DE102005047292A1

DE102005047292A1 - Verfahren zum Nachweis der Aktivität ADP-ribosylierender Enzyme

Info

Publication number: DE102005047292A1
Application number: DE200510047292
Authority: DE
Inventors: Hendrik Dr.rer.nat. Fuchs; Mark Dr.rer.medic. Sutherland; Christopher Bachran
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2005-10-03
Filing date: 2005-10-03
Publication date: 2007-04-05

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Enzymaktivität eines ADP-ribosylierenden Enzyms in einer Probe, wobei das dem Enzym zur Verfügung gestellte Substrat an einer Festphase direkt oder indirekt immobilisiert ist. Das Verfahren kann Anwendung finden zur Diagnose einer bakteriellen Infektion in einem Wirt, vorzugsweise einer Diphtherie oder einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa in einem Menschen, indem die Aktivität von Diphtheriatoxin bzw. Pseudomonas Exotoxin bestimmt wird. Das Verfahren kann auch Anwendung finden zum Nachweis der Enzymaktivität in tumortherapeutischen Proteinen, die eine ADP-ribosylierende Enzymaktivität enthalten. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Verwendung des Verfahrens, einen Kit und eine Verwendung des Kits. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Ergebnisse nach kurzer Zeit vorliegen, da das Anlegen einer Primärkultur entfällt, die Durchführung einfach und kostengünstig ist und eine große Anzahl von Proben analysiert werden kann.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Enzymaktivität eines ADP-ribosylierenden Enzyms in einer Probe, wobei das dem Enzym zur Verfügung gestellte Substrat an einer Festphase direkt oder indirekt immobilisiert ist. Das Verfahren kann Anwendung finden zur Diagnose einer bakteriellen Infektion in einem Wirt, vorzugsweise einem Menschen, oder zum Nachweis der Enzymaktivität in tumortherapeutischen Proteinen, die eine ADP-ribosylierende Enzymaktivität enthalten. Genauer betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Diphtherie oder einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa mit Hilfe der Bestimmung der Aktivität von Diphtheriatoxin bzw. Pseudomonas Exotoxin. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Verwendung des Verfahrens, einen Kit und eine Verwendung des Kits.
Hintergrund der Erfindung
Diphtherie ist eine aerogen, seltener durch Kontakt übertragbare, melde- und hospitalisierungspflichtige Infektionskrankheit, die durch Corynebacterium diphtheriae verursacht wird. Dabei handelt es sich um aerobe, unbewegliche, nicht sporulierende, grampositive unbekapselte Stäbchen. Die Virulenz des Bakteriums entsteht durch das Diphtheriatoxin, welches im Genom eines spezifischen Corynephagen codiert ist. Nicht toxigene Corynebakterien können die Fähigkeit, Diphtheriatoxin zu erzeugen, durch Infektion mit tox⁺-Phagen erwerben [Laude, 2001).
Infektionen durch C. diphtheriae werden weltweit beobachtet, die meisten Erkrankungen treten in gemäßigten Klimazonen mit einem saisonalen Morbiditätsgipfel im Herbst und Winter auf. In den ehemaligen Republiken der Sowjetunion ist die Zahl der gemeldeten Erkrankungsfälle von 1436 im Jahr 1990 stark angestiegen auf 50 434 im Jahr 1995, ehe Impfaktionen der Weltgesundheitsorganisation zu einem Rückgang auf rund 1500 Fälle in den Jahren 1999 und 2000 führten [Kelly & Efstratiou, 2003].
Auch wenn in Deutschland der letzte registrierte Todesfall 1997 auftrat, ist die Gefahr durch Diphtherie in Westeuropa weiterhin latent vorhanden, und in weiten Teilen der dritten Welt ist die Diphtherie weiterhin endemisch. Die Gefahr für eine Wiederkehr der Diphtherie nach Westeuropa liegt insbesondere begründet in einer weltweiten Reisetätigkeit und der Öffnung Westeuropas nach Osten, verbunden mit einer zurückgehenden Immunisierung der Bevölkerung. So wird in der Region um St. Petersburg seit 1998 eine jährlich zunehmende Anzahl an Fällen mit inzwischen 2,6 Infektionen auf 100 000 Einwohner beobachtet. Zwischen 1997 und 2002 wurden im Vereinigten Königreich 36 Fälle einer Infektion mit Corynebakterien festgestellt, 1993 trat in Finnland der erste Fall seit 30 Jahren auf, im Jahr 2002 die ersten Fälle in Frankreich und Italien seit Ende der 80er Jahre. In Lettland wurden allein zwischen 1993 und 2001 insgesamt 1288 Fälle, darunter 96 tödlich verlaufende, registriert. Bedenklich stimmt, dass die Immunisierung der Bevölkerung nicht ausreichend ist. So ergab eine Studie in Österreich, dass unter den 18 bis 70 jährigen 27 % überhaupt keinen und weitere 27 % nur einen geringen Schutz gegenüber Corynebakterien besaßen [Laude, 2001; Kelly & Efstratiou, 2003], in Deutschland sind gar nur noch ein Drittel der Erwachsenen ausreichend geschützt [Impfkommission, 2000], sodass hier eine erhebliche latente Gefahr besteht.
Die Primärinfektion mit Corynebakterien erfolgt überwiegend im Respirationstrakt und betrifft hauptsächlich die Tonsillopharyngealregion. Wesentlich seltener treten laryngeale, nasale oder tracheobronchiale Primärinfektionen auf. Die Haut- und Wunddiphtherie kommt dagegen vor allem in den Tropen vor, in den westlichen Ländern nur bei bestimmten Gruppen wie Obdachlosen, Alkoholikern und Drogensüchtigen. Wichtigste Komplikationen sind die Obstruktion des Respirationstraktes, die Myokarditis und Polyneuritis. Der Tod tritt als Folge einer Atemwegsobstruktion oder eines Herzversagens ein, die Letalität liegt bei 5–10 %, unter ungünstigen Verhältnissen bei bis zu 25 %. Bei klinischem Verdacht auf eine Diphtherie ist sofort eine Labordiagnostik einzuleiten. Die dafür zur Verfügung stehenden Methoden sind durch die Notwendigkeit der Anlage einer Kultur oder hohen apparativen Aufwand gekennzeichnet [Laude, 2001].
