DE102005058185A1

DE102005058185A1 - Verfahren und Anordnung zur Detektion von Fluoreszenz- oder Reflexionsspektren beliebig wählbarer Bereiche und Strukturen eines vom Fremdlicht überlagerten Objekts unter geringer Strahlenbelastung

Info

Publication number: DE102005058185A1
Application number: DE200510058185
Authority: DE
Inventors: Dietrich Dr.-Ing. habil. Schweitzer; Frank Dr. Schweitzer; Martin Dr. Hammer
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2005-12-01
Filing date: 2005-12-01
Publication date: 2007-06-14

Abstract

Aufgabe war es, die Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren in beliebig wählbaren Bereichen und Strukturen des von Fremdlicht überlagerten Objekts bei geringer Strahlenbelastung, aber dennoch mit möglichst hohem Signal-Rausch-Verhältnis sowie zuverlässig und unverfälscht durch das störende Fremdlicht detektieren zu können. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird von einem ausgewählten Bereich (2) des Objekts (1) jeder beleuchtete bzw. strahlungsangeregte Ort (5) konfokal in eine Feldblende (7) abgebildet. Die dort auftreffende Strahlung wird jeweils spektral zerlegt (8), detektiert (9) und zu einem ersten Signal akkumuliert (10). Das dabei überlagerte störende Fremdlicht wird jeweils unter vorzugsweise nicht konfokaler Abbildung ebenfalls spektral zerlegt (8), detektiert (9) sowie zu einem zweiten Signal akkumuliert (10). Aus den Signalen wird ein Differenzsignal (11) zur Auswertung (11, 12) gebildet. DOLLAR A Anwendungen ergeben sich beispielsweise bei der patientenschonenden Untersuchung des Augenhintergrundes und in der Analytik lichtempfindlicher Proben.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur Detektion von Fluoreszenz- oder Reflexionsspektren in beliebig wählbaren Bereichen und Strukturen eines Objekts, dessen auszuwertendes Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht von störendem Fremdlicht beeinflusst wird, verursacht insbesondere durch Fluoreszenz bzw. Reflexion von dem Objekt vor- und/oder nachgelagerter sowie Licht streuender Medien bzw. Schichten. Die durch Beleuchtung bzw. Strahlungsanregung entstehenden Fluoreszenz- oder Reflexionsspektren sollen dabei unter möglichst geringer Strahlenbelastung des Objekts registriert werden.
Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet der Erfindung ist die patientenschonende Erfassung der Fluoreszenzspektren von Bereichen des Augenhintergrundes, deren Position, Größe und Form beliebig wählbar sind. Dabei soll der Augenhintergrund, welchem die ebenfalls fluoreszierende und somit dessen Fluoreszenzspektren beeinflussende Augenlinse vorgelagert ist, lediglich mit geringer Exposition belastet werden.
Weitere Anwendungsgebiete sind z. B. die Bestimmung von Reflexionsspektren des Augenhintergrundes, dem die lichtstreuende Linse bei beginnender Katarakt vorgelagert ist, oder die Messung der Fluoreszenz lichtempfindlicher Substanzen, bei deren Untersuchung die Ausbleichung oder sonstige chemische Veränderungen durch das Anregungslicht vermieden werden können. Speziell bei der Charakterisierung mikroskopischer Proben ist das zu bestimmende Objekt nicht selten in ein oder mehrere ebenfalls fluoreszierende Medien eingebettet, so dass das Fluoreszenzspektrum von störendem Fremdlicht ganz oder teilweise überlagert ist.
Die Überlagerung der auszuwertenden Spektren durch störendes Fremdlicht kann in der Praxis zu erheblichen Verfälschungen der Messauswertung führen.
In bekannten Anordnungen zur Detektion von Fluoreszenz- oder Reflexionsspektren, beispielsweise in Fluoreszenz- oder Reflexionsspektrometern, wird die gesamte Probe oder ein fest zugeordneter Bereich des Objekts beleuchtet und das angeregte Fluoreszenzlicht oder das Reflexionslicht auf einen Monochromator oder einen Spektrographen abgebildet, an dessen Ausgang das Fluoreszenz- oder Reflexionsspektrum detektiert wird.

So ist bekannt, in ophthalmologischen Anordnungen (beispielsweise DE 44 10 690 C1 und DE 199 07 479 A1 ), ein spaltförmiges Feld des Augenhintergrundes mit weißem Licht oder mit dem Anregungslicht zu beleuchten und dieses Feld auf den Eintrittsspalt eines Imaging Spektrographen abzubilden, wobei für jeden beleuchteten Ort am Augenhintergrund ein spezifisches Reflexions- oder Fluoreszenzspektrum detektiert wird.

Es ist auch eine Anordnung bekannt (Delori: „Fluorophotometer for noninvasive measurement of RPE lipofuscin" in Noninvasive Assessment of the Visual System, Vol. 1 OSA Technical Digest Series, Optical Society of America, 1992, 164–168), bei der ein fixierter ausgedehnter Bereich am Augenhintergrund zur Fluoreszenz angeregt wird und dieser ausgedehnte Bereich (Durchmesser 325 μm bis 1300 μm) auf eine ebenfalls ausgedehnte Konfokalblende abgebildet wird. Weiterhin wird die Aperturblende der Funduskamera auf den Eintrittsspalt eines Spektrographen abgebildet, an dessen Ausgang das Fluoreszenzspektrum dieses fixierten Bereichs, einschließlich des überlagerten Störlichtes, z. B. der Linsenfluoreszenz, detektierbar ist. In einem zweiten Schritt wird ein anderer fixierter und gleich großer Bereich des Augenhintergrundes beleuchtet, der aber nicht in die ausgedehnte Konfokalblende abgebildet wird. Das in diesem Falle von der Aperturblende der Funduskamera auf den Eintrittsspalt eines Spektrographen abgebildete Licht ist das störende Fremdlicht. Durch Differenzbildung des im ersten Fall erhaltenen Summen-Fluoreszenzspektrums und des im zweiten Fall erhaltenen überlagerten störenden Fremdlichts wird das Fluoreszenzspektrum des fixierten ausgedehnten Bereiches am Augenhintergrund erhalten.

Diese Lösung besitzt den entscheidenden Nachteil, dass durch die Abbildung der Aperturblende auf den Eintrittsspalt des Spektrographen prinzipiell immer zwei zeitlich getrennte Messungen notwendig sind, um das Fluoreszenzspektrum des Augenhintergrundes zu erhalten. Dabei ist (insbesondere für bewegte Objekte, wie der Augenhintergrund) nicht gesichert, dass in den separaten Messungen mit hoher Genauigkeit auch jeweils derselbe Bereich zur Auswertung erfasst wird. Speziell bei der Bewegung des Auges wird die Fluoreszenzmessung dann in der Praxis von unterschiedlichen Bereichen des Augenhintergrundes erfasst. Außerdem können mit dieser Lösung wegen des mindest erforderlichen Signal/Rausch Verhältnisses nur ausgedehnte Bereiche am Fundus untersucht werden, die mit einer hohen Exposition zur Fluoreszenz angeregt werden müssen. Ein großes Problem ist nach wie vor, die Fluoreszenz von beliebigen Bereichen des Augenhintergrundes mit hoher Ortsauflösung zu erfassen; insbesondere ist keine Messung der Fluoreszenz eines ausgewählten Bereiches mit beliebiger Kontur möglich.

Die erforderliche hohe Bestrahlungsstärke bewirkt ein Ausbleichen der Fluoreszenz und stellt eine unangenehme Patientenbelastung dar.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, die durch Strahlungsanregung bzw. Beleuchtung entstehenden Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren in beliebig wählbaren Bereichen und Strukturen eines von Fremdlicht, insbesondere Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht vor- und/oder hinter dem Objekt befindlicher Medien bzw. Schichten, überlagerten Objekts bei geringer Strahlenbelastung, aber dennoch mit möglichst hohem Signal-Rausch-Verhältnis sowie zuverlässig und unverfälscht durch das störende Fremdlicht detektieren zu können.

Dies soll insbesondere auch für bewegte Objekte ermöglicht werden, beispielsweise für den Augenhintergrund, der nur mit geringer Exposition belastet werden darf und dem die ebenfalls fluoreszierende Augenlinse bzw. die lichtstreuende Linse bei beginnender Katarakt vorgelagert ist.

In lichtempfindlichen Proben soll die Ausbleichung der Fluoreszenz durch die Anregungsstrahlung minimiert werden.

