DE102005005276A1

DE102005005276A1 - Verwendung von Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffen zur Chemoprävention der Tumorgenese und/oder zur Inhibition der Tumorprogression bei endokrin-abhängigen und endokrin-unabhängigen Tumoren

Info

Publication number: DE102005005276A1
Application number: DE102005005276A
Authority: DE
Inventors: Peter Heger; Reinhard Rettenberger; Carl-Friedrich Spaich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-02-04
Filing date: 2005-02-04
Publication date: 2006-08-10

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffs oder einer Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffkombination, ausgewählt unter Resveratrol- und Piceatannol-Prodrugs; sowie Resveratrol und Piceatannol; sowie deren stereoisomeren Formen, jeweils in Form ihrer Salze oder in der Phenolform, oder Kombinationen von wenigstens zwei dieser Verbindungen zur Herstellung eines Mittels zur Chemoprävention der Tumorgenese und/oder zur Inhibition der Tumorprogression bei endokrin-abhängigen oder endokrin-unabhängigen Tumoren.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffs oder einer Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffkombination, ausgewählt unter Resveratrol- und Piceatannol-Prodrugs, wie insbesondere Rhaponticin, Desoxyrhaponticin, cis- und trans-Rhapontigenin, Desoxyrhapontigenin und Astringin; sowie Resveratrol und Piceatannol; sowie stereoisomeren Formen davon, jeweils in Form ihrer Salze oder in der Phenolform, oder Kombinationen dieser Verbindungen zur Herstellung eines Mittels zur Chemoprävention der Tumorigenese und/oder zur Inhibition der Tumorprogression bei endokrin-abhängigen und endokrin-unabhängigen Tumoren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Viele Prozesse im Rahmen der Entwicklung, Differenzierung und Homöostase in Säugern werden durch Östrogene reguliert, welche die Genexpression durch Bindung an Kernrezeptorproteine kontrollieren. Diese Wirkungsweise der Östrogene wird durch die Östrogenrezeptoren ER-α und ER-β vermittelt, und zwar durch Liganden-abhängige Bindung an das Östrogen-responsive Element (ERE) von Zielgenen, was wiederum deren transkriptionelle Regulation bewirkt (Kuiper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 93: 5925–5930). Während diese beiden Rezeptoren strukturelle Ähnlichkeiten aufweisen, sind deren unterschiedliche biologische Funktionen aufgrund beträchtlicher Unterschiede in der N-terminalen Domäne und in der Liganden-Bindungsdomäne nicht ausreichend charakterisiert (Kuiper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 93: 5925–5930; Enmark et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997; 82: 4258–4265).
Den ER-α-vermittelten mitogenen Wirkungen von Östrogen schreibt man eine kritische Rolle bei der Entwicklung und Progression von menschlichem Brust-, Endometrium- und Ovarialkrebs zu. Dies wurde kürzlich durch die Ergebnisse großer prospektiver Studien mit menopausalen Frauen gezeigt (Beral et al., Lancet 2002; 360: 942–944; Cheblowski et al., JAMA 2003; 289: 3243–3253; Writing Group for the Women's Health Initiative Investigators, JAMA 2002; 288: 321–333; Million Women Study Collaborators; Lancet 2003; 362: 419–427). Darüber hinaus ist bekannt, dass Östrogen über die Aktivierung von ER-α an der Entwicklung der Prostatahyperplasie und des Prostatakarzinoms beteiligt ist (Weihua et al., Mol. Cell Endocrinol. 2002; 193: 1–5).
Auf der Grundlage mehrerer klinischer und experimenteller Studien wurde vorgeschlagen, dass ein Ungleichgewicht in der Expression von ER-α und ER-β als gemeinsames Merkmal einen kritischen Schritt bei der Östrogen-abhängigen Tumor-Progression darstellen könnte. Das Gleichgewicht zwischen dem ER-α und dem ER-β Rezeptor scheint für die Aufrechterhaltung einer normalen zellulären Funktion insofern von essentieller Bedeutung zu sein, als ER-β als negativer Regulator der ER-α-vermittelten Signalübermittlung wirkt, welche für die Proliferation verantwortlich ist. Dies wird auch durch Untersuchungen an ER-β-knock-out Mäusen belegt. Die Überexpression von ER-α in diesen Mäusen resultiert in einem hyperproliferativen Uterus und führt zur Ovarialkarzinogenese (Frasor et al., Endocrinol. 2003; 144: 3159–3166).
Es wird postuliert, dass die antiproliferative Wirkung von ER-β durch Wechselwirkungen mit verschiedenen proliferativen Ereignissen vermittelt wird, was zu einer Schutzwirkung gegen eine ER-α-induzierte Hyperproliferation führt. Insbesondere werden eine Inhibition der anti-apoptotischen Genexpression, eine Induktion der proapoptotischen Genexpression und eine Inhibition der ER-α-induzierten Zellproliferation diskutiert (Bardin et al., Endocrine-Rel. Cancer 2004; 299: 408–414).
In verschiedenen Organen und Geweben, wie Brust, Ovarien, Uterus und Dickdarm, wurde beobachtet, dass unter den Bedingungen einer Abnahme der ER-β-Expression (z. B. bei Hyperplasie, neoplastischen Läsionen) eine unkontrollierte zelluläre Proliferation aufgrund einer ER-α-Aktivierung erfolgt, was zu einem tumorigenen Status führt (Bardin et al., Endocrine-Rel. Cancer 2004; 11: 537–551). Somit scheint ER-β ein entscheidender negativer Modulator der ER-α-vermittelten prokanzerogenen Wirkung von Östrogen zu sein, so dass eine selektive Aktivierung von ER-β bei der Prävention und/oder der Behandlung von Östrogen-abhängigen Tumoren, beispielsweise in der Brust, den Ovarien, des Uterus, der Prostata und des Colons, von Bedeutung sein könnte.
Derzeitige Behandlungsstrategien für Brustkrebs im Frühstadium umfassen den selektiven Östrogenrezeptormodulator (SERM) Tamoxifen, der jedoch als ER-Antagonist nur bei ER-positivem Brustkrebs wirkt, bei ER-negativem Brustkrebs jedoch keine Wirkung zeigt (Park & Jordan, Trends Mol. Medicine 2002; 8: 82–88; Hanstein et al., Eur. J. Endocrinol. 2004; 150: 243–255). Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die Langzeitbehandlung mit Tamoxifen aufgrund seiner agonistischen Aktivität am ER-α Endometriumkrebs induziert (Stygar et al., Reprod. Biol. Endocrinol. 2003; 1 : 40).
Es besteht somit ein Bedarf an neuen Wirkstoffen für die Behandlung von endokrin-abhängigen und endokrin-unabhängigen Tumoren, wie z.B. Brustkrebs, wobei diese Wirkstoffe kein ER-α-aktivierendes Potential in anderen Geweben und Organen zeigen sollten. Ein Weg bestünde in der Aktivierung von ER-β als natürlichem Gegenspieler von ER-α. Eine weitere Strategie bestünde in der Aktivierung von ER-unabhängigen Mechanismen, welche zu einer Inhibition der Proliferation von Krebszellen führen.
Natürlich vorkommende Phytoöstrogene, wie die Sojaflavonoide Genistein und Daidzein, oder die Flavonoide Koumestrol zeigen eine gewisse Präferenz für ER-β. Sie aktivieren jedoch auch ER-α in vivo (Kuiper et al., Endocrinol. 1997, 138: 863–870; Belcher & Zsarnovszky, J. Pharmacol. Exp. Therap. 2001; 299: 408–414), so dass eine Langzeitbehandlung, beispielsweise mit Soja-haltigen Präparaten in wirksamen Dosen, ein gewisses kanzerogenes Potential aufweisen könnte.
Es besteht deshalb ein großer Bedarf an neuen Wirkstoffen, welche zur Chemoprävention der Tumorigenese und/oder zur Inhibition der Tumorprogression bei endokrin-abhängigen oder endokrin-unabhängigen Tumoren geeignet sind, ohne die oben beschriebenen Nebenwirkungen zu haben.

Seit 1993 ist in Deutschland unter der Bezeichnung Extrakt Rheum rhaponticum (ERr 731) (Handelsname Phytoestrol^® N) ein Trockenextrakt aus Wurzeln von Rheum rhaponticum zur Follikelhormonersatztherapie, beispielsweise zur Behandlung von Frauen mit klimakterischen Beschwerden, juveniler Oligomenorrhoe und Dysmenorrhoe, primärer und sekundärer Amenorrhoe sowie Endometritis auf dem Markt. Die Inhaltsstoffe des spezifischen ERr 731-Extrakts sind Rhaponticin, Desoxyrhaponticin, Rhapontigenin und Desoxyrhapontigenin (Tabelle 1). Tabelle 1

Sämtliche Inhaltsstoffe von ERr 731 gehören zur Gruppe der Hydroxystilbene. Vertreter dieser Gruppe besitzen folgende allgemeine Formel:

Mehrere Studien haben gezeigt, dass Zahl und Position der freien Hydroxy- und Methoxygruppen die biologische Aktivität der Hydroxystilbene stark beeinflusst (Kageura et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 9 (2001) 1887–1893, Matsuda et al. Biol. Pharm. Bull. 2001 (24(3) 264–267, Roberti et al. J. Med. Chem. 2003, 46, 3546–3554). Der pharmakologische Effekt der Hydroxystilbene ist darüber hinaus abhängig von der Präsenz einer Glukosegruppe (Park et al. Arch. Pharm. Res. 2002, 25(4), 528–533).

Ob, bzw. zu welchen Metaboliten die Inhaltsstoffe von ERr 731, z.B. nach oraler Verabreichung im Körper abgebaut werden, ist nicht genau untersucht worden. So ist lediglich aus Untersuchungen zur antithrombotischen und antiallergischen Aktivität von Rhaponticin-Extrakten aus Rhei Rhizoma bekannt, dass dieses durch Bakterien des menschlichen Intestinaltrakts zu Rhapontigenin abgebaut wird (Park et al., Arch. Pharm. Res. 2002, 25 (4), 528–533). Eine Metabolisierung von Rhaponticin zu Piceatannol oder von Desoxyrhaponticin zu Resveratrol wurde bisher nicht beschrieben.

Roberti et al beschreiben in J. Med. Chem. 2003, 46, 3546–3554 die apoptotische Wirkung von Resveratrol und Analogen auf HL60 Leukämiezellinien. Die wirksamsten Analoga waren dabei bestimmte cis-konfigurierte Derivate.

Für Rhapontigenin und Resveratrol wurde eine Inhibition des Zellwachstums bei Versuchen mit der ZNS-Tumorzellinie XF498 und der Kolon-Tumorzellinie HCT15 beschrieben (Ryu et al., Arch. Pharm. Res. 1994; 17: 43–44). Die entsprechenden Glykone waren inaktiv.

Eine Behandlung von Lewis Lungenkarzinom-tragenden Mäusen mit Piceatannol aus Cassia garrettiana führte zu einer Verringerung des Tumorwachstums und der Metastasierung sowie zu einer Zunahme der Überlebensrate und Verlängerung der Überlebenszeit (Kimura at al., Anticancer Res. 2000; 20: 2923–2930).

Wieder et al., Leukemia 2001; 15: 1735–1742 beschreiben die apoptotische Wirkung von Piceatannol und Resveratrol auf die Burkitt-ähnliche Lymphomzelllinie BJAB.

Von Wolter et al., J. Nutr. 2002; 132: 298–302 wurde beobachtet, dass Piceatannol die Proliferationsrate von colorektalen Krebszellinien Caco-2 und HCT-116 inhibiert.

Aggarwal et al. beschreiben in einem Übersichtsartikel (Anticancer Research, 24, 2004) die Rolle von Resveratrol bei der Prävention und Therapie von verschiedenen Krebsformen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, einen neuen Weg zur Chemoprävention der Tumorigenese und/oder zur Inhibition der Tumorprogression bei endokrin-abhängigen oder endokrin-unabhängigen Tumoren aufzuzeigen.

Diese Aufgabe wurde überraschenderweise durch die Verwendung eines Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffs oder einer Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffkombination, ausgewählt unter Resveratrol- und Piceatannol-Prodrugs, wie insbesondere Rhaponticin, Desoxyrhaponticin, Rhapontigenin, Desoxyrhapontigenin und Astringin; sowie Resveratrol und Piceatannol; sowie deren stereoisomeren Formen, jeweils in Form ihrer Salze oder in der Phenolform, oder Kombinationen dieser Verbindungen zur Herstellung eines Mittels zur Chemoprävention der Tumorigenese und/oder zur Inhibition der Tumorprogression bei endokrin-abhängigen oder endokrin-unabhängigen Tumoren gelöst.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis einer neuen Wirkungsweise erfindungsgemäßer Wirkstoffe und Wirkstoffkombinationen, wie des Trockenextraktes ERr 731 sowie seiner Inhaltsstoffe und Metabolite.

Insbesondere wurde festgestellt, dass ERr 731 und seine Inhaltsstoffe bzw. Metabolite den ER-β aktivieren, was von entscheidender Bedeutung für die Inhibition der durch ER-α stimulierten Hyperproliferation und somit für die Prävention der Tumorbildung ist.

FIGURENBESCHREIBUNG

1 zeigt die Bildung von Piceatannol und Resveratrol in vivo in männlichen und weiblichen Hunden 24 Stunden nach Verabreichung von 100 mg ERr 731/kg Körpergewicht.

2 veranschaulicht die östrogene Aktivität von Östradiol im Vergleich zu Resveratrol, cis- und trans-Rhapontigenin, Desoxyrhapontigenin, Piceatannol und ERr 731 in einem rekombinanten Hefe-Screen, stabil ER-α exprimierend. Die Konzentrationen (X- Achse) sind molare Konzentrationen mit Ausnahme der ERr 731-Konzentration, die in μg/ml angegeben ist.

3 zeigt das Ergebnis der Untersuchung der Aktivität verschiedener Hydroxystilbene in der ER-β-exprimierenden endometrialen Adenokarzinomzelllinie HEC-1B. Man beobachtet insbesondere eine Aktivierung von ER-β durch Rhapontigenin (3a) und Piceatannol (3b).

4 zeigt das Ergebnis der Untersuchung des inhibitorischen Effekts von Rhaponticin (Rp; bei 2,5, 25 und 250 μg/ml) auf die Proliferation von ER-negativen MDA MB 435S Brustkrebszellen.

5 zeigt das Ergebnis der Untersuchung des inhibitorischen Effekts von metabolisiertem Rhaponticin (Rp; bei 2,5, 25 und 250 μg/ml) auf die Proliferation von ER-negativen MDA MB 435S Brustkrebszellen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

1. Bevorzugte Gegenstände der Erfindung

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffs oder einer Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffkombination, ausgewählt unter Resveratrol- und Piceatannol-Prodrugs, wie insbesondere Rhaponticin, Desoxyrhaponticin, Rhapontigenin, Desoxyrhapontigenin und Astringin; sowie Resveratrol und Piceatannol; sowie deren stereoisomeren Formen, insbesondere cis- und trans-Form, jeweils in Form ihrer Salze oder in der Phenolform, oder Kombinationen dieser Verbindungen zur Herstellung eines Mittels zur Chemoprävention der Tumorigenese und/oder zur Inhibition der Tumorprogression bei endokrin-abhängigen oder endokrin-unabhängigen Tumoren.

Erfindungsgemäße Mittel sind dabei insbesondere ausgewählt unter Arzneimitteln, wie z.B. Homöopathika, Nahrungsergänzungsmitteln, diätetischen Lebensmitteln oder anderen Arzneipflanzenzubereitungen.

Resveratrol- und Piceatannol-Prodrugs im Sinne der Erfindung sind insbesondere Substanzen, welche in vivo, wie z.B. im Menschen und/oder einem anderen Säuger, wie z.B. Hund, in Resveratrol und/oder Piceatannol überführbar sind. Hierbei kann es sich um zuckerhaltige (Glycone) oder zuckerfreie (Aglycone) natürliche oder synthetische Vorläufer von Resveratrol oder Piceatannol handeln. Typische Beispiele für zuckerhaltige Vorläufer umfassen Rhaponticin, Astringin und Desoxyrhaponticin. Typische Beispiele für zuckerfreie Vorläufer umfassen Rhapontigenin und Desoxyrhapontigenin.

Vorzugsweise liegen die Wirkstoffe in wesentlichen in der trans-Form vor. Salze sind insbesondere die Alkali- und Erdalkaliphenolate obiger Verbindungen, die eine oder mehrere freie phenolische Hydroxylgruppe aufweisen. Liegen mehrere Hydroxylgruppen vor, so können diese teilweise oder vollständig in der Salzform vorliegen.

Der erfindungsgemäß einzusetzende Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination ist dabei chemisch synthetisiert oder insbesondere aus natürlichen oder rekombinanten Pflanzen isolierbar.

Bevorzugt wird eine Wirkstoffkombination aus wenigsten zwei dieser Verbindungen eingesetzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination aus Pflanzen zugänglich, die ausgewählt sind unter natürlichen Pflanzen sowie durch Züchtung veränderten oder rekombinanten, genetisch veränderten, Pflanzen, die einen in Vergleich zur entsprechenden unveränderten Pflanze höheren Gehalt an wenigstens einem der gewünschten Inhaltsstoffe aufweisen. Insbesondere sind diese Pflanzen ausgewählt unter Pflanze der Gattung Rheum spp., Astragalus spp., Cassia spp. oder Picea spp. oder wirkstoffhaltigen Pflanzenteilen. Nichtlimitierende Beispiele für geeignete Arten dieser Gattungen sind Rheum undulatum, Rheum palmatum, Rheum tataricum, Rheum officinale, Rheum wittrockii, Rheum altaicum, Rheum reticulatum, Astragalus complanatus Cassia garrettiana und Picea sitchensis.

Dem Fachmann ist außerdem bewusst, dass Gattungen/Arten unterschiedlicher Provinienz sowie verschiedenen Alters (d.h. Ernte zu verschiedenen Zeiten der Vegetationsperiode) einsetzbar sind, was wiederum Einfluss auf Art, Menge und Zusammen setzung des daraus isolierbaren Wirkstoffe und Gemische haben kann. Ebenso sind verschiedene Pflanzenteile, wie Wurzel, Rhizome, Blätter und/oder Stängel, grundsätzlich brauchbar.

Besonders vorteilhaft ist der Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination erhältlich aus Wurzeln, insbesondere von Rheum rhaponticum.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Wirkstoffkombination im wesentlichen Rhaponticin und/oder Desoxyrhaponticin, insbesondere Rhaponticin und Desoxyrhaponticin, wobei die Wirkstoffkombination im wesentlichen Rhaponticin und Desoxyrhaponticin in einem Gewichtsverhältnis von etwa 10:1 bis 1:10, wie z.B. in einem Bereich von etwa 5:1 bis 1:5 oder 4:1 bis 1:4 oder 3:1 bis 1:3 oder 2:1 bis 1:2 oder etwa 1:1, umfassen kann.

Eine weitere bevorzugte Wirkstoffkombination kann Rhaponticin und Desoxyrhaponticin, insbesondere in oben angegebenen Mengenverhältnissen, sowie Rhapontigenin und/oder Desoxyrhapontigenin umfassen. Der mengenmäßige Anteil von Rhapontigenin und/oder Desoxyrhapontigenin am Gesamtwirkstoffgehalt kann über einen weiten Bereich schwanken, und liegt z.B. im Bereich von etwa 0.01 bis 20 Gew.-%, insbesondere 0.1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf den Gesamtwirkstoffgehalt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Wirkstoffkombination verwendet, die im wesentlichen frei ist von Aglycon-Derivaten von Rhaponticin und Desoxyrhaponticin, wie insbesondere Resveratrol und Piceatannol. „Im Wesentlichen frei" bedeutet einen Aglycon-Gehalt von weniger als 5 Gew.-%, insbesondere weniger als 2 Gew.-% wie z.B. weniger als 1 Gew.-% oder 0,1 Gew.-%, wie 0 bis 0,05 Gew.-%, jeweils bezogen auf den Gesamtgehalt an Rhaponticin und Desoxyrhaponticin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird als Wirkstoffkombination ein pflanzlicher Trockenextrakt verwendet, der einen hohen Anteil an Glyconen, insbesondere Glyconen des oben beschriebenen Typs, aufweist, wie z.B. einen Anteil von 30 bis 100 Gew.-%, 50 bis 100 Gew.-%, 60 bis 99 Gew.-% oder 80 bis 98 Gew.-% oder 85 bis 96 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des erhaltenen Trockenextrakts. Ein „Trockenextrakt" in Sinne der Erfindung liegt insbesondere dann vor, wenn der Restfeuchtegehalt, d.h. der Restanteil an Wasser und/oder organischer Flüssig keit, (wie Extraktionsmittel) weniger als etwa 5 Gew.-%, insbesondere weniger als 2 Gew.-%, wie z.B. 0 bis 1,5 Gew.-% oder 0,1 bis 0,5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des erhaltenen Trockenextrakts, beträgt.

Nichtlimitierende Beispiele für geeignete Wirkstoffkombination, umfassend die Wirkstoffe Rhaponticin, Desoxyrhaponticin, Rhapontigenin, Desoxyrhapontigenin, werden im folgenden aufgeführt:
60–70 Gew.-%, wie z.B. 60–66 oder 62–68 Gew.-%, Rhaponticin
30–40 Gew.-%, wie z.B. 30–36 oder 31–37 Gew.-%, Desoxyrhaponticin
0–2 Gew.-% trans-Rhapontigenin und
0–2 Gew.-% Desoxyrhapontigenin;
oder
50–60 Gew.-%, wie z.B. 53–58 Gew.-%, Rhaponticin
20–30 Gew.-%, wie z.B. 14–28 Gew.-%, Desoxyrhaponticin
5–20 Gew.-%, wie z.B. 10–18 Gew.-%, trans-Rhapontigenin und
0–10 Gew.-%, wie z.B. 4–10 Gew.-%, Desoxyrhapontigenin;
jeweils bezogen auf den Gesamtwirkstoffgehalt und insbesondere auf den Gesamtgehalt an Rhaponticin, Desoxyrhaponticin, Rhapontigenin und Desoxyrhapontigenin.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Wirkstoffen oder Kombinationen davon nach obiger Definition, in Kombination mit wenigstens einem weiteren zur Chemoprävention der Tumorgenese und/oder zur Inhibition der Tumorprogression bei endokrin-abhängigen oder endokrin-unabhängigen Tumoren geeigneten und von Verbindungen gemäß obiger Definition verschiedenen Wirkstoffen. Weiterhin ist eine Kombination mit Vitaminen, Mineralstoffen, weiteren Nahrungsergänzungsmitteln und/oder diätetischen Lebensmitteln brauchbar.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Dosierungsform, enthaltend in einem pharmazeutisch verträglichen Träger einen Wirkstoff oder eine Wirkstoffkombination gemäß obiger Definition.

