DE102005036149A1

DE102005036149A1 - Anordung für eine schnelle, räumlich und spektral auflösende Fluoreszenzanalyse von Biochips

Info

Publication number: DE102005036149A1
Application number: DE200510036149
Authority: DE
Inventors: Wolf-Dieter Dr. Schmidt; Florian Dipl.-Ing.(FH) Erfurth; Dieter Prof. Dr. Faßler
Original assignee: FOERDERUNG VON MEDIZIN BIO und; Gesellschaft zur Foerderung von Medizin Bio und Umwelttechnologien eV
Current assignee: FOERDERUNG VON MEDIZIN BIO und; Gesellschaft zur Foerderung von Medizin Bio und Umwelttechnologien eV
Priority date: 2005-07-28
Filing date: 2005-07-28
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2025-07-29
Also published as: DE102005036149B4

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung für eine schnelle, räumlich und spektral auflösende Fluoreszenzanalyse von Biochips. Diese Anordnung besteht aus einem Spektrografen, mit dem zeitgleich von einer großen Anzahl linienhaft angeordneter Biospots und dem Untergrund einer flächigen Probe die jeweiligen Emissionsspektren in nur einem Messvorgang gebildet und diese Fluoreszenzspektren zeitgleich mit einem hochempfindlichen optischen Kamerasystem gemessen werden. DOLLAR A Erfindungsgemäß ist hierfür eine linienhafte Lichtquelle zur Fluoreszenzanregung mit einem Spektrografen derart angebracht, dass von bis zu 1000 linear angeordneten Spots eines Biochips gleichzeitig die Fluoreszenzspektren gemessen werden. Zur Anregung der Fluoreszenzspektren werden übliche Strahlungsquellen, vorzugsweise aber Laser eingesetzt. Durch Kombination der Lichtquelle mit einer Strahlformungsoptik zur linienhaften Beleuchtung werden auf dem Biochip nur eine ausgewählte Spotreihe, nicht aber die benachbarten Reihen angeregt. Der Einsatz einer Multi-Beam-Technik wird durch eine zusätzliche Anordnung von Mikrolinsenarray, Strahlteiler und Blendenarray realisiert und erlaubt eine zentrische Fluoreszenzanregung innerhalb sowohl der Biospots als auch der Zwischenräume in der ausgewählten Spotreihe. Der Spektrograf, der die Fluoreszenzemission der linienhaften Anordnung von Biospots spektral aufspaltet, bildet diese über eine Optik auf die Detektormatrix einer CMOS- oder CCD-Kamera ab. Durch eine ...

