Als
solches Verfahren zur Permeabilisierung ist die Elektroporation
bekannt, mit der nanoskaliges Material, insbesondere DNS, in lebende
Zellen eingeschleust werden kann. Bekanntermaßen wird dazu durch Pulse eines
sich entladenden Kondensators kurzeitig ein elektrisches Feld der
Stärke
zwischen etwa 250 V/cm und 14 kV/cm erzeugt, das Durchgänge in Zellwänden verursacht,
die sich kurze Zeit später
wieder schließen.
Durch die kurzzeitig offenen Durchgänge können exogene Nukleinsäuren, Flüssigkeiten
oder Partikel in die Zellen eingeführt werden.
Generell
werden für
diese Elektroporationsverfahren Elektroden eingesetzt, die in geringem
Abstand zueinander angeordnet werden. Beim Anlegen der Spannung
bildet sich ein elektrisches Feld aus, das zum Überschreiten eines kritischen Transmembranpotentials
führt.
Das Überschreiten
bewirkt eine Permeabiliserung der Zellmembran bei lebenden Zellen.
Allerdings führt
dies auch oft zum Tod der Zelle. Für die Elektroporation werden
die Zellen in der logarithmischen Phase geerntet und aufbereitet.
Zur Vermeidung eines elektrischen Durchschlags wird die zu transfizierende
DNS oder andere Nukleinsäurederivate
in eine weitgehend von Ionen befreiten Lösung gebracht. Die Transformationseffizienz
der Elektroporation z. B. bei gram-positiven Bakterien kann bekanntermaßen dadurch
erhöht
werden, dass Substanzen, wie Glycinoder Tween 80, bei der Anzucht
der Zellen zugesetzt werden. Diese Substanzen bewirken eine „Schwächung" der Zellwand. Das bekannte
Elektroporationsverfahren hat jedoch folgende Nachteile: Zunächst ist
eine Optimierung der Parameter für
den Zelltyp, für
die Zell-Menge und für die
Art des einzuschleusenden Materials nötig. Auch ist die bekannte
Elektroporation an Säugerzelllinien und
primären
Zellen wegen der relativ geringen Effizienz nur begrenzt geeignet.
Schließlich
wird die DNS bei der Elektroporation zunächst in das Zytoplasma geschleust
und gelangt erst späterwährend der
Zellteilung in den Zellkern. Aus diesem Grund wird die Forschung
meist mit stark teilungsaktiven Zelllinien betrieben. Einzelne Zellen
sind mit der bekannten Elektroporation schwer zu transfizieren.
Bei
einem anderen Verfahren werden durch niedrige elektrische Impulse
relativ schwache (10–100
V/cm) elektrische Felder erzeugt und in speziell entwickelten spezifischen
Reagenzien über
Mikrokapillare auf die Zellen abgegeben (Oloffson et al. Current
Opinion in Biotchnology 2003, 14:29–34; Rae et al. Eur. J. Physiol
2002, 443:664–670; Nolkrantz
et al. Anal. Chem. 2001, 73 :4469–4477). Die Dauer der Elektroporation
beträgt
mehrere Sekunden. Allerdings müssen
die Impulse und die Reagenzien auf den jeweiligen Zelltyp optimiert
werden. Das Verfahren bewirkt, dass die DNS (Plasmid-DNS oder Oligonukleotide)
direkt in die einzelne Zelle gelangt. Da bei einem DNS-Transfer
in den Zellkern die Wirkung des transfizierten Materials in der
Regel von der Zellteilung abhängig
ist, sind auch unstimulierte, respektive nicht- oder langsam-proliferierende
Zellen, also auch Primärzellen,
dem Gentransfer unzugänglich.
Bei diesem Verfahren wird die Mikrokapillare durch eine nicht-kontaktierende
Manipulation direkt in die Nähe
der Zelle gebracht, wobei die Verwendung von 3D einstellbaren Mikrokapillaren
das Risiko des Zellentodes senkt. Um den Eingriff mit einer gewissen
Wahrscheinlichkeit zu überstehen, müssen die
Zellen trotz lokalisierter und nichtkontaktierender Elektroporation
räumlich
fixiert werden. Zudem müssen
sich die von der Mikrokapillare verursachten Öffnungen schließen, um
einen vollständigen
Zusammenbruch des Membranpotentials zu verhindern.
Ein
weiterer Nachteil ist, dass die Dimensionen solcher Kapillare noch
zu groß sind,
um einzelne Organellen eukaryotischer Zellen oder Mikroorganismen,
wie Bakterien, manipulieren zu können.
So wäre
eine Nanomanipulation an lebenden Prokaryoten und Eukaryoten nur
mit einer überaus
aufwendigen weiteren Miniaturisierung der Elektroden bis zu einer
Größe von wenigen
Nanometern möglich.
Aufgabe
der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Permeabilisierung zu schaffen,
das sich kostengünstig
und mit einfachen Mitteln umsetzen lässt und das bei einfacher Handhabung
eine schonende Transfektion oder Zellmanipulation mit hoher Effizienz
ermöglicht,
wobei das Verfahren sich auch im Falle kleiner biologischer Strukturen
einsetzen lässt.
Diese
Aufgabe wird durch das Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen
des Anspruch 1 gelöst.
Merkmale besonderer Ausführungsformen der
Erfindung sind in den Unteransprüchen
genannt.
Der
Grundgedanke der Erfindung liegt darin, sich nanoskaliger Werkzeuge,
hier verallgemeinernd als Nanokörper
bezeichnet, zu bedienen, diese in die Lösung zu geben und damit auf
die über
die Lösung zugängliche
Membran einzuwirken, um deren Permeabilität kurzzeitig zu erhöhen. Dabei
werden die Nanokörper über extern
erzeugte und an die Lösung angelegte
Feldkräfte
derart manipuliert, dass sie mit der Membran Wechselwirken und eine
Permeabilisierung hervorrufen. Damit ist die Transfektion oder die
Zell-Manipulation des ebenfalls nanoskaligen Fremdmaterials, z.B.
der fremden DNS, in die von der Membran umgebene Struktur, insbesondere
in die lebende Zelle, möglich.
Zusammenfassend
funktioniert das erfindungsgemäße Verfahren
so, dass in die Lösung
Nanokörper
eingebracht werden, wobei als Nanokörper solche Strukturen bezeichnet
werden, die einen Querschnitt im Bereich von einigen Nanometern,
insbesondere bis zu 20 Nanometern, haben. Sie können dabei eine wesentlich
größere Länge aufweisen.
Diese Nanokörper
sind innerhalb der Lösung
frei beweglich. Wenn die Nanokörper
sich in der Lösung
befinden, wird ein Feld erzeugt, das die Lösung durchdringt und das elektrisch
und/oder mechanisch auf die Nanokörper wirkt. Während das
Feld anliegt, wechselwirken die Nanokörper mit der Membran zumindest
kurzzeitig, wobei an den Stellen der Wechselwirkung lokale Permeabilitäten entstehen,
die für das
Fremdmaterial durchlässig
sind.
Besonders
vorteilhaft lässt
sich das erfindungsgemäße Verfahren
zur Transfektion einsetzen an Prokaryoten- und Eukaryotenzellen
sowie an Zellkompartimenten, wie Zellkernen, Mitochondrien, Chloroplasten.
Die Erfindung führt
dabei zur Erzeugung von Transmembran-(Nano)poren in der Zellhülle bei
gleichzeitigem Transport des Fremdmaterials durch die Membran. Die
erfindungsgemäße Technologie
ist damit im Prinzip eine neue Transfektionsmethode, bei der ein
physikalischer Vektor, insbesondere ein Nanoröhrchen oder ein Nanodraht (Nanonadel)
als Nanoinjektor den Gen-oder Partikeltransfer direkt in die Zellen
oder Zellkompartimente ermöglicht.
Damit können
erstmals auch sich nicht teilende Zellen mit einer hohen Effizienz
transfiziert werden.
Um
eine effektive und damit effiziente mechanische Wechselwirkung zwischen
Nanokörper und
der Membran gewährleisten
zu können,
ist es vorteilhaft, wenn die Nanokörper zumindest in dem für die Wechselwirkung
vorgesehenen Bereich eine im Vergleich zur Membran höhere mechanische
Stabilität
aufweisen. Mit solchen Nanokörpern
ist eine unmittelbare mechanische Perforierung möglich. Auf der anderen Seite
ist es im Hinblick auf eine effektive und damit effiziente elektrische
Wechselwirkung vorteilhaft, wenn Nanokörper gewählt werden, die durch das Anlegen
eines elektrischen und/oder magnetischen Feldes polarisiert werden.
Beide Voraussetzungen werden von Nanokörpern erfüllt, die anthropogen hergestellt
sind, die im wesentlichen aus Kohlenstoff und/oder einem Metall bestehen
und die die Form von Nanoröhrchen,
Nanonadeln oder Nanoglobuli haben. Dabei können mehrwandige Nanokörpern von
Vorteil sein.
