DE102005046348B4

DE102005046348B4 - Thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität

Info

Publication number: DE102005046348B4
Application number: DE200510046348
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr. Greiner-Stöffele; Sven Pfeifer; Ramona Schmiedel
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2005-09-15
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2025-09-16
Also published as: DE102005046348A1

Abstract

Thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, enthaltend
a. einen Sequenzabschnitt B mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 1 oder eine Aminosäuresequenz, die eine mindestens 80%-prozentige Identität mit SEQ ID 1 aufweist,
b. einen Sequenzabschnitt A aus 1 bis 5 Aminosäuren, der N-terminal zum Sequenzabschnitt B liegt und an den sich der Sequenzabschnitt B direkt anschließt,
c. einen Sequenzabschnitt C aus 1 bis 5 Aminosäuren, der C-terminal zum Sequenzabschnitt B liegt und der sich an den Sequenzabschnitt B direkt anschließt,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts A mindestens eine Aminosäure ausgewählt aus den Aminosäuren Glutamat oder Aspartat enthält und die Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts C mindestens eine Aminosäure ausgewählt aus den Aminosäuren Arginin, Lysin oder Histidin enthält
oder
dass die Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts A mindestens eine Aminosäure ausgewählt aus den Aminosäuren Arginin, Lysin oder Histidin enthält und die Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts C mindestens eine...

Description

Die Erfindung betrifft ein thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität zum Einsatz in der Molekularbiologie.
Exodeoxyribonuclease III (Exonuclease III) aus Escherichia coli (E. coli) ist ein monomeres Protein aus 268 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 31 kD (C. C. Richardson & A. Kornberg, 1964, J. Biol. Chem. 239, 242–250.).
Exonuclease III weist vier katalytische Eigenschaften auf:

– eine 3'-5' Exonucleaseaktivität, die spezifisch für doppelsträngige DNA ist: Exonucelase III baut doppelsträngige DNA von "blunt"-Enden, 5'-Überhängen oder "nicks" her ab. Sie setzt dabei 5'-Mononukleotide von den 3'-Enden der DNA-Stränge frei und produziert Abschnitte einzelsträngiger DNA.
– eine 3'-Phosphat-Monoesteraseaktivität Exonuclease III entfernt 3'-terminale Phosphatreste und erzeugt 3'-OH-Gruppen.
– eine RNase H-Aktivität Exonuclease III baut den RNA-Strang in DNA-RNA-Hybridduplexen ab
– eine Apyrimidin- bzw. Apurin-Stellen (AP-Stellen) spezifische Endonucleaseaktivität Exonuclease III spaltet Phosphodiester-Bindungen an Apurin- oder Apyrimidin-Stellen und produziert basenfreie Desoxyribose 5'-phosphat Reste als 5'-Termini.

Die Geschwindigkeit der 3'-5'-Exonuclease-Aktivität der Exonuclease III kann durch die Variation der Reaktionstemperatur bzw. durch die Variation der NaCl-Konzentration zwischen 20 und 400 Basen/min eingestellt werden (Tomb, J. F., Barcak, G. J., 1989, Regulating the 3'-5' activity of exonuclease III by varying the sodium chloride concentration, BioTechniques, 7, 932–933.).
Rekombinant hergestellte E. coli Exonuclease III wird bereits seit langem bei zahlreichen molekularbiologischen Anwendungen eingesetzt, z. B zur Herstellung unidirektionaler Deletionen in DNA-Fragmenten in Verbindung mit S1 Nuclease (Henikoff, S., 1984, Unidirectional digestion with exonuclease III creates targeted breakpoints for DNA sequencing, Gene, 28, 351–359.), zur Herstellung von einzelsträngigen Templaten für die Didesoxy-Sequenzierung von DNA (Guo, Li-He., Wu, R., 1982, New rapid methods for DNA sequencing based an exonuclease III digestion followed by repair synthesis, Nucleic Acids Res., 10, 2065–2084.), zur gerichteten Mutagenese (Vandeyar, M. A., et al., 1988, A simple and rapid method for the selection of oligodeoxynucleotide-directed mutants, Gene, 65, 129–133.) oder zur Klonierung von PCR-Produkten (Li, Ch., Evans, R. M., 1997, Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility, Nucleic Acids Res., 25, 4165–4166). Weitere Anwendungsgebiete bestehen für die Rekombination von homologen DNA-Sequenzen (Koltermann, A, Kettling, U, Eigen M., 2002, Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit veränderten Eigenschaften, DE 19953854 A1 ) oder das 1 Wiederzusammensetzen von Genen oder Nukleinsäuren (Short J. M., 2003, Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution, US2003036116 A1 , Short J. M., 2003, Exonuclease-mediated gene assembly in directed evolution, US2002142394 A1 ).
Das Temperaturoptimum der E. coli Exonuclease III liegt bei 32°C. E. coli Exonuclease III wird jedoch bei den meisten molekularbiologischen Anwendungen bei Temperaturen von 35 bis 40°C eingesetzt. Bei diesen Temperaturen wird das Enzym in kurzer Zeit hitzeinaktiviert. Bei Inkubationstemperaturen oberhalb von 50°C wird E. coli Exonuklease III inaktiviert, durch Inkubation für 5 min bei 68°C wird das Enzym vollständig und irreversibel deaktiviert.
Das Enzym wird rekombinant in E. coli hergestellt. Die Präparation von E. coli Exonuclease III wird dadurch erschwert, dass sich das Enzym nicht lyophilisieren lässt. Dadurch kann es nur in gelöster Form gelagert werden, was sich negativ auf die Haltbarkeit auswirkt. Zum Versand von Exonuclease III-Enzymlösungeen ist ein aufwendiger gekühlter Transport erforderlich.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine stabile Variante der E. coli Exonuklease III anzugeben, die bei Inkubationstemperaturen von 35°C bis 40°C länger aktiv ist und ohne Aktivitätsverlust lyophilisierbar ist.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, enthaltend

– einen Sequenzabschnitt B mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 1 oder eine Aminosäuresequenz, die eine mindestens 80%-prozentige Identität mit SEQ ID 1 aufweist,
– einen Sequenzabschnitt A aus 1 bis 5 Aminosäuren, der N-terminal zum Sequenzabschnitt B liegt und an den sich der Sequenzabschnitt B direkt anschließt,
– einen Sequenzabschnitt C aus 1 bis 5 Aminosäuren, der C-terminal zum Sequenzabschnitt B liegt und der sich an den Sequenzabschnitt B direkt anschließt,