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung aus einem optischen Spektrografen und einer digitalen Kamera für eine schnelle, räumlich und spektral auflösende Fluoreszenzanalyse von Biochips.
In der Medizin und Biotechnologie erwartet man von der Fluoreszenz- Diagnostik mit Biochips im nächsten Jahrzehnt bahnbrechende Wirkungen bei der Krankheitsfrüherkennung und Kostensenkung. Eine gängige Methode in der Gen-Diagnostik besteht darin, nach Schlüssel-Schloss-Prinzip ausgewählte Gen-Abschnitte mit Fluoreszenzmolekülen (Label) zu markieren und nach weiteren Verfahrensschritten z.B. auf einem aufpipettierten Biospot eines Trägersubstrats (Bioslide) fluoreszenzspektroskopisch nachzuweisen. Typische Materialien beim Fluoreszenz-Labeling von Gen-Abschnitten sind die Cyanin- Farbstoffe Cy3 und Cy5. Die Fluoreszenzdiagnostik beruht auf der Einstrahlung einer Anregungswellenlänge und dem Nachweis der langwelligeren Fluoreszenz-Emission. Das Labeln unterschiedlicher Gen-Abschnitte mit zwei oder mehreren Fluorophoren stellt dabei eine große Herausforderung an die Fluoreszenz-Messtechnik dar. Der Fluoreszenz-Nachweis erfolgt meist integral über die Intensität, wie z.B. bei einer Bildaufnahme, kann jedoch vorteilhafterweise auch spektral oder zeitlich aufgelöst im ns-Bereich erfolgen. Die Anregungsstrahlungsenergie kann bei den Fluorophoren aufgrund photochemischer Prozesse ein irreversibles Ausbleichen (Photobleaching) verursachen, so dass möglichst kurze Bestrahlungszeiten erwünscht sind.
Stand der Technik für die Fluoreszenzdetektion von Biochips sind Lesegeräte (Reader) auf der Basis von Bildaufnehmern (Imager) oder x-y-verfahrbaren Punktmessanordnungen (Scanner). Fluoreszenz-Imager arbeiten schnell, haben jedoch den Nachteil einer relativ geringen Nachweisempfindlichkeit und einer fehlenden Wellenlängenauflösung. Konventionelle Kameramodule mit optischer Filtertechnik (Farb- oder Interferenzfilter) erfassen beim Fluoreszenz- Imaging die spektralen Informationen nur unvollkommen; außerdem steigen die Messfehler besonders bei niedrigen Beleuchtungsstärken drastisch an. Scannende konfokale Reader erfordern dagegen aufgrund der x-y-Verschiebung der Bioslides relativ lange Messzeiten, haben dage gen den Vorteil einer hohen Messempfindlichkeit. Bei den hier typischerweise verwendeten Detektoren auf der Basis von Photo-Multiplier-Tubes wird in der Regel nur die integrale Fluoreszenzintensität ausgewertet, wodurch die spektralen Informationen insbesondere für die Trennung unterschiedlicher Farbstoff-Emissionen verloren gehen. Verwendet man als Scanner-Detektor ein herkömmliches fasergekoppeltes Halbleiter-Zeilenspektrometer, so erhält man zwar eine punktförmige Spektralinformation der Fluoreszenz-Emission, ist jedoch weiterhin auf ein zeitaufwendiges Scannen des Bioslides angewiesen, um alle Informationen auf der Spot-Matrix (Mikroarray) auszulesen.

Bei Microarray- Scannern wird der Stand der Technik durch Anordnungen für die punktuelle Aufnahme von Fluoreszenzspektren und ein anschließendes zweidimensionales Scanning beschrieben, so z.B. in WO 2001035074A1 [2000], US 6407395B1 [2000], WO 2001065241A1 [2001], WO 2003027724A2 [2002] oder US 20030142302A1 [2003]. Nachteilig an diesen Anordnungen ist, dass sie durch das einzelne Anfahren der Biospots einen erheblichen Zeitaufwand für die Messung eines Chips erfordern, der vom Minuten- bis in den Stundenbereich reicht.

In DE 199 07 479 A1 [1999] wird eine ophthalmologische Vorrichtung zur Messung von Fluoreszenzspektren unterschiedlicher Fluorophore am Augenhintergrund beschrieben, bei der das Messobjekt in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen angeregt werden kann. Der Einsatz eines Spektrografen zur zeitgleichen spektralen Detektion einer Zeile von Messpunkten ist damit jedoch nicht möglich.

Beim Imaging wird der Stand der Technik durch Bildaufnahmegeräte gekennzeichnet, die mit verschiedenen Farb- oder Interferenzfiltern einschließlich Filterradwechsler im Detektionszweig ausgerüstet sind (Multi-Spektral-Kameras). Die in WO 2000079326A1 [2000], WO 2002028273A2 [2001] und EP 1283416A3 [2002] beschriebenen Anordnungen erfordern jedoch zur Detektion und Trennung verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe aufwändig auszutauschende Filterkombinationen. Nachteilig ist dabei eine für viele Fluoreszenzmarker nicht ausreichende Wellenlängenauflösung, wie sie die Fluoreszenzspektroskopie bietet. Als Filtervariante kommen auch durchstimmbare Flüssigkristallfilter zum Einsatz (Nuance^TM-System: Firmenzeitschrift LOT-Oriel, Spectrum Nr. 95, 2004). Diese Flüssigkristallfilter besitzen jedoch nur eine Auflösung von 7 nm und ermöglichen damit keine Detektion von gelabelten Farbstoffen mit eng benachbarten Emissionsspektren.