Diphtheriatoxin führt durch die Inhibierung der Proteinbiosynthese zum Zelltod. Die Regulation der tox-Genexpression wird durch den eisenaktivierten Repressor DtxR der Corynebakterien kontrolliert [Tao et al., 1994]. Das Toxin wird in großer Menge nur dann produziert, wenn sich das Wachstum der Bakterien aufgrund von Eisenmangel abschwächt. Diphtheria toxin wird als Precursor synthetisiert und kotranslational sekretiert [Smith et al., 1980]. Funktionell besteht es aus einer katalytischen Domäne, einer Membrantransferdomäne und einer Rezeptorbindungsdomäne [Choe et al. 1992]. Letztere bindet an den heparinbindenden epidermalen Wachstumsfaktor ähnlichen Precursor auf der Oberfläche eukaryoter Zellen [Naglich et al., 1992]. Nach Rezeptor vermittelter Endocytose wird Diphtheriatoxin in einem Protease sensitiven Loop durch eine Protease der Furinfamilie zwischen der katalytischen Domäne und der Membrantransferdomäne gespalten [Tsuneoka et al., 1993]. Die katalytische Domäne wird auch als A-Kette bezeichnet (DTA), die beiden anderen Domänen bilden die B-Kette; beide Ketten sind weiterhin über eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft. In der sauren Umgebung der Endosomen dringt die Membrantransferdomäne in die endosomale Membran ein und vermittelt den Transfer der A-Kette ins Cytosol. Dies erfolgt unter Mithilfe eines cytosolischen Translokationsfaktorkomplexes der Zielzelle, der auch eine Thioredoxinreduktase enthält, die vermutlich in die Spaltung der Disulfidbrücke involviert ist [Papini et al., 1993; Falnes et al., 1994; Ratts et al., 2003].
Bei der A-Kette von Diphtheriatoxin (DTA) handelt es sich um ein ADP-ribosylierendes Enzym. Substrat ist ein posttranslational modifizierter Histidinrest im eukaryotischen Elongationsfaktor (EF2), das Diphthamid-715. Bei der durch DTA katalysierten Reaktion wird die ADP-Ribose aus NAD⁺ (Nicotinamid-Adeninnukleotid) unter Freisetzung von Nicotinamid auf EF2 übertragen, der dadurch inaktiviert wird [Chung & Collier, 1993]. Da ein DTA-Molekül eine Vielzahl an EF2-Molekülen ADP-ribosylieren kann, reichen meist wenige Toxinmoleküle aus, um die zelluläre Proteinbiosynthese zu inhibieren, wodurch schließlich Apoptose erfolgt [Koch und Collier, 1993]. Dies erklärt auch die enorme Toxizität des Diphtheriatoxins; rund 100–150 ng/kg Körpergewicht gelten als letal [Gill, 1982].
Neben Diphtheriatoxin existiert mit Pseudomonas Exotoxin A (PE) ein weiteres bakterielles Toxin, welches den Elongationsfaktor EF2 ADP-ribosyliert [Pavlovskis et al., 1978]. Der opportunistische Erreger ruft Wundinfektionen, insbesondere bei Brandwunden, mit blaugrünem Eiter hervor. Komplikationen sind vor allem Pneumonie, Peritonitis, Meningitis und Sepsis. Patienten mit Mukoviszidose sind besonders anfällig für eine Infektion mit Pseudomonien.
Um die richtigen Strategien zur Behandlung einer Diphtherie ergreifen zu können, ist eine zweifelsfreie und rasche Identifizierung tox-positiver Corynebakterien erforderlich. Eine Di agnose auf der Basis rein klinischer Daten ist häufig schwierig, insbesondere dort, wo die Krankheit wie in Westeuropa eher selten auftritt. Diphtherie wird häufig mit anderen Krankheitsbildern verwechselt, wie beispielsweise Streptokokken bedingter Angina tonsillaris, Plaut-Vincent-Angina oder Pfeiffer-Drüsenfieber. Eine genaue mikrobiologische Diagnose ist daher von besonderer Wichtigkeit [Estratiou et al., 1994].
Eine Verwechslung einer Infektion durch Pseudomonas aeruginosa mit einer Infektion durch Corynebakterien schließt das klinische Erscheinungsbild aus. Die klinische Diagnose gelingt anhand der Eiterfarbe und der unter UV-Licht auftretenden Fluoreszenz im Wundbereich. Die Labordiagnose erfolgt in der Regel mikrobiologisch über Selektivmedien, typischerweise Blutagar, aber auch molekularbiologische Techniken sind beschrieben [Xu et al., 2004].
Geschwindigkeit und Genauigkeit ist von besonderer Bedeutung bei der Diagnose von Diphtherie. Die Analyse ist jedoch stark abhängig von der Verfügbarkeit von Reagenzien, der Erfahrung des Laborpersonals und finanziellen Mitteln. Das aus Rachenabstrichen gewonnene Material sollte auf Tellurit-Nährboden ausgestrichen werden, weil Tellurit das Wachstum der meisten oral vorkommenden Bakterien hemmt, nicht jedoch das von Corynebakterien, vielen Staphylokokken und Hefen, die in der Lage sind Tellurit zu schwarzem Tellur zu reduzieren [Bisgard et al., 1998].
Potentiell toxische Arten der Corynebakterien sind C. diphtheriae, C. ulcerans und C. pseudotuberculosis. Der Nachweis dieser Arten kann über die Anwesenheit von Cystinase bei gleichzeitiger Abwesenheit von Pyrazinamidase geführt werden [Colman et al., 1992]. C. diphtheriae tritt in vier Biotypen auf (var. gravis, var. mitis, var. belfanti, var. intermedius), die aufgrund weiterer biochemischer Parameter unterschieden werden können. Die genannten Differenzierungen können für epidemiologische Betrachtungen eine Rolle spielen, für die zu treffenden ärztlichen Maßnahmen sind sie jedoch von untergeordneter Bedeutung. Das alles entscheidende Kriterium ist, ob die zu charakterisierenden Corynebakterien mit tox-positiven Corynephagen infiziert sind. Dieser Test sollte ohne Verzögerung für jedes verdächtige Isolat durchgeführt werden. Alle bislang angewendeten Tests weisen jedoch zahlreiche Nachteile auf, so je nach Test unter anderem Unzuverlässigkeit, Langsamkeit, hoher technischer Aufwand und gehobene Laboranforderungen [Collier und Kandel, 1971]. Auch wenn prinzipiell Nachweissysteme zur Bestimmung der Enzymaktivität des Toxins für Forschungszwecke beschrieben sind [Collier und Kandel, 1971], existiert bislang kein diagnostischer Test, der direkt die Enzymaktivität des Diphtheriatoxins nachweist, obwohl dies der unmittelbare Nachweis für die Anwesenheit von Corynephagen wäre.
Der bis weit über die Mitte des letzten Jahrhunderts durchgeführte Virulenztest in vivo an Meerschweinchen hat heute praktisch keine Bedeutung mehr. In den letzten Jahrzehnten erfolgte der Nachweis des Toxins meist mit dem nach S. D. Elek benannten und 1949 veröffentlichten Immundiffusionstest [Elek, 1949], der bis heute in zahlreichen Modifikationen Anwendung findet. Bei einer am 29.04.2002 in Deutschland aufgetretenen Diphtherieerkrankung wurde die Diagnose am 08.05.2002 labordiagnostisch mittels Elek-Test gesichert [Maassen und Pfaff, 2002]. Bei diesem Verfahren werden die Erreger auf Proteose-Peptonagar senkrecht zu einem darauf liegenden, mit einem anti-Diphtheriatoxin getränkten sterilen Papierstreifen aufgeimpft. Nach 24- bis 48-stündiger Bebrütung treten Präzipitationsstreifen an den Beruhrungsstellen zwischen diffundiertem Toxin und dem Antitoxin auf. Dieser Test ist jedoch sehr fehlerbehaftet, so ist zum Beispiel die Reinheit des Antitoxins und der Abstand zum Inoculum von entscheidender Bedeutung [Reinhardt et al., 1998; Engler et al., 1997].