Durch die Verknüpfung mindestens eines Aminosäurerestes aus Sequenzabschnitt A mit mindestens einem Aminosäurerest aus Sequenzabschnitt C wird vorteilhaft die Thermostabilität des Enzyms erhöht und das Enzym lässt sich ohne Aktivitätsverlust lyophilisieren. Unter dem Begriff „thermostabil" ist dabei zu verstehen, dass das Enzym mit Exonuklease-Aktivität bei Temperaturen von mehr als 45°C für einen Zeitraum von mindestens 20 Minuten Exonukleaseaktivität aufweist.
Das lyophilisierte und somit getrocknete Enzym ist unter Schutzgas nahezu unbegrenzt haltbar und kann vorteilhaft ohne Kühlung versandt werden.
Sequenzabschnitt B hat eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 1 oder eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 1 identisch ist.
Die prozentuale Aminosäuresequenzidentität ist als derjenige prozentuelle Anteil an Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz definiert, der beim Vergleich der Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 1 mit den Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 1 identisch ist. Der Vergleich der Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 1 erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden, beispielsweise unter Verwendung von Computerprogrammen wie z. B. BLAST.
SEQ ID NO 1 lautet:
SEQ ID 1 entspricht damit dem zentralen Abschnitt (von F3 bis F266) der Aminosäuresequenz von Exonuclease III aus Escherichia coli (Eintrag in Swiss-Prot unter der Accession Number: P09030) gemäß SEQ ID 2:
In einer Ausführungsform der Erfindung enthält Sequenzabschnitt A mindestens eine saure Aminosäure (Glutamat oder Aspartat) und Sequenzabschnitt C enthält mindestens eine basische Aminosäure (Arginin, Lysin oder Histidin). Auf diese Weise ist die Ausbildung einer Salzbrücke zwischen der Seitenkette der sauren Aminosäure des N-Terminal zu Sequenzabschnitt B liegenden Sequenzabschnitts A und der Seitenkette der basischen Aminosäure des C-Terminal zu Sequenzabschnitt B liegenden Sequenzabschnitts C möglich.
Ein erfindungsgemäßes thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität enthält beispielsweise folgende Aminosäuresequenz:
Sequenzabschnitt A weist darin die Aminosäuresequenz (X)_n-E/D-(x)_k-n auf. Sequenzabschnitt C weist darin die Aminosäuresequenz (X)_m-K/R/H-(X)_l-m auf.
Dabei bedeutet „(X)_n" eine Sequenz von n aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, „(X)_k-n" bedeutet eine Sequenz von „n-k" aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, wobei k bzw. n die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei n kleiner oder gleich k ist, „/" bedeutet „oder", d. h. „E/D" bedeutet „Glutamat oder Aspartat", „K/R/H" bedeutet „Lysin, Arginin oder Histidin", „(X)_m" bedeutet eine Sequenz von m aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, „(X)_l-m" bedeutet eine Sequenz von „l-m" aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, wobei l bzw. m die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei m kleiner oder gleich l ist.
Sequenzabschnitt A kann daher beispielsweise folgende Aminosäuresequenzen aufweisen, wobei X für eine beliebige Aminosäure steht:
E für k = 0 und n = 0
X-E für k = 1 und n = 1
E-X für k = 1 und n = 0
X-X-E für k = 2 und n = 2
X-E-X für k = 2 und n = 1
E-X-X für k = 2 und n = 0
X-X-X-E für k = 3 und n = 3
X-X-E-X für k = 3 und n = 2
X-E-X-X für k = 3 und n = 1
E-X-X-X für k = 3 und n = 0
X-X-X-X-E für k = 4 und n = 4
X-X-X-E-X für k = 4 und n = 3
X-X-E-X-X für k =4 und n = 2
X-E-X-X-X für k = 4 und n = 1
E-X-X-X-X für k = 4 und n = 0
Sequenzabschnitt C kann daher beispielsweise folgende Aminosäuresequenzen aufweisen, wobei X für eine beliebige Aminosäure steht:
R für l = 0 und m = 0
X-R für l = 1 und m = 1
R-X für l = 1 und m = 0
X-X-R für l = 2 und m = 2
X-R-X für l = 2 und m = 1
R-X-X für l = 2 und m = 0
X-X-X-R für l = 3 und m = 3
X-X-R-X für l = 3 und m = 2
X-R-X-X für l = 3 und m = 1
R-X-X-X für l = 3 und m = 0
X-X-X-X-R für l = 4 und m = 4
X-X-X-R-X für l = 4 und m = 3
X-X-R-X-X für l = 4 und m = 2
X-R-X-X-X für l = 4 und m = 1
R-X-X-X-X für l = 4 und m = 0
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthält Sequenzabschnitt A mindestens eine basische Aminosäure (Arginin, Lysin oder Histidin) und Sequenzabschnitt C enthält mindestens eine saure Aminosäure (Glutamat oder Aspartat). Auf diese Weise ist die Ausbildung einer Salzbrücke zwischen der Seitenkette der basischen Aminosäure des N- terminal zu Sequenzabschnitt B liegenden Sequenzabschnitts A und der Seitenkette der sauren Aminosäure des C-terminal zu Sequenzabschnitt B liegenden Sequenzabschnitts C möglich.
Ein erfindungsgemäßes thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität enthält beispielsweise folgende Aminosäuresequenz:
Sequenzabschnitt A weist darin die Aminosäuresequenz (X)_n-K/R/H-(X)_k-n auf. Sequenzabschnitt C weist darin die Aminosäuresequenz (X)_m-E/D (X)_l-m- auf.
Dabei bedeutet „(X)_n" eine Sequenz von n aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, „(X)_k-n" bedeutet eine Sequenz von „n-k" aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, wobei k bzw. n die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei n kleiner oder gleich k ist, „/" bedeutet „oder", d. h. „E/D" bedeutet „Glutamat oder Aspartat", „K/R/H" bedeutet „Lysin, Arginin oder Histidin", „(X)_m" bedeutet eine Sequenz von m aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, „(X)_l-m" bedeutet eine Sequenz von „l-m" aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, wobei l bzw. m die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei m kleiner oder gleich l ist.
Sequenzabschnitt A kann daher beispielsweise folgende Aminosäuresequenzen aufweisen, wobei X für eine beliebige Aminosäure steht:
R für k = 0 und n = 0
X-R für k = 1 und n = 1
R-X für k = 1 und n = 0
X-X-R für k = 2 und n = 2
X-R-X für k = 2 und n = 1
R-X-X für k = 2 und n = 0
X-X-X-R für k = 3 und n = 3
X-X-R-X für k = 3 und n = 2
X-R-X-X für k = 3 und n = 1
R-X-X-X für k = 3 und n = 0
X-X-X-X-R für k = 4 und n = 4
X-X-X-R-X für k = 4 und n = 3
X-X-R-X-X für k = 4 und n = 2
X-R-X-X-X für k = 4 und n = 1
R-X-X-X-X für k = 4 und n = 0
Sequenzabschnitt C kann daher beispielsweise folgende Aminosäuresequenzen aufweisen, wobei X für eine beliebige Aminosäure steht:
E für l = 0 und m = 0
X-E für l = 1 und m = 1
E-X für l = 1 und m = 0
X-X-E für l = 2 und m = 2
X-E-X für l = 2 und m = 1
E-X-X für l = 2 und m = 0
X-X-X-E für l = 3 und m = 3
X-X-E-X für l = 3 und m = 2
X-E-X-X für l = 3 und m = 1
E-X-X-X für l = 3 und m = 0
X-X-X-X-E für l = 4 und m = 4
X-X-X-E-X für l = 4 und m = 3
X-X-E-X-X für l = 4 und m = 2
X-E-X-X-X für l = 4 und m = 1
E-X-X-X-X für l = 4 und m = 0
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält Sequenzabschnitt A mindestens ein Cystein und Sequenzabschnitt C enthält mindestens ein Cystein. Auf diese Weise ist die Ausbildung einer Disulfidbrücke zwischen der Cysteinseitenkette des N-terminal zu Sequenzabschnitt B liegenden Sequenzabschnitts A und der Cysteinseitenkette des C-terminal zu Sequenzabschnitt B liegenden Sequenzabschnitts C möglich.
Ein erfindungsgemäßes thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität enthält beispielsweise folgende Aminosäuresequenz:
Sequenzabschnitt A weist darin die Aminosäuresequenz (X)_n-C-(X)_k-n auf. Sequenzabschnitt C weist darin die Aminosäuresequenz (X)_m-C-(X)_l-m auf.
Dabei bedeutet „(X)_n" eine Sequenz von n aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, „(X)_k-n" bedeutet eine Sequenz von „n-k" aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, wobei k bzw. n die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei n kleiner oder gleich k ist, „(X)_m" bedeutet eine Sequenz von m aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, „(X)_l-m" bedeutet eine Sequenz von „l-m" aufeinander folgenden beliebigen Aminosäuren, wobei l bzw. m die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei m kleiner oder gleich l ist.
Sequenzabschnitt A kann daher beispielsweise folgende Aminosäuresequenzen aufweisen, wobei X für eine beliebige Aminosäure steht:
C für k = 0 und n = 0
X-X für k = 1 und n = 1
C-X für k = 1 und n = 0
X-X-C für k = 2 und n = 2
X-C-X für k = 2 und n = 1
C-X-X für k = 2 und n = 0
X-X-X-C für k = 3 und n = 3
X-X-C-X für k = 3 und n = 2
X-C-X-X für k = 3 und n = 1
C-X-X-X für k = 3 und n = 0
X-X-X-X-C für k = 4 und n = 4
X-X-X-C-X für k = 4 und n = 3
X-X-C-X-X für k = 4 und n = 2
X-C-X-X-X für k = 4 und n = 1
C-X-X-X-X für k = 4 und n = 0
Sequenzabschnitt C kann daher beispielsweise folgende Aminosäuresequenzen aufweisen, wobei X für eine beliebige Aminosäure steht:
C für 1 = 0 und m = 0
X-C für l = 1 und m = 1
C-X für l = 1 und m = 0
X-X-C für l = 2 und m = 2
X-C-X für l = 2 und m = 1
C-X-X für l = 2 und m = 0
X-X-X-C für l = 3 und m = 3
X-X-C-X für l = 3 und m = 2
X-C-X-X für l = 3 und m = 1
C-X-X-X für l = 3 und m = 0
X-X-X-X-C für l = 4 und m = 4
X-X-X-C-X für l = 4 und m = 3
X-X-C-X-X für l = 4 und m = 2
X-C-X-X-X für l = 4 und m = 1
C-X-X-X-X für l = 4 und m = 0
In besonders bevorzugten Ausführungsformen enthält das erfindungsgemäße Enzym eine Aminosäuresequenz, die eine der folgenden Aminosäuresequenzen
M-E/D-K
M-K-E/D
M-V-E/D-K
M-E/D-V-K
als Sequenzabschnitt A und eine der folgenden Aminosäuresequenzen
R/K/H-R/K/H
als Sequenzabschnitt C enthält.
In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen enthält das erfindungsgemäße Enzym eine Aminosäuresequenz, die eine der folgenden Aminosäuresequenzen
M-K
M-V-K
M-R/K/H-K
M-V-R/K/H-K
M-K-R/K/H
M-V-K-R/K/H
als Sequenzabschnitt A und eine der folgenden Aminosäuresequenzen
E/D-E/D
R-E/D
E/D-R
als Sequenzabschnitt C enthält.
In alternativen besonders bevorzugten Ausführungsformen enthält das erfindungsgemäße Enzym eine Aminosäuresequenz, die eine der folgenden Aminosäuresequenzen
C-K
M-C
M-K-C
M-C-K
C-V-K
M-V-C
M-V-K-C
M-C-V-K
M-V-C-K
als Sequenzabschnitt A und eine der folgenden Aminosäuresequenzen
C-R
R-C
C-R-R
R-C-R
R-R-C
als Sequenzabschnitt C enthält.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität enthält eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4: SEQ ID NO 3:
Das erfindungsgemäße thermostabile Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 3 enthält, enthält als Sequenzabschnitt A die Aminosäuresequenz M-E-V-K, als Sequenzabschnitt B die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 und als Sequenzabschnitt C die Aminosäuresequenz R-R. Auf diese Weise wird die Ausbildung einer Salzbrücke zwischen der Glutamatseitenkette des Sequenzabschnitts A und einer Argininseitenkette des Sequenzabschnitts C ermöglicht.
Das erfindungsgemäße thermostabile Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 3 enthält, zeigt im Vergleich zur Wildtyp E. coli Exonuklease III gemäß SEQ ID NO. 2 ein um 8°C höheres Temperatur-Optimum von ca. 40°C. Dies geht einher mit einer im Vergleich zur Wildtyp E. coli Exonuklease III verlängerten Aktivität des Enzyms bei Inkubationstemperaturen über 37°C. Vorteilhaft ist das erfindungsgemäße thermostabile Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 3 enthält, lyophilisierbar und nach Lyophilisation ist das Enzym ohne Aktivitätsverlust wieder lösbar. SEQ ID NO 4:
Das erfindungsgemäße thermostabile Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 4 enthält, enthält als Sequenzabschnitt A die Aminosäuresequenz M-C-V-K, als Sequenzabschnitt B die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 und als Sequenzabschnitt C die Aminosäuresequenz C-R. Auf diese Weise wird die Ausbildung einer Disulfidbrücke zwischen der Cysteinseitenkette des Sequenzabschnitts A und der Cysteinseitenkette des Sequenzabschitts C ermöglicht.
Das erfindungsgemäße thermostabile Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 4 enthält, zeigt im Vergleich zur Wildtyp E. coli Exonuklease III gemäß SEQ ID NO. 2 ein um 8°C höheres Temperatur-Optimum von ca. 40°C. Dies geht einher mit einer im Vergleich zur Wildtyp E. coli Exonuklease III verlängerten Aktivität des Enzyms bei Inkubationstemperaturen über 37°C. Vorteilhaft ist das erfindungsgemäße thermostabile Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 4 enthält, lyophilisierbar und nach Lyophilisation ist das Enzym ohne Aktivitätsverlust wieder lösbar.
Bestandteil der Erfindung ist auch ein thermostabile Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, das zusätzlich zu den Sequenzabschnitten A, B und C einen Sequenzabschnitt enthält, der so vorteilhaft die Reinigung des thermostabilen Enzyms mittels affinitätschromatographischer Verfahren ermöglicht, beispielsweise mittels Metallionen-Affinitätschromatographie.
Als besonders geeignet hat sich ein thermostabile Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität erwiesen, das zusätzlich zu den Sequenzabschnitten A, B und C einen Sequenzabschnitt enthält, der aus 6 bis 12 aufeinander folgenden Histidinresten besteht. Besonders geeignet sind thermostabile Enzyme mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 5 oder SEQ ID 6 aufweisen. SEQ ID NO 5:
SEQ ID NO 6
Bestandteil der Erfindung sind auch Nukleinsäuren, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die für ein erfindungsgemäßes thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität kodieren.
Eine für einen Sequenzabschnitt B mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 1 kodierende Nukleinsäure enthält z. B. eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 7: SEQ ID NO. 7:
SEQ ID NO 7 entspricht den Basen 195 bis 1001 des xthA-Gens von Escherichia coli (Accession Number X13002).
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäuren enthalten die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 8 oder die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 9. SEQ ID NO 8 kodiert ein thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuclease-Aktivität gemäß SEQ ID 3, SEQ ID NO 9 kodiert ein thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuclease-Aktivität gemäß SEQ ID 4: SEQ ID NO 8:

SEQ ID NO. 9:
In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren Plasmide, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die für ein erfindungsgemäßes thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität kodieren, in besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Nukleinsäuren Expressionsvektoren, insbesondere Expressionsvektoren, die die Expression des thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease- Aktivität in einem Mikroorganismus, z. B. in Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli, ermöglichen.
SEQ ID NO. 10 kodiert ein Expressionsplasmid für die Expression eines thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuclease-Aktivität gemäß SEQ ID NO. 5. SEQ ID NO. 11 kodiert ein Expressionsplasmid für die Expression eines thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuclease-Aktivität gemäß SEQ ID NO. 6. SEQ ID NO. 10

SEQ ID NO. 11:
Bestandteil der Erfindung ebenfalls Zellen, welche Nukleinsäuren enthalten, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die für ein erfindungsgemäßes thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität kodieren. In besonders bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Zellen Plasmide als Nukleinsäuren, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die für ein erfindungsgemäßes thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität kodieren, in besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Nukleinsäuren Expressionsvektoren, insbesondere Expressionsvektoren, die die Expression des thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität in den Zellen ermöglichen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Zellen Mikroorganismen, z. B. Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli Tuner (DE3) pLacI oder Origami (DE3) pLacI (Novagen/Merck Biosciences, Bad Soden). Menschliche embryonale Stammzellen sind von der Erfindung nicht umfasst.
Bestandteil der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität mit den Schritten:

– Inkubation von Zellen, welche Nukleinsäuren enthalten, die die für ein erfindungsgemäßes thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen enthalten, unter Bedingungen, die eine Expression des thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität ermöglichen
– Reinigen des thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens sind die Zellen Mikroorganismen, z. B. Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli.
Handelt es sich bei dem herzustellenden thermostabilen Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität um ein Enzym, das zusätzlich zu den Sequenzabschnitten A, B und C einen Sequenzabschnitt enthält, der die Reinigung des thermostabilen Enzyms mittels affinitätschromatographischer Verfahren ermöglicht, wie z. B. ein thermostabile Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, das zusätzlich zu den Sequenzabschnitten A, B und C einen Sequenzabschnitt enthält, der aus 6 bis 12 aufeinander folgenden Histidinresten besteht, so erfolgt der Reinigungsschritt geeigneterweise mittels Affinitätschromatographie, beispielsweise mittels Metallionen-Affinitätschromatographie.
Bestandteil der Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität zur Behandlung von doppelsträngigen oder einzelsträngigen Nukleinsäureproben, zur Herstellung unidirektionaler Deletionen in DNA-Fragmenten in Verbindung mit S1 Nuclease, zur Herstellung von einzelsträngigen Templaten für die Didesoxy-Sequenzierung von DNA, zur gerichteten Mutagenese oder zur Klonierung von PCR-Produkten.
Bestandteil der Erfindung sind auch Kits zur Behandlung von doppelsträngigen oder einzelsträngigen Nukleinsäureproben, zur Herstellung unidirektionaler Deletionen in DNA-Fragmenten in Verbindung mit S1 Nuclease, zur Herstellung von einzelsträngigen Templaten für die Didesoxy-Sequenzierung von DNA, zur gerichteten Mutagenese oder zur Klonierung von PCR-Produkten, welche ein erfindungsgemäßes thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität enthalten.
Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert. Dabei zeigen
1: Agarosegele von mit E. coli Exonuclease III (Wildtyp) (1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (1B) behandelter Plasmid-DNA, wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei den angegebenen Temperaturen inkubiert wurde.

Die Plasmid-DNA wurde für 15 min bei 35°C mit Exonuclease III (Wildtyp) (1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 3 (1B) inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA abgestoppt.

S:	DNA Leiter
L:	lineariserte Plasmid-DNA ohne Zugabe von Exonuclease
Bahnen 1:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 34,9°C inkubiert wurde.
Bahnen 2:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig.1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 35,2°C inkubiert wurde.
Bahnen 3:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 36,3°C inkubiert wurde.
Bahnen 4:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 38,0°C inkubiert wurde.
Bahnen 5:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 40,3°C inkubiert wurde.
Bahnen 6:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 42,9°C inkubiert wurde.
Bahnen 7:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 45,7°C inkubiert wurde.
Bahnen 8:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 48,4°C inkubiert wurde.
Bahnen 9:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 51,0°C inkubiert wurde.
Bahnen 10:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 53,2°C inkubiert wurde.
Bahnen 11:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 54,8°C inkubiert wurde.
Bahnen 12:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 1A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 1B), wobei die Exonuclease zuvor 3 Minuten bei 55,7°C inkubiert wurde.

2: Agarosegele von mit Exonuclease III (Wildtyp) (2A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (2B) behandelter Plasmid-DNA, wobei die Exonuclease zuvor für die angegebenen Zeiten bei 45°C inkubiert wurde.

Die Plasmid-DNA wurde für 15 min bei 35°C mit Exonuclease III (Wildtyp) (2A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (2B) inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA abgestoppt

S:	DNA Leiter
L:	lineariserte Plasmid-DNA ohne Zugabe von Exonuclease
Bahnen 1:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 2A) bzw. Exonuclease 111 gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 2B), wobei die Exonuclease zuvor 0 Minuten bei 45°C inkubiert wurde.
Bahnen 2:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 2A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 2B), wobei die Exonuclease zuvor 5 Minuten bei 45°C inkubiert wurde.
Bahnen 3:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 2A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 2B), wobei die Exonuclease zuvor 10 Minuten bei 45°C inkubiert wurde.
Bahnen 4:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 2A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 2B), wobei die Exonuclease zuvor 20 Minuten bei 45°C inkubiert wurde.
Bahnen 5:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 2A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 2B), wobei die Exonuclease zuvor 30 Minuten bei 45°C inkubiert wurde.
Bahnen 6:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 2A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 2B), wobei die Exonuclease zuvor 40 Minuten bei 45°C inkubiert wurde.
Bahnen 7:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 2A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 2B), wobei die Exonuclease zuvor 50 Minuten bei 45°C inkubiert wurde.
Bahnen 8:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III (Wildtyp) (Fig. 2A) bzw. Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (Fig. 2B), wobei die Exonuclease zuvor 60 Minuten bei 45°C inkubiert wurde.