In DE 102 23 438 A1 [2002] wird ein Fluoreszenz-Messsystem mit einer Videokamera für ein Wirkstoff-Screening mittels Mikrotiterplatte beschrieben. Gegenstand dieser Offenlegungsschrift ist jedoch eine spezielle Anordnung von Beleuchtungsquellen für eine großflächige, homogene Ausleuchtung der Mikrotiterplatte. Ein Nachteil des Imaging-Verfahrens besteht weiterhin darin, dass das Bioslide während der gesamten Messzeit komplett mit der Anregungsstrahlung beleuchtet und damit eine Degradation der gelabelten Fluoreszenz-Farbstoffe verursacht werden kann.

Für ein zweidimensionales spektral auflösendes Imaging-Verfahren wird eine Kombination aus Sagnac-Interferometer und CCD-Kamera angeboten, die flächenhaft eine räumliche und spektrale Auflösung einer Fluoreszenzprobe liefern (SpectraCube^® der Fa. Applied Spectral Imaging Inc.). Allerdings müssen die hier von CCD-Matrix-Detektoren in vielen Einzelschritten aufgenommenen Interferogramme zunächst zeitaufwändig in einem Rechner mittels Fourier-Transformationen entflochten und zum gewünschten Spektrum zusammengesetzt werden. Abhängig von der Lichtintensität sind hohe Messzeiten von bis zu zehn Minuten erforderlich. Bei den bisher verwendeten Kameras mit 628 × 488 Bildpunkten ist die räumliche Auflösung bei Abbildung eines kompletten Biochips auf 100 μm begrenzt. Schnelle und hochauflösende High-Throughput-Bioreaderapplikationen lassen sich damit nicht realisieren. Außerdem ist der finanzielle Aufwand für ein derartiges Messsystem sehr hoch.

Die oben genannten Nachteile des Standes der Technik bezüglich einer schnellen, räumlich und spektral auflösende Fluoreszenzanalyse von Biochips sollen erfindungsgemäß mit einer kombinierten Anordnung von Bilderfassungstechnik (Imaging) und Fluoreszenz-Spektroskopie überwunden werden.

Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe besteht in der kombinierten Anordnung von Anregungsstrahlungsquelle, Spektrograf und Bildaufnehmer dergestalt, dass ein Spektrograf die gleichzeitige spektrale Zerlegung optischer Emission von einer Vielzahl zeilenförmig angeordneter Messpunkte vornimmt, die mit einem empfindlichen elektronischen Bildaufnehmer nachgewiesen wird. Hierfür eignen sich beispielsweise Prisma-Gitter-Prisma-Spektrografen der Fa. Specim/Finnland. Die Fluoreszenzanregung kann mit unterschiedlichen Strahlungsquellen und Filterkombinationen erfolgen wie Blitz-, Xenon- oder Halogenlampen sowie lichtemittierenden Dioden. Vorzugsweise werden jedoch Laser eingesetzt, deren Wellenlänge in der Nähe des Absorptionsmaximums des betreffenden Fluoreszenzfarbstoffs liegt. Nach der Anregungsstrahlungsquelle sind bei einer Single-Beam-Messanordnung Strahlformer für eine linienhafte Ausleuchtung der Spotreihe sowie Emissionsfilter angeordnet. Für eine Multi-Beam-Messeinrichtung wird anstelle eines Strahlformers ein mikrooptisches Linsenarray der Strahlungsquelle nachgeordnet, das über einen optischen Strahlteiler, ein Blendenarray und ein Objektiv eine annähernd punktweise, zentrische Bestrahlung von Spots und Zwischenräumen einer Linearanordnung auf dem Biochip ermöglicht. Eine konfokale Detektion ist mit einer Anordnung aus Objektiv, Blendenarray und Strahlteiler ebenfalls möglich, wodurch optimal nur die Fluoreszenzinformationen von den Biospot-Oberflächen, nicht aber der Fluoreszenz-Untergrund in den Eingangsspalt des Spektrografen eingekoppelt werden.