Eine
besonders effektive Einwirkung auf die Membran lässt sich mit Nanoröhrchen („Nanotubes") oder Nanonadeln
durchführen,
die einen Außendurchmesser
zwischen 10 und 20 nm, einen Innendurchmesser zwischen 1 und 10
nm, einen Spitzendurchmesser zwischen 1 und 20 nm sowie eine Länge zwischen
10 und 5000 nm haben. Verfahren zur Herstellung solcher Nanokörper sind
bekannt. Die Nanokörper
haben eine Spitze, die entweder gut in die Membran eindringen kann
oder an der sich bei der Polarisation eine ausreichend hohe Feldstärke ausbildet,
um eine Permeabilität
in der Membran zu erzeugen. Erfindungsgemäß werden somit die Nanotubes
oder Nanonadeln als in Wasser dispergierbare Strukturen verwendet.
Im
Zusammenhang mit der Erfindung werden zwei Arten von externen Feldern
vorgeschlagen, mit denen auf die Nanokörper eingewirkt werden kann.
Dabei wird die Lösung
mit elektromagnetischer Strahlung, insbesondere mit Mikrowellen,
bestrahlt oder die Lösung
wird einer beschleunigenden Kraft, insbesondere einer Zentrifugalkraft,
ausgesetzt. Auch eine Kombination beider Arten externer Felder ist
möglich.
So
ist es im Hinblick auf eine Polarisation der Nanokörper vorteilhaft,
die Lösung,
insbesondere das mit der Lösung
gefüllte
Gefäß, mit elektromagnetischen
Wellen zu bestrahlen, wobei die in der Lösung befindlichen Nanokörper bevorzugt
im Frequenzbereich von Mikrowellen absorbieren. Eine derartige Bestrahlung
insbesondere mit Mikrowellen erzeugt Felder in der Lösung, die
eine Polarisation der Nanokörper
hervorrufen. Um die Zellen zu schonen ist es dabei besonders vorteilhaft,
wenn die Mikrowellenstrahlung in Pulsen appliziert wird und die Charakteristik
der Pulse so gewählt
wird, dass keine das biologische Material beeinträchtigende
Wärme in der
Lösung
erzeugt wird. Dieses erfindungsgemäße Verfahren kann als „minimalinvasive
Nanoelektroporation" bezeichnet
werden, die eine kontrollierte und insbesondere dreidimensional
gesteuerte Poration erlaubt Die Nanotubes oder Nanonadeln können als Injektionsvorrichtung
in der Art einer Nanokanüle
eingesetzt werden, die unter der Wirkung elektromagnetischer Felder
manipuliert werden. Die Verwendung von Nanoröhren als Nanokanülen stellt
eine Weiterentwicklung der „Nanoelektroporation" dar und basiert
auf der Kombination spezifischer elektrischer, mechanischer und
thermischer Eigenschaften der Nanoröhren sowie des zelltyp-spezifischen
Zeta Potentials.
Insbesondere
die durch Mikrowellen-Bestrahlung aktivierten Nanokörper sind
in der Lage, die Zellmembran und die Zellwand bakterieller Zellen und
pflanzlicher Zellen ungehindert zu durchdringen, ohne dabei die
Zellen zu beschädigen.
Wie angedeutet, können
hohle Nanoröhren
als Nanokapillaren Fremdmaterial, wie Biomoleküle oder Partikel, aufnehmen,
wobei das integrierte Fremdmaterial die Nanolektroporation nicht
nur in einer sauberen Umgebung ermöglicht, sondern, was noch wichtiger
ist, die Menge an injizierendes Material so verringert, dass eine
kostengünstige
und kontrollierte Elektroporation ausgeführt werden kann. Im Wechselfeld
und durch Wärme
gelangt das Fremdmaterial durch Kapillarkräfte wegen des Konzentrationsgradienten
ins Zellinnere. Dabei liegen weitere Vorteile in der nur lokalen
Erwärmung
der Materialien, der deutlichen Reduzierung der für die Poration
erforderlichen Zeit, sowie der Energieminimierung.
Mit
den die Nanokörper
polarisierenden Mikrowellen stellt sich die Erfindung im Prinzip
als Elektroporationsverfahren dar, das zum Einbringen nanoskaliger
Stoffe, wie Nukleinsäuren
(DNS, RNS) und rekombinanten Nukleinsäuren, sowohl in prokaryotische
als auch in eukaryotische Zellen besonders geeignet ist. Dabei kann
entweder eine Transformation von Prokaryoten oder eine Transfektion
(transient, stabil) von Eukaryoten durchgeführt werden oder es können Molekülen in Zytoplasma
und Zellkompartimente von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen
eingebracht werden.
Dabei
kann das hinter der Mikrowellenbestrahlung stehende Wirkprinzip
so erklärt
werden: Beim Eindringen hochfrequenter elektromagnetischer Strahlung
in Nanotubes und in biologisches Material findet eine Polarisation
auf atomarer und molekularer Ebene statt, wobei Dipole entstehen,
deren hochfrequente Bewegung zu innerer Reibung und damit zur Erwärmung führt. Das
wiederum bewirkt, dass die Nanotubes die Membranen der Zellen durchdringen.
Somit können
die Nanoröhren
ohne Beeinflussung durch Mikrowellen nicht die Zellen durchdringen.
Sie sammeln sich an der Zelloberfläche.
Der
Mechanismus, mit dem die Nanotubes den Transport des Fremdmaterials
in die Zelle bewirken, stellt sich folgendermaßen dar: Negativ geladene Kohlenstoff-Nanoröhren, mit
chemisch durch -COO Gruppen funktionalisierter Oberfläche, Wechselwirken
elektrostatisch mit Ladungen der Zellhülle, so dass Nanotubes als
physikalische Vektoren eine einzelne Zellen umgeben. Durch die Einstrahlung von
Mikrowellen geschieht eine Ladungsverteilung an der Oberfläche der
Nanotubes, die damit einen elektrischen Dipol bilden. Dabei werden
die positiven Ladungen des Dipols an der Zelloberfläche die
negativen Ladungen dagegen auf der Gegenseite angereichert. Diese
Orientierungspolarisation ermöglicht den
Nanoröhren
ein nanoskalige „Targeting" der Zelloberfläche bei
gleichzeitiger Transmembran-Diffusion (Porenbildung). Da die Mikrowellenimpulse
von kurzer Dauer, insbesondere zwischen 1 und 5 Sekunden, sind,
geraten die Wassermoleküle
kaum in Schwingung, so dass die Zelltemperatur nicht über 37°C ansteigt.
Wie
schon oben angedeutet, kann statt des Mikrowellenfeldes ein anderes
Feld auf die Nanokörper
einwirken, das eine Relativbewegung zwischen den Zellen und den
Nanokörpern
verursacht. Dazu wird die mit Nanokörpern versehene Lösung einer beschleunigenden
Kraft, insbesondere einer Zentrifugalkraft ausgesetzt, deren Feld
die in der Lösung befindlichen
Nanokörper
im Verhältnis
zu der Membran beschleunigt. Je nach Dichteunterschied werden die
Nanokörper
oder die Zellen stärker
von der Zentrifugalkraft getrieben. Letztendlich treffen die Spitzen
der Nanokörper
auf die Membran und durchstoßen
diese zumindest teilweise. Die so beschleunigten Nanokörper dringen
zumindest teilweise in die Membran ein und erzeugen somit Poren
zum Durchtritt von Fremdmaterial.
Beide
Arten der Manipulation der Nanokörper
können
auch gemeinsam oder ergänzend
eingesetzt werden. Zudem ist es möglich, die Nanokörper vor
der Bestrahlung unter Zuhilfenahme eines makroskopischen Mittels,
insbesondere eines Mikromanipulators, in die Nähe der Membran zu bringen.
Mit Hilfe eines Mikroskops und eines Mikromanipulators können ein
oder mehrere Nanotubes als befestigte Einheit an das gewünschte biologische
Target herangebracht werden, bevor sie mittels Mikrowellen oder mechanisch
in das Target einstechen.
Ein
Aspekt der Erfindung liegt auch an der Präparation der Nanokörper. So
können
daran Nukleinsäuren,
wie DNS oder RNS, chemisch gebunden sein. Es ist auch möglich, dass
die Nanokörper
Moleküle
oder Partikel in ihre nanoporöse
Struktur aufnehmen, wobei mittels der Mikrowellenbestrahlung ein thermischer
Effekt entsteht, der diese Moleküle
oder Partikel ins Zellinnere einschleust. Auch können Nanotubes Moleküle, wie
Zytostatika, Nukleinsäuren, Arzneimittel
oder „Quantum
dots", magnetische
Nanostrukturen, deren Durchmesser 1–10 nm beträgt, beinhalten.