3: Agarosegele von mit Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 3 behandelter Plasmid-DNA, wobei die angegebenen Mengen von Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 eingesetzt wurden. Die Plasmid-DNA wurde für 5 min bei 35°C mit Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 3 inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA abgestoppt.

Fig. 3A:	Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 3, gelöst in 66 mmol/L TRIS/HCl, 0,66 mmol/L MgCl₂, pH 8,0
Fig. 3B:	Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 in 50 mmol/L NH₄HCO₃
Fig. 3B:	Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 nach Lyophilisation, gelöst in 66 mmol/L TRIS/HCl, 0,66 mmol/L MgCl₂, pH 8,0
S:	DNA Leiter
L:	lineariserte Plasmid-DNA ohne Zugabe von Exonuclease
Bahnen 1:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5, wobei 0,2 μg Exonuclease eingesetzt wurde.
Bahnen 2:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5, wobei 0,1 μg Exonuclease eingesetzt wurde.
Bahnen 3:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5, wobei 0,05 μg Exonuclease eingesetzt wurde.
Bahnen 4:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 wobei 0,025 μg Exonuclease eingesetzt wurde.
Bahnen 5:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5, wobei 0,0125 μg Exonuclease eingesetzt wurde.
Bahnen 6:	lineariserte Plasmid-DNA nach Behandlung mit Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5, wobei 0,00625 μg Exonuclease eingesetzt wurde.

Ausführungsbeispiel 1:
Inaktivierungstemperaturen.
Gleiche Mengen (0,2 μg) von Exonuclease III (Wildtyp) und Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 wurden für 3 Minuten bei Temperaturen von 34,9°C bis 55,7°C in ExoIII-Puffer (66 mmol/L TRIS/HCl, 0,66 mmol/L MgCl₂, pH 8,0) inkubiert. Nach Abkühlen wurde linearisierte Plasmid-DNA (0,2 μg, 2,6 kbp) zugesetzt und die Proben wurden für 15 min bei 35°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA (100 mmol/L) abgestoppt.
Die Plasmid-DNA wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert (s. 1). Je weiter unten die Bande der Plasmid-DNA im Vergleich zum Leewert (Bahnen L) im Gel läuft, umso höher ist die verbleibende 3'-5'-Exonuclease-Aktivität. Bei sehr hohen Aktivitäten wird die Plasmid-DNA nahezu komplett abgebaut und es ist keine Bande mehr zu erkennen.
Während Exonuclease III (Wildtyp) bereits ab einer Inkubationstemperatur von 38,0°C einen Aktivitätsverlust zeigt (1A, Bahn 4) ist bei der Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 erst ab 45,7°C ein solcher Aktivitätsverlust erkennbar (1B, Bahn 7). Ab einer Inkubationstemperatur von 42,9°C ist Exonuclease III (Wildtyp) komplett inaktiviert (1A, Bahn 6). Bei der Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 kann selbst bei Inkubationstemperaturen von bis zu 55,7°C keine vollständige Inaktivierung erzielt werden, da im Vergleich zu der Bahn L nach wie vor ein Abbau der DNA stattfindet (1B, Bahnen 8–12).
Ausführungsbeispiel 2:
Stabilität bei 45°C
Gleiche Mengen (0,2 μg) von Exonuclease III (Wildtyp) und Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 wurden bei 45°C in ExoIII-Puffer (66 mmol/L TRIS/HCl, 0,66 mmol/L MgCl2, pH 8,0) inkubiert. Zuvor, nach 5, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 Minuten wurden Aliquots entnommen, mit linearisierter Plasmid-DNA (0,2 μg, 2,6 kbp) versetzt und 15 min bei 35°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA (100 mmol/L) abgestoppt.
Die Plasmid-DNA wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert (s. 2). Je weiter unten die Bande der Plasmid-DNA im Vergleich zum Leewert (Bahnen L) im Gel läuft, umso höher ist die verbleibende 3'-5'-Exonuclease-Aktivität. Bei sehr hohen Aktivitäten wird die Plasmid-DNA nahezu komplett abgebaut und es ist keine Bande mehr zu erkennen.
Während Exonuclease III (Wildtyp) bereits nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 45°C vollständig inaktiviert ist (2A, Bahn 5) ist bei der Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 erst nach 50 min ein solcher vollständiger Aktivitätsverlust erkennbar (2B, Bahn 7). Zwischen 5 und 20 min bei 45°C bewahrt die Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 wesentlich höhere Aktivität als der Exonuclease III (Wildtyp) (2A und 2B, Bahnen 2–5)
Ausführungsbeispiel 3:
Lyophilisierbarkeit
Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 wurde durch Gelfiltration in 50 mmol/L NH₄HCO₃, einen flüchtigen Puffer, überführt, über Nacht lyophilisiert und anschließend wieder in ExoIII-Puffer (66 mmol/L TRIS/HCl, 0,66 mmol/L MgCl2, pH 8,0) gelöst. Von der Ausgangslösung, der Lösung von Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 in 50 mmol/L NH₄HCO₃ und der nach Lyophilisation wieder gelösten Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 wurde eine Konzentrationsreihe gemacht, diese für 5 min mit linearisierter Plasmid-DNA bei 35°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA abgestoppt.
Die Plasmid-DNA wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert (s. 3). Je weiter unten die Bande der Plasmid-DNA im Vergleich zum Leewert (Bahnen L) im Gel läuft, umso höher ist die verbleibende 3'-5'-Exonuclease-Aktivität. Bei sehr hohen Aktivitäten wird die Plasmid-DNA nahezu komplett abgebaut und es ist keine Bande mehr zu erkennen.
Der Vergleich zwischen den erhaltenen Abbauraten bei Einsatz von verschiedenen Mengen von Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 5 (0,2 μg; 0,1 μg; 0,05 μg; 0,025 μg; 0,0125 μg; 0,00625 μg) vor und nach der Lyophilisation (3B und 3C) zeigt, dass durch die Lyophilisation kein Aktivitätsverlust auftritt.
Ausführungsbeispiel 4:
Klonierung des Gens für Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 3

Mit den beiden Primern Exo_NE_S (SEQ ID NO. 12, 5'-ACCTGAATTCCATGGAGGTTAAATTTGTCTCTTTTAATATCAACGGC-3') und Exo_NE_A (SEQ ID NO. 13, 5'-AAAACCGCTCGAGACCGCGGCGGAAGGTCG-3') (beide Thermo Electron, Ulm) wird das für Exonuclease III Wildtyp (SEQ ID NO. 2) codierende Gene (Accession Number X13002) durch eine PCR aus einer E. coli Probe unter den nachfolgenden Bedingungen amplifiziert und dabei die in der thermophilen Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 3 im Vergleich zu Exonuclease III Wildtyp (SEQ ID NO. 2) enthaltenen Mutationen eingefügt. PCR-Bedingungen:

PCR-Ansatz:	10 μl	10 × VENT-Puffer (NEB, Beverly, USA)
	2 μl	dNTPs (je 10 mmol/L)
	100 pmol	Primer Exo_NE_S (SEQ_ID No. 12)
	100 pmol	Primer Exo_NE_A (SEQ_ID No. 13)
	10 μl	Kultur von E. coli K12 OD₆₀₀ = 1,0
	2 U	VENT-Polymerase (NEB)
	ad 100 μl	H₂O dest.

