DE102004026903A1

DE102004026903A1 - Verfahren zur Bestimmung von Lipoproteinen in Körperflüssigkeiten und Messanordnung dafür

Info

Publication number: DE102004026903A1
Application number: DE102004026903A
Authority: DE
Inventors: Fritz Dr. Huber; Hans Robert Prof. Dr. Kalbitzer; Werner Dr. Kremer
Original assignee: Universitaet Regensburg
Current assignee: Numares AG
Priority date: 2004-06-01
Filing date: 2004-06-01
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2024-06-02
Also published as: AU2005250571A1; WO2005119285A1; PL1774356T3; DE102004026903B4; EP1774356A1; CA2568705A1; CA2568705C; EP1774356B1; US7927878B2; AU2005250571B2; ES2529040T3; US20080038829A1

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentrations- und Größenverteilung von Lipoproteinklassen in Körperflüssigkeiten, z. B. Blut. Hierzu werden NMR-Spektren einer zu analysierenden Probe bei verschiedenen diffusionsgewichteten Messbedingungen, ausgewählt nach verschiedenen Pulsprogrammen (z. B. PFG-STE, PFG-LED etc.) und damit differenziert nach den Relaxationszeiten durch Magnetfeld-Gradientenstärken und Temperaturen, gemessen. Die unterschiedlichen Auswirkungen dieser Messbedingungen auf die Intensität/Linienform der NMR-Signale der einzelnen Lipoproteinklassen wird ermittelt und erlaubt die Bestimmung einer Konzentrations-/Größenverteilung der einzelnen Lipoproteinklassen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Dichte und Größenverteilungen von Lipoproteinen in Körperflüssigkeiten, sowie eine Messanordnung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Arteriosklerose, die unter anderem auf Cholesterinablagerungen in den arteriellen Gefäßwänden zurückgeht, ist eine der häufigsten Todesursachen in den westlichen Industrienationen. Je nachdem wo die Ablagerungen auftreten, kann es zu Durchblutungsstörungen im Gehirn (Schlaganfall), Durchblutungsstörungen im Herzen (koronare Herzerkrankung, Herzinfarkt) und arteriellen Verschlusskrankheiten in den peripheren Arterien kommen. Untersuchungen haben gezeigt, dass das Risiko an Arteriosklerose zu erkranken, mit dem Anteil des im Blut vorliegenden Cholesterins korrespondiert. Dieses Cholesterin liegt dabei in Form von Lipoproteinpartikeln vor, die Lipide, z.B. Cholesterin zusammen mit Proteinen enthalten. Diese Lipoproteine bewirken den Transport der wasserunlöslichen Lipide im Blut. Lipoproteine lassen sich unter anderem anhand ihrer Dichte, Lipidkomponenten und Apolipoproteine in verschiedene Lipoproteinklassen einteilen. Das Risiko, an Arteriosklerose zu erkranken, korreliert dabei anscheinend mit einem hohen Spiegel an LDL (Low Density Lipoprotein)-Cholesterin. Im Gegensatz dazu scheint Cholesterin in HDL-Partikeln (High Density Lipoprotein) zur Entfernung von arteriosklerotischen Plaques in arteriellen Gefäßwänden beizutragen. Weitere Untersuchungen deuten daraufhin, dass bestimmte Größen- und Dichteverteilungen innerhalb von Lipoproteinklassen ein guter Indikator für die Früherkennung von Herzkreislauferkrankungen und dem Risiko, an Arteriosklerose zu erkranken, sind (Kuller et al., (2002), Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy of lipoproteins and risk of coronary heart disease in the cardiovascular health study, Aterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22, 1175-1180; Blake et al., (2002), Low-density lipoprotein particle concentration and size as determined by nuclear megnetic resonance spectroscopy as predictors of cardiovascular disease in women, Circulation 106, 1930-1937; Rosenson et al., (2002), Relations of lipoprotein subclass levels and low-density lipoprotein size to progression of coronary artery disease in the pravastatin limitation of artherosclerosis in the coronary arteries (PLAC-I Trial), Am. J. Cardiol. 90, 89-94; Rosenson et al., (2002), Effects of pravastatin treatment on lipoprotein subclass profiles and particle size in the PLAC-I trial, Atherosclerosis 160, 41-48). Deshalb werden zur Früherkennung von Herzkreislauferkranken zahlreiche Lipoprotein-Bestimmungen im Blut durchgeführt. Es wird davon ausgegangen, dass bis zu 60-80% der labordiagnostischen Blutuntersuchungen zumindest als Teilaspekt eine Lipoproteinbestimmung zum Gegenstand haben.

Aus der EP 0 361 214 B1 ist ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von vier Lipoproteinen in einer Blutplasmaprobe mittels NMR-Messungen bekannt. Bei diesem Verfahren wird die Linienkontur eines zu analysierenden NMR-Spektrums einer Plasmaprobe mittels einer gewichteten linearen Kombination der vier Lipoprotein-Bezugsspektren angeglichen. Durch Verfeinerung der Gewichtungskoeffizienten der einzelnen Bezugsspektren können dann die Konzentrationen der vier Lipoproteinbestandteile berechnet werden. Bei diesem Verfahren können allerdings keine Größen- und Dichteverteilungen innerhalb einer Lipoproteinklasse ermittelt werden.

Im Review-Artikel „Nuclear magnetic resonance chromatography: applications of pulse field gradient diffusion NMR to mixture analysis and ligand-receptor interaction", Journal of chromatography B; 725 (1999), Seiten 79-90 wird ein aufwändiges Verfahren zur Untersuchung von Protein-Liganden Wechselwirkungen offenbart, bei dem neben der Puls-Feld-Gradienten-NMR auch eigens für die NMR-Spektroskopie ¹³C/¹⁵N-markierte Proteine verwendet werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung, insbesondere Klassifizierung und Quantifizierung von Lipoproteinen in Körperflüssigkeiten sowie eine Messanordnung zur Durchführung dieses Verfahrens anzugeben, die bezüglich der oben genannten Nachteile verbessert sind.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sowie eine Messanordnung zur Durchführung des Verfahrens sind Gegenstand weiterer Ansprüche.

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung, insbesondere Klassifizierung und Quantifizierung von Lipoproteinen in Körperflüssigkeiten. Dabei werden erfindungsgemäß NMR-Spektren einer Probe der zu analysierenden Körperflüssigkeit bei verschiedenen Messbedingungen gemessen. Die verschiedenen Messbedingungen sind dabei so ausgewählt, dass sie die Trennung der sich überlagernden inhomogenen NMR-Resonanzlinien verschiedener Lipoproteinklassen ermöglichen. Mittels Variation der Messbedingungen lässt sich dabei eine diffusionsgewichtete ein- und mehrdimensionale magnetische Kernresonanz-Spektroskopie (NMR) