DE19907479A1

DE19907479A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Messung unterschiedlicher Fluoreszenzspektren an einem Objekt

Info

Publication number: DE19907479A1
Application number: DE1999107479
Authority: DE
Inventors: Dietrich Schweitzer; Martin Hammer; Achim Kolb; Eike Thamm
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 1999-02-15
Filing date: 1999-02-15
Publication date: 2000-08-17

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung unterschiedlicher Fluoreszenzspektren an einem Objekt, und kann unter anderem für ophthalmologische Untersuchungen, wie der Physiologie und der Pathologie des lebenden Auges, angewendet werden. DOLLAR A Aufgabe war es, unterschiedliche Fluorophore mit möglichst geringem Handhabungs- und Justieraufwand jeweils unter exakt gleichen optischgeometrischen Bedingungen messen zu können, obgleich jedes Fluorophor in einem charakteristischen Wellenlängenbereich angeregt werden muß und das Fluoreszenzspektrum in einem zur Anregung angepaßten Spektralbereich zu detektieren ist. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird das Objekt, auf dem die Fluorophore angeregt werden sollen, beispielsweise ein Augenhintergrund für ophthalmologische Messungen, zum Zweck einer simultanen Fluoreszenzanregung gleichzeitig mit räumlich getrennten und chromatisch unterschiedlichen Anregungsstrahlen beleuchtet. Mit jedem Anregungsstrahl werden separate Fluorophore angeregt, deren Fluoreszenzspektren örtlich aufgelöst in ein und dem selben Untersuchungsaufbau und in einem einzigen Auswertegang gemessen werden können. Die unterschiedlichen Anregungsstrahlen können durch getrennte Lichtquellen, wie Laser, oder durch geteilte Filter erzeugt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung unterschiedlicher Fluoreszenzspektren an einem Objekt, und kann unter anderem für ophthalmologische Untersuchungen der Physiologie und der Pathologie, insbesondere des lebenden Auges, angewendet werden. Derartige Untersuchungen werden beispielsweise zur Differenzierung der Autofluores zenz des Augenhintergrundes als Objekt, speziell bei altersbezogener Maku ladegeneration, oder auch zur Messung der Autofluoreszenz der Linse bei Katarakt oder bei Diabetes durchgeführt.

