nukleophile Reagenz, welche im Verfahrensschritt
ii) eingesetzt wurde und in der sich nach dem Verfahrensschritt
iii) ein Teil der Biomoleküle
befindet,
- A2) die wässrige
Lösung
beinhaltend ein Enzym, ein Detergenz oder eine chaotrope Verbindung, sofern
die wässrige
Lösung
beinhaltend das nukleophile Reagenz nach dem Verfahrensschritt iii) durch
einen entsprechenden Lysepuffer ersetzt oder der wässrigen
Lösung
beinhaltend das nukleophile Reagenz vor oder nach dem Verfahrensschritt
iii) entsprechende Lyse-Komponenten
zugesetzt worden sind,
- A3) eine wässrige
Lösung,
welche nach der Aufreinigung eines Biomoleküls in einer der beiden vorstehend
genannten Zusammensetzungen A1) oder A2), beispielsweise mittels
Filtration, Dialyse, Extraktion, Fällung, Chromatogaphie oder
einer Kombination dieser Aufreinigungsverfahren, vorzugsweise jedoch
mittels Adsorptionschromatographie, erhalten wurde, wobei insbesondere eine
Aufreinigung durch Trennung der wässrigen Lösung A1) oder A2) in eine Protein-Fraktion,
eine RNA-Fraktion und eine DNA-Fraktion,
beispielsweise durch selektive Fällung,
Extraktion oder Adsorption besonders bevorzugt und eine Trennung durch
Adsorption am meisten bevorzugt ist, oder
- A4) eine wässrige
Lösung,
welche durch Extraktion des im Anschluss an den Verfahrensschritt
iii) erhaltenen Gewebes mit einer entsprechenden wässrigen
Phase erhalten wurde, dienen.
Die
Analyse des Biomoleküls
in den jeweiligen Zusammensetzungen A1) bis A4) erfolgt vorzugsweise
durch die dem Fachmann bekannten Analysemethoden. So kommen als
Analyseverfahren insbesondere immunologische Methoden wie Western-Blotting,
Enzyme-linked Immonosorbent Assays (ELISAs), die Immunpräzipitation
oder die Affinitätschromatographie,
Mutationsanalysen, Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(PAGE), insbesondere zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE),
High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Polymerase-Kettenreaktion
(PCR), RFLP-Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism-Analyse),
Southern-Blotting, serielle Analyse der Genexpression (SAGE), Fast
Protein Liquid Chromatography (FPLC), MALDI-TOFF-Massenspektrometrie, SELDI-Massenspektrometrie,
Mikroarray-Analyse und dergleichen in Betracht.
Einen
Beitrag zur Lösung
der eingangs genannten Aufgaben leistet auch die durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhältliche
biologische Probe.
Auch
die Verwendung eines nukleophilen Reagenzes, wie vorstehend beschrieben,
insbesondere eines nukleophilen Reagenzes, welches mindestens eine
primäre,
sekundäre
oder tertiäre
Aminogruppe der Struktur I aufweist, zu Behandlung einer fixierten
biologischen Probe, insbesondere zur Behandlung einer mit Formaldehyd
fixierten biologischen Probe, leistet einen Beitrag zur Lösung der eingangs
genannten Aufgaben.
Einen
weiteren Beitrag zur Lösung
der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Kit zur Isolierung eines
Biomoleküls
aus einer fixierten, vorzugsweise aus einer mit Formaldehyd fixierten
biologischen Probe, umfassend
- (α1) einen
Puffer beinhaltend ein nukleophiles Reagenz,
- (α2)
eine Matrix zur Adsorption eines Biomoleküls, sowie
- (α3)
gegebenenfalls einen Elutionspuffer,
- (α4)
gegebenenfalls ein Enzym, sowie
- (α5)
gegebenenfalls eine chaotrope Substanz.
Als
nukleophiles Reagenz sind insbesondere diejenigen Reagenzien bevorzugt,
die bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
als bevorzugte Reagenzien genannt wurden.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Kits
beinhaltet dieser auch noch Komponenten zur Lyse einer Zelle, insbesondere
Enzyme (α4),
vorzugsweise eines der proteolytischen Enzyme, die vorstehend im
Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannt wurden,
Detergentien oder chaotrope Substanzen (α5), vorzugsweise einer der chaotropen
Substanzen, die vorstehend im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
genannt wurden. Insbesondere das Enzym und die chaotrope Substanz
können,
einzeln oder in Kombination, bereits in dem Puffer (α1) beinhaltend
das nukleophile Reagenz enthalten sein. Es ist jedoch auch möglich, dass
der Kit einen entsprechenden Lysepuffer (α1') umfasst, in dem diese Verbindungen
enthalten sind und der zum Aufschluss einer biologischen Probe eingesetzt
werden kann. Auch kann der erfindungsgemäße Kit ein Lysekonzentrat (α1'') umfassen, das ein Enzym, ein Detergenz
oder eine chaotrope Verbindung in konzentrierter Form enthält und der
bei der Anwendung des Kits dem Puffer (α1) zu einem geeigneten Zeitpunkt
zugesetzt werden kann.