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung ein Mittel, umfassend eine Dosierungsform gemäß obiger Definition.

2. Weitere spezielle Ausgestaltungen erfindungsgemäß verwendeter Formulierungen

2.1 Arzneimittel

Die Erfindung umfasst auch die Herstellung pharmazeutischer Mittel (Arzneimittel) zur Behandlung eines Individuums, vorzugsweise eines Säugers, insbesondere eines Menschen, Nutz- oder Haustieres. So werden die oben beschriebenen Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen gewöhnlich in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht, die einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Wirkstoff, insbesondere einem Gemisch mehrerer erfindungsgemäßer Wirkstoffe, und gegebenenfalls weitere Wirkstoffe umfassen. Diese Zusammensetzungen können beispielsweise auf oralem, lokalem, rektalem, transdermalem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intraperitonealem, intrakutanem oder intranasalem Weg verabreicht werden.

Beispiele geeigneter pharmazeutischer Formulierungen sind feste Arzneiformen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, wie überzogene Tabletten, magensaftresistente überzogene Tabletten, Mantel-, Punkt- und Schichttabletten, Pastillen, Kautabletten, Lutschtabletten, Sachets, Cachets, Dragees, Kapseln wie Hart- und Weichgelatinekapseln, Globuli, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arzneiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder Pflaster, sowie flüssige Arzneiformen, wie Lösungen, Emulsionen, insbesondere Öl-in-Wasser-Emulsionen, Suspensionen, beispielsweise Lotionen, Injektions- und Infusionszubereitungen, Augen- und Ohrentropfen, Nasentropfen, Nasenspray und Tinkturen. Auch implantierte Abgabevorrichtungen können zur Verabreichung erfindungsgemäßer Inhibitoren verwendet werden. Ferner können auch Liposomen, Mikrosphären oder Polymermatrizes zur Anwendung kommen.

Bei der Herstellung der Zusammensetzungen werden erfindungsgemäße Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen gewöhnlich mit einem Exzipienten vermischt oder verdünnt. Exzipienten können feste, halbfeste oder flüssige Materialien sein, die als Vehi kel, Träger, Adsorbens oder Medium für den Wirkstoff oder die Wirkstoffkombinationen dienen.

Zu geeigneten Exzipienten gehören beispielsweise Lactose, Dextrose, Succrose, Sorbitol, Mannitol, Stärken, Akaziengummi, Calciumphosphat, Alginate, Traganth, Gelantine, Calciumsilikat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Cellulosederivate, wie z.B. Methylcellulose, Wasser, Sirupe und Methylcellulose. Ferner können die Formulierungen pharmazeutisch akzeptable Träger oder übliche Hilfsstoffe, wie Gleitmittel, beispielsweise Talg, Magnesiumstearat und Mineralöl; Netzmittel; emulgierende und suspendierende Mittel; konservierende Mittel, wie Methyl- und Propylhydroxybenzoate; Antioxidantien; Antireizstoffe; Chelatbildner; Dragierhilfsmittel; Emulsionsstabilisatoren Filmbildner; Gelbildner; Geruchsmaskierungsmittel; Geschmackskorrigentien; Harze; Hydrokolloide; Lösemittel; Lösungsvermittler; Neutralisierungsmittel; Permeationsbeschleuniger; Pigmente; quaternäre Ammoniumverbindungen; Rückfettungs- und Überfettungsmittel; Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe; Silikon-Derivate; Spreithilfsmittel; Stabilisatoren; Sterilanzien; Suppositoriengrundlagen; Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge; Treibmittel; Trocknungsmittel; Trübungsmittel; Verdickungsmittel; Wachse; Weichmacher; Weißöle umfassen.

Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie beispielsweise in Fiedler, H.P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, dargestellt ist; vgl auch Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Springer Verlag, Heidelberg.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein pharmazeutisches Mittel bereitgestellt, das eine feste Dosierungsform umfasst. Diese feste Dosierungsform umfasst ihrerseits einen wirkstoffhaltigen festen Kern mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und einem Wirkstoffgehalt von etwa 1 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Kerns, wobei der Hydroxystilben-haltige Wirkstoff oder die Hydroxystilben-haltige Wirkstoffkombination, eine Verbindung ausgewählt unter Resveratrol- und Piceatannol-Prodrugs, wie Rhaponticin, Desoxyrhaponticin, Rhapontigenin, Desoxyrhapontigenin und Astringin; sowie Resveratrol und Piceatannol; sowie deren stereoisomeren Formen, jeweils in Form ihrer Salze oder in der Phenolform, oder Kombinationen dieser Verbindungen umfasst. Bevorzugte Wirkstoffkombinationen sind wie oben definiert.

Diese feste Dosierungsform hat beispielsweise einem Gesamt-Wirkstoffgehalt von etwa 1 bis 20 mg, wie z. B. 2 bis 10 mg, je Dosiseinheit und kann in Form einer Pille, einer Tablette, eines Extrudats oder eines Granulat vorliegen und z.B. dragiert sein. Gewünschtenfalls kann sie auch einen magensaftresistenten Überzug aufweisen.

Die feste Dosierungsform wird z.B. hergestellt, indem man den Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination mit dem pharmazeutisch verträglichen Träger mischt und die Mischung zum Wirkstoffkern verfestigt. Dabei löst oder dispergiert man den Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination in einer inerten Flüssigkeit, mischt ihn/sie mit dem Träger und entfernt das Lösungsmittel während oder nach der Verfestigung. Den Wirkstoffkern kann man dann gegebenenfalls mit einem magensaftresistenten Überzug versehen, bevor man den Kern in üblicher Weise dragiert.

Art und Dauer der Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel obliegen der Entscheidung des behandelnden Arztes. Dieser kann in Abhängigkeit vom gewählten Verabreichungsweg, von der Wirksamkeit der konkreten Wirkstoffzusammensetzung, der Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung, vom Befinden des Patienten und von dessen Ansprechen auf die Therapie eine geeignete Dosis und einen entsprechenden Dosierungsplan festlegen. Beispielsweise kann eine geeignete Einzeldosis etwa 0,1 bis 50 mg, wie z.B. 2 bis 12 mg, Wirkstoff oder Wirkstoffkombination gemäß obiger Definition enthalten und 1 bis 3-mal täglich verabreicht werden, bis der gewünschte Behandlungserfolg zu beobachten ist.

2.2 Nahrungsergänzungsmittel und Lebensmittel

Zu den erfindungsgemäßen Mitteln gehören insbesondere auch Nahrungsergänzungsmittel und Lebensmittel, insbesondere funktionale oder diätetische Lebensmittel. Die erfindungsgemäßen Lebensmittel besitzen neben einer vorwiegend nährwertbezogenen Funktion zusätzlich eine wirkstoffbezogene Funktion, welche insbesondere die erfindungsgemäße Wirkstoffkombination betrifft. Sie werden daher als funktionale oder diätetische Lebens- oder Nahrungsmittel bezeichnet. Nahrungsergänzungsmittel dienen zur Ergänzung der täglichen Ernährung mit der erfindungsgemäßen Wirkstoffkombination, wobei die nährwertbezogene Funktion des Nahrungsergänzungsmittels für sich genommen in den Hintergrund tritt.

Die Formulierungsgrundlage für erfindungsgemäße Nahrungsergänzungsmittel und Lebensmittel umfasst ebenfalls physiologisch akzeptable Hilfsstoffe im weitesten Sinn, wie z.B. oben genannte Exzipienten. Hilfsstoffe im erfindungsgemäßen Sinne können auch einen Nährwert besitzen und deshalb allgemein als Nahrungskomponente verwendet werden. Auch Nährstoffe, insbesondere essentielle Nährstoffe, können dazu gehören.

Nahrungskomponenten enthalten in der Regel eine oder mehrere Aminosäuren, Kohlenhydrate oder Fette und sind für die menschliche und/oder tierische Ernährung geeignet. Sie umfassen Einzelkomponenten, häufig pflanzliche aber auch tierische Produkte, insbesondere Zucker gegebenenfalls in Form von Sirupen, Fruchtzubereitungen, wie Fruchtsäfte, Nektar, Fruchtpulpen, Pürees oder getrocknete Früchte, beispielsweise Apfelsaft, Grapefruitsaft, Orangensaft, Apfelmus, Tomatensauce, Tomatensaft, Tomatenpüree; Getreideprodukte, wie Weizenmehl, Roggenmehl, Hafermehl, Maismehl, Gerstenmehl, Dinkelmehl, Maissirup, sowie Stärken der genannten Getreide; Milchprodukte, wie Milcheiweiß, Molke, Joghurt, Lecithin und Milchzucker.

Beispiele essentieller Nährstoffe sind insbesondere Vitamine, Provitamine, Mineralstoffe, Spurenelemente, Aminosäuren und Fettsäuren. Als essentielle Aminosäuren seien genannt Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin. Dazu gehören auch semi-essentielle Aminosäuren, die beispielsweise in Wachstumsphasen oder Mangelzuständen zugeführt werden müssen, wie Arginin, Histidin, Cystein und Tyrosin. Als Spurenelemente seien genannt: essentielle Spurenelemente und Mineralstoffe, wie: Eisen, Kupfer, Zink, Chrom, Selen, Calcium, Magnesium, Natrium, Kalium, Mangan, Cobalt, Molybdän, Iod, Silicium, Fluor, Chlor, Phosphor, Zinn, Nickel, Vanadium, Arsen, Lithium, Blei, Bor. Als für den Menschen essentielle Fettsäuren seien genannt: Linolsäure und Linolensäure, ARA (Arachidonsäure) und DHA (Docosahexaensäure) für Säuglinge und möglicherweise EPA (Eicosapentaensäure) und DHA auch für Erwachsene. Eine umfassende Aufzählung von Vitaminen findet sich in "Referenzwerte für die Nährstoffzufuhr", 1. Auflage, Umschau Braus Verlag, Frankfurt am Main, 2000, herausgegeben von der Deutschen Gesellschaft für Ernährung.

Beispiele geeigneter Formulierungen zur Nahrungsergänzung sind Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulverbeutel, Flüssigampullen und Fläschchen mit Tropfeinsätzen, sowie die oben bereits genannten Arzneiformen.

Lebensmittel-Formulierungen haben in der Regel die übliche Form und werden beispielsweise als Frühstückszubereitungen, in Form von Müslis oder Riegeln, Sportlerdrinks, Komplettmahlzeiten, diätetische Zubereitungen, wie Diätdrinks, Diätmahlzeiten und Diätriegel, angeboten.

Die Herstellung erfindungsgemäßer Nahrungsergänzungsmittel und Lebensmittel erfolgt nach dem Fachmann geläufigen Methoden und bedarf keiner weiteren Erläuterung. (vgl. z.B. Hans-Dieter Belitz et al. Lehrbuch der Lebensmittelchemie. Springer-Lehrbuch 5., überarb. Aufl. 2001. XLIV, 1059 Verlag: SPRINGER, BERLIN)

Der Gehalt an erfindungsgemäßem Wirkstoffen/Wirkstoffkombinationen in obigen Nahrungsergänzungsmitteln und Lebensmitteln kann über einen weiten Bereich variieren und liegt z. B in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gew.-%, wie z.B. 0,1 bis 1 Gew.-%.

Die Erfindung wird nun anhand folgender nichtlimitierender Beispiele und unter Bezugnahme auf beiliegende Figuren weiter erläutert.

EXPERIMENTELLER TEIL
Allgemeine Methoden:
Bestimmung von Stilbenen durch Hochdruckflüssigkeitschromatograghie (HPLC) in Trockenextrakt aus Rhapontikrhabarberwurzel
a) Probenvorbereitung:
50 mg Extrakt werden mit 40 ml einer Mischung aus Aceton und Wasser (1:1) in einem Braunglasgefäß versetzt, 15 Minuten im Ultraschallbad behandelt und mit der Lösungsmittelmischung auf 50 ml aufgefüllt und anschließend 1:10 mit der Lösungsmittelmischung verdünnt.
b) Durchführung der Chromatographie:

Mit einem Teil der oben erhaltenen Lösung wird eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit folgenden Systemparametern durchgeführt:

Probensshleife:	20 μl
Säule:	Lichrospher 5 μ RP 18, 250 × 4 mm
Vorsäule:	Lichrospher 5 μ RP 18, 5 × 4 mm
Säulentemperatur:	25°C
Fließmittel A:	Acetonitril/dest. Wasser/Phosphorsäure 85%,
	15/85/0,05 (Volumenteile)
Fließmittel B:	Acetonitril/dest. Wasser/Phosphorsäure 85%
	80/20/0,05 (Volumenteile)
Fluss:	1,5 ml/min
Säulenspülung:	15 min mit Eluent 50% B; Equilibrierzeit 15 min
Detektion:	310 nm
HPLC:	Kontron Kroma 2000

Gradient:

Zeit	% B
0,0	0
0,5	0
7,5	75
8,5	100
9,5	0
12,5	0

Unter den oben angegebenen Systembedingungen ergeben sich folgende Retentionszeiten:

Rhaponticin: ca. 5,5 min

Desoxyrhaponticin: ca. 6,8 min

Rhapontigenin: ca. 7,2 min

Desoxyrhapontigenin: ca. 9,0 min
Für eine quantitative Bestimmung werden die jeweiligen Peak-Flächen ermittelt und mit den entsprechenden Peak-Flächen eines Standard-Extraktes bekannter Zusammensetzung verglichen.
Herstellungsbeispiel 1: Herstellung des Trockenextraktes ERr 731 aus Rhapontikrhabarberwurzel mit einer wässrigen Calciumhydroxid-Lösung
Für die Herstellung eines Trockenextraktes aus Rhapontikrhabarberwurzel werden eingesetzt:

Droge (Radix rheum rhaponticum) 50,0 kg

Calciumoxid 5,0 kg

Gereinigtes Wasser 190,0 kg

Essigsäure (je nach Bedarf um den erforderlichen pH-Wert einzustellen)
Die erzielbare Ausbeute liegt dabei zwischen 2 und 3 kg je 50 kg Droge.
Die Herstellung erfolgt in folgenden Schritten:

a) In einen Plastikbottich werden zunächst 5 kg Calciumoxid gefüllt und mit 20 kg gereinigtem Wasser aufgeschlämmt. Die unter diesen Bedingungen stattfindende Bildung von Calciumhydroxid (Löschkalk) führt zu einem starken Temperaturanstieg der Lösung. Daher kann das Calciumhydroxid erst nach Abkühlen weiter verwendet werden. Die Temperatur der Lösung liegt dann bei 30°C bis 35°C.
b) 50 kg Droge werden in einen Mischer gefüllt und mit dem oben erwähnten Löschkalk versetzt. Um den Löschkalk möglichst vollständig aus dem Plastikbottich zu entfernen, wird dieser mit 10 kg gereinigtem Wasser nachgespült. Diese Waschflüssigkeit wird ebenfalls in den Mischer gegeben.
c) Die mit Löschkalk homogen durchmischte Droge wird in einen Perkolator gefüllt und mit 160 kg gereinigtem Wasser überschichtet. Der Perkolator bleibt für 48 Stunden verschlossen. Anschließend wird das Perkolat in einem geeigneten Gefäß mit einer Flussrate von 50 ml/min aufgefangen. Die Perkolation wird solange fortgesetzt, bis kein Perkolat mehr austritt. Die Drogenmasse wird nach Beendigung nicht ausgepresst, sondern verworfen.
d) Unter permanenter Kontrolle wird dem Perkolat solange konzentrierte Essigsäure zugefügt, bis ein pH-Wert erreicht ist, der im Bereich von 3,4 bis 3,6 liegt. Um eine möglichst vollständige Fällung des Extraktes zu erreichen, ruht der Ansatz für 5 Tage.
e) Die Gewinnung des Trockenextraktes erfolgt durch Filtration über Büchnertrichter unter angelegtem Vakuum. Abschließend wird der Extrakt noch mit 10 bis 20 kg gereinigtem Wasser gewaschen.
f) Der nach Filtration erhaltene Trockenextrakt wird im Trockenschrank bei 40°C solange getrocknet, bis eine Restfeuchte-Toleranz von max. 1% erreicht ist.

Rhaponticin ist in wässrigen Lösungen mit alkalischem pH-Bereich gut löslich, während es im sauren pH-Bereich (pH 3,4–3,6) als gelbliche Substanz ausfällt. Dies macht man sich bei seiner Isolierung zu Nutzen. Da die Wurzel neben anderen organischen Säuren vor allem einen hohen Gehalt an Oxalsäure besitzt (2/3 in wasserlöslicher und 1/3 in gebundener Form) muss diese während der Isolation neutralisiert werden, um ein Abdriften des pH-Werts in den sauren Bereich zu verhindern und so ein frühzeitiges Ausfallen des Rhaponticins zu unterbinden. Dies wird durch den Einsatz von Calciumoxid erreicht. Dieses wird als Löschkalk-Lösung mit einem pH-Wert von 12,4–12,6 eingesetzt.
Wird der Löschkalk mit der Droge homogen durchmischt, so verändert sich der pH-Wert der Mischung. Er liegt dann im Bereich von 11,3 bis 11,8, wodurch ein Ausfällen von Rhaponticin verhindert wird, da die phenolische Form in eine Phenolat-Form überführt wurde. Trotz des hohen Gehalts an Oxalsäure kann der pH-Wert im alkalischen Bereich gehalten werden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass das Calciumhydroxid mit Oxalsäure reagiert und unlösliches und ungiftiges Calciumoxalat bildet.
Durch die anschließende Perkolation mit gereinigtem Wasser wird Rhaponticin aus der Wurzel extrahiert. Nach Beendigung der Perkolation wird durch Zugabe von Essigsäure ein pH-Wert von 3,4 bis 3,6 eingestellt. Dieser pH-Shift vom alkalischen in den sau ren Bereich führt zum Ausfällen von Rhaponticin durch Rückführung in die phenolische Form. Um eine möglichst vollständige Fällung des Rhaponticins zu erreichen, lässt man den Ansatz 5 Tage stehen. Danach wird abfiltriert. Rhaponticin bleibt als gelbliche Substanz auf dem Filter zurück.
Herstellungsbeispiel 2: Herstellung eines Trockenextraktes aus Rhapontikrhabarberwurzel mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln
In der hier als Droge verwendeten Rhapontikrhabarberwurzel gehören die hauptsächlich nachweisbaren Inhaltstoffe zur Gruppe der Hydroxystilbene. Aus dieser Gruppe finden sich in den Wurzeln Rhaponticin (Rh) mit einem Anteil von etwa 6% und Desoxyrhaponticin (DRh) mit einem Anteil von etwa 4%.
Bei Einwirkung der im Folgenden angegebenen Lösungsmittelsysteme in der 100-fachen Menge, bei Raumtemperatur für 10 Minuten unter Schütteln oder Rühren lassen sich die nachfolgend zusammengefassten Anteile extrahieren:
Keine brauchbaren Resultate wurden mit Heptan erzielt.
Die jeweiligen Ausbeuten an Rohextrakten in Massenanteilen (bezogen auf eingesetzte Droge) sind folgende:

Ethanol 86% 35,5%

Ethanol 15% 32,2%

Aceton 21,4

Heptan 0%

Wasser, alkalisch 4,5%
Die Extraktion von Rhapontikrhabarberwurzel mit Ethanol-Wasser-Gemischen führt zu einem Extrakt, der neben den Hauptinhaltsstoffen Rhaponticin (ca. 30%) und Desoxyrhaponticin (ca. 22%), ein weiteres z.Zt. noch nicht erforschtes Stilben in ca. 20% Anteil am Extrakt enthält. Daneben erhält man die Aglykone Rhapontigenin (ca. 8%) und Desoxyrhapontigenin (ca. 2%) und noch 9 weitere Verbindungen, die sich zu ca. 20% summieren.
Bei der Extraktion mit Aceton erhält man grundsätzlich gleiche Ergebnisse.
Die Extraktion mit alkalisiertem Wasser (vgl. Bedingungen gemäß Herstellungsbeispiel 1) führt zu einem Extrakt höherer Reinheit.
Die Hauptinhaltsstoffe Rhaponticin und Desoxyrhaponticin sind in einen ca. 97%igen Anteil im trockenen Extrakt enthalten. Rhapontigenin und Desoxyrhapontigenin ergeben im Extrakt einen Anteil von zusammen 1,1%, während das noch nicht erforschte Stilben lediglich in einem Anteil von 0,2% enthalten ist. Weitere 3 Verbindungen sind in einem 2,5%igen Anteil enthalten.
Formulierungsbeispiel 1: Herstellung einer festen Dosierungsform-Minitablette
1. Herstellung des Tablettenkerns:

Ein fester Tablettenkern wird unter Verwendung folgender Wirk- und Hilfsstoffe in den angegebenen Mengenverhältnissen (TI = Gewichtsteile) hergestellt. Die Bestandteile werden auf zwei verschieden Weisen vermischt und tablettiert:

Gereinigter Trockenextrakt gemäß Herstellungsbeispiel 1
aus Rhapontikrhabarberwurzel (ERr 731)	3,6 TI
Mikrokristalline Cellulose (z.B. Avicel^®)	57,0 TI (± 40%)
Sorbit	8,0 TI (± 40%)
Talkum	2,5 TI (± 40%)
Makrogol 6000 (Polyglykol)	1,6 TI (± 40%)
Polyvidon (K-Wert ca. 25, z.B. Kollidon^® 25)	1,6 TI (± 40%)
Natriumdodecylsulfat (z.B. Texapon^® K 12)	0,5 TI (± 40%)
Magnesiumstearat (pflanzlich)	0,8 TI (± 40%)
	75,6 TI (± 40%)

Durch Variation der eingewogenen ERr 731-Menge und/oder Variation der mikrokristallinen Cellulose-Menge können beliebige ERr 731-Gehalte des Rohkerns erhalten werden (wie z.B. 2, 4, 6, 8, 10, 12 mg je Tablette).
Mischungs-Variante a:
1,2 TI ERr 731 werden anteilig mit Avicel^® verrieben, anschließend wird gemischt und tablettiert.
Mischungs-Variante b:
ERr 731 (1 g/l Lösungsmittel) wird in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. Ethanol/Wassergemisch 86% v/v Ethanol) gelöst und auf Avicel^® aufgezogen, getrocknet (bei 40°C mindestens 48 Stunden), gemischt und anschließend tablettiert.
Tablettierung:
Die Mischung wird durch eine Siebmaschine (Siebdurchmesser 1.2 mm) in einen geeigneten Mischbehälter gesiebt und in einem geeigneten Mischer (z.B. Rhönrad-Mischer Typ Standard RR M 200, Firma Engelsmann AG/Ludwigshafen) mind. 30 min gemischt. Nach Zugabe von Magnesiumstearat wird nochmals mind. 5 min gemischt.
Die Verpressung erfolgt auf einer geeigneten Tablettenpresse (z.B. Rundläufer Typ Perfecta Fette 2000, Fa. Fette/Schwarzenbeck):

Kerngewicht: 84 mg ± 4.2 mg maximale Abweichung

Stempel: 7 mm Durchmesser, drageegewölbt
Der ERr-731-Gehalt je Kern beträgt etwa 4 mg.
2. Herstellung der magensaftresistenten überzogenen Tablette
Nach dem Entstauben der Tablettenkerne wird ein magensaftresistenter Überzug aus Celluloseacetatphthalat und Diethylphthalat, gelöst in Isopropanol und Ethylacetat, auf die Tablettenkerne mit Hilfe einer Coatinganlage aufgebracht.
Macrogol wird in gereinigtem Wasser gelöst. Die Bestandteile Zucker (Saccharose oder Isomalt), Calciumcarbonat, Talkum, Titaniumdioxid und die beiden Povidone werden gemischt und in die Flüssigkeit eingerührt. Die Suspension wird 2 Stunden im Rührkessel gerührt.
Die Dragiersuspension wird mit Hilfe eines Dragierautomaten auf die isolierten Kerne aufgebracht. Der Vorgang wird so lange wiederholt, bis ein durchschnittliches Gewicht von 150 mg pro aufdragiertem Kern erreicht ist. Schließlich trägt man das Polierwachs auf und anschließend lässt man bis zum Hochglanz rollieren.
Endgewicht der magensaftresistenten überzogenen Tablette: 150 mg ± 7.5 mg maximale Abweichung.
Auf diese Weise werden zwei verschieden Tablettenformen – eine zuckerhaltige und eine zuckerfreie – hergestellt, wobei die jeweiligen Hilfsstoffen in den im Folgenden angegebenen Gewichtsteilen eingesetzt wurden. Magensaftresistente überzogene Tablette – zuckerhaltig

Magensaftresistente überzogene Tablette – zuckerfrei
Formulierungsbeispiel 2: Herstellung einer festen Dosierungsform – magensaftresistente überzogene Tablette

Auf der Grundlage der folgenden allgemeinen Rezepturen werden entsprechend Formulierungsbeispiel 1 Tabletten mit einem Endgewicht von etwa 400 mg, einem Kerngewicht von etwa 250 mg und einem Wirkstoffgehalt von 4 mg je überzogene Tablette hergestellt. Tablettenkern:

Trockenextrakt aus Rhapontikrhabarberwurzel gemäß Herstellungsbeispiel 1	1,2 kg
Mikrokristalline Cellulose	zwischen 19,0 und 50,0 kg
Lactose-Monohydrat	zwischen 21,0 und 55,0 kg
Talkum	zwischen 1,0 und 4,0 kg
Povidon (K-Wert ca. 25)	zwischen 0,5 und 2,0 kg
Macrogol 6000	zwischen 0,4 und 1,9 kg
Magnesiumstearat	zwischen 0,3 und 1,2 kg
Natriumdodecylsulfat	zwischen 0,1 und 1,2 kg
mittleres Gesamtgewicht der Batch	75,0 kg

Tablettenhülle:

Saccharose	26,52 kg ± 40%
Calciumcarbonat	6,36 kg ± 40%
Talkum	5,28 kg ± 40%
Celluloseacetatphthalat	3,18 ± 40%
Povidon (K-Wert ca. 25)	0,75 kg ± 40%
Titandioxid E 171	0,63 kg ± 40%
Macrogol 3500	0,63 kg ± 40%

Diethylphthalat	0,72 kg ± 40
Methacrylsäure-Methylmethacrylat-Copolymer (1:1)	0,51 kg ± 40%
(Eudragit L) 12,5%
Povidon (K-Wert ca. 90)	0,33 kg ± 40%
Capol 1295 (95% Carnaubawachs, 5% gebleichtes Wachs)	0,09 kg ± 40
Endgewicht magensaftresistente überzogene Tablette (300.000 Stück)	120,00 kg

Testbeispiel 1: In vivo-Metabolisierung des Trockenextrakts ERr 731
Zur weiteren Aufklärung der Wirkungsweise wurde ERr 731 3 männlichen und 3 weiblichen Hunden (reinrassige Beagles, Gewicht 6–9 kg, Alter 6–8 Monate) in einer Dosis von 100 mg ERr 731/kg Körpergewicht oral per Kapsel verabreicht. In verschiedenen Zeitintervallen wurde den Tieren Blut entnommen und Blutplasma gewonnen. Das Plasma wurde auf ERr 731-Inhaltsstoffe und -Metabolite untersucht. Überraschenderweise konnten sowohl in männlichen als auch in weiblichen Tieren signifikante Mengen des Metaboliten Piceatannol und geringe Mengen des Metaboliten Resveratrol nachgewiesen werden. Maximale Plasmaspiegel dieser Metabolite wurden nach etwa 24 h erreicht. Die Plasmaspiegel für Piceatannol lagen deutlich über denen von Resveratrol. Die Versuchsergebnisse sind in 1 dargestellt.
Testbeispiel 2: Östrogene Aktivität von ERr 731 und dessen Inhaltsstoffe bzw. Metabolite in einem ER-α-exprimierenden Hefezellsystem
Es sollte die Frage geklärt werden, ob ERr 731 ER-α aktiviert. Deshalb wurde der Extrakt ERr 731 und dessen Inhaltsstoffe bzw. Metabolite (Rhapontigenin (trans-Rhapontigenin), Desoxyrhapontigenin, Resveratrol, Piceatannol sowie cis-Rhapontigenin) im Vergleich mit Östradiol auf die östrogene Aktivität in etablierten Modellsystemen untersucht.
Tabelle 2 stellt die Konzentrationen für die positive Kontrolle (Östradiol) und die Testsubstanzen dar, welche in dem Assay verwendet wurden. Tabelle 2

¹ Ausnahme: Die Konzentration für den Extrakt ERr 731 ist in μg/ml angegeben

In diesen Experimenten wurde ein rekombinanter Hefe-Screen verwendet (vgl. E. Routledge and J.P. Sumpter, Östrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen, Envirom. Tox. Chem. 1996).
Saccharomyces-cerevisiae-Zellen wurden mit humanem ER-α sowie mit einem Reporter-Gen, bestehend aus dem jeweiligen responsiven Promotorelement fusioniert mit dem LacZ-Gen, welches für β-Galaktosidase kodiert, stabil transfiziert. Durch Östrogenbehandlung (mit Östrogen oder einem östrogenähnlich wirkenden Substrat) der Zellen wird, vermittelt durch den Östrogenrezeptor, β-Galaktosidase aktiviert, was zu einer Rotfärbung der Hefezellen führt, welche bei 565 nm gemessen werden kann.
Die Versuchsergebnisse sind in 2 zusammengefasst.
Testbeispiel 3: Östrogene Aktivität von ERr 731 und seinen Metaboliten in der ER-β-exprimierenden endometrialen Adenkarzinomzelllinie HEC-1B
HEC-1B Zellen, eine humane endometriale Adenocarcinom-Zelllinie, exprimieren weder den ER-α noch den ER-β. Damit stellen sie eine Möglichkeit dar, in einem humanen und endometrialen Kontext ligandabhängige Effekte von Substanzen auf die Transaktivierungsmechanismen hinsichtlich verschiedener Rezeptor-Subtypen und verschiedener östrogenresponsiver Promotoren zu untersuchen.
Eingesetzt wurde ein etabliertes ER-β/mC3-Luciferase-System. Dazu wurden HEC-1B Zellen in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 95.000 Zellen/Well ausgebracht. Am nächsten Tag wurden diese mit einem ER-β-enthaltenden Konstrukt (hERβ/pSG2) und einem triple-ERE-enthaltenden Promotor/Luciferase Konstrukt (mC3-Luc/pGL2) kotransfiziert. Die transiente Transfektion erfolgte mittels DOTAP^® (Roth). Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit entsprechenden Konzentrationen der zu untersuchenden Substanzen bzw. Substanzgemische behandelt. Als Positivkontrolle diente Estradiol (10 nM), als Lösungsmittelkontrolle wurde ein vergleichbares Volumen Dimethylsulfoxid (DMSO) eingesetzt. Die Inkubationszeit betrug 24 Stunden. Danach wurden die Zellen lysiert. Einerseits wurde mittels des Luciferase Assay^® Kits (Promega) die Luciferaseaktivität und andererseits mittels des BCA^® Kits (Sigma) der Proteingehalt bestimmt. Die resultierenden spezifischen Luciferase-Aktivitäten der zu untersuchenden Substanzen konnten dann gegen die DMSO-Kontrolle (100%) verglichen werden.
Die Ergebnisse für Trans Rhapontigenin und Piceatannol sind in 3a) bzw. 3b) dargestellt.
Man beobachtet insbesondere eine Aktivierung von ER-β durch Rhapontigenin (3a) und Piceatannol (3b).
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse sowie der Ergebnisse gemäß 2 kann gefolgert werden, dass ERr 731 und seine Inhaltsstoffe bzw. Metabolite selektive ER-β Aktivatoren sind und keine Wirkung auf ER-α zeigen. Somit stellen ERr 731 sowie dessen Inhaltsstoffe und Metabolite wirksame Verbindungen zur Chemoprävention und Behandlung sämtlicher Formen von endokrin-abhängigen Tumoren dar, indem sie ER-β als entscheidenden endogenen Tumorsuppressor aktivieren.
Testbeispiel 4: Untersuchung des inhibitorischen Effekts von Rhaponticin (Rp; 2.5 bis 250 μg/ml) auf die Proliferation von ER-negative MDA MB 435S Brustkrebszellen
Die Untersuchungen wurden mit der Mammakarzinom-Zelllinie MDA MB 435S durchgeführt. Deren Wachstumsstimulation wurde zunächst mit Östradiol (E2) in einer Konzentrationsreihe von 10^–4 – 10^–10 M untersucht. Dann erfolgte die Testung mit Rhaponticin in einer Konzentrationsreihe von 250 μg/ml bis 0.25 μg/ml. Die Messung der Wachstumsraten erfolgte mit Hilfe einer Methylen-Blau-Färbung der Tumorzellen in einem Inkubationszeitraum von 24–260 h.
Überraschenderweise wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass Rhaponticin dosisabhängig die Proliferation der Brustkrebszelllinie MDA MB 435S inhibiert (vgl. 4), welche keinerlei Östrogenrezeptoren exprimiert (Berthois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986; 83: 2496–2500). Ethanol als Lösungsmittel hatte keinen Effekt.
Testbeispiel 5: Untersuchung des inhibitorischen Effekts von metabolisiertem Rhaponticin (Rp; 2.5 bis 250 μg/ml) auf die Proliferation von ER-negative MDA MB 435S Brustkrebszellen
Die Zellen wurden mit E2 behandelt wie oben beschrieben. Um eine mögliche Lebermetabolisierung und deren Auswirkungen auf die Wirkung von Rhaponticin abschätzen zu können, wurden die gleichen Experimente wie o.g. mit Rhaponticin durchgeführt, das zuvor durch Rattenleberextrakte metabolisiert wurde. Hierzu wurden verschiedene Konzentrationen von Rhaponticin in einer 27%igen alkoholischen Lösung mit SG-Aroclor KCL Rattenleberextrakt (Organon Teknika) in einem Verhältnis von 1:15 im Brutschrank unter halbsterilen Bedingungen inkubiert. Das Abstoppen der Reaktion erfolgte durch Zugabe von eiskaltem Aceton in einer Endkonzentration von 80%, was zu einem vollständigen Ausfällen des Leberextraktes führte. Nach 1 h Zentrifugation bei 2600 × g und 4°C konzentrierte der Leberextrakt auf dem Boden, die Oberphase mit den Rhaponticin-Metaboliten wurde dekantiert, lyophilisiert und anschließend resuspendiert und im Zellkulturexperiment für verschiedene Zeitpunkte eingesetzt.
Überraschenderweise wurde nun erfindungsgemäß festgestellt, dass metabolisiertes Rhaponticin die Proliferation der ER-negativen Brustkrebszelllinie MDA MB 435S in dosisabhängiger Weise inhibiert (5). Ethanol als Lösungsmittel hatte keinen Einfluss.

Claims

Verwendung eines Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffs oder einer Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffkombination, ausgewählt unter Resveratrol- und Piceatannol-Prodrugs; sowie Resveratrol und Piceatannol; sowie deren stereoisomeren Formen, jeweils in Form ihrer Salze oder in der Phenolform, oder Kombinationen dieser Verbindungen zur Herstellung eines Mittels zur Chemoprävention der Tumorgenese und/oder zur Inhibition der Tumorprogression bei endokrin-abhängigen oder endokrin-unabhängigen Tumoren.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der endokrin-abhängige Tumor ausgewählt ist unter Tumoren der Brust, der Ovarien, des Uterus, der Prostata und des Colons, und wobei der endokrin-unabhängige Tumorausgewählt ist unter Tumoren der Brust, der Ovarien, des Uterus, der Prostata und des Colons.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Wirkstoffkombination aus wenigsten zweien dieser Verbindungen eingesetzt wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination chemisch synthetisiert oder aus Pflanzen isolierbar ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination erhältlich ist aus Pflanzen der Gattung Rheum spp, Astragalus spp, Cassia spp oder Picea spp.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination erhältlich ist aus Wurzeln von Rheum rhaponticum.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination im wesentlichen Rhaponticin und/oder Desoxyrhaponticin umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Wirkstoffkombination im wesentlichen Rhaponticin und Desoxyrhaponticin in einem Gewichtsverhältnis von etwa 10:1 bis 1:10 umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Wirkstoffkombination Rhaponticin, Desoxyrhaponticin sowie Rhapontigenin und/oder Desoxyrhapontigenin umfasst.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wirkstoffkombination im wesentlichen frei ist von Aglycon-Derivaten von Rhaponticin und Desoxyrhaponticin
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Wirkstoffkombination im wesentlichen frei ist von Resveratrol und Piceatannol.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Wirkstoffkombination im wesentlichen aus etwa 60–70 Gew.-% Rhaponticin 30–40 Gew.-% Desoxyrhaponticin 0–2 Gew.-% trans-Rhapontigenin; 0–2 Gew.-% Desoxyrhapontigenin besteht.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in Kombination mit wenigstens einem weiteren zur Chemoprävention der Tumorgenese und/oder zur Inhibition der Tumorprogression bei endokrin-abhängigen oder endokrin-unabhängigen Tumoren geeigneten und von Verbindungen gemäß der Definition in Anspruch 1 verschiedenen Wirkstoff.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mittel ausgewählt ist unter chemisch-synthetischen, biotechnologisch hergestellten, pflanzlichen und homöopathischen Arzneimitteln, anderen Arzneipflanzenzubereitungen, Nahrungsergänzungsmitteln und diätetischen Lebensmitteln.
Dosierungsform, enthaltend in einem pharmazeutisch oder diätetisch verträglichen Träger einen Wirkstoff oder eine Wirkstoffkombination gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 13.
Mittel, umfassend eine Dosierungsform gemäß der Definition in Anspruch 15.