Temperaturprofil der PCR: 2 min/94°C

1. 45 sec/94°C (Denaturierung) – 25 ×
2. 45 sec/57°C (Anlagerung) – 25 ×
3. 30 sec/72°C (Elongation) – 25 × 2 min/2°C

Die resultierenden PCR-Produkte werden mittel des QlAquick PCR-Reinigungs-Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellervorschrift gereinigt.
Restriktionsverdau:
Das Gen wird in den Expressionsvektor pET28a (SEQ_ID No. 14) kloniert. SEQ ID NO. 14 (Vektor pET28a)

Dazu werden das PCR-Produkt und der Vektor pET28a (SEQ_ID No. 14) mittels Restriktionsendonucleasen NcoI und XhoI (alle MBI Fermentas, Vilnius, Litauen) wie folgt inkubiert: Restriktionsverdau-Ansätze:

PCR-Produkte:		Vektor:
2 μg	PCR-Produkt	4 μg	pET28a
4 μl	10 × Puffer Y⁺ (MBI)	4 μl	10 × Puffer Y⁺ (MBI)
10 U	NcoI	10 U	NcoI
10 U	XhoI	10 U	XhoI
ad 20 μl	H₂O dest.	ad 20 μl	H₂O dest.

Die Restriktionsverdau-Ansätze werden 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Zu dem „Vektor-Ansatz" wird anschließend zur Dephosphorylierung 1 U SAP (MBI Fermentas, Vilnius, Litauen) hinzu gegeben und für weitere 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Enzyme für 20 min bei 80°C inaktiviert. Daraufhin werden die Produkte mittels des QlAquick PCR-Reinigungs-Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt.
Ligation, Transformation in E. coli und Plasmid-Reisolation
Die Vektor-DNA und das PCR-Produkt werden durch die Inkubation mit T4-DNA-Ligase wie folgt miteinander verbunden:

Ligase-Ansatz: 200 fmol Vektor-DNA

600 fmol PCR-Produkt

3 μl 10 × Ligase-Puffer (MBI)

1 μl T4-DNA-Ligase

ad 30 μl H₂O dest.
Die Ansätze werden 8 h bei 16°C inkubiert und anschließend wurde das Enzym durch 10-minütige Inkubation bei 65°C inaktiviert. 1 μl dieses Ansatzes wurde direkt zur Transformation kommerziell erhältlicher kompetenter XL1 Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla, USA) mittels Elektroporation eingesetzt. Die elektroporierten Zellen wurden auf Festagar-Platten mit Kanamycin ausplatiert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Ausgehend von einer resultierenden Einzelkolonie wird das fertige Plasmid mittels des Plasmid-Reinigungskits QlAprep Minipräparations-Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellervorschrift reisoliert und das Plasmid pEP28_exoNE erhalten. Durch Klonierung in pET28 wird das Gen für die thermophile Exonuclease gemäß SEQ ID NO. 3 mit dem in pET28 vorhandenen His₆-Tag verschmolzen, so dass bei Expression die thermophile Exonuclease gemäß SEQ ID NO. 5 hergestellt wird.
Ausführungsbeispiel 5:
Klonierung des Gens für Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 4

Mit den beiden Primern Exo_NC_S (SEQ ID NO. 15, 5'-CAGTACATGTGCGTTAAATTTGTCTCTTTTAATATCAACGGCCTG-3') und Exo_NC_A (SEQ ID NO. 16, 5'-GTGGTGCTCGAGACCGCGGCAGAAGGTCGCCCAGAC-3') (beide Thermo Electron, Ulm) wird das für Exonuclease III Wildtyp (SEQ ID NO. 2) codierende Gene (Accession Number X13002) durch eine PCR aus einer E. coli Probe unter den nachfolgenden Bedingungen amplifiziert und dabei die in der thermophilen Exonuclease III gemäß SEQ ID NO. 4 im Vergleich zu Exonuclease III Wildtyp (SEQ ID NO. 2) enthaltenen Mutationen eingefügt. PCR:

PCR-Ansatz:	10 μl	10 × VENT-Puffer (NEB, Beverly, USA)
	2 μl	dNTPs (je 10 mmol/L)
	100 pmol	Primer Exo_NC_S (SEQ_ID No. 15)
	100 pmol	Primer Exo_NC_A (SEQ_ID No. 16)
	10 μl	Kultur von E. coli K12 OD₆₀₀ = 1,0
	2 U	VENT-Polymerase (NEB)
	ad 100 μl	H₂O dest.

Temperaturprofil der PCR: 2 min/94°C

1. 45 sec/94°C (Denaturierung) – 25 ×
2. 45 sec/57°C (Anlagerung) – 25 ×
3. 30 sec/72°C (Elongation) – 25 × 2 min/72°C

Die resultierenden PCR-Produkte werden mittel des QlAquick PCR-Reinigungs-Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellervorschrift gereinigt.
Restriktionsverdau:

Zur Klonierung des Gens in den Expressionsvektor pET28a (SEQ_ID No. 14) wird das PCR-Produkt und der Vektor mittels Restriktionsendonucleasen NcoI und XhoI (alle MBI Fermentas, Vilnius, Litauen) wie folgt inkubiert: Restriktionsverdau-Ansätze:

PCR-Produkte:		Vektor:
2 μg	PCR-Produkt	4 μg	pET28a
2 μl	10 × Puffer O⁺ (MBI)	4 μl	10 × Puffer Y⁺ (MBI)
10 U	PciI (NEB)	10 U	NcoI
10 U	XhoI	10 U	XhoI
ad 20 μl	H₂O dest.	ad 20 μl	H₂O dest.