Die Entwicklung neuer Techniken eröffnete auch neue Nachweismöglichkeiten für das Diphtheriatoxin. Zahlreiche Veröffentlichungen zeigen den Nachweis des Toxingens mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und abgeleiteter Techniken [Mothershed et al., 2002 und Übersicht in Efstratiou et al., 2000]. Zwar werden auch für die PCR in der Regel zunächst Kulturen angelegt, jedoch ist ein Nachweis direkt aus dem klinischen Material möglich, sodass in diesem Fall die Nachweiszeit deutlich verkürzt werden kann [Efstratiou et al., 1998]. Bei einem validierten negativen Ergebnis kann die PCR eine Infektion mit toxigenen Corynebakterien zwar mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit ausschließen, bei einem positiven Ergebnis muss jedoch nicht zwangsläufig eine Toxinexpression vorliegen. Mehrere Studien haben gezeigt, dass es Isolate von Corynebakterien gibt, die das Toxingen besitzen, jedoch kein aktives Diphtheriatoxin produzieren und somit aus diagnostischer Sicht nicht toxigen sind. Solche Isolate wurden zunächst vor allem in Nordamerika gefunden, neuere Studien aus Russland und der Ukraine zeigen auch dort eine zunehmende Zahl an nicht toxigenen Stämmen, die positiv in der PCR sind [Efstratiou et al., 2000; Efstratiou et al., 1998; Pallen, 1991; Pallen et al., 1994; Groman et al., 1983]. Die PCR kann somit nicht als alleinige Methode zur Diagnose herangezogen werden. Zudem ist gerade in vielen der Länder, in denen Diphtherie endemisch auftritt, die dafür erforderliche Ausstattung nicht in ausreichendem Maße verfügbar.

Weitere Methoden zum Nachweis von Diphtheriatoxin sind Immunoblots, Enzym gekoppelte Immunadsorptionstests (ELISA) und immunochromatografische Streifentests [Efstratiou, 2000, Efstratiou, 1998; Engler et al., 2002], jedoch sind dies letztlich alles Varianten eines Antikörper-Antigen-Nachweises, sodass diese Methoden keine grundsätzlich neue Qualität gegenüber dem Elek-Test darstellen und vermutlich daher auch keine Verbreitung in der Diagnostik gefunden haben. Andere Testverfahren wie der Latexagglutinationstest, der passive Hämagglutinationsassay und der Verozellenassay können zwar auch zum Nachweis von Diphtheriatoxin genutzt werden, haben ihre Bedeutung aber eher in der Titerbestimmung von Diphtheriatoxin-Antikörpern [Walroy et al., 2000]. Alle diese Methoden sind sehr indirekte Titrationsverfahren, die wie die oben genannten unmittelbar immunologischen Techniken ebenfalls auf Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen basieren.

Alle möglichen Nachweisverfahren lassen sich auf drei grundsätzliche Prinzipien zurückführen, (i) den immunologischen Nachweis des Antigens, (ii) den molekularbiologischen Nachweis des Toxingens und (iii) den Aktivitätsnachweis des Toxins. Obwohl das dritte Prinzip den unmittelbaren Nachweis aktiver Toxine verkörpert und damit genau über die diagnostisch relevante Kernfrage Auskunft gibt, existiert dafür bislang mit Ausnahme des Tests an lebenden Meerschweinchen kein relevantes diagnostisches Verfahren.

Auch die in jüngsten Veröffentlichungen [Hoshino et al., 2005; Rubina et al., 2005; Rucher et al. 2005] beschriebenen Verfahren beruhen auf dem Nachweis durch Antikörper. Durch die Anwendung aufwändiger technischer Methoden, wie etwa der totalen internen Reflektionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) werden die Nachweise zwar sensitiver, die Verfahren sind jedoch aufgrund der Kosten und des Arbeitsaufwands weder für Screeningassay geeignet, noch wird dabei die Aktivität des Diphtheriatoxins nachgewiesen. Einer der wesentlichen Nachteile des Elek-Tests wird damit nicht beseitigt. Beschrieben wurde beispielsweise ein Verfahren, bei dem anti-DT-Antikörper mit fluoreszierenden Nanokristall-Quantumdots markiert und mittels TIRFM nachgewiesen werden [Hoshino et al., 2005]. Weitere Verfahren beruhen auf der Verwendung von Hydrogel basierten Proteinmikrochips [Rubina et al., 2005] und einem Kompetitionsassay mit Antikörper basierten Mikroarrays [Rucher et al. 2005].

In der Tumortherapie finden zunehmend zielzellgerichtete Toxine Anwendung. Dabei wird ein Ligand oder Antikörper, der gegen ein tumorzellspezifisches Oberflächenprotein gerichtet ist, mit einem Toxin verknüpft. Als Toxine finden insbesondere Diphtheriatoxin und Pseudomonas Exotin und enzymatisch aktive Teile davon Verwendung (zusammengefasst in [Eklund & Kuzel, 2005; Barth, 2002]). Zur Qualitätskontrolle dieser Wirkstoffe ist eine Überprüfung und genaue Quantifizierung der enzymatischen Aktivität des Toxinanteils von großer Bedeutung.

Die prinzipielle Eignung eines ADP-Ribosylierungsassays für die genannten Fragestellungen konnte von den Erfindern selbst in einem lösungsbasierten ADP-Ribosylierungsassay gezeigt werden [Sutherland et al., 2003; Bachran et al., 2005]. Im Gegensatz zu der hier beschriebenen Erfindung bietet das lösungsbasierte Verfahren, welches nur in Kombination mit gelelektrophoretischen Techniken, Elektromembrantransfer und Immunoblot einsetzbar ist und nur eine semiquantitative Auswertung ermöglicht, keine Aussicht für den routinemäßigen Einsatz in Diagnostik und Qualitätskontrolle und keine Möglichkeit zum vollautomatisierten High-Throughput-Screening.

Folglich besteht im Stand der Technik ein Bedarf an einem Verfahren, mit dem sich die Aktivität von ADP-ribosylierenden Proteinen schneller, genauer und einfach nachweisen lässt, um eine Infektion mit toxinproduzierendem Corynebakterium oder Pseudomonas aeruginosa oder die Enzymaktivität von tumortherapeutischen Proteintoxinen schneller, genauer und einfach nachzuweisen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein verbessertes Verfahren zur Diagnose einer Infektion mit toxinproduzierendem Corynebakterium oder Pseudomonas aeruginosa verfügbar zu machen. Aufgabe war es auch, den Assay so zu gestalten, dass er darüber hinaus zur Quantifizierung der Aktivität von tumortherapeutischen Proteinen, die Diphtheriatoxin oder Pseudomonas Exotoxin oder enzymatisch aktive Teile davon enthalten, geeignet ist.

Kurzfassung der Erfindung

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines ADP-ribosylierenden Enzyms in einer Probe, wobei ein Substrat des ADP-ribosylierenden Enzyms an einer Festphase immobilisiert ist.

In einer Ausführung ist das ADP-ribosylierende Enzym ein eukaryotisches oder ein bakterielles Enzym.

In einer bevorzugten Ausführung ist das ADP-ribosylierende Enzym ein bakterielles Enzym oder ein enzymatisch aktives Fragment, Derivat oder Analogon davon.

In einer besonders bevorzugten Ausführung ist das ADP-ribosylierende Enyzm ein natürliches Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Diphtheriatoxin oder Pseudomonas Exotoxin, oder ein chimäres Protein, umfassend eine enzymatische Aktivität eines Toxins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Diphtheriatoxin und Pseudomonas Exotoxin.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin gelöst durch ein Verfahren zur Diagnose einer bakteriellen Infektion in einem Wirt, umfassend die Bestimmung der Aktivität eines ADP-ribosylierenden Enzyms in einer Probe, wobei ein Substrat des ADP-ribosylierenden Enzyms an einer Festphase immobilisiert ist.

In einer Ausführung ist die bakterielle Infektion ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Diphtherie und einer Pseudomonas aeruginosa-Infektion.

In einer Ausführung ist der Wirt ein Wirbeltier, vorzugsweise ein Säugetier, besonders vorzugsweise ein Mensch.

In einer Ausführung ist das ADP-ribosylierende Enzym ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Diphtheriatoxin, Pseudomonas Exotoxin, Choleratoxin, Pertussistoxin, einem hitzelabilen Enterotoxin, Exoenzym C3-Toxin, Exoenzym C2-Toxin und einem enzymatisch aktiven Fragment, Derivat oder Analogon davon.

In einer bevorzugten Ausführung ist das ADP-ribosylierende Enzym Diphtheriatoxin oder Pseudomonas Exotoxin.

In einer besonders bevorzugten Ausführung dient Pertussistoxin als eine Negativreferenz bei der Bestimmung der Aktivität von Diphtheriatoxin oder Pseudomonas Exotoxin.

In einer Ausführung ist die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Haut-, Wund- oder Schleimhautabstrich, einem Körpersekret, Punktat, einer Biopsie sowie einer Probe von Blut, Liquor und Körpergewebe.

In einer bevorzugten Ausführung ist die Probe ein Schleimhautabstrich aus der Tonsillopharyngealregion.

In einer Ausführung ist die Aktivität des ADP-ribosylierenden Enzyms bestimmbar, ohne zuvor eine Primärkultur anzulegen.

In einer Ausführung ist das Substrat ein natürliches, rekombinantes oder chemisch synthetisiertes Substrat.

In einer bevorzugten Ausführung ist das Substrat ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Elongationsfaktor 2, der G-Protein-α-Untereinheit, einem kleinen GTP-bindenden Protein und einem Fragment, Derivat oder Analogon davon.

In einer besonders bevorzugten Ausführung ist das Substrat natürlicher Elongationsfaktor 2 aus Erbsenkeimen, Weizenkeimen oder Hefe.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung wird der Elongationsfaktor 2 mit einem Solubilisat aus Zellen oder Cytosol, vorzugsweise von Saccharomyces cerevisiae, in Kontakt gebracht, vorzugsweise in einem Verhältnis von 1–5 μl Solubilisat zu 1 μg Elongationsfaktor 2, vorzugsweise nach Hitzebehandlung des Solubilisats für 5–15 min bei 60–70 °C.

In einer besonders bevorzugten Ausführung ist das kleine GTP-bindende Protein Rho oder monomeres G-Aktin.

In einer Ausführung wird die Festphase durch die Oberfläche einer Vertiefung in einer Testvorrichtung bereitgestellt.

In einer alternativen Ausführung wird die Festphase durch die Oberfläche eines Teststreifens oder einer Schicht auf einem Teststreifen bereitgestellt.

In einer Ausführung ist das Substrat an der Festphase direkt oder indirekt immobilisiert.

In einer Ausführung ist das Substrat, wenn es indirekt immobilisiert ist, durch Bindung an ein Linkermolekül immobilisiert.

In einer bevorzugten Ausführung ist das Linkermolekül ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Antikörper, einem Liganden, einer tag-bindenden Verbindung und einem Fragment, Derivat oder Analagon davon.

In einer Ausführung katalysiert das ADP-ribosylierende Enzym die Übertragung einer markierten ADP-Ribose oder eines Fragments, Derivats oder Analogons davon, umfasst von einem markierten NAD⁺-Molekül oder einem Fragment, Derivat oder Analogon davon, auf eine Aminosäure des Substrats.

In einer bevorzugten Ausführung ist die Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Arginin, Cystein, Threonin, Asparagin und Diphthamid.

In einer besonders bevorzugten Ausführung ist die Aminosäure ein von Elongationsfaktor 2 umfasstes Diphthamid.

In einer bevorzugten Ausführung ist das markierte NAD⁺-Molekül 6-Biotin-l7-NAD⁺, umfassend eine biotinylierte ADP-Ribose.

In einer besonders bevorzugten Ausführung wird die biotinylierte ADP-Ribose durch eine Biotin bindende Verbindung gebunden.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung ist die Biotin bindende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem anti-Biotin-Antikörper, Avidin und Streptavidin und einem Fragment, Derivat oder Analogon davon.

In einer Ausführung wird der anti-Biotin-Antikörper colorimetrisch oder luminometrisch nachgewiesen.

In einer Ausführung wird die Aktivität des ADP-ribosylierenden Enzyms quantitativ bestimmt.

In einer bevorzugten Ausführung zeigt eine Enzymaktivität von ≥ 10 ng/ml eine bakterielle Infektion an.

In einer alternativen bevorzugten Ausführung zeigt eine Enzymaktivität von > 50 ng/ml eine bakterielle Infektion an.

In einer besonders bevorzugten Ausführung ist die Enzymaktivität die Aktivität von Diphtheriatoxin oder eines enzymatisch aktiven Fragments, Derivats oder Analogons davon.

In einer Ausführung umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen der Probe;
(b) Inkontaktbringen der Probe mit dem immobilisierten Substrat und dem markierten NAD⁺-Molekül;
(c) Nachweisen der auf das Substrat übertragenen markierten ADP-Ribose;
(d) Vergleichen des in Schritt (c) erhaltenen Ergebnisses mit einer Referenz.

In einer bevorzugten Ausführung ist die Referenz in Schritt (d) eine Negativreferenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Petussistoxin, toxinfreiem Wasser und toxinfreiem Puffer.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist die Referenz in Schritt (d) eine Positivreferenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Diphtheriatoxin und Pseudomonas Exotoxin und einem enzymatisch aktiven Fragment, Derivat oder Analogon davon.

In einer besonders bevorzugten Ausführung ist die Positivreferenz die A-Kette von Diphtheriatoxin.

In einer bevorzugten Ausführung umfasst das Verfahren weiterhin den folgenden Schritt:

(a') Abtrennen partikulärer Bestandteile der Probe durch eine für Proteine durchlässige Trennvorrichtung, vorzugsweise ein Filter mit einer Porengröße im Bereich von 0,22 μm und 0,45 μm.