Zur Bestimmung frühester pathologischer Veränderungen wird die Autofluo reszenz des Augenhintergrundes ausgewertet. Bekannt sind Messungen der zweidimensionalen Verteilung der Autofluoreszenz am Augenhintergrund (z. B. v. Rückmann A., Fitzke F. W., Bird A. C.: Distribution of fundus auto fluorescence with a scanning laser ophthalmoscope. Br J Ophthalmol 79, 1995, 407-412). Diese Messungen werden mit einem Laser Scanner Ophthalmoskop ausgeführt, wobei der Augenhintergrund mit dem blauen Licht eines Ar-Lasers bei der Anregungswellenlänge 488 nm beleuchtet wird. Zur Messung des Lichtes der Autofluoreszenz ist im Meßstrahlengang ein Sperrfilter, z. B. bei 520 nm, angeordnet, so daß das Anregungslicht gesperrt wird und nur das Fluoreszenzlicht den Empfänger erreicht. Auf diese Weise wird das Fluoreszenzlicht integral über alle Wellenlängen gemessen. Mit dieser Anordnung ist keine Variation der Anregungswellenlänge möglich. Des weiteren kann nicht unterschieden werden, welche der möglichen Substanzen fluoresziert, da hierzu die Messung des Fluoreszenzspektrums erforderlich ist. Von Delori (Delori F. C.: Spectrometer for noninvasive measurement of intrinsic fluorescence and reflectance of the ocular fundus, Applied Optics 33, 1994, 7439-7452) wurde eine Anordnung vorgestellt, die es ermöglicht, die Autofluoreszenz des Augenhintergrundes nacheinander mit Licht unterschiedlicher Wellenlängenbereiche anzuregen und das Fluoreszenzlicht mit einem optischen Multikanal Analysator zu detektieren. Dabei wird das Spektrum der Fluoreszenz gemessen. Der optische Multikanalanalysator besteht aus einem Spektrographen und einer intensivierten Detektorzeile. Da die Aperturblende des Systems in den Eintrittsspalt des Spektrographen abgebildet wird, ist eine ortsaufgelöste Messung der Autofluoreszenz nur möglich, indem die gesamte Untersuchungsanordnung auf einen neuen Ort am Augenhintergrund einjustiert wird. Da ein Bild der Aperturblende auch in der Linse des menschlichen Auges entsteht, wirkt die starke Autofluoreszenz der Linse störend. Von Schweitzer und Hammer (DE-PS 44 10 690 C1) wird ein Imaging Ophthalmospektrometer angegeben, bei dem der Augenhintergrund mit einem schlitzförmigen Feld durch weißes Licht beleuchtet wird. Das von diesem Feld reflektierte Licht wird konfokal auf den Eintrittsspalt eines Imaging-Spektrographen abgebildet. In diesem wird das Licht von jedem beleuchteten Ort des Augenhintergrundes spektral zerlegt, so daß eine gleichzeitige spektral und örtlich aufgelöste Messung erreicht wird. Dieses Prinzip wurde durch Einfügen geeigneter Anregungs- und Sperrfilterkombi nationen so erweitert (Schweitzer D., Lang G. E., Remsch E., Hammer M., Thamm E., Beuermann B., Spraul C., Lang G. K.: Comparison of the optical density of xanthophyll, the fluorescence of lipofuscin and the oxygen saturation between ARMD patients, their children, and controls; Investigative Ophthalmology 39, 4, 1998 March 15, 387), daß die ortsaufgelöste Messung von Spektren der Autofluoreszenz möglich ist. Nachteilig ist an dieser Anordnung, daß Messungen verschiedener Fluorophore jeweils eine spezielle Meßapparatur erfordern, da die spezifische Kombination aus Anregungs- und Sperrfiltern zur Messung jedes Fluorophors gewechselt und speziell angepaßt werden muß. Dabei ist es für die Auswertung und ärztliche Diagnose wichtig, die unterschiedlichen Fluorophore in den separaten Meßvorgängen jeweils unter möglichst gleichen Bedingungen auszuwerten. Hinzu kommt, daß die Einrichtung, Justierung und Bedienung der einzelnen Meßaufbauten für die Augenuntersuchung Zeit- und bedienungsaufwendig sind und für den Patienten eine nicht unerhebliche Belastung darstellen. Alle diese Umstände erschweren eine Realisierung vergleichbarer Meßbedingungen der unterschiedlichen Fluorophore. Dennoch konnte gezeigt werden, daß durch sequentielle Messung mit verschiedenen Kombinationen von Anregungs- und Sperrfiltern mindestens zwei Fluorophore am Augenhintergrund meßbar sind, die sich im Verlauf einer Erkrankung (beispielsweise altersbezogene Makuladegeneration) unterschiedlich ändern, so daß aus relativen Beziehungen zwischen beiden Fluoreszenzen Schlüsse auf den Krankheitszustand gezogen werden können. Die registrierbaren Fluores zenzen sind allerdings sehr schwach und können durch Fehler bei der Justierung zwischen Patient und Meßapparatur, die jeweils durch die unterschiedliche und wellenlängenspezifische Kombination der Anregungs- und Sperrfilter für die Fluoreszenzen erforderlich ist, beeinflußt werden. Hinzu kommt, daß jedes Einrichten und Justieren der Meßvorrichtung, noch dazu unter den Bedingungen eines bewegten Untersuchungsobjektes, ohnehin aufwendig ist sowie Fingerspitzengefühl und Erfahrung voraussetzt. Damit ist eine exakte und objektive Unterschiedserkennung der Fluores zenzen für eine Bewertung des Krankheitszustandes des Patienten zumindest in der täglichen Routineuntersuchung so gut wie nicht gegeben.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, unterschiedliche Fluorophore mit möglichst geringem Handhabungs- und Justieraufwand jeweils unter exakt gleichen optisch-geometrischen Bedingungen messen zu können, obgleich jedes Fluorophor in einem charakteristischen Wellen längenbereich angeregt werden muß und das Fluoreszenzspektrum in einem zur Anregung angepaßten Spektralbereich zu detektieren ist.