Erfindungsgemäß wird in dem zu untersuchenden Objekt ein Bereich ausgewählt, innerhalb dessen Kontur jeder Ort durch die Strahlung eines scannenden Spots einer Strahlungsquelle beleuchtet und gegebenenfalls zur Fluoreszenz angeregt wird. Alle dabei zur Fluoreszenz angeregten bzw. zur Reflexion beleuchteten Orte innerhalb dieses ausgewählten Bereiches vom Objekt werden jeweils konfokal in dieselbe Feldblende abgebildet, wobei die jeweils in diese konfokale Feldblende auftreffende Strahlung, einschließlich des überlagerten Fremdlichts (Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht von dem Objekt vor- und/oder nachgelagerter Medien bzw. Schichten), spektral zerlegt sowie detektiert wird. Aus der Summe aller dieser lokal ortsabhängigen Fluoreszenz- oder Reflexionssignale wird ein für den ausgewählten Bereich des Objektes spezifisches erstes akkumuliertes Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignal gebildet. Zeitgleich oder danach wird das der besagten konfokalen Abbildung überlagerte Fremdlicht, welches außerhalb der Konfokalebene entsteht, vorzugsweise nicht konfokal auf den Eintrittsspalt vorzugsweise desselben Imaging Spektrographen abgebildet und spektral zerlegt. Aus der Summe aller dieser wiederum lokal ortsabhängigen Fluoreszenz- oder Reflexionssignale wird ein für den ausgewählten Bereich des Objektes spezifisches zweites akkumuliertes Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignal gebildet.

Das erste akkumulierte Signal entspricht dabei der Summe der für den ausgewählten Bereich repräsentativen Fluoreszenz- bzw. Reflexionsstrahlung mit dem überlagerten Fremdlicht, das zweite akkumulierte Signal entspricht dem im ersten Summensignal enthaltenen und für die Auswertung störenden Fremdlicht, welches durch Differenzsignalbildung eliminiert wird, so dass ein für den ausgewählten Bereich spezifisches Signal ohne störendes Fremdlicht mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis sowie unter geringer Strahlungsbelastung zur Fluoreszenzanregung bzw. Beleuchtung des beliebig auswählbaren Bereiches vom Objekt zur spektrometrischen Auswertung und Präsentation gelangt.

Die Messungen können auch nacheinander ausgeführt werden. So bewirkt beispielsweise das Einfügen einer Planplatte vor der feststehenden Konfokalblende, dass nunmehr nicht das Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht der durch den scannenden Spot strahlungsangeregten bzw. beleuchteten Orte, sondern jeweils das dafür störende Fremdlicht unter nicht konfokaler Abbildung nach der Konfokalblende in ein und demselben Spektrographen wellenlängenabhängig zerlegt sowie detektiert und summiert wird.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von teils in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Es zeigen:

1: Blockschema der erfindungsgemäßen Anordnung bei gleichzeitiger Detektion von konfokal abgebildetem Licht und von Fremdlicht

2: Beleuchtung des Eintrittsspaltes eines abbildenden Imaging Spektrographen durch konfokal und nicht konfokal abgebildetes Licht für gleichzeitige Detektion von konfokal abgebildetem Licht und von Fremdlicht