Die Restriktionsverdau-Ansätze werden 2 h bei 37°C inkubiert. Zu dem „Vektor-Ansatz" wird anschließend zur Dephosphorylierung 1 U SAP (MBI Fermentas, Vilnius, Litauen) hinzu gegeben und für weitere 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Enzyme für 20 min bei 80°C inaktiviert. Daraufhin werden die Produkte mittels des QlAquick PCR-Reinigungs-Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt.
Ligation, Transformation in E. coli und Plasmid-Reisolation
Die Vektor-DNA und das PCR-Produkt werden durch die Inkubation mit T4-DNA-Ligase wie folgt miteinander verbunden:

Ligase-Ansatz: 200 fmol Vektor-DNA

600 fmol PCR-Produkt

3 μl 10 × Ligase-Puffer (MBI)

1 μl T4-DNA-Ligase

ad 30 μl H₂O dest.
Die Ansätze werden 8 h bei 16°C inkubiert und anschließend wurde das Enzym durch 10-minütige Inkubation bei 65°C inaktiviert. 1 μl dieses Ansatzes wurde direkt zur Transformation kommerziell erhältlicher kompetenter XL1 Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla, USA) mittels Elektroporation eingesetzt. Die elektroporierten Zellen wurden auf Festagar-Platten mit Kanamycin ausplatiert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Ausgehend von einer resultierenden Einzelkolonie wird das fertige Plasmid mittels des Plasmid-Reinigungskits QlAprep Minipräparations-Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellervorschrift reisoliert und das Plasmid pET28_exoNC erhalten. Durch Klonierung in pET28 wird das Gen für die thermophile Exonuclease gemäß SEQ ID NO. 4 mit dem in pET28 vorhandenen His₆-Tag verschmolzen, so dass bei Expression die thermophile Exonuclease gemäß SEQ ID NO. 6 hergestellt wird.
Ausführungsbeispiel 6:
Expression und Reinigung der thermostabilen Exonuclease III nach SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6
Die unter Ausführungsbeispiel 4 oder Ausführungsbeispiel 5 generierten Expressionsplasmide pET28_exoNE bzw. pET28_exoNC für die thermostabilen Enzyme mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität wurden mittels Elektroporation in Zellen Tuner (DE3) pLacI (für pET28_exoNE; Novagen-Merck-Biosciences, Bad Soden) bzw. Origami (DE3) pLacI (für pET28_exoNC; Novagen-Merck-Biosciences, Bad Soden) und Zellen auf LB-Agar-Platten (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, ad 1 l Aqua dest.) mit Kanamycin und Chloramphenicol ausplattiert.
Von diesen Platten wurden Einzelklone gepickt und zunächst Vorkulturen für die Expression hergestellt. Dazu wurden 100 ml LB (Kan, Cam)-Medium mit 1% (w/v) Glucose mit 1 ml einer 5 ml Vorkultur angeimpft und bis zum Erreichen einer OD₆₀₀ von 0,6 bei 37°C und 200 Upm geschüttelt. Die Zellen wurden abzentrifugiert (4°C, 15 min, 3200 × g) und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 2 ml 10% (v/v) Glycerol resuspendiert. Die Suspension wurde zu je 200 μl aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
Die Hauptkultur für die Expression bestand aus 500 ml LB (Kan, Cam)-Medium mit 1% (w/v) Glucose. Sie wurde mit einem Aliquot der Vorkultur angeimpft. Die Hauptkultur wurde bei 37°C und 170 Upm inkubiert. Nach Erreichen einer OD600 von 0,7 wurde mit 250 μmol/L IPTG induziert und über Nacht bei 25°C und 140 Upm geschüttelt. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation (4°C, 15 min, 3200 × g) sedimentiert und nach Entfernen des Mediums mit 150 ml Sörensen-Puffer (1,06 g KH₂PO₄, 6,44 g Na₂HPO₄, ad 800 ml Aqua dest.) gewaschen. Nach nochmaliger Zentrifugation und Verwerfen des Überstands wurde das Pellet für mindestens 24 h bei –20°C eingefroren, um den Aufschluss zu verbessern. Alle weiteren Schritte wurden zum Schutz des überexprimierten Proteins auf Eis bzw. unter Kühlung durchgeführt. Das Pellet wurde mit 5–10 ml Lysepuffer (20 mmol/L Tris/HCl pH 8,0, 10 mmol/L Imidazol, 0,5 mol/L NaCl) resuspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen (5 × 30 s, 80% Leistung). Die Suspension der aufgeschlossenen Zellen wurde zentrifugiert (4°C, 30 min, 14000 × g). Der Überstand wurde anschließend einer weiteren Zentrifugation unterworfen (4°C, 30 min, 14000 × g). Der so gewonnene Rohextrakt wurde abgenommen und für die Affinitätschromatographie eingesetzt.
Das Prinzip der Reinigung basiert auf der Bindung des Proteins mit His₆-Tag an eine mit Nickel beladene chelatierende Sepharose-Matrix. Die Elution erfolgte mit hohen Konzentrationen an Imidazol. Dieses ist, wie auch die His-Reste, in der Lage mit Nickel Komplexverbindungen einzugehen.
Die Affinitätschromatographie wurde an einer Äkta-Proteinreinigungsanlage (Amersham Biosciences, Freiburg) durchgeführt. Zunächst wurde die angeschlossene „1-ml-HiTrap Chelating HP-Säule" (Amersham Biosciences, Freiburg) mit 5 Säulenvolumen (SV) Aqua dest. gewaschen und mit 5 SV Bindungspuffer (20 mmol/L Tris/Hl pH 8,0, 20 mmol/L Imidazol) equilibriert. Dann wurde der Rohextrakt aufgetragen und nacheinander mit 5 SV Bindungspuffer und 5 SV Waschpuffer (20 mmol/L Tris/HCl pH 8,0, 20 mmol/L Imidazol, 0,5 mol/L NaCl, 1% TritonX-100) gewaschen. Die Elution erfolgte mit 5 SV Elutionspuffer (20 mmol/L Tris/HCl pH 8,0, 500 mmol/L Imidazol). Der Durchfluss wurde dabei in 0,5 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen mit dem höchsten Proteingehalt wurden vereint und umgepuffert.
Die Umpufferung erfolgte mittels Gelfiltrationschromatographie. Dabei sind die Poren des Säulenmaterials so klein, das sie nur von den Bestandteilen des Puffers passiert werden können, die entsprechend langsam laufen. Das Protein hingegen läuft im Ausschlussvolumen und wandert schnell aus der Säule und befindet sich dann folglich in dem Puffer, mit dem die Säule equilibriert worden ist.
Die Umpufferung wurde ebenfalls an der ÄKTA-Proteinreinigungsanlage durchgeführt. Es wurde eine 5 ml HiTrapDesalting-Säule (Amersham Biosciences, Freiburg) verwendet, die zunächst mit Aqua dest. (5 SV) gewaschen und anschließend mit 5 SV Lyophilisationsspuffer (50 mmol/L NH₄HCO₃) äquilibriert wurde. Die Probe wurde aufgetragen und mit Lyophilisationsspuffer eluiert. Die Fraktionen mit dem höchsten Proteingehalt wurden vereint und durch Messung der Absorption bei 280 nm quantifiziert. Die Proteinlösung wurde über Nacht an einer Gefriertrocknungsanlage (Christ Gefriertrocknungsanlagen, Osterode) getrocknet und das erhaltene Proteinpulver bei 4°C aufbewahrt.
Sequenzprotokoll:

SEQ ID NO 1: Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts B der erfindungsgemäßen Exonuclease
SEQ ID NO 2: Aminosäuresequenz der Exonuclease III aus Escherichia coli (Eintrag in Swiss-Prot unter der Accession Number: P09030)
SEQ ID NO 3: Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, das als Sequenzabschnitt A die Aminosäuresequenz M-E-V-K, als Sequenzabschnitt B die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 und als Sequenzabschnitt C die Aminosäuresequenz R-R enthält.
SEQ ID NO 4: Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, das als Sequenzabschnitt A die Aminosäuresequenz M-C-V-K, als Sequenzabschnitt B die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 und als Sequenzabschnitt C die Aminosäuresequenz C-R enthält.
SEQ ID NO 5: Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität gemäß SEQ ID NO 3, das zusätzlich zu den Sequenzabschnitten A, B und C einen Sequenzabschnitt enthält, der aus 6 aufeinander folgenden Histidinresten besteht.
SEQ ID NO 6: Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität gemäß SEQ ID NO 4, das zusätzlich zu den Sequenzabschnitten A, B und C einen Sequenzabschnitt enthält, der aus 6 aufeinander folgenden Histidinresten besteht.
SEQ ID NO 7: Nukleinsäuresequenz der Basen 195 bis 1001 des xthA-Gens von Escherichia coli (Accession Number X13002).
SEQ ID NO 8: Nukleinsäuresequenz, die für ein thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuclease-Aktivität gemäß SEQ ID 3 kodiert.
SEQ ID NO 9: Nukleinsäuresequenz, die für ein thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuclease-Aktivität gemäß SEQ ID 4 kodiert.
SEQ ID NO 10: Nukleinsäuresequenz eines Expressionsplasmids für die Expression eines thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuclease-Aktivität gemäß SEQ ID NO. 5.
SEQ ID NO 11: Nukleinsäuresequenz eines Expressionsplasmids für die Expression eines thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuclease-Aktivität gemäß SEQ ID NO. 6.
SEQ ID NO 12: Nukleinsäuresequenz des Primers Exo_NE_S
SEQ ID NO 13: Nukleinsäuresequenz des Primers Exo_NE_A
SEQ ID NO 14: Nukleinsäuresequenz des Expressionsvektors pET28a.
SEQ ID NO 15: Nukleinsäuresequenz des Primers Exo_NC_S
SEQ ID NO 16: Nukleinsäuresequenz des Primers Exo_NC_A

SEQUENCE LISTING

Claims

Thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, enthaltend a. einen Sequenzabschnitt B mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 1 oder eine Aminosäuresequenz, die eine mindestens 80%-prozentige Identität mit SEQ ID 1 aufweist, b. einen Sequenzabschnitt A aus 1 bis 5 Aminosäuren, der N-terminal zum Sequenzabschnitt B liegt und an den sich der Sequenzabschnitt B direkt anschließt, c. einen Sequenzabschnitt C aus 1 bis 5 Aminosäuren, der C-terminal zum Sequenzabschnitt B liegt und der sich an den Sequenzabschnitt B direkt anschließt, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts A mindestens eine Aminosäure ausgewählt aus den Aminosäuren Glutamat oder Aspartat enthält und die Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts C mindestens eine Aminosäure ausgewählt aus den Aminosäuren Arginin, Lysin oder Histidin enthält oder dass die Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts A mindestens eine Aminosäure ausgewählt aus den Aminosäuren Arginin, Lysin oder Histidin enthält und die Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts C mindestens eine Aminosäure ausgewählt den Aminosäuren aus Glutamat oder Aspartat enthält oder dass die Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts A mindestens ein Cystein enthält und die Aminosäuresequenz des Sequenzabschnitts C mindestens ein Cystein enthält.
Thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz
wobei „(X)_n" eine Sequenz von n aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren bedeutet, „(X)_k-n" bedeutet eine Sequenz von „n-k" aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren, wobei k bzw. n die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei n kleiner oder gleich k ist, „/" bedeutet „oder", d. h. „E/D" bedeutet „Glutamat oder Aspartat", „K/R/H" bedeutet „Lysin, Arginin oder Histidin", „(X)_m" bedeutet eine Sequenz von m aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren, „(X)_l-m" bedeutet eine Sequenz von „l-m" aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren, wobei l bzw. m die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei m kleiner oder gleich l ist.
Thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz
wobei „(X)_n" eine Sequenz von n aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren bedeutet, „(X)_k-n" bedeutet eine Sequenz von „n-k" aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren, wobei k bzw. n die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei n kleiner oder gleich k ist, „/" bedeutet „oder", d. h. „E/D" bedeutet „Glutamat oder Aspartat", „K/R/H" bedeutet „Lysin, Arginin oder Histidin", „(X)_m" bedeutet eine Sequenz von m aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren, „(X)_l-m" bedeutet eine Sequenz von „l-m" aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren, wobei l bzw. m die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei m kleiner oder gleich l ist.
Thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz
wobei „(X)_n" eine Sequenz von n aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren bedeutet, „(X)_k-n" bedeutet eine Sequenz von „n-k" aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren, wobei k bzw. n die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei n kleiner oder gleich k ist, „(X)_m" bedeutet eine Sequenz von m aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren, „(X)_l-m" bedeutet eine Sequenz von „l-m" aufeinanderfolgenden beliebigen Aminosäuren, wobei l bzw. m die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können und wobei m kleiner oder gleich l ist.
Thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4.
Thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym zusätzlich zu den Sequenzabschnitten A, B und C einen Sequenzabschnitt enthält, der die Reinigung des Enzyms mittels affinitätschromatographischer Verfahren ermöglicht.
Thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Sequenzabschnitt, der die Reinigung des Enzyms mittels affinitätschromatographischer Verfahren ermöglicht, aus 6 bis 12 aufeinander folgenden Histidinresten besteht.
Thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID 5 oder SEQ ID 6.
Nukleinsäure, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein thermostabiles Enzym mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Nukleinsäure, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 9.
Plasmid, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10.
Plasmid nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID 10 oder SEQ ID 11.
Zelle, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Zeile keine menschliche embryonale Stammzelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität mit nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit den Schritten a) Inkubation von Zellen, welche Nukleinsäuren enthalten, die für ein thermostabiles Enzym mit einer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen enthalten, unter Bedingungen, die eine Expression des thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität ermöglichen b) Reinigen des thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität.
Verwendung eines thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität mit nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Behandlung von doppelsträngigen oder einzelsträngigen Nukleinsäureproben, zur Herstellung unidirektionaler Deletionen in DNA-Fragmenten in Verbindung mit S1 Nuclease, zur Herstellung von einzelsträngigen Templaten für die Didesoxy-Sequenzierung von DNA, zur gerichteten Mutagenese oder zur Klonierung von PCR-Produkten.
Kit enthaltend ein thermostabilen Enzyms mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität mit nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Behandlung von doppelsträngigen oder einzelsträngigen Nukleinsäureproben, zur Herstellung unidirektionaler Deletionen in DNA-Fragmenten in Verbindung mit S1 Nuclease, zur Herstellung von einzelsträngigen Templaten für die Didesoxy-Sequenzierung von DNA, zur gerichteten Mutagenese oder zur Klonierung von PCR-Produkten.