Die räumlich und spektral aufgespalteten Fluoreszenzsignale einer Reihe von N Biospots stehen am Ausgang des Prisma-Gitter-Prisma-Spektrografen zur Detektion mit einem empfindlichen elektronischen Bildaufnehmer bereit. Elektronische Bildaufnehmer sind CMOS- oder CCD-Kameras, die in einer Matrixanordnung von lichtempfindlichen Sensorbauelementen die optische Strahlungsinformation in eine elektrische umwandeln. Diese integrierte Bildaufnahmeeinrichtung soll im Weiteren zusammenfassend als Kamera bezeichnet werden. Der typische Wellenlängenbereich solcher Kameras wird von den eingesetzten Halbleitermaterialien bestimmt. Eine Kombination von hochempfindlicher CCD-Kamera und Spektrograf ist in der Lage, von bis zu 1000 Bildpunkten in einer Reihe zeitgleich das zugehörige Fluoreszenzspektrum zu liefern. Jede aufgenommene Messobjektzeile beinhaltet auf dem 2D-Videochip in einer Richtung die Ortsinformation mit einer Auflösung entsprechend der verwendeten Pixelzahl (N = 640 bis 1280) und in der anderen Richtung die Spektralinformation ebenfalls mit einer wählbaren Pixel-Auflösung zwischen M = 480 und 1024. Damit sind Ortsauflösungen bis zu 1/1000 eines abgebildeten Linearabschnitts möglich. Da für diese zeilenförmige Bildaufnahme keine mechanisch bewegten Teile erforderlich sind, können typische Aufnahmegeschwindigkeiten bis zu 200 Frames pro Sekunde (Zykluszeit: 5 ms) erreicht werden. Je nach gewählter Pixelzahl der CCD-Matrix lassen sich spektrale Auflösungen zwischen 2 und 15 nm realisieren. Damit erreichen sie die Parameter herkömmlicher Diodenzeilenspektrometer.

Im Bildaufnehmer integrierte elektronische Ladungsverstärker und Digitalisierer stellen am Ausgang digitale Signale der räumlich und spektral aufgespalteten Fluoreszenz zur Verfügung. Zur Auswertung und Speicherung dieser Fluoreszenzsignale von Biochips mit der erfindungsgemäßen Anordnung eines Spektrografen mit Bildaufnehmer wird eine elektronische Datenverarbeitungseinheit wie ein PC mit Controller-Karte verwendet.

Über die geometrische Verteilung der Fluoreszenz auf dem Biochip ist die Fluoreszenzintensität jedes einzelnen Spots im Verhältnis zum benachbarten Fluoreszenz-Untergrund im Bildaufnehmersignal erfassbar. Aus der gleichzeitig vorliegenden spektralen Intensitätsverteilung geht die Art der gelabelten Fluoreszenzmarker hervor. Damit ist eine umfassende und präzise Vermessung von Biochips möglich, die gegenüber dem Stand der Technik Falsch-Positiv-Aussagen drastisch verringert. Erfindungsgemäß erfolgt ein mechanischer Scan des Biochips nur über eine räumliche Achse, so dass eine schnelle Vermessung auch von mittel- und hochdichten Biochips möglich ist Durch die hochempfindliche Bildaufnahme wird eine Spotreihe auf dem Biochip nur so lange bestrahlt, wie es für eine schonende Detektion notwendig ist.

Die Erfindung ist in der Bioreadertechnik für den Nachweis von fluoreszenzgelabelten Biospots verwendbar und gewährleistet deutliche Verbesserungen hinsichtlich der Nachweisgenauigkeit, der Detektionsgeschwindigkeit und der Reproduzierbarkeit bei Wiederholungsmessungen gegenüber konventioneller Gerätetechnik.