Von einem zu untersuchenden Objekt 1, dem eine fluoreszierende Schicht 19 vorgelagert ist, soll die strahlungsarm angeregte Fluoreszenz, speziell deren Spektrum, in einem ausgewählten Bereich 2 bestimmt werden, die nur in diesem entsteht. Der Einfluss der in 1 durch Pfeile 20 symbolisierten störenden Fluoreszenz der vorgelagerten Schicht 19 ist zu beseitigen. Für den selektierten Bereich 2 kann dabei eine beliebige Kontur gewählt werden.
Zur Fluoreszenzanregung wird die Strahlung eines Anregungslasers 3 mittels eines konfokalen Laser Scanner Systems 4 so auf das zu untersuchende Objekt 1 abgebildet, dass ein scannender Spot 5 auf dem Objekt 1 nur den ausgewählten Bereich 2 zur Fluoreszenz anregt. Bei dieser Beleuchtung wird aber ebenfalls die vorgelagerte Schicht 19 zur Fluoreszenz angeregt, deren Licht als konfokal abgebildetes Fluoreszenzlicht 20 jedes durch den scannenden Spot angeregten Ortes innerhalb des ausgewählten Bereiches 2 durch das Laser Scanner System 4 über einen dichroitischen Teiler 6 konfokal in eine Feldblende 7 abgebildet wird, die sich in der Ebene eines Eintrittsspaltes 23 eines abbildenden ortsauflösenden Imaging Spektrographen 8 befindet. Durch die Anwendung des konfokalen Prinzips ist der Einfluss des störenden Fremdlichtes der vorgelagerten Schicht 19 reduziert, jedoch nicht vollständig beseitigt. Damit ist dem konfokal abgebildeten Fluoreszenzlicht jedes durch den scannenden Spot angeregten Ortes im ausgewählten Bereich 2 das störende Fremdlicht der vorgelagerten Schicht 19 überlagert.
Am Ausgang des Imaging Spektrographen 8, der das Fluoreszenzlicht spektral auflöst, ist ein Detektor 9 angeordnet, welcher nacheinander von jedem Ort innerhalb des ausgewählten Bereiches 2 das dort entstehende Fluoreszenzlicht und das überlagerte Fremdlicht der vorgelagerten Schicht 19 spektral aufgelöst detektiert. Diese Signalfolge wird in einer Akkumulationsstufe 10 integriert und mittels eines Rechners 11 über ein Display 12 als Summenfluoreszenzspektrum dargestellt. Das überlagerte Fremdlicht der vorgelagerten fluoreszierenden Schicht 19 durchläuft ebenfalls das Laser Scanning System 4 und trifft als nicht konfokal abgebildetes Fluoreszenzlicht 21 außerhalb der Konfokalblende 7 auf den Eintrittsspalt der abbildenden Imaging Spektrographen 8 (vgl. auch 2).
Der am Ausgang des Imaging Spektrographen 8 in 1 angeordnete Detektor 9, der vorteilhaft als Empfängermatrix ausgeführt ist, detektiert je nach spektraler Auflösung des Imaging Spektrographen 8 mit einigen Zeilen das Summen-Fluoreszenzlicht aus der Fluoreszenz der Orte im ausgewählten Bereich 2 mit dem überlagerten Fluoreszenzlicht der vorgelagerten Schicht 19, andere Zeilen des Detektors 9 hingegen detektieren nur das störende Fluoreszenzlicht der vorgelagerten Schicht 19. Dieses störende Fluoreszenzlicht wird ebenfalls und gleichzeitig mit dem Summen Fluoreszenzlicht in der Akkumulationsstufe 10 integriert und mittels des Rechners 11 über das Display 12 als Fluoreszenzspektrum des störenden Fremdlichtes dargestellt. Im Rechner 11 wird durch die Differenzbildung aus dem akkumulierten Fluoreszenzsignal des Summen-Fluoreszenzspektrums und dem akkumulierten Fluoreszenzsignal des Spektrums vom störenden Fluoreszenzlicht das reine Fluoreszenzspektrum des ausgewählten Bereiches 2 berechnet, das damit zur weiteren Auswertung zur Verfügung steht. Über das Display 12 wird das reine Fluoreszenzspektrum des ausgewählten Bereiches 2 dargestellt.
Die Messung wird fortgeführt, bis dieses reine Fluoreszenzspektrum des ausgewählten Bereiches 2 mit einem ausreichenden Signal-Rausch Verhältnis zur Verfügung steht.
Zum Festlegen des interessierenden Bereiches 2, aus dem das Fluoreszenzspektrum bestimmt werden soll, wird das beim Scannen erhaltene Fluoreszenzlicht oder das reflektierte Anregungslicht bzw. die reflektierte Strahlung eines nicht dargestellten weiteren Lasers, welche außerhalb des Anregungs- oder Fluoreszenzspektralbereiches liegt, über den dichroitischen Teiler 6 unter Abbildung in eine Feldblende 13 mit einem weiteren Detektor 14 registriert, aus dessen Signalen mittels eines Framegrabbers 15 und des Rechners 11 auf einem Display 16 das Bild des zu untersuchenden Objektes 1 erzeugt wird. In diesem Bild werden die Konturen des ausgewählten Bereiches 2 festgelegt.
Mit einer Steuerung wird bewirkt, dass nur das Fluoreszenzlicht aus dem ausgewählten Bereich 2 detektiert wird. Das kann erreicht werden, indem nur innerhalb des ausgewählten Bereiches 2 gescannt wird oder dass beim Abscannen des Objektes 1 der Anregungslaser 3 nur innerhalb des ausgewählten Bereiches 2 eingeschaltet ist oder dass das Fluoreszenzlicht nur beim Abscannen des ausgewählten Bereiches 2 detektiert wird.
