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Die
Erfindung betrifft eine Reaktionskammer zum Prozessieren, insbesondere
Hybridisieren und Immobilisieren, von biologischen Proben, insbesondere
solchen auf Mikroarrays und Objektträgern für zellbiologische Anwendungen.
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In
zunehmendem Maße
werden Mikroarrays für
Analysen im Bereich der Medizin oder Lebensmittelanalyse eingesetzt.
Unter Mikroarrays sind Objektträger
aus verschieden Substraten wie z.B. Glas oder Kunststoffe zu verstehen,
auf denen Spots von DNA oder RNA – Oligonukleotiden, Enzymen,
Proteinen usw. immobilisiert werden können. Die Spots sind in einem
zweidimensionalen Gitter auf dem Substrat angeordnet und in der
Regel immobilisiert. Anschließend
wird der Mikroarray hybridisiert, d.h. es werden biologische Proben,
die häufig
mit Fluoreszenzmarkern markiert sind, auf dem Mikroarray aufgebracht und
Reaktionsbedingungen erzeugt, die das Binden der Proben an die Spots
auf dem Array unterstützen.
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Mikroarrays
haben sich in der Forschung als erfolgreiches Werkzeug etabliert.
Zum Hybridisieren der Arrays sind mehrere Vorrichtungen und Verfahrensweisen
bekannt. Eine Methode ist, ein Deckglas nach dem Aufbringen der
biologischen Probe auf den Mikroarray aufzulegen. Dadurch wird die
Probenlösung
auf dem Mikroarray verteilt. Außerdem
verteilt sich die Probenlösung
aufgrund von Kapillarkräften gut
unter dem Deckglas. Nachteilig wirken sich bei solchen Ausführungen
die starke Haftung des Deckglases am Mikroarray, der mögliche Einschluss
von Luftblasen und die geringe Reproduzierbarkeit aus.
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Zur
Vermeidung dieses Nachteils werden nach dem Stand der Technik sogenannte
Hybridisierungskammern eingesetzt, bei denen Mikro-Arrays in die Kammer
eingelegt sind, die mit einem Reaktanden überschichtet und anschließend mit
einem Deckel verschlossen werden.
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Vorliegender
Erfindung am nächsten
kommt dabei ein in
DE
203 01 279 U1 beschriebenes Reaktionsgefäß. Bei der
dort beschriebenen Hybridisierungskammer handelt es sich um einen Reaktionsbehälter für zwei oder
mehr Mikroarrays. Die Reaktionsräume
sind dabei mittels Gummidichtung und klarsichtigen Deckel nach außen abgedichtet.
Der Deckel wird nach dieser Lösung
mit einer Deckelpresseinrichtung (Schraube mit Anpresskreuz) auf
den Reaktionsbehälter
aufgedrückt.
Zum kraftlosen Lösen des
Deckels kommt dort ein Federmechanismus zum Einsatz, der eine gewisse
Störanfälligkeit
aufweist und vor allem hinderlich bei Reinigungsschritten ist.
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Ähnliche
Hybridisierungskammern wie vorstehend beschrieben, werden auch für ein oder
mehrere Mikroarrays von Unternehmen wie z.B. Scienion AG, TeleChem
International, Inc. angeboten. Auch dort wird die Kammer durch einen
Boden und einen Deckel ausgebildet. Im Boden ist eine Aufnahme für das Mikroarray
vorgesehen. Weiterhin wird der Boden von einer Gummidichtung umfasst,
welche den gesamten Array umgibt. Der Deckel wird auf den Dichtungsring
aufgesetzt und z.B. mittels vier Schrauben an dem Boden befestigt.
Dadurch bildet sich zwischen Deckel, Dichtung und Boden eine luftdicht
abgeschlossene Kammer aus, in der sich die Mikroarrays befinden.
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Zur
Durchführung
einer Hybridisierungsreaktion werden die vorstehend beschriebenen
Hybridisierungskammern in ein temperiertes Tauchbad gelegt. Der
Temperaturbereich liegt je nach angewandeten Protokoll zwischen
10° C und
100° C.
Durch die Temperierung entsteht in den Kammern bei Abkühlung ein
Unterdruck. Dieser hält
den Deckel auch nach dem Lösen
aller Befestigungen fest mit dem Boden verbunden. Zum Lösen des
Deckels muss eine angemessene Kraft zum seitlichen Abziehen oder eine
größere Kraft
zum Abheben des Deckels aufgebracht werden. Dadurch kommt es oft
zum Vergießen der
enthaltenen Flüssigkeit.
Des Weiteren kann es durch seitliches Abziehen zur Verletzung der
Dichtung kommen. Die darüber
hinaus notwendige Kraft zum Öffnen
des Deckels ist für
den Anwender hinderlich. Durch ihre Bauweise sind diese Kammern
in ihrer Höhe
begrenzt und können
nur mit Objekten bis zu einer maximalen Höhe von 5 mm bestückt werden.
Ein weiterer Nachteil ist die geringe Anzahl der gleichzeitig prozessierbaren
Mikroarrays, Mikrotiterplatten oder Objektträger für zellbiologische oder Mikroarray-Anwendungen.
Ferner werden die Mikroarrays und die Objektträger nicht fest auf den Boden der
Kammer gedrückt,
so dass Wärmebrücken entstehen
können.
Diese Art der Vorrichtungskonzeption gewährleistet weiterhin nicht die
Möglichkeit
der Durchmischung der biologischen Probe auf dem Array. Dadurch
sind geringere Signalstärken
bei der Auswertung der einzelnen Experimente zu erwarten. All die
bekannten Vorrichtungen für
den speziellen Verwendungszweck sind eher für einen kleineren Labormaßstab und
Handversuche konzipiert. Die vorstehend aufgezeigten Nachteile wurden
teilweise mit
DE 20 2004
009 793.1 gelöst.
In der dort beschriebenen Reaktionskammer können gleichzeitig mehrere Mikroarrays
oder Objektträger
für zellbiologische
Anwendungen prozessiert werden. Zwischen Reaktionskammer und Deckel
ist eine Dichtung angebracht. Durch geeignete Verschlussmittel,
z.B. Schrauben werden der Deckel und die Reaktionskammer miteinander
verbunden. So entsteht ein abgeschlossener Reaktionsraum, der den
Inhalt vor Einflüssen
von außen
schützt.
Zum kraft- und materialschonenden Öffnen sind im dortigen Vorschlag
in den Rahmen der Reaktionskammer und in dem Deckel magnetische
Baugruppen eingelassen, die so angebracht sind, dass ihre Kräfte entgegengesetzt wirken.
Unter der Reaktionskammer sind Füße aus magnetischem
Material so angebracht, dass sie auf handelsübliche Schüttler mit einer Adaption im
Mikrotiterplatten-Format aufgestellt werden kann. Dadurch kann eine
gleichmäßigere Verteilung
der Probe auf den Mikroarray gewährleistet
werden. Dies führt
zu einer höheren
Bindungsanzahl auf dem Array.
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Die
meisten Hybridisierungsreaktionen erreichen ihre optimalen Ergebnisse
nur durch eine direkte, schnelle und genaue Temperaturregelung,
d.h. dass je nach durchgeführtem
Hybridisierungsschritt bestimmte Temperaturen gewährleistet
werden sollten. Eine direkte, schnelle und genaue Temperaturregelung
kann nicht durch ein Temperierbad oder einen Thermoschrank erzeugt
werden. Ein weiterer Nachteil bekannter Reaktionskammern ist, dass
zur Aufnahme von Mikroarrays oder Objektträgern für zellbiologische Anwendungen
eine zusätzliche
Halterung benötigt
wird. Diese Art von Vorrichtung gewährleistet zudem nicht den Einsatz
auf handelsüblichen
Roboterstationen. Hierfür
sind Außenabmessungen der Reaktionskammer
im Mikrotiterplatten-Format notwendig. Hinderlich wird vom Anwender
bei den meisten bekannten Reaktionskammern, die Anzahl der zum Verschließen benötigten Verschlusselemente angesehen.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, eine Reaktionskammer zum Prozessieren von
biologischen Proben zu schaffen, die durch den Einsatz handelsüblicher
Geräte
zur Prozessierung von Mikrotiterplatten, wie z.B. Thermo-Schüttler, eine
direkte Temperierung und gleichzeitig eine aktive Durchmischung
der eingelegten Objekte ermöglicht.
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Diese
Aufgabe wird mit einer Reaktionskammer mit den Merkmalen des Anspruches
1 gelöst. Vorteilhafte
Weiterbildungen sind durch die Unteransprüche erfasst.
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Eine
Reaktionskammer gemäß vorliegender Erfindung
ist derart ausgebildet, dass in den im wesentlichen plan ausgebildeten
Bodenbereich des Reaktionsbehälters
zumindest im Bereich zwischen den Längsseiten zweier benachbart
und beabstandet angeordneter Objektträger magnetische oder magnetisierbare
Baugruppen eingebracht sind und diesen zugeordnet, lose aufsetzbar
und zumindest einseitig konisch ausgeführte magnetisierbare oder magnetische
Distanz- und Anpressstücke
vorgesehen sind, wobei wenigstens eine der genannten, einander zugeordneten
Baugruppen dauermagnetische Eigenschaften aufweist. In einen solcher
Art ausgebildeten Reaktionsraum können mehrere Objektträger und/oder
Mikroarrays eingelegt werden, wobei alle Objektträger in direktem
thermischen Kontakt zu dem temperierbaren Reaktionskammerboden liegen.
Die Außenabmaße der Reaktionskammer
entsprechen dabei bevorzugt dem Abmaß einer Mikrotiterplatte. Im
Bodenbereich des Reaktionsraumes ist weiterhin zumindest eine Vertiefung
als Reservoir zur Aufnahme von Flüssigkeiten eingelassen. Die
Art der vorgeschlagenen Distanz- und Anpressstücke gewährleistet dabei zugleich eine
sichere Halterung der Objektträger
während
der Handhabung selbst auch auf Schütteltischen, die Schaffung
eines engen thermischen Kontakts der Objektträger zu dem wärmeleitfähigen und
durch nicht näher
beschriebene Mittel von außen
temperierbaren Reaktionskammerboden und zugleich eine erheblich
benutzerfreundlichere Handhabung beim Einlegen und Entnehmen der
Objektträger
in die und aus der Reaktionskammer als bei vergleichbaren Vorrichtungen
nach dem Stand der Technik. In besonders bevorzugter Ausbildung
der Erfindung sind die magnetisierbaren oder magnetischen Distanz-
und Anpressstücke
als Kugeln ausgeführt,
die sich problemlos ohne Vororientierung über den korrespondierenden
magnetischen oder magnetisierbaren Baugruppen ausrichten lassen.
In weiterer Ausbildung der Erfindung sind die magnetischen oder
magnetisierbaren Baugruppen solcher Art in den Reaktionskammerboden
eingebracht, dass zum im wesentlichen planen Reaktionskammerbodenniveau
eine Vertiefung gebildet ist. Im Zusammenwirken mit den aufgesetzten
Kugeln sind dadurch variierende Dickenunterscheide und unterschiedliche
Breiten der eingesetzten Objektträger in größeren Grenzen problemlos ausgleichbar,
so dass die vorgeschlagene Kammerausbildung den meisten z.Z. verfügbaren unterschiedlichen "Normungen" von Objektträgern zugänglich ist,
was einen erheblichen Vorteil der Erfindung darstellt.
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In
weiterer Ausbildung der Erfindung können unter der Reaktionskammer
weiterhin Füße, bevorzugt
aus magnetischen Materialien angebracht werden. Diese sind so angebracht,
dass die Reaktionskammer auf handelsübliche Geräte mit gegenpoligen Magneten,
wie z.B. Thermoschüttler,
aufgestellt und über
die wirkende Magnetkraft fest mit dem Gerät verbunden werden kann. Durch
diese Verbindung wird ein guter Wärmeübergang zwischen Reaktionskammer
und dem Prozessiergerät
gewährleistet.
Damit besteht die Möglichkeit
der aktiven und direkten Temperaturregulierung, wodurch es zu einer
Erhöhung
der Bindungsanzahl zwischen Probe und aufgetragenen Spots kommt.
Des Weiteren sind anwenderunfreundliche Schraubverbindungen zwischen Prozessiergeräten, wie
z.B. Schüttler,
und Kammer nicht notwendig. Weiterhin wirkt sich das Schütteln des
Reaktionsbehälters
vorteilig auf das gleichmäßige Verteilen
der biologischen Probe auf dem Mikroarray aus. Dies führt ebenfalls
zu einer höheren
Bindungsanzahl auf dem Array.
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Die
Erfindung wird beispielhaft an Hand nachstehender schematischer
Zeichnungen näher erläutert. Es
zeigen:
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1 eine
perspektivische Ansicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Reaktionskammer;
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2 eine
Draufsicht auf eine Reaktionskammer nach 1;
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3 eine
perspektivische Ansicht der Unterseite einer erfindungsgemäßen Reaktionskammer und
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4 eine
perspektivische Ansicht der Unterseite eines zur Reaktionskammer
zugehörigen Deckels.
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1 zeigt
eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Reaktionskammer
mit einem Reaktionsbehälter 1 mit zwei
beispielhaft eingelegten Objektträgern 3 und, zwecks
Verdeutlichung des Kammerinnenaufbaus, zwei weiteren Kammerbereichen
ohne eingelegte Objektträger.
Die Außenabmaße des Reaktionsbehälters 1 sind
so bemessen, dass sie dem Format einer Mikrotiterplatte nach ANSI/SBS
01-2004 entsprechen. Dadurch ist, im Gegensatz zu bekannten Kammern,
bspw. eine aktive Durchmischung mittels handelsüblicher Schüttler für Mikrotiterplatten und somit eine
gleichmäßigere Bindung
der Proben auf dem Mikroarray gewährleistet.
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Die
erfindungsgemäße Reaktionskammer umfasst
einen Reaktionsraum 2. Der Reaktionsraum 2 ist
dabei so dimensioniert, dass er die Aufnahme von mindestens zwei
Objektträger 3 und/oder
Mikroarrays gewährleistet.
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Im
Beispiel ist die Art der Arretierung und Anpressung der Objektträger in 1 verdeutlicht. Dazu
sind im Beispiel in den Kammerboden 13 Vertiefungen 10 vorgesehen,
in die im Beispiel zylinderförmige
Dauermagnete 12 mit einer Magnetisierung von 1300 mT [Millitesla]
eingebracht sind. Über
die Längserstreckung
eines Objektträgers 3 sollten
dabei wenigstens zwei solcher Dauermagnete 12 im Bereich
zwischen zwei aneinander grenzenden Objektträgern 3 vorgesehen
sein. Wie im Weiteren beschrieben wird, sollten diese Dauermagnete
so ausgeführt
und eingebracht sein, dass bis zum im wesentlichen planen Reaktionskammerbodenniveau 13 jeweils
eine weitere Vertiefung verbleibt. Zweckmäßiger Weise sollte diese weitere
Vertiefung als gesonderte Ausnehmung in den Kammerboden so eingebracht
sein, dass über
dem eingebrachten Dauermagneten 12 Material des Kammerbodens
verbleibt. Es liegt aber selbstverständlich auch im Rahmen der Erfindung,
genannte Vertiefung als durchgehende Bohrung auszubilden, wobei
die Vertiefung durch die dem Kammerboden zugewandte Seite des Dauermagneten
bodenseitig abgeschlossen ist. Diesen Dauermagneten 12 zugeordnet
sind lose aufsetzbare und zumindest einseitig konisch ausgeführte magnetisierbare
oder magnetische Distanz- und Anpressstücke 4, die im Beispiel
vorteilhaft als Kugeln ausgeführt
sind. Weiterhin ist zwischen zwei aneinander grenzenden Objektträgern 3 wenigstens
ein Anschlag 8 vorgesehen. Im Beispiel sind die Anschläge 8 als
in den Kammerboden eingebrachte Stifte ausgebildet. Zur weiteren
Vereinfachung der Beschickungs- und Entnahmevorgänge mit Objektträgern 3 ist
im Rahmen der Erfindung [im Beispiel an den sich gegenüberstehenden
Querseiten des Reaktionsbehälters 1] jeweils
eine Fase 6, die mehrstückig, durchbrochen
oder, wie im Beispiel über
eine gewisse Längserstreckung
durchgehend ausgeführt
sein kann, vorgesehen, deren Neigung in Richtung Kammerboden verjüngend derart
ausgebildet ist, dass sie die im Beispiel außen liegenden Objektträger 3 unterschiedlicher
Dicke einseitig klemmend aufzunehmen gestattet. Obwohl konstruktiv
aufwendiger als im Beispiel dargestellt, liegt es im Rahmen der
Erfindung, derartige Fasen auch innerhalb der Kammer und ggf. als
Modifizierung der Anschläge 8 vorzusehen.