Figuren und Beispiel

Die Erfindung wird im Folgenden anhand eines Ausführungsbeispieles in zwei Varianten näher erläutert. In den zugehörigen Zeichnungen zeigen:

1 Seitendarstellung einer Single-Beam-Messanordnung

2 Draufsicht auf eine Single-Beam-Messanordnung mit Biochip und Spotreihen

3 Seitendarstellung einer konfokalen Multi-Beam-Messanordnung mit Spektrografen-Eingangsspalt

1 zeigt in einer Seitendarstellung eine Single-Beam-Messanordnung. Der auf einem X-Positioniertisch 1 aufgelegte Biochip 2 wird durch eine Anregungsstrahlungsquelle 3, die mit einem Strahlformer 4 und einem Anregungsfilter 5 versehen ist, mit einem linienförmigen Strahlungsprofil zur Fluoreszenz angeregt. Die Anregungsstrahlungsquelle 3 ist an einer Vertikalaufhängung 8 befestigt und kann mit einem Feinantrieb 7 sowie mittels einer Schwenkaufhängung 6 manuell oder automatisch in ihrer Position justiert werden. Dies ermöglicht eine exakte linienhafte Strahlungsanregung einer Spotreihe von Biochips mit unterschiedlichen geometrischen Abmessungen durch Variation von Winkel und Abstand. Die auf den Biospots entstehende linienhafte Fluoreszenzstrahlung wird durch ein Objektiv 10 mit einem vorgesetzten Emissionsfilter 11 auf den Eingangsspalt des Spektrografen 9 abgebildet. Der Spektrograf 9 mit einer Prisma-Gitter-Prisma-Anordnung erzeugt daraus eine flächige, räumlich und spektral aufgespaltete Fluoreszenzinformation, die durch eine hochempfindliche Kamera 12 detektiert wird. Der Abbildungsmaßstab kann über die Verschiebung der Detektionseinheit mit der Kamera 12 durch einen Stellantrieb an der Kameraaufhängung 13 an die Größe der aufzunehmenden Struktur angepasst werden. Ein weiterer Antrieb am Objektiv 10 ermöglicht eine automatische Scharfstellung der Abbildung. Der Aufbau ist vorteilhafterweise in einem lichtdichten Gehäuse untergebracht, wobei dessen Gehäusewand 14 mit einer speziellen, nicht fluoreszierenden Gehäusewand-Auskleidung 15 versehen ist.
2 zeigt eine Draufsicht auf eine Single-Beam-Messanordnung mit einem Biochip 2 mit aufgebrachten Spotreihen 16. Aus der Anregungsstrahlungsquelle 3 tritt über den Strahlformer 4 und das Anregungsfilter 5 ein trapezförmiges Strahlenbündel mit einer Breite, die annähernd dem Durchmesser eines Biospots, und einer Länge, die der Spotreihe 16 entspricht, heraus. Die Homogenität der Anregungsstrahlung über der beleuchteten Fläche der Spotreihe 16 soll dabei besser als 5% betragen.
3 zeigt eine Seitendarstellung einer konfokalen Multi-Beam-Messanordnung mit Strahlteiler 18 und Spektrografen-Eingangsspalt 22. Für diese konfokale Messeinrichtung wird ein Mikrolinsenarray 17 der Anregungsstrahlungsquelle 3 nachgeordnet, das über einen optischen Strahlteiler 18, ein Blendenarray 19 und ein Objektiv 20 eine annähernd punktweise, zentrische Bestrahlung jedes Spots und Zwischenraums innerhalb der Spotreihe 16 auf dem Biochip 2 gewährleistet. Für eine konfokale Detektion zur Einkopplung in den Eingangsspalt 22 des Spektrografen 9 wird ebenfalls die Kombination aus Objektiv 20, Blendenarray 19 und Strahlteiler 18 verwendet, um ausschließlich die Fluoreszenzinformationen von der Oberfläche der jeweiligen Biospots einer Spotreihe 16 einzukoppeln, jedoch den Fluoreszenzuntergrund des Biochips 2 zu unterdrücken.