In einer besonders bevorzugten Ausführung sind die Trennvorrichtung und die Festphase gemeinsam von einer Testvorrichtung umfasst.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin gelöst durch eine Verwendung des Verfahrens zur Bestimmung der Aktivität eines ADP-ribosylierenden Enzyms in einer Probe zur Bestimmung der Aktivität eines chimäres Proteins.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird außerdem gelöst durch eine Verwendung des Verfahrens zur Diagnose einer bakteriellen Infektion in einem Wirt zur Diagnose einer bakteriellen Infektion.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird auch gelöst durch einen Kit zur Bestimmung der Aktivität eines chimären Proteins, wobei das Kit mindestens ein immobilisierbares Substrat und mindestens ein markiertes NAD⁺-Molekül umfasst.

In einer Ausführung umfasst das Kit weiterhin eine Festphase, an der das Substrat immobilisiert ist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird schließlich auch gelöst durch eine Verwendung des Kits zur Bestimmung der Aktivität eines chimären Proteins.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird auch gelöst durch einen Kit zur Diagnose einer bakteriellen Infektion in einem Wirt, wobei das Kit mindestens ein immobilisierbares Substrat und mindestens ein markiertes NAD⁺-Molekül umfasst.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird schließlich auch gelöst durch eine Verwendung des Kits zur Diagnose einer bakteriellen Infektion in einem Wirt.

Der Begriff „Testvorrichtung", wie hier verwendet, bezeichnet beispielsweise eine Mikrotiterplatte („micro plate") mit einer Vielzahl von Vertiefungen („wells"), wie etwa eine 96-Well-Platte.

Als Material für die „Festphase" kommen alle Materialien in Betracht, an denen das Substrat bzw. ein Protein immobilisiert werden kann, wie beispielsweise Polystyrol oder Polyvinylidenfluorid (PVDF). Ebenfalls in Betracht gezogen wird, dass die Festphase beschichtet ist und das Substrat an die Beschichtung bindet. Dies ist beispielsweise der Fall, wenn die Festphase mit „Linkermolekülen" beschichtet ist, die einerseits an die Festphase und andererseits das Substrat binden und auf diese Weise eine indirekte Immobilisierung des Substrats vermitteln.

Der Begriff „colorimetrisch" bedeutet, dass eine Nachweisreaktion die Entwicklung einer Farbreaktion umfasst. Dabei wird ein Farbstoff gebildet, der löslich sein kann (z.B. mit Tetramethylbenzidin als Substrat) oder ausfällt (z.B. mit 6-Chlornaphtol als Substrat).

Die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zum Nachweis von Diphtheriatoxin, Pseudomonas Exotoxin und anderen ADP-ribosylierenden Toxinen auf der Basis einer Festphasenreaktion verfügbar, bei dem immobilisiertes Substrat durch aktives Enzym biotinyliert wird. Der grundlegende Mechanismus der Reaktion ist die Biotinylierung von EF2 durch ADP-ribosylierende Enzyme. Bei bakteriellen Enzymen wird die Reaktion in der Regel durch die A-Kette der Enzyme katalysiert. Eine besonders vorteilhafte Anwendung des Verfahrens ist die Diagnose einer bakteriellen Infektion. Das Verfahren ermöglicht, (a) einen Nachweis direkt aus dem Rachenabstrich ohne Anlage einer Kultur zu führen, (b) die Toxin produzierenden Bakterien unmittelbar anhand ihrer tatsächlichen Enzymaktivität einzustufen, und (c) eine erhebliche Steigerung der Genauigkeit und Nachweisgeschwindigkeit sowie eine verbesserte Sensitivität zu erzielen. Eine weitere Anwendung des Verfahrens besteht darin, die enzymatische Aktivität in tumortherapeutischen Proteinen zu bestimmen. Bei diesen, in der Tumortherapie Anwendung findenden Toxinen handelt es sich um chimäre Proteine mit enzymatisch aktiven Anteilen von Diphtheriatoxin und Pseudomonas Exotoxin, wie beispielsweise Denileukin diftitox (DAB389IL-2; Ontak) und RFB4(dsFv)-PE38 (BL22). Die Erfindung ist ferner geeignet für die Verwendung in der wissenschaftlichen Forschung. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Ergebnisse nach kurzer Zeit vorliegen, da das Anlegen einer Primärkultur entfällt, die Durchführung einfach und kostengünstig ist und eine große Anzahl von Proben analysiert werden kann (High-Throughput-Einsatz).

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung soll im Folgenden unter Bezugnahme auf die Beispiele und die Figuren näher beschrieben werden.

1 zeigt das grundlegende Prinzip für den Nachweis der ADP-Ribosylierungaktivität von Diphtheriatoxin und Pseudomonas Exotoxin [nach Sutherland et al., 2003].

2 zeigt den Nachweis von biotinyliertem EF2 nach Inkubation mit biotinyliertem NAD⁺ und unterschiedlichen Mengen an Diphtheriatoxin im Westernblot [aus Sutherland et al., 2003].

3 zeigt die Coomassiefärbung einer Reinigung des EF2 (Pfeil) aus Keimlingen von Futtererbsen (Pisum sativum ssp. sativum convar. speciosum) über eine Hydroxyapatitsäule (linkes Bild) sowie den Nachweis der Eignung des angereicherten EF2 als Substrat für Diphtheriatoxin (rechtes Bild). Angereicherter EF2 wurde in Gegenwart von DTA mit biotinyliertem NAD⁺ versetzt. Der Nachweis der ADP-Ribosylierung erfolgte mit einem anti-Biotin-Antikörper im Westernblot.

4 zeigt die Coomassiefärbung einer Reinigung von His-getaggtem EF2 aus S. cerevisiae mittels Nickel-NTA-Affinitätschromatographie.

5 stellt den Einfluss eines Blockierschritts auf das Messsignal dar. Die Vertiefungen der Festphase wurden mit verschiedenen Lösungen blockiert und in Abwesenheit von EF2 mit biotinyliertem NAD⁺ inkubiert. Der Nachweis von Biotin erfolgte nach Inkubation mit einem anti-Biotin-Antikörper und einem Peroxidase markierten Sekundärantikörper colorimetrisch mit Tetramethylbenzidin als Substrat. Coll: Collagen; Gela: Gelatine; LB: Luria Broth Medium; Tf: Transferrin.

6 zeigt das Ergebnis eines kombinierten Lösungs- und Festphasenassays zum Nachweis der Aktivität von Diphtheriatoxin. Angereicherter EF2 wurde in Lösung mit biotinyliertem NAD⁺ und DTA inkubiert und anschließend immobilisiert. ADP-ribosylierter EF2 wurde auf der Festphase mit einem anti-Biotin-Antikörper und einem Peroxidase markierten Sekundärantikörper detektiert. Die Quantifizierung erfolgte colorimetrisch mit Tetramethylbenzidin als Substrat.

7 zeigt das Ergebnis eines Festphasenassays zum Nachweis der Aktivität von Diphtheriatoxin. Angereicherter EF2 wurde immobilisiert und mit biotinyliertem NAD⁺ und DTA inkubiert. Anschließend wurde ADP-ribosylierter EF2 mit einem anti-Biotin-Antikörper und einem Peroxidase markierten Sekundärantikörper detektiert. Die Quantifizierung erfolgte colorimetrisch mit Tetramethylbenzidin als Substrat.

8 zeigt das Ergebnis einer Messung mit dem Festphasenassay. His-getaggter Elongationsfaktor 2 wurde aus der Hefe gereinigt und immobilisiert, und die Enzymreaktion wurde anhand biotinylierter ADP-Ribose mit einem anti-Biotin-Antikörper und einem Peroxidase-markierten Sekundärantikörper colorimentisch nachgewiesen. Als Substrat in der Farbreaktion diente Tetramethylbenzidin.

BEISPIEL 1: Nachweis der Enzymaktivität von Diphtheriatoxin und Pseudomonas Exotoxin
Bei der durch DTA und PE vermittelten Katalyse wird die ADP-Ribose eines NAD⁺-Moleküls auf die Aminosäure Diphthamid des Elongationsfaktors EF2 übertragen (1). Zum Nachweis dieser Reaktion wurde von Collier & Kandel [1971] ein Testverfahren etabliert, bei dem angereicherter EF2 aus Weizenkeimen in Gegenwart des Toxins mit radioaktiv markiertem NAD⁺ inkubiert wird und ADP-ribosylierter EF2 anschließend autoradiographisch nachgewiesen wird [Collier & Kandel, 1971]. Vor wenigen Jahren konnte Zhang [1997] zeigen, dass Diphtheriatoxin und Pertussistoxin (ADP-ribosyliert die α-Einheit von G-Proteinen) auch 6-Biotin-l7-NAD⁺ als Substrat erkennen.
Auf dieser Grundlage wurde ein Aktivitätsassay etabliert, mit dem sich die Enzymaktivität von Diphtheriatoxin und DTA in individuellen Präparationen zuverlässig quantifizieren lässt. In dem Assay wird bei Collier & Kandel [1971] angereicherter EF2 verwendet (siehe Beispiel 2.3 unten), der jedoch zusammen mit biotinyliertem NAD⁺ anstelle von radioaktivem NAD⁺ eingesetzt wird.
In Vorarbeitung zur Entwicklung des Assays erfolgte die Quantifizierung der Aktivität nach gelektrophoretischer Auftrennung durch Nachweis des EF2 im Westernblot mit Hilfe eines anti-Biotin-Antikörpers [Sutherland et al., 2003]. In dieser Form erlaubte der Assay einen schnellen und semiquantitativen Nachweis innerhalb von 5 h nach Probenerhalt. Eine Menge von 17 fmol Diphtheriatoxin (0,1 ng) konnte noch problemlos nachgewiesen werden (2). Nachteilig an diesem Verfahren war jedoch, dass die Bestimmung erst nach gelchromatiographischer Auftrennung der Proteine im Westernblot erfolgen konnte und nur semiquantitiativ war. Deshalb wurde das Verfahren zu einem Festphasenassay weiterentwickelt.
Das Prinzip des Verfahren der vorliegenden Erfindung beruht auf der direkten oder indirekten Immobilisierung des Substrats an einer Festphase und der Inkubation mit der Probe, bei der das Substrat ADP-ribosyliert wird, wenn aktives Toxin in der Probe vorhanden ist. Die ADP-Ribose stammt aus ebenfalls angebotenem NAD⁺, das in seinem Adeninanteil biotinyliert ist. Das bei der Enzymreaktion auf das Substrat übertragene Biotin wird mit Hilfe eines oder mehrerer Antikörper oder Biotin bindender Proteine nachgewiesen und im Anschluss an eine colorimetrische oder anderweitige Nachweisreaktion mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin spektrophotometrisch quantifiziert.
Um eine unspezifische Bindung an die Festphase zu verhindern, wird die Festphase zuvor blockiert. Für die Blockierung eignen sich u. a. Gelatine (5) oder eine Lösung, bestehend aus 2 % Sucrose, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,9 % Natriumchlorid. Der Assay funktioniert nicht nur als reiner Festphasenassay, sondern auch als gemischter Assay, bei dem die Immobilisierung erst nach der Enzymreaktion erfolgt (6). Als reiner Festphasenassay durchgeführt lässt sich sowohl mit natürlichem EF2 (7) als auch mit His-getaggtem, rekombinant hergestelltem EF2 (8) die Enzymaktivität quantitativ bestimmen, wobei mit dem rekombinant hergestellten Produkt die besseren Ergebnisse erzielt werden.
Wie aus 8 hervorgeht, ist in Gegenwart von 2,5 μM 6-Biotin-l7-NAD eine Konzentration von 50 ng/ml Diphtheriatoxin sehr gut nachweisbar, und selbst eine Konzentration von 10 ng/ml lässt sich noch nachweisen (im Vergleich zur Kontrolle ohne Diphtheriatoxin). In Gegenwart von 2,5 μM 6-Biotin-l7-NAD liegt die Nachweisgrenze des Assays damit bei etwa ≥ 10 ng/ml Diphtheriatoxin.
Lebende Bakterienkulturen sezernieren zahlreiche Substanzen in ihre Umgebung, die mit dem Nachweissystem interferieren können. In Gegenwart von intakten Bakterien kann es nicht nur zu einer Störung des Testverfahrens durch sezernierte Substanzen kommen, ebenso könnten die Bakterien selbst sich an die Oberfläche der Mikrovertiefungen heften. In diesem Fall besteht die Möglichkeit, Zellkulturplatteneinsätze (z. B. Millicell^TM oder MultiScreen^TM von Millipore) zu verwenden. Diese Systeme sind eigentlich für die Untersuchung von Epithelzellen vorgesehen und erlauben eine Trennung von apikalem und basolateralem Medium. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden sie dazu verwendet, das Probenmaterial von der mit EF2 immobilisierten Oberfläche derart zu trennen, dass der Durchtritt für Bakterien ausgeschlossen ist, die Diffusion des Toxins aber frei erfolgen kann. Wie dicht der Bakterienrasen auf dem Filter ist, spielt dabei für diese Untersuchungen keine Rolle.
BEISPIEL 2: Bereitstellen von Diphtheriatoxin, Pseudomonas Exotoxin und EF2
2.1. Diphtheriatoxin
Diphtheriatoxin bzw. Pseudomonas Exotoxin (siehe 2.2. unten) dienen in dem Festphasenassay als Posititvrefernz.
Komplettes Diphtheriatoxin kann käuflich erworben werden (Firma Sigma).
Die enzymatisch aktive A-Kette des Diphtheriatoxins (DTA) kann sowohl biochemisch durch tryptische Spaltung des kompletten Toxins als auch molekularbiologisch durch Expression des Fragments hergestellt werden.
DTA und alle DTA-Fusionsproteine werden im E. coli-Stamm BL21(DE3) pLysS oder Rosetta(DE3) pLysS unter Verwendung eines pET11d-Vektors exprimiert. Die rekombinante Form von DTA ist zu bevorzugen, da die Herstellung preislich am günstigsten ist. Alternativ können die Proteine in PKK233-3, dessen Multiple Cloning Site ausgetauscht wurde, zur Expression gebracht werden. Die Reinigung der Produkte erfolgt durch Ionenaustauschermaterialien und Gelfiltration sowie im Falle His-getaggter Proteine durch Metallchelatchromatographie. Auf diese Weise werden die meisten Konstrukte in einer Reinheit von mehr als 90 % erhalten.
2.2. Pseudomonas Exotoxin