Erfindungsgemäß wird das Objekt, beispielsweise ein Augenhintergrund für ophthalmologische Messungen, zum Zweck einer simultanen Fluoreszenz anregung gleichzeitig mit räumlich getrennten und chromatisch unterschied lichen Anregungsstrahlen beleuchtet. In jedem Anregungsstrahl werden separate Fluorophore angeregt, deren Fluoreszenzspektren örtlich aufgelöst in ein und dem selben Untersuchungsaufbau und in einem einzigen Auswertegang gemessen werden können. Die gleichzeitige Fluoreszenzmes sung sichert eine Auswertung jeweils unter identischen Meßbedingungen und Voraussetzungen, d. h. unter exakt gleichen optisch-geometrischen Bedin gungen, die bei Verwendung veränderter Meßaufbauten oder bei sequentiell ausgeführten empfindlichen Justierungen zu bewegten Objekten, wie beispielsweise bei ophthalmologischen Untersuchungen, so gut wie nicht gewährleistet sind. Die identischen optisch-geometrischen Meßbedingungen für die einzelnen Fluorophore sind gegeben, obgleich jedes Fluorophor durch chromatisch unterschiedliche Strahlung angeregt wird und diese Strahlungen jeweils durch unterschiedliche optische Mittel im Strahlengang erzeugt werden müssen. Die simultane Messung der Fluorophore gewährleistet nicht nur deren spektrometrische Auswertungen unter exakt gleichen Meß bedingungen, sondern erübrigt auch den nachteiligen Aufwand des bekannten Standes der Technik, mehrere separate Einzelmessungen der unterschied lichen Fluoreszenzspektren durchzuführen und dabei zumindest in vorgege benen Toleranzbereichen jeweils annähernd vergleichbare Meß- und Justier bedingungen schaffen zu müssen. In der Ophthalmologie bedeutet das für die Untersuchungen am lebenden Auge sowohl eine exakte und objektive Unterschiedserkennung der Fluorophore für die Beurteilung des Krankheits bildes als auch eine wesentliche Erleichterung der Meßprozedur für Arzt und Patient.

Die räumlich und chromatisch getrennten Strahlungsquellen können durch unterschiedliche Mittel realisiert werden. So ist es möglich, separate mono chromatische Strahlungsquellen, wie Laser, vorzusehen, oder beispielsweise die Strahlung einer Weißlichtquelle durch räumlich getrennte Filter, wie eine Feldblende mit Blendenbereiche unterschiedlicher spektraler Transmission, wellenlängenspezifisch in mehrere Teilstrahlen aufzuspalten.

Durch die räumlich getrennten Strahlungsquellen wird das Objekt für eine simultane Anregung unterschiedlicher Fluorophore gleichzeitig, aber lokal und chromatisch separiert beleuchtet. Zur gleichzeitigen Messung des Fluoreszenzlichtes dieser unterschiedlichen Fluorophore werden die emittie renden Felder auf den Eintrittsspalt eines Polychromators abgebildet, wobei in diesem für jeden Ort längs des Eintrittsspaltes eine spektrale Zerlegung des emittierten Lichtes erfolgt und die Fluoreszenzspektren unterschiedlicher Orte, z. B. von einem intensivierten CCD Matrixdetektorsystem, ortsaufge löst registriert werden.

Die örtlich getrennten Blendenbereiche besitzen entsprechend ihrer spektra len Transmission eine wellenlängenspezifische Filterwirkung für das Anregungslicht. Bei entsprechender Einstellung des abbildenden Beugungs gitters im Spektrographen wird vom Detektorsystem nur der Spektralbereich des Fluoreszenzlichtes detektiert, so daß auf Sperrfilter verzichtet werden kann.

Die Erfindung soll nachstehend anhand zweier in der Zeichnung dargestellter Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Es zeigen:

Fig. 1: schematische Darstellung einer ophthalmologischen Meßeinrich tung zur simultanen Erzeugung und Messung zweier Fluorophore am Augenhintergrund, wobei die Anregungsstrahlen für die Fluorophore mit einer zweiteiligen Feldblende erzeugt werden.

Fig. 2: ophthalmologische Meßeinrichtung gemäß Fig. 1, wobei die Anregungsstrahlen für die Fluorophore durch Lasereinkopplung realisiert werden.

Fig. 1 zeigt die schematische Darstellung einer ophthalmologischen Meß einrichtung zur Untersuchung eines Auges 1, auf dessen Augenhintergrund 2 gleichzeitig zwei unterschiedliche Fluorophore angeregt und die zugehörigen Fluoreszenzspektren simultan gemessen und ausgewertet werden. Zur Fluoreszenzanregung der beiden Fluorophore dient eine Weißlichtquelle 3. Das Licht der Weißlichtquelle 3 wird durch Linsen 4, 5 und 6 in einem Beleuchtungsstrahlengang 7 nach Reflexion an einem Lochspiegel 8 in eine Aperturblende 9 eines Beobachtungsstrahlenganges 10 abgebildet, wobei deren Bild 11 in der Aperturblende 9 des Auges 1 liegt, so daß der Augenhintergrund 2 gleichmäßig ausgeleuchtet wird. Im Beleuchtungs strahlengang 7 befindet sich zwischen den Linsen 4 und 5 eine Feld blende 12, in der ein zweigeteilter Anregungsfilter 13 mit wellenlängenunter schiedlichen Filterbereichen 14, 15 angeordnet ist. Da die Feldblende 12 definitionsgemäß eine zum Augenhintergrund 2 konjugierten Ebene ist, wird der Augenhintergrund 2 erfindungsgemäß in zwei getrennten Feldern 16, 17 mit Licht unterschiedlicher Wellenlängen beleuchtet. Somit werden dort befindliche verschiedene Fluorophore gleichzeitig zur Fluoreszenz angeregt. Das Reflexions- und Fluoreszenzlicht dieser Fluorophore am Augenhinter grund 2 tritt durch ein Bild 18 einer Meßaperturblende 19 aus dem Auge 1 aus und wird durch die Linse 6 sowie eine Linse 20 und ein Okular 21 in den Beobachtungsstrahlengang 10 abgebildet. Wird ein Sperrfilter 33, der zur Beobachtung der Ausrichtung der beleuchteten Felder am Augenhintergrund ausgeschwenkt wurde, in den Beobachtungsstrahlengang 10 eingeführt, ist die Autofluoreszenz der unterschiedlichen Fluorophore des lebenden Auges 1 von einem Beobachterauge 22 aus zu beobachten. Um die Autofluoreszenz der beiden Fluorophore gleichzeitig messen zu können, wird ein Spiegel 23 in den Beobachtungsstrahlengang 10 eingeschwenkt, über welchen die räumlich getrennten Felder 16, 17 des Augenhintergrundes 2 in einem Meßstrahlengang 32 über eine Linse 24 konfokal auf einen Eintrittsspalt 25 eines Imagingspektrographen 26 abgebildet werden. Zur simultanen Messung der Autofluoreszenz der beiden Fluorophore des Augenhintergrundes 2 wird das in den Eintrittsspalt 25 einfallende Fluoreszenzlicht des Augenhinter grundes 2 im Imagingspektrographen 26 für jeden Ort längs des Eintritts spaltes 25 spektral zerlegt, so daß es zur Auswertung von örtlich zugeordne ten Bereichen eines Empfängers 30 detektiert wird. Zu diesem Zweck ist das dispergierende Element (z. B. das abbildende Beugungsgitter) im Imaging spektrographen 26 so justiert, daß der Spektralbereich des Anregungslichtes nicht vom Empfänger 30 erfaßt werden kann. Zur Verringerung des Streulichtes in Imagingspektrographen 26, was eine Verbessserung des Signal/Rausch Verhältnisses zur Folge hat, oder für den Fall einer geringen Stokes-Verschiebung zwischen Anregungs- und Fluoreszenzlicht, ist es zweckmäßig, in einer zum Augenhintergrund 2 konjugierten Ebene im Meßstrahlengang 32, beispielsweise in der Ebene des Eintrittsspaltes 25, einen zweigeteilten Sperrfilter 27 anzuordnen, dessen räumlich getrennte Filterbereiche 28, 29 wellenlängenspezifisch mit den Filterbereichen 14, 15 des Anregungsfilters 13 korrespondieren.

Vorteilhafterweise ist die Feldblende 12 schlitzförmig und konfokal zum Eintrittsspalt 25 ausgebildet, und die Trennstelle zwischen den wellenlängen unterschiedlichen Filterbereichen 14, 15 des Anregungsfilters 13 ist licht- undurchlässig abgedeckt. Auf diese Weise wird das in den Eintrittsspalt 25 einfallende Fluoreszenzlicht des Augenhintergrundes 2 so im Imaging spektrographen 26 zerlegt, daß es zur Meßauswertung von örtlich zugeordne ten Bereichen des Empfängers 30 detektiert wird. Der gesamte Meßablauf wird von einem Rechner 31 gesteuert.

Das Ausführungsbeispiel in Fig. 2 zeigt vom Prinzipaufbau die gleiche ophthalmologische Meßeinrichtung wie Fig. 1 mit dem Unterschied, daß die räumlich und chromatisch getrennten Anregungsstrahlen für die Fluorophore am Augenhintergrund 2 durch zwei Laser 35 realisiert werden, deren Strahlungen jeweils über Lichtleitfasern 34 in den Beleuchtungsstrahlen gang 7 eingekoppelt werden. Die Enden der Lichtleitfasern 34 sind in der Ebene der Feldblende 12 längs ihrer mit dem Eintrittsspalt 25 des Imaging spektrographen 26 korrespondierenden Ausdehnung soweit verschiebbar, wie gewährleistet ist, daß bei Verwendung des Sperrfilters 27 das Anregungslicht noch vom Detektor 30 ferngehalten wird. Die Lichtquelle 3 dient in diesem Falle lediglich zur Umfeldbeleuchtung und wird zur Fluoreszenzmessung abgeschaltet oder durch (aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellte) mechanisch-optische Elemente ausgeblendet.

Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen

1

Auge

2

Augenhintergrund

3

Weißlichtquelle

4

,

5

,

6

,

20

,

24

Linse

7

Beleuchtungsstrahlengang

8

Lochspiegel

9

Aperturblende

10

Beobachtungsstrahlengang

11

Bild der Aperturblende

9

12

Feldblende

13

Anregungsfilter

14

,

15

,

28

,

29

Filterbereich

16

,

17

Feld

18

Bild der Meßaperturblende

19

Meßaperturblende

21

Okular

22

Beobachterauge

23

(einschwenkbarer) Spiegel

25

Eintrittsspalt

26

Imagingspektrograph

27

Sperrfilter

30

Empfänger

31

Rechner

32

Meßstrahlengang

33

(einschwenkbarer) Sperrfilter

34

Lichtleitfaser

35

Laser

Claims

1. Verfahren zur Messung unterschiedlicher Fluoreszenzspektren an einem Objekt, bei dem die Fluoreszenz an dem Objekt durch Strahlung angeregt und die vom Objekt emittierte Fluoreszenzstrahlung registriert wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Objekt zum Zweck einer simultanen Fluoreszenz anregung gleichzeitig mit räumlich getrennten und chromatisch unterschiedlichen Anregungsstrahlen beleuchtet wird, daß die zur Fluores zenz angeregten Objektbereiche konfokal auf den Eintrittsspalt eines Spektrographen abgebildet werden und daß die Fluoreszenzspektren mit dem gleichen Detektorsystem registriert werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anre gungsstrahlen durch räumlich und chromatisch getrennte Aufspaltung einer Strahlung, insbesondere einer Weißlichtstrahlung oder eines Mehrwellen längenlasers, erzeugt werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die räumlich getrennten und chromatisch unterschiedlichen Anregungsstrahlen durch unterschiedliche Strahlungsquellen erzeugt werden.

4. Vorrichtung zur Messung unterschiedlicher Fluoreszenzspektren an einem Objekt, bei dem die Fluoreszenz an dem Objekt durch Strahlung angeregt und die vom Objekt emittierte Fluoreszenzstrahlung auf den Eintrittsspalt eines Spektrographen abgebildet und mit einem Detektorsystem registriert wird, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beleuchtung und zur gleichzeitigen Anregung unterschiedlicher Fluoreszenzen am Objekt (2) mindestens zwei räumlich getrennte monochromatische Strahlungsquellen (14, 15 bzw. 35) unterschiedlicher Emissionswellenlänge vorgesehen sind.

5. Vorrichtung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als monochromatische Strahlungsquellen Laser (35) unterschiedlicher Wellen länge eingesetzt werden.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Emissionsstrahlungen der Laser (35) jeweils über Lichtleitfasern (34) auf das in seiner Fluoreszenz anzuregende Objekt (2) geleitet werden.

7. Vorrichtung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Emissionsstrahlungen der Laser (35) mittels optischer Bauelemente wie Spiegel oder Linsen auf das in seiner Fluoreszenz anzuregende Objekt (2) geleitet werden.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die mono chromatischen Strahlungsquellen durch räumlich und chromatisch getrennte Anregungsfilter, beispielsweise durch einen geteilten Filter (13) mit wellen längenunterschiedlichen Filterbereichen (14, 15), gebildet werden, die in einem Beleuchtungsstrahlengang (7) angeordnet sind, der von einer Weiß lichtquelle (3) ausgeht.

9. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die räumlich und chromatisch getrennten Anregungsfilter (13) in bzw. an einer Feld blende (12) im Beleuchtungsstrahlengang (7) angeordnet sind.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Feldblende (12) schlitzförmig ausgebildet und konfokal zum Eintritts spalt (25) eines Imagingspektrographen (26), auf den die vom Objekt (2) emittierten Fluoreszenzstrahlungen abgebildet werden, angeordnet ist.

11. Vorrichtung nach Ansprüchen 4 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beseitigung von störendem Anregungslicht im Eingangsspalt (25) des Imagingspektrographen (26) räumlich und chromatisch getrennte Sperr filter (27) angeordnet sind, deren Sperr- und Durchlaßbereiche (28, 29) bezüglich der kongruenten örtlich und chromatischen Anregungsstrahlungen und der zu messenden Fluoreszenzspektren angepaßt sind.