Zum Ausgleich von Bewegungen des Objektes 1 wird ein Bildstabilisierungssystem, bestehend aus einer Einheit 17 zur Bewegungsdetektion und Bildlagenkorrektur und einer Steuerstufe 18 zur Spotsteuerung, eingesetzt, dessen Informationen so auf das Laser Scanner System 4 übertragen werden, so dass immer der gleiche Bereich 2 des Objektes 1 gescannt wird.
In 2 ist (zum besseren Verständnis der gemäß 1 beschriebenen zeitgleichen örtlich getrennten Detektion von konfokal abgebildetem Licht und von Fremdlicht) der Eintrittsspalt 23 vom Imaging Spektrograph 8 mit der unmittelbar in dessen Ebene angeordneter Feldblende 7 frontseitig gesondert dargestellt.
Das konfokal abgebildete Fluoreszenzlicht 21 (durch Pfeildarstellung angedeutet) trifft auf die im Zentrum des Eintrittsspaltes 23 angeordnete Feldblende 7, während das ebenfalls durch Pfeildarstellung symbolisierte nicht konfokal abgebildete Fluoreszenzlicht 22 (dem Fluoreszenzlicht des ausgewählten Bereiches 2 überlagertes störendes Fluoreszenzlicht von der Schicht 19 aus 1) außerhalb der Feldblende 7 auf Bereiche 24 des Eintrittsspaltes 23 fällt und dort räumlich getrennt vom konfokal abgebildeten Fluoreszenzlicht 21 in den Imaging Spektrographen 8 (vgl. 1) gelangt.
Als Objekt 1 können neben Anwendungen in der Ophthalmologie (Untersuchung des Augenhintergrundes) auch bewegte mikroskopische Proben untersucht werden, insbesondere bei denen die Fluoreszenzspektren innerhalb ausgewählter Strukturen bei nur geringer Lichtbelastung bestimmt werden sollen.
Die Erfindung könnte prinzipiell auch so ausgeführt werden (nicht explizit in der Zeichnung dargestellt), dass die Messung von Summenfluoreszenzlicht und störendem Fremdlicht nacheinander erfolgt. In diesem Falle ist der Eintrittsspalt 23 des Spektrographen 8 nur im Bereich der Konfokalblende 7 freigegeben. Dieser Spektrograph 8 ist dann kein ortsauflösender abbildender Imaging Spektrograph, der (wie im Ausführungsbeispiel zu 1) die gleichzeitige spektrale Zerlegung von Licht unterschiedlicher Orte erlaubt. In einem ersten Schritt wird bei scannender konfokaler Beleuchtung der Orte innerhalb des ausgewählten Bereiches 2 das Licht aus der Fluoreszenz des ausgewählten Bereiches, überlagert mit dem störenden Fluoreszenzlicht der vorgelagerten Schicht 19, vom Spektrographen 8 spektral zerlegt, in der Akkumulationsstufe 10 integriert und an einen Rechner 11 zur weiteren Verarbeitung übergeben. In einem zweiten Schritt wird beispielsweise ein ablenkendes Element, vorzugsweise eine nicht in der Zeichnung dargestellte Glasplanplatte, im abbildenden Strahlengang des Fluoreszenzlichtes vor der Konfokalblende 7 angeordnet, so dass das Summenfluoreszenzlicht nicht in die Konfokalblende 7 gelangt, sondern daneben abgebildet wird und nicht in den Spektrographen 8 gelangt. In die Konfokalblende 7 dringt bei gleicher Abtastung des ausgewählten Bereiches 2 dann nur das störende Fluoreszenzlicht der vorgelagerten fluoreszierenden Schicht 19. Dieses wird im Spektrographen 8 spektral zerlegt, von dem Detektor 9, der in diesem Falle als Detektorzeile ausgebildet sein kann, detektiert, in der Akkumulationsstufe 10 integriert und dem Rechner 11 zur Verfügung gestellt. Im Rechner 11 wird das vom Einfluss des störenden Fremdlichtes befreite reine Fluoreszenzspektrum des ausgewählten Bereiches 2 aus der Differenz von Summenfluoreszenzspektrum und Spektrum des im zweiten Schritt registrierten störenden Fluoreszenzlichtes der vorgelagerten Schicht 19 berechnet sowie über das Display 12 ausgegeben.
Es wäre ebenfalls möglich, das störende Fluoreszenzlicht der vorgelagerten Schicht 19 einzeln so zu erfassen, dass der scannende Spot 5 auf die Schicht 19 abgebildet und das entsprechende Fluoreszenzlicht konfokal in die Feldblende 7 abgebildet werden, die sich in der Ebene des Eintrittsspaltes 23 des Spektrographen 8 befindet. In diesem Falle wäre die Intensität des Fremdlichtes jedoch höher als bei der konfokalen Beleuchtung und Abbildung der ausgewählten Bereiche des Objektes in die Konfokalblende (Feldblende 7). Deshalb würde es erforderlich, vor der Differenzbildung aus beiden Spektren (Differenzbildung aus dem akkumulierten Fluoreszenzsignal des Summen-Fluoreszenzspektrums und dem akkumulierten Fluoreszenzsignal des Spektrums vom störenden Fluoreszenzlicht) eine Intensitätsanpassung dieser Fluoreszenzsignale vorzunehmen.
Die Festlegung des ausgewählten Bereiches und die Erfassung der Bewegungen des Objektes oder des ausgewählten Bereiches sowie die Nachführung des Scannvorgangs erfolgen wie im ersten Ausführungsbeispiel beschrieben.
Die Erfindung kann in gleicher Weise zur Bestimmung der Reflexionsspektren von ausgewählten Bereichen des Objekts verwendet werden, vor und/oder hinter denen eine lichtstreuende Schicht angeordnet ist.
Prinzipiell ist es auch möglich, statt des Spektrographen einen Monochromator zu verwenden. Allerdings können dann während der Durchstimmung des Ausgangsspektrums ggf. zu berücksichtigende Bewegungen des Objektes nicht erfasst werden.