Neben Diphtheriatoxin und DTA kann als ADP-ribosylierendes Enzym auch die katalytische Domäne von Pseudomonas Exotoxin (Ib_385-404/III) erfolgreich exprimiert werden. Als Quelle für Pseudomonas Exotoxin kommt auch rekombinant hergestelltes komplettes Toxin in Betracht.
2.3. Elongationsfaktor 2
Für die durchzuführenden Aktivitätstests wird EF2 in Anlehnung an die Methode von Passador & Iglewski [1994] angereichert. Nach 2-stündigem Wässern werden 100 g Weizenkörner im Dunkeln in einer feuchten Atmosphäre keimen gelassen. Etwa 3 g der abgeschnittenen Keime werden homogenisiert, es wird filtriert und nach differentieller Zentrifugation werden die bei 200 000 × g in 100 mM KCl löslichen Proteine mit Ammoniumsulfat gefällt, und anschließend wird dialysiert. Der so angereicherte EF2 macht etwa 5 % des Gesamtproteins aus; er kann bei –80°C gelagert werden [Sutherland et al., 2003].
Zur Durchführung des Enzymassays an einer Festphase sind jedoch Reinheiten von mindestens 90 % erforderlich. Die veröffentlichte dreidimensionale Struktur des EF2 aus der Hefe [Jorgensen, 2004] eröffnet nunmehr die Möglichkeit, gezielt Peptidantikörper gegen eine gut definierte und exponierte Struktur zu generieren. Daher wurden zur Herstellung polyklonaler Peptidantikörper die Synthese des Peptids 739-AVGGIYSVLNKKRG-752 des EF2 und die anschließende Immunisierung von Kaninchen durchgeführt. Das Peptid bildet im EF2 eine gut nach außen exponierte α-Helix aus, die dem Diphthamid im Molekül diametral gegenüber liegt, sodass sterische Hinderungen für die ADP-Ribosylierung durch die Antikörper praktisch ausgeschlossen sind, eine Voraussetzung, die durch die bislang beschriebenen polyklonalen Antikörper nicht gewährleistet werden kann. Das für die Immunisierung eingesetzte EF2-Peptid aus der Hefe unterscheidet sich in drei Aminosäuren von dem des Weizens, von denen zwei jedoch sehr ähnliche Aminosäuren sind. Da für den EF2 aus Weizen keine Daten für die dreidimensionale Struktur vorliegen und es daher nicht gänzlich ausgeschlossen werden kann, dass die homologe Region beim Weizen weniger gut exponiert ist, wurde die Hefesequenz bevorzugt.
Zunächst werden die Antikörper aus dem Kaninchenserum mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Als Bindungspartner dient dabei das für die Immunisierung eingesetzte und an NHS-aktivierter Matrix immobilisierte Peptid. Der EF2 wird zunächst angereichert und anschließend chromatographisch gereinigt. Verwendung dafür finden bei natürlichen Proteinen Anionenaustauscher und Hydroxyapatitsäulen, bei His-getaggten Proteinen Metallchelatsäulen. Alternativ ist eine Affinitätschromatographie mit Antikörpern möglich, sofern Antikörper zur Verfügung stehen, die das native Protein erkennen. Durch Variation der Beladungs- und Elutionsbedingungen kann die Aufreinigung optimiert werden. Die ADP-Ribosylierbarkeit des gereinigten EF2 wird mit dem bereits etablierten Assay auf Westernblotbasis überprüft.
Wie beschrieben, unterscheidet sich die Hefesequenz des für die Immunisierung ausgewählten Peptides geringfügig von der Weizensequenz. Da es sich um polyklonale Antikörper handelt, ist die erwünschte Kreuzreaktion dennoch wahrscheinlich; mit einer geringeren Affinität muss jedoch gerechnet werden. Alternativ lässt sich EF2 analog aus Hefen in der Proliferationsphase gewinnen.
Eine Vergrößerung der Menge an Ausgangsmaterial kann durch zwei alternative Methoden erreicht werden. Bei der ersten Methode werden die Keimlinge von Futtererbsen (Pisum sativum ssp. sativum convar. speciosum) statt von Weizenkörnern verwendet. Für die Aufreinigung werden verschiedene Kombinationen von Anionenaustauscher (Mono Q), Hydroxyapatit, HiTrap Blue und Gelfiltration verwendet. Dabei konnte im ersten Reinigungsschritt sowohl mit Mono Q als auch mit Hydroxyapatit (3, links) eine gute Anreicherung von etwa 30 % erzielt werden. Mit Hilfe des herkömmlichen Aktivitätsassays konnte im Westernblot gezeigt werden, dass der so gewonnene EF2 ADP-ribosylierbar ist (3, rechts). Für einen optimierten Festphasenassay ist die nach einer Säule erzielte Reinheit jedoch noch nicht ausreichend.
Bei der zweiten Methode zur Vergrößerung der Menge an Ausgangsmaterial wird Hisgetaggter EF2 aus Hefe verwendet. Das dafür notwendige Plasmid wurde freundlicherweise von Terri Goss Kinzy (Cleveland, Ohio) zur Verfügung gestellt. Nach Expression in Hefe und Aufschluss der Zellen mittels Glaskugelaufschluss kann EF2 über Metallchelatchromatographie gereinigt werden (4).
Bei der Untersuchung der entstehenden EF2-Fragmente zeigte sich, dass ein bestimmtes Degradationsprodukt, das in einer relativ zum vollständigen EF2 großen Menge auftritt, im Aktivitätsassay weiterhin ADP-ribosylierbar ist. Da es für den zu entwickelnden Assay nicht auf die Vollständigkeit, sondern auf die ADP-Ribosylierbarkeit des EF2 ankommt, könnte dieses Fragment eine mögliche Alternative darstellen. Für den Festphasenassay hätte dieses Fragment darüber hinaus den Vorteil, dass aufgrund der geringeren Größe eine höhere Molarität an der Festphase erzielt werden könnte.
Interessantweise hat sich gezeigt, dass die Nachweisreaktion erheblich verbessert werden kann, wenn dem EF2 nach seiner Reinigung Cytosol zugesetzt wird. Dazu wird 1 μg reiner EF2 mit einem Solubilisat aus Saccharomyces cerevisiae versetzt, das zuvor für 5–15 min bei 60–70 °C hitzebehandelt worden ist.
Neuerdings ist erstmals auch ein kommerzieller anti-EF2-Antikörper erhältlich (H-118 von Santa Cruz Biotechnology). Es handelt sich um einen polyklonalen Antikörper gegen ein rekombinantes Protein, das der Sequenz des C-Terminus (Aminosäuren 741–858) des humanen EF2 entspricht. Dieser Antikörper verhält sich allerdings in allen untersuchten Aspekten genau wie der von den Erfindern generierte Antikörper gegen die Aminosäuren 739–752 aus der Hefe. Der Antikörper H-118 reagiert kreuz mit EF2 aus Weizenkeimen, erkennt jedoch ebenfalls nur die denaturierte Form im Westernblot. Im übrigen untermauert dies die Annahme, dass das Epitop durch einen Kofaktor maskiert wird.
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Claims