Für die
meisten der vorgesehenen Einsatzfälle ist es weiterhin erforderlich
wenigstens ein Flüssigkeitsreservoir
innerhalb des Reaktionsbehälters
vorzusehen. Im Beispiel sind mehrere solcher Reservoirvertiefungen 7 vorgesehen,
die derart in den Kammerboden 13 zwischen zwei Objektträgern 3 eingebracht
sind, dass sie die Objektträger
nicht wesentlich unterschneiden und die Objektträger 3 somit im Wesentlichen
ganzflächig
in engem thermischen Kontakt zum Reaktionskammerboden 13 anordenbar
sind. Auch diese Vertiefungen 7 können zur Vereinfachung bei der
Entnahme der Objektträger
mittels geeigneten Laborgeräten,
wie z.B. Pinzetten, dienen.
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2 zeigt
eine Draufsicht auf eine Reaktionskammer nach 1,
wobei die in 1 beispielhaft angedeuteten
Objektträger
nicht dargestellt sind. Die Lage der eingebrachten Bohrungen und
in Richtung des Kammerbodens 13 verbleibenden Vertiefungen 10 ist
in dieser Figur deutlicher erkennbar. Pro Längserstreckungsrichtung der
nicht dargestellten Objektträger
sind vier solcher mit im Beispiel mit Dauermagneten versehenen Vertiefungen 10 vorgesehen,
wobei die am Rand liegenden Objektträger einseitig von genannter
Fase 6 erfassbar sind. Die Objektträger 3 werden in die
Reaktionskammer 2 einfach eingelegt, wozu zur lateralen
Grobausrichtung und Vermeidung von seitlichen Berührungen
die Anschläge 8 dienen.
Zusätzlich
sind Eingriffmulden 11 vorgesehen, die das Einlegen und
die Entnahme der Objektträger
erleichtern. Es liegt im Rahmen der Erfindung auch diese Eingriffmulden
so wie die Vertiefungen 10 auszubilden und mit magnetischen
oder magnetisierbaren Baugruppen 12 zu versehen, so dass
auch diesen Anpress- und Distanzstücke 4 (hier nicht
dargestellt) zuordenbar sind. Gleiches gilt für die im Beispiel vorgesehenen
Ausnehmungen in den Eckbereichen 14 der Kammer, die im
Beispiel als Einstiche ausgeführt
sind.
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Nachdem
alle Objektträger 3 in
die Kammer eingelegt sind, werden die Distanz- und Anpressstücke 4 über den
Objektträgern
im Bereich der Vertiefungen 10 abgelegt und bewirken durch
die geschaffene magnetische Anziehung eine Ausrichtung und Fixierung
der Objektträger 3.
Durch die ausgeübte Anpresskraft
ist ein guter Wärmeübergang
zwischen dem Reaktionsbehälterboden 13 und
den Objektträgern 3 gewährleistet.
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3 stellt
die Unterseite der erfindungsgemäßen Reaktionskammer 1 in
perspektivische Ansicht dar. Die Lage der in drei Reihen eingebrachten magnetischen
oder magnetisierbaren Baugruppen 12 zur Halterung von vier
Objektträgern
ist ersichtlich. In dieser Figur ist weiterhin verdeutlicht, dass
die Bodenunterseite des Reaktionsbehälters 1 mit magnetisierbaren
oder magnetischen Bereichen versehen ist, die im Beispiel als erhabene
und wahlweise lösbare
Füße 5 in
den Eckbereichen ausgebildet sind. Als Füße 5 können beispielsweise
geeignete Dauermagnete ebenfalls mit einer Magnetisierung von 1300
mT eingesetzt werden. Diese sind so angebracht, dass sie auf geeignete
Geräte,
wie z.B. Thermoschüttler,
mit magnetisierbaren Materialien eine Verbindung herstellen. Dadurch
wird eine kraftschlüssige
Verbindung zwischen in solchen Geräten integrierten Heizplatten
und der Reaktionskammer gewährleistet
und somit der Wärmeübergang
optimal gestaltet.