Letztendlich
liegt der generelle Aspekt der Erfindung in der Idee, insbesondere
aus Kohlenstoff oder aus Metall, beispielsweise Gold, gefertigte
Nanoröhrchen,
Nanonadeln oder Nanoglobuli zur Erzeugung von Permeabilitäten in der
Membran einer biologischen Struktur, insbesondere einer Zellmembran,
zu verwenden.
Nachfolgend
wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispieles näher erklärt. Dabei
handelt es sich um die Transformation von Escherichia coli mit Plasmid
Puc 19 durch einen von Nanotubes unterstützten Transport von.
Wie
schon dargelegt wird der Vorgang der Einschleusung von Fremd-DNS
in die Bakterienzelle durch die Plasmamembran als Transformation
bezeichnet. Bei der von Nanotubes unterstützten Elektroporation werden
die Zellmembranen der in Suspension befindlichen Empfängerzellen
durch kurze Mikrowellenbestrahlung mit einzelnen Nanotubes vorübergehend
permeabilisiert. Dabei entspricht der Durchmesser der einzelnen
Permeabilisation-Stellen der Breite der Köpfe, etwa 10–20 nm,
einzelner Nanotubes.
Die
Zellen werden dabei zusammen mit der DNS und den Nanotubes in einem
Nährmedium
oder einer Pufferlösung
aufgenommen. Dann wird die Probe in ein Gefäß überführt, das Mikrowellen ungehindert
durchläßt. Anschließend wird
die Probe in ein Mikrowellengerät
gebracht und ein zelltypspezifisches Zeitprogramm ausgeführt. Danach
werden die Zellen ausplattiert oder wieder in Kultur gegeben, sie
können
in der Regel nach 12 bis 24 Stunden analysiert werden.
E.
coli (DH5a) werden über
Nacht in Luria-Bertani (LB) Medium kultiviert. Anschließend werden
die Zellen in frischem LB-Medium 1/100 verdünnt und bis zur logarithmischen
Wachstumsphase kultiviert. Von der so entstandenen Zelllösung werden 100 μl für die Transformation
eingesetzt. Dann werden 5 μl
Plasmid-DNS Puc 19 mit einer Konzentration von 1 ng/μl auf den
Boden eines auf Eis vorgekühlten Gefäßes für die Transformation
aufgebracht und mit 100 μl
der zwischenzeitlich aufgetauten Bakteriensuspension vermischt.
Anschließend
werden 10 μl mehrwandiger
Kohlenstoffnanoröhren
zugegeben. Die Transformation wird mit einem Mikrowellengerät mit 1000
W und einer Magnetron-Frequenz
von 2,45 GHz unterstützt.
Dabei wurden folgende Parameter eingestellt:
Die sich beim
Transformationsvorgang einstellende Zeitkonstante sollte im Bereich
von 1 s bis 4 s liegen. Unmittelbar nach der Transformation werden
die Bakterien mit 1 ml LB Medium versetzt und in ein steriles 1,5
ml-Reaktionsgefäß überführt. Es
folgt eine einstündige
Inkubation dieser Suspension bei 37 °C im Thermomixer. Anschließend werden
von dieser Suspension 10 μl,
50 μl und
100 μl auf
je einer Petrischale mit LB-Selektionsagar ausgestrichen. Der Selektionsagar
enthielt in Abhängigkeit
von Puc 19 250 μl
Ampicillin (200 mg/ml), X-Gal (5-chloro-4-bromo-3-indolyl-β-D-galactopyranosid,
200 mg/ml in DMF) und 50 μl
IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid,
1 M).
Die
Petrischalen mit den ausplattierten E. colis werden über Nacht
bei 37 °C
im Brutraum inkubiert. Eine blaue Kolonie zeigt an, dass die Bakterien auf
dem Selektionsagar wachsen konnten und das Plasmid Puc 19 enthalten.
Von den Transformanten konnte ebenfalls Plasmid-DNS Puc 19 isoliert
werden. Die Ergebnisse der Elektrophorese geben einen Hinweis darauf,
welche Proben sich nach der Elektroporation aufgrund ihrer Konzentration
an Nanotubes am besten für
die Transformation eignen würden.
Zur Kontrolle wurden ebenfalls analog zu Protokol 1 behandelte E.
coli Zellen ohne Zugabe an Nanoröhren ausplattiert.
Alle Versuche lieferten negative Ergebnisse.