Als
Matrix (α2)
zur Adsorption eines Biomoleküls
können
alle dem Fachmann bekannten Materialien zur Adsorption eines Biomoleküls, insbesondere
eines Proteins, einer DNA oder einer RNA, verwendet werden, wobei
auf Cellulose basierende Materialien, insbesondere carboxyfunktionelle
Cellulosematerialien oder Diethylaminoethyl-Cellulose, Agarose,
oder mineralische Träger
wie Silika, Glas, Quarz, Zeolithe, oder Metalloxide, oder mit Ionenaustauscher-Materialien
beschichtete Träger,
besonders bevorzugt sind. Die genannten Materialien können beispielsweise
in Form von Membranen bzw. magnetischen oder nichtmagnetischen Partikeln
vorliegen. Vorzugsweise ist diese Matrix als Säulenmaterial in bereits vorgefertigten
Säulen
oder auch als Suspension in dem Kit enthalten. Die Art der Matrix
hängt entscheidend
von der chemischen Struktur der zu analysierenden Biomoleküle ab, wobei
dem Fachmann für
den jeweiligen Anwendungszweck, z. B. Analyse von Proteinen, RNA
oder DNA, geeignete Adsorptionsmaterialien bekannt sind.
Als
Elutionspuffer können
ebenfalls alle dem Fachmann bekannten Puffer in dem erfindungsgemäßen Kit
enthalten sein, die üblicherweise
zur Elution in der Säu lenchromatographie
eingesetzt werden. Bei dem Elutionspuffer handelt es sich vorzugsweise
um eine wässrige
Salzlösung,
insbesondere um wässrige
Lösungen
beinhaltend Alkalihalogenide, wie etwa NaCl, KCl oder LiCl, Erdalkalihalogenide,
wie etwa CaCl2 oder MgCl2,
Ammoniumsalze wie etwa Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat oder Mischungen
aus mindestens zwei dieser Salze, wobei der Elutionspuffer gegebenenfalls
auch Puffersysteme wie etwa Alkaliacetat/Essigsäure oder auf Tris(hydroxymethyl)aminomethan
basierende Puffersysteme beinhalten kann. Sofern der Kit zur Isolierung
von RNA aus einem fixierten Gewebe eingesetzt wird und als Matrix
eine Silika-Membran eingesetzt wird, ist es besonders bevorzugt,
als Elutionspuffer Wasser, insbesondere RNase-freies Wasser einzusetzen.
Gemäß einer
weiteren, besonderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Kits
kann dieser auch noch einen Waschpuffer beinhalten, mit dem die
Matrix, nachdem diese das zu analysierende Biomolekül gebunden
hat, vor der Elution mit dem Elutionspuffer gewaschen wird.
Einen
Beitrag zur Lösung
der eingangs genannten Aufgabe leistet weiterhin die Verwendung des
erfindungsgemäßen Kits
in einem Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen aus einer fixierten, vorzugsweise
einer mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe.
Einen
Beitrag zur Lösung
der eingangs genannten Aufgaben leistet schließlich auch ein Verfahren zur
Behandlung einer Krankheit, umfassend die Verfahrensschritte:
- (β1)
Entnahme einer biologischen Probe aus einem Organismus, vorzugsweise
aus einem Säugetier,
besonders bevorzugt aus einem Menschen oder aus einem Tier,
- (β2)
Fixierung der biologischen Probe, vorzugsweise mit Formaldehyd,
- (β3)
Analyse eines Biomoleküls
aus der fixierten biologischen Probe durch das erfindungsgemäße Verfahren
umfassend den Verfahrensschritt iv),
- (β4)
Diagnose einer Krankheit auf der Grundlage der Ergebnisse der Analyse,
sowie
- (β5)
therapeutische Behandlung der diagnostizierten Krankheit.
Als
biologische Probe und als Biomolekül sind wiederum diejenigen
biologischen Proben und Biomoleküle
bevorzugt, die bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
beschrieben wurden.