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines ADP-ribosylierenden Enzyms in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat des ADP-ribosylierenden Enzyms an einer Festphase immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ADP-ribosylierende Enzym ein eukaryotisches oder ein bakterielles Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das ADP-ribosylierende Enzym ein bakterielles Enzym oder ein enzymatisch aktives Fragment, Derivat oder Analogon davon ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das ADP-ribosylierende Enyzm ein natürliches Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Diphtheriatoxin oder Pseudomonas Exotoxin, oder ein chimäres Protein, umfassend eine enzymatische Aktivität eines Toxins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Diphtheriatoxin und Pseudomonas Exotoxin, ist.
Verfahren zur Diagnose einer bakteriellen Infektion in einem Wirt, umfassend die Bestimmung der Aktivität eines ADP-ribosylierenden Enzyms in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat des ADP-ribosylierenden Enzyms an einer Festphase immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die bakterielle Infektion ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Diphtherie und einer Pseudomonas aeruginosa-Infektion.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Wirt ein Wirbeltier, vorzugsweise ein Säugetier, besonders vorzugsweise ein Mensch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das ADP-ribosylierende Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Diphtheriatoxin, Pseudomonas Exotoxin, Choleratoxin, Perlussistoxin, einem hitzelabilen Enterotoxin, Exoenzym C3-Toxin, Exoenzym C2-Toxin und einem enzymatisch aktiven Fragment, Derivat oder Analogon davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das ADP-ribosylierende Enzym Diphtheriatoxin oder Pseudomonas Exotoxin ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei Pertussistoxin als eine Negativreferenz bei der Bestimmung der Aktivität von Diphtheriatoxin oder Pseudomonas Exotoxin dient.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Haut-, Wund- oder Schleimhautabstrich, einem Körpersekret, Punktat, einer Biopsie sowie einer Probe von Blut, Liquor und Körpergewebe.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Probe ein Schleimhautabstrich aus der Tonsillopharyngealregion ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Aktivität des ADP-ribosylierenden Enzyms bestimmbar ist, ohne zuvor eine Primärkultur anzulegen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Substrat ein natürliches, rekombinantes oder chemisch synthetisiertes Substrat ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Elongationsfaktor 2, der G-Protein-α-Untereinheit, einem kleinen GTP-bindenden Protein und einem Fragment, Derivat oder Analogon davon.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Substrat natürlicher Elongationsfaktor 2 aus Erbsenkeimen, Weizenkeimen oder Hefe ist.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Elongationsfaktor 2 mit einem Solubilisat aus Zellen oder Cytosol, vorzugsweise von Saccharomyces cerevisiae, in Kontakt gebracht wird, vorzugsweise in einem Verhältnis von 1–5 μl Solubilisat zu 1 μg Elongationsfaktor 2, vorzugsweise nach Hitzebehandlung des Solubilisats für 5–15 min bei 60–70 °C.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das kleine GTP-bindende Protein Rho oder monomeres G-Aktin ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Festphase durch die Oberfläche einer Vertiefung in einer Testvorrichtung bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Festphase durch die Oberfläche eines Teststreifens oder einer Schicht auf einem Teststreifen bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Substrat an der Festphase direkt oder indirekt immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Substrat indirekt durch Bindung an ein Linkermolekül immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Linkermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Antikörper, einem Liganden, einer tag-bindenden Verbindung und einem Fragment, Derivat oder Analagon davon.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das ADP-ribosylierende Enzym die Übertragung einer markierten ADP-Ribose oder eines Fragments, Derivats oder Analogons davon, umfasst von einem markierten NAD⁺-Molekül oder einem Fragment, Derivat oder Analogon davon, auf eine Aminosäure des Substrats katalysiert.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Arginin, Cystein, Threonin, Asparagin und Diphthamid.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Aminosäure ein von Elongationsfaktor 2 umfasstes Diphthamid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei das markierte NAD⁺-Molekül 6-Biotin-l7-NAD⁺, umfassend eine biotinylierte ADP-Ribose, ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die biotinylierte ADP-Ribose durch eine Biotin bindende Verbindung gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Biotin bindende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem anti-Biotin-Antikörper, Avidin und Streptavidin und einem Fragment, Derivat oder Analogon davon.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der anti-Biotin-Antikörper colorimetrisch oder luminometrisch nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Aktivität des ADP-ribosylierenden Enzyms quantitativ bestimmt wird.
Verfahren nach einen der Ansprüche 5 bis 31, wobei eine Enzymaktivität von ≥ 10 ng/ml eine bakterielle Infektion anzeigt.
Verfahren nach einen der Ansprüche 4 bis 31, wobei eine Enzymaktivität von ≥ 50 ng/ml eine bakterielle Infektion anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, wobei die Enzymaktivität die Aktivität von Diphtheriatoxin oder eines enzymatisch aktiven Fragments, Derivats oder Analogons davon ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen der Probe; (b) Inkontaktbringen der Probe mit dem immobilisierten Substrat und dem markierten NAD⁺-Molekül; (c) Nachweisen der auf das Substrat übertragenen markierten ADP-Ribose; (d) Vergleichen des in Schritt (c) erhaltenen Ergebnisses mit einer Referenz.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Referenz in Schritt (d) eine Negativreferenz ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Petussistoxin, toxinfreiem Wasser und toxinfreiem Puffer.
Verfahren nach Anspruch 35 oder 35 und 36, wobei die Referenz in Schritt (d) eine Positivreferenz ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Diphtheriatoxin und Pseudomonas Exotoxin und einem enzymatisch aktiven Fragment, Derivat oder Analogon davon.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Positivreferenz die A-Kette von Diphtheriatoxin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 38, weiterhin umfassend den folgenden Schritt: (a') Abtrennen partikulärer Bestandteile der Probe durch eine für Proteine durchlässige Trennvorrichtung, vorzugsweise ein Filter mit einer Porengröße im Bereich von 0,22 μm und 0,45 μm.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Trennvorrichtung und die Festphase gemeinsam von einer Testvorrichtung umfasst sind.
Verwendung des Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Bestimmung der Aktivität eines chimäres Proteins.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 5 bis 40 zur Diagnose einer bakteriellen Infektion in einem Wirt.
Kit zur Bestimmung der Aktivität eines chimären Proteins, das mindestens ein immobilisierbares Substrat und mindestens ein markiertes NAD⁺-Molekül umfasst.
Kit nach Anspruch 43, das weiterhin eine Festphase umfasst, an der das Substrat immobilisiert ist.
Verwendung des Kits nach Anspruch 44 zur Bestimmung der Aktivität eines chimären Proteins.
Kit zur Diagnose einer bakteriellen Infektion in einem Wirt nach einem der Ansprüche 5 bis 40, das mindestens ein immobilisierbares Substrat und mindestens ein markiertes NAD⁺-Molekül umfasst.
Kit nach Anspurch 46, das weiterhin eine Festphase umfasst, an der das Substrat immobilisiert ist.
Verwendung des Kits nach Anspruch 47 zur Diagnose einer bakteriellen Infektion in einem Wirt.