1: Objekt
2: Bereich
3: Anregungslaser
4: Laser Scanner System
5: scannender Spot
6: dichroitischer Teiler
7, 13: Feldblende
8: Imaging Spektrograph
9, 14: Detektor
10: Akkumulationsstufe
11: Rechner
12: Display für Ausgabe der Fluoreszenzspektren
15: Framegrabber
16: Display zur Darstellung des Objektes 1 und Auswahl des Bereiches 2
17: Einheit zur Bewegungsdetektion und Bildlagenkorrektur
18: Steuerstufe zur Spotsteuerung
19: Schicht
20: Pfeil (störende Fluoreszenz der Schicht 19)
21: konfokal abgebildetes Fluoreszenzlicht
22: nicht konfokal abgebildetes Fluoreszenzlicht
23: Eintrittsspalt des Spektrographen 8
24: Bereich des Eintrittsspaltes 23

Claims

Verfahren zur Detektion von Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren beliebig wählbarer Bereiche und Strukturen eines von Fremdlicht, insbesondere der Fluoreszenz bzw. Reflexion vor- und/oder nachgelagerter Medien bzw. Schichten, beeinflussten Objekts, beispielsweise des Augenhintergrundes, bei dem das Objekt durch Strahlung eines scannenden Spots, vorzugsweise eines Lasers, beleuchtet und das durch die Beleuchtung und/oder Strahlungsanregung entstehende Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht für eine unter Differenzbildung getrennt von dem Fremdlicht vorgesehene wellenlängenabhängige Auswertung und Präsentation detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass vom Objekt ein Bereich ausgewählt wird, innerhalb dessen Kontur jeder Ort durch die Strahlung des scannenden Spots beleuchtet wird, dass jeder zur Erfassung der Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren beleuchtete Ort innerhalb des ausgewählten Bereiches vom Objekt jeweils konfokal in ein und dieselbe Feldblende abgebildet wird, dass die in der konfokalen Feldblende auftreffende Strahlung spektral zerlegt sowie detektiert wird, dass das für jeden beleuchteten Ort innerhalb des ausgewählten Bereiches vom Objekt jeweils auftretende lokale Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignal zur Bildung eines ersten Signals akkumuliert wird, dass außerdem das die Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren während der durch den scannenden Spot erfolgenden Beleuchtung bzw. Strahlungsanregung der Orte innerhalb des ausgewählten Bereiches vom Objekt überlagernde Fremdlicht vorzugsweise unter nicht konfokaler Abbildung spektral zerlegt, detektiert und zur Bildung eines zweiten Signals akkumuliert wird und dass aus den akkumulierten Signalen ein Differenzsignal zur spektralen Auswertung und Präsentation des vom Einfluss des störenden Fremdlichts befreiten reinen Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektrums gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die konfokale Abbildung der zur Erfassung der Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren beleuchteten bzw. strahlungsangeregten Orte innerhalb des ausgewählten Bereiches vom Objekt in die Feldblende sowie die nicht konfokale Abbildung des Fluoreszenz- bzw. Reflexionslichtes der dem ausgewählten Bereich des Objekts vor- und/oder nachgelagerten Medien bzw. Schichten zur jeweiligen spektralen Lichtzerlegung zeitgleich und örtlich getrennt auf den Eintrittsspalt eines einzigen abbildenden ortsauflösenden Imaging Spektrographen erfolgen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die konfokale Abbildung der zur Erfassung der Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren beleuchteten bzw. strahlungsangeregten Orte innerhalb des ausgewählten Bereiches vom Objekt in die Feldblende sowie die Abbildung des Fluoreszenz- bzw. Reflexionslichtes der dem ausgewählten Bereich des Objekts vor- und/oder nachgelagerten Medien bzw. Schichten nacheinander zur spektralen Lichtzerlegung in ein und demselben Imaging Spektrograph erfolgen, dessen Eintrittsspalt nur im Bereich der Feldblende zugänglich ist, wobei während der nicht konfokalen Abbildung die konfokale Abbildung auf die Feldblende unterbunden wird.
Verfahren nach Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildung des störenden Fluoreszenz- bzw. Reflexionslichtes der dem ausgewählten Bereich des Objekts vor- und/oder nachgelagerten Medien bzw. Schichten in den Eintrittsspalt des Spektrographen nicht konfokal erfolgt.