Die
Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Figuren und Beispiele
näher erläutert.
Es
zeigt die 1 die Ausbeute an RNA (in ng)
aus einem Formalin-fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt
aus der Lunge einer Ratte nach der erfindungsgemäßen Behandlung.
Es
zeigt die 2 das Verhalten der RNA (in Anzahl
der zum Erreichen einer bestimmten DNA-Menge erforderlichen PCR-Zyklen
in einer real-time RT-PCR-Analyse),
welche durch das erfindungsgemäße Verfahren
aus einem Formalinfixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus
der Leber einer Ratte isoliert wurde, in einer PCR-Analyse.
Es
zeigt die 3 die Ausbeute an RNA (in ng)
aus einem Formalin-fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt
aus der Leber einer Ratte nach der erfindungsgemäßen Behandlung.
BEISPIELE
Beispiel 1
Mit
Formalin fixierte und deparaffinierte Gewebeschnitte (10 μm) aus der
Lunge einer Ratte wurden mit jeweils 250 μl einer wässrigen Lösung beinhaltend 5 Mol/l Guanidin-Hydrochlorid
und jeweils unterschiedliche nukleophile Reagenzien (13 mM TRIS,
350 mM TRIS, 5 Gew.-% Trimethylamin, 10 mg/ml Aminoguanidin oder
50 mg/ml Aminoguanidin) in Kontakt gebracht, wobei der pH-Wert der
wässrigen
Lösungen
jeweils 7,5 betrug. Die Schnitte wurden für 60 Minuten bei 70°C mit den
entsprechenden Lösungen
inkubiert.
Aus
dem erhaltenen Zelllysat wurde die RNA isoliert. Dazu wurde zunächst genomische
DNA mittels der gDNA-Eliminator Mini Spin Column (Qiagen, Hilden,
Deutschland) entfernt, der Durchfluss gesammelt, mit 400 μl Ethanol
versetzt und die so erhaltene Zusammensetzung auf eine RNeasy® MinElute
Spin Column (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgetragen. Nach zweimaligem
Waschen mittels des im RNeasy®-Kit enthaltenen RPE-Puffers
wurde die Membran getrocknet und die RNA mittels 30 μl RNase-freiem Wasser
eluiert. Die Menge an RNA im Eluat wurde mittels OD-Messung bei
260 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 1 dargestellt.
Beispiel 2
Mit
Formalin fixierte und deparaffinierte Gewebeschnitte (10 μm) aus der
Leber einer Ratte wurden mit jeweils 250 μl einer wässrigen Lösung beinhaltend unterschiedliche
nukleophile Reagenzien (10 mM TRIS, 10 mM TRIS und 1 % Ethanolamin,
10 mM TRIS und 0,1 % Ethanolamin sowie 10 mM TRIS und 0,01 Ethanolamin)
in Kontakt gebracht, wobei der pH-Wert der wässrigen Lösungen jeweils 7,5 betrug. Die
Zellen wurden für
60 Minuten bei 70°C
mit den entsprechenden Lösungen
inkubiert. Anschließend wurde
Guanidin-Hydrochlorid in einer finalen Konzentration von 5 Mol/l
zugesetzt.
Aus
dem erhaltenen Zelllysat wurde die RNA isoliert und das Verhalten
der RNA in der PCR mittels einer TaqMan-Analyse bestimmt, wobei
der QuantiTect Probe RT-PCR Kit der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland,
und ein entsprechendes Primer/Probe Set eingesetzt wurden. Dazu
wurde zunächst
genomische DNA mittels der gDNA-Eliminator Mini Spin Column (Qiagen,
Hilden, Deutschland) entfernt, der Durchfluss gesammelt, mit 400 μl Ethanol
versetzt und die so erhaltene Zusammensetzung auf eine RNeasy® MinElute
Spin Column (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgetragen. Nach zweimaligen
Waschen mittels des im RNeasy®-Kit enthaltenen RPE-Puffers wurde die
Membran getrocknet und die RNA mittels 30 μl RNase-freiem Wasser eluiert.
Die Ergebnisse der PCR sind in der 2 dargestellt. Neben
der Analyse des Verhaltens der RNA in der PCR wurde im Beispiel
2 auch die Menge an isolierter RNA mittels OD-Messung bei 260 nm
bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 3 dargestellt.
Den 2 und 3 ist
zu entnehmen, dass durch die erfindungsgemäße Behandlung der Proben hohe
Mengen an RNA isoliert werden können
und die isolierte RNA zudem ein gutes Verhalten in der PCR-Analyse
zeigt.