1: X-Positioniertisch
2: Biochip
3: Anregungsstrahlungsquelle
4: Strahlformer
5: Anregungsfilter
6: Schwenkaufhängung
7: Feinantrieb
8: Vertikalaufhängung
9: Spektrograf
10: Objektiv 1
11: Emissionsfilter
12: Kamera
13: Kameraaufhängung
14: Gehäusewand
15: Gehäusewand-Auskleidung
16: Spotreihe
17: Mikrolinsenarray
18: Strahlteiler
19: Blendenarray
20: Objektiv 2
21: Okular
22: Spektrografen-Eingangsspalt

Claims

Anordnung für eine schnelle, räumlich und spektral auflösende Fluoreszenzanalyse von Biochips, aufweisend einen X-Positioniertisch 1 als Aufnahmeeinrichtung für einen Biochip 2 mit gelabelten Spotreihen 16, eine Fluoreszenz-Anregungsstrahlungsquelle 3, einen Spektrografen 9 mit einem Spektrografen-Eingangsspalt 22 und eine digitale Kamera 12, dadurch gekennzeichnet, dass als räumlich und optisch-spektroskopisch zerlegende Messeinrichtung ein Spektrograf 9 und als elektronischer Bildaufnehmer eine Kamera 12 in der Kombination mit weiteren optischen Komponenten eine zeitgleiche, spektral auflösende Fluoreszenz- Detektion einer Spotreihe 16 mit bis zu 1000 fluoreszenz-gelabelten Biospots ermöglichen.
Anordnung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungsstrahlungsquelle 3 als Blitz-, Xenon- oder Halogenlampe, lichtemittierende Diode, vorzugsweise aber als Laser ausgeführt ist und über ein Anregungsfilter 5 Strahlung der gewünschten Wellenlänge zur Anregung der aufgespotteten Fluoreszenzlabels bereitgestellt wird.
Anordnung gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass beim Single-Beam-Betrieb die Strahlung der Anregungsstrahlungsquelle 3 über einen optischen Strahlformer 4 als Linie auf die Spotreihe 16 des Biochips geleitet wird.
Anordnung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass beim Multi-Beam-Betrieb ein Mikrolinsenarray 17 nach der Anregungsstrahlungsquelle 3 angeordnet ist, wodurch in Kombination mit einem optischen Strahlteiler 18, einem Blendenarray 19 und einem Objektiv 20 eine weitgehend punktweise, zentrische Bestrahlung von Biospots und von Zwischenräumen innerhalb der Spotreihe 16 auf dem Biochip 2 gewährleistet wird.
Anordnung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Spektrograf 9 eine optische Anordnung von Prisma, Beugungsgitter und Prisma verwendet wird.
Anordnung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass bei Multi-Beam-Strahlungsanregung für eine konfokale Detektion zur Einkopplung in den Eingangsspalt 22 des Spektrografen 9 eine Kombination aus Objektiv 20, Blendenarray 19 und Strahlteiler 18 verwendet wird, um ausschließlich die Fluoreszenzinformationen von der Oberfläche der jeweiligen Biospots einer Spotreihe 16 einzukoppeln, jedoch den Fluoreszenzuntergrund des Biochips 2 zu unterdrücken.
Anordnung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Bildaufnehmer eine digitale Kamera 12 auf der Basis von CMOS- oder CCD-Matrixdetektoren, vorzugsweise aber von hochempfindlichen Intensified- CCD oder Electron-Multiplying-CCD- Detektoren, eingesetzt ist.
Anordnung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass beim Single-Beam-Betrieb die Anregungsstrahlungsquelle 3 selbstjustierend ausgeführt ist, so dass bei veränderlichen Abmessungen der Spotreihen 16 auf den Biochips 2 das linienförmige Beleuchtungsfeld durch einen Feinantrieb 7 automatisch auf den Detektionsbereich des Spektrografen 9 eingestellt wird.
Anordnung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombination aus Spektrograf 9 und Kamera 12 durch einen Stellantrieb an der Kameraaufhängung 13 selbstjustierend ausgeführt ist und dadurch die räumliche Auflösung an eine veränderliche Abmessung der Spotreihe 16 angepasst wird.
Anordnung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass durch eine translatorische Bewegung des X-Positioniertischs 1 die Fluoreszenz der gesamten Oberfläche des Biochips 2 detektiert wird.
Anordnung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gehäusewand 14 der Messeinrichtung mit einer Gehäusewand-Auskleidung 15 aus einem nicht fluoreszierenden Material ausgestattet ist.