Verfahren nach Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erfassung des Spektrums vom Fremdlicht eine konfokale Beleuchtung der dem ausgewählten Bereich des Objekts vor- und/oder nachgelagerten Medien bzw. Schichten durch den scannenden Spot sowie eine Abbildung dieses störenden Fluoreszenz- bzw. Reflexionslichtes ebenfalls in eine in der Ebene des Eintrittsspaltes des Spektrographen angeordnete Konfokalblende erfolgen und dass vor der Bildung des Differenzsignals zur spektralen Auswertung und Präsentation des vom Einfluss des störenden Fremdlichts befreiten reinen Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektrums die akkumulierten Signale von konfokal gemessenem Fremdlicht und konfokal gemessenem Licht des vom Objekt ausgewählten Bereiches in ihrer Intensität zueinander angepasst werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontur des ausgewählten Bereiches in einem Reflexionsbild des Objektes festgelegt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontur des ausgewählten Bereiches in einem Fluoreszenzbild des Objektes festgelegt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dass Bewegungen und/oder Konturveränderungen des ausgewählten Bereiches des Objekts, beispielsweise durch die Detektion von phasenempfindlichen Reflexionsänderungen oder andere Verfahren der Bildlagendetektion, erfasst und bei der Steuerung des scannenden Spots berücksichtigt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der beleuchtende Spot die Orte zu deren Fluoreszenzanregung bzw. Reflexionslichterzeugung nur innerhalb des ausgewählten Bereiches vom Objekt scannt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der beleuchtende Spot zwar das Objekt großflächig scannt, jedoch die Laserstrahlung des Spots für die Fluoreszenzanregung bzw. Reflexionslichterzeugung nur dann aktiviert ist, wenn der ausgewählte Bereich überstrichen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der beleuchtende Spot das Objekt großflächig scannt und jeden Ort zur Fluoreszenzanregung bzw. Reflexionslichterzeugung beleuchtet, jedoch nur dann das Fluoreszenz- oder Reflexionslicht detektiert wird, wenn der Spot den ausgewählten Bereich überstreicht.
Anordnung zur Detektion von Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren beliebig wählbarer Bereiche und Strukturen eines von Fremdlicht, insbesondere der Fluoreszenz bzw. Reflexion vor- und/oder nachgelagerter Medien bzw. Schichten, beeinflussten Objekts, beispielsweise des Augenhintergrundes, bei dem das Objekt durch einen scannenden Spot einer Strahlungsquelle, vorzugsweise einen Laserstrahl, beleuchtet und das durch die Beleuchtung und/oder Strahlungsanregung entstehende Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht für eine unter Differenzbildung getrennt von dem Fremdlicht vorgesehene wellenlängenabhängige Auswertung und Präsentation detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungsquelle (3) zur Beleuchtung bzw. Fluoreszenzanregung mit einer Steuereinrichtung (4) zur programmierbaren Strahlablenkung des scannenden Spots (5) innerhalb eines mit ausgewählter Kontur selektierten Bereiches des Objekts (1) in Verbindung steht, dass eine Abbildungsoptik (4) vorgesehen ist, durch welche jeder zur Erfassung der Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren beleuchtete bzw. strahlungsangeregte Ort innerhalb des selektierten Bereiches (2) des Objekts (1) konfokal auf ein und dieselbe Feldblende (7) abgebildet wird, dass in der Ebene der Feldblende (7) der Eintrittsspalt (23) eines abbildenden Spektrographen (8) angeordnet ist, welcher das in die Konfokalblende (7) treffende Licht (21) spektral zerlegt, dass am Ausgang des Spektrographen (8) ein Detektor (9) für das spektral zerlegte Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignal angeordnet ist, dessen Ausgang mit einer Einheit (10) zur Akkumulation des Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignals der jeweils während des Scannvorgangs des Spots (5) für jeden Ort des selektierten Bereiches (2) detektierten Fluoreszenz- oder Reflexionsspektren in Verbindung steht, dass ein Spektrograph vorgesehen ist, vorzugsweise derselbe Spektrograph (8), zur spektralen Zerlegung des beim Scannvorgang des Spots (5) erfassten und nicht konfokal in den Eintrittsspalt (23) des Spektrographen projizierten Fluoreszenz- bzw. Reflexionslichtes (22) aller dem ausgewählten Bereich (2) des Objekts (1) vor- und/oder nachgelagerten Medien oder Schichten (19), wobei der Ausgang ebenfalls über einen Detektor (9) für das spektral zerlegte Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignal mit einer Einheit (10) zur Akkumulation des Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignals in Verbindung steht, und dass Mittel, beispielsweise ein Rechner (11), vorgesehen ist, welche von den jeweils aus der konfokalen und nicht konfokalen Abbildung auf den Spektrographen (8) entstehenden akkumulierten Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignalen ein Differenzsignal zur spektrometrischen Auswertung und Präsentation in einer vorzugsweise rechnergestützten Einheit (11) bilden.