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Zusätzlich zu
den vorstehend beschriebenen Baugruppen ist in 3 angedeutet,
dass in den Rahmenbereich der Reaktionskammer noch Gewindebohrungen 9 zur
Aufnahme von im Deckel 20 (vgl. 4) vorgesehener
Verschlussmittel, im Beispiel Schrauben 21, vorgesehen
sind, wozu hier nur zwei Schrauben erforderlich sind.
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Weiterhin
sind im Rahmenbereich weitere magnetische Baugruppen 12' eingebracht,
die korrespondierend zu zweiten magnetischen Baugruppen 212,
die ebenfalls bündig
oder leicht hintersetzt mit der dem Reaktionsbehälter 1 zugewandten
Deckelseite abschließen
derart eingebracht sind, dass diese zu den zweiten magnetischen
Baugruppen 212 des Deckels eine entgegengesetzte Magnetisierung
aufweisen, was der leichteren Trennbarkeit von Deckel und Reaktionskammer
nach Ende des Prozesses dient.
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Schließlich ist
im Beispiel nach 4 ersichtlich, dass auf den
beiden Querseiten des Deckels 20 jeweils magnetisierte
oder magnetische Elemente 212, beispielsweise Dauermagnete,
eingebracht sind. Diese Magnete 212 korrespondieren in ihrer
Lage mit den in den Wandungen des Reaktionsbehälters 1 eingebrachten
Magneten 12' (vgl. 3), weisen
jedoch eine zu diesen entgegengesetzte Polarisierung auf. Für die Magnete
im Deckel 20 haben sich vernickelte Neodymium-Eisen-Bor-Magnete mit einem
Durchmesser von jeweils 4 mm und einer Höhe von 12,5 mm und einer Magnetisierung
von 1300 mT und für
die Magnete 12' in
den Kammerwandungen solche mit einem Durchmesser von jeweils 4 mm
und einer Höhe
von 4 mm und einer ebensolchen Magnetisierung als vorteilhaft erwiesen. Ein
solche Ausführung
garantiert ein problemloses Öffnen
der Reaktionskammer bei Unterdruck nach Durchführung des Experiments bei einer
Kammergröße in der
Größenordnung
von 90·130
mm durch Abstoßung
des Deckels. Andere Kammergrößen erfordern
mehr oder weniger Magnete oder andere Geometrien der Magnete oder
ggf. das Vorsehen von Jochen.
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In
die Unterkante des Deckels 20 ist vorteilhaft eine umlaufende
Dichtung 23 eingesetzt. Durch die Dichtung 23 wird
in Verbindung mit dem Reaktionsbehälter 1 (vgl. 2)
der Reaktionsraum 2 abgedichtet, wenn Verschlussmittel,
bevorzugt in Form von durch den Deckel 20 durch Gewindebohrungen 24 in
Gewindebohrungen 9 der Kammerwandung eingreifende Schrauben 21 eingebracht
werden. Im Rahmen der Erfindung ist es weiterhin vorteilhaft, die gegenüberliegenden
Längsseiten
der Außenwandungen
des Deckels 20 mit Griffstücken 22, insbesondere
in Form von Griffmulden zu versehen.
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- 1
- Reaktionsbehälter
- 2
- Reaktionsraum
- 3
- Objektträger
- 4
- Distanz-
und Anpressstücke
- 5
- Füße
- 6
- Fasen
- 7
- Reservoirvertiefungen
- 8
- Anschlag
(Stifte)
- 9
- Gewindebohrungen
- 10
- Vertiefungen
- 11
- Eingriffmulden
- 12
- erste
Dauermagnete
- 12'
- Magnete
- 13
- Bodenbereich
des Reaktionsbehälters
- 14
- Eckbereiche
der Reaktionskammer
- 212
- Dauermagnete
- 20
- Deckel
- 21
- Verschlussmittel
(Schrauben)
- 22
- Griffstück (-mulde)
- 23
- Dichtung
- 24
- Gewindebohrungen