Anordnung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass zur spektralen Zerlegung des Lichts aus der konfokalen Abbildung sowie aus der nicht konfokalen Projektion ein einziger abbildender ortsauflösender Imaging Spektrograph (8) vorgesehen ist, an dessen Ausgang ein Detektor (9) angeschlossen ist mit unterschiedlichen Bereichen zur Registrierung der spektral zerlegten Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignale aus der konfokalen Abbildung sowie aus der nicht konfokalen Projektion auf den Imaging Spektrographen.
Anordnung gemäß Ansprüchen 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Eintrittsspalt des Spektrographen (8) nur im Bereich der Feldblende (7) zugänglich ist und dass zum Zweck der getrennten spektralen Zerlegung des Fluoreszenz- bzw. Reflexionslichts jeweils aus der konfokalen und nicht konfokalen Abbildung Mittel zur Ablenkung des Fluoreszenz- bzw. Reflexionslichts, beispielsweise eine Planplatte, vorgesehen sind, durch welche während der spektralen Zerlegung des Fluoreszenz- bzw. Reflexionslichts aus der nicht konfokalen Abbildung die konfokale Abbildung der beleuchteten bzw. strahlungsangeregten Orte innerhalb des selektierten Bereiches (2) des Objekts (1) auf die Feldblende (7) unterbunden wird.
Anordnung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuerstufe (4, 18) für die Strahlungsquelle (3) vorgesehen ist, durch welche der Spot (5) beim Scannvorgang außerhalb der Kontur des selektierten Bereiches (2) des Objekts (1) ausgetastet wird.
Anordnung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel, beispielsweise eine Steuerstufe für den Detektor (9) oder ein Shutter im Detektionsstrahlengang, vorgesehen sind, durch welche jeweils ausschließlich Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignale von innerhalb der Kontur des selektierten Bereiches (2) des Objekts (1) befindlichen Orten zur Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignal-Detektion und/oder zur Fluoreszenz- oder Reflexionssignal-Akkumulation herangezogen werden.
Anordnung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Steuereinrichtung für den scannenden Spot (5) der Strahlungsquelle (3) und als konfokale Abbildungsoptik ein Laser Scanning System (4), beispielsweise ein Laser Scanning Ophthalmoskop oder ein Laser Scanning Mikroskop, vorgesehen ist.
Anordnung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel (17, 18) vorgesehen sind zur Erkennung von Bewegungen und Formveränderungen des Objekts (1) bzw. dessen selektierten Bereiches (2) sowie zur entsprechenden Beeinflussung des Scannvorgangs des Spots (5) der Strahlungsquelle (3) und/oder der Detektion der Fluoreszenz- oder Reflexionssignale und/oder der Bildung des akkumulierten Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignals.
Anordnung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel aus einer Einheit zur Bilderfassung (17) bestehen, die ausgangsseitig mit der Steuereinrich tung (18, 4) für die Strahlungsquelle (3) und/oder dem Detektor (9) und/oder anderen im Auswertestrahlengang befindlichen Elementen, wie der Einheit (10) zur Akkumulation des Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignals in Verbindung stehen.
Anordnung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einheit (16) zur Darstellung des Objektes (1) und Festlegung des ausgewählten Bereiches (2) mit der Steuereinrichtung (4, 18) zur programmierbaren Strahlablenkung des scannenden Spots (5) in Verbindung steht.
Anordnung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass im Abbildungsstrahlengang der konfokalen Abbildungsoptik (4) ein Strahlteiler, beispielsweise ein dichroitischer Teiler (6) angeordnet ist, über welchen jeder zur Erfassung der Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren beleuchtete bzw. strahlungsangeregte Ort innerhalb des selektierten Bereiches (2) vom Objekt (1) auf eine weitere Konfokalblende (13) vor einem weiteren Detektor (14) abgebildet wird, welcher über einen Framegrabber (15) und die vorzugsweise rechnergestützte Einheit (11) mit einem Display (16) zur Darstellung des Objektes (1) sowie zur Auswahl dessen zu untersuchenden Bereiches (2) in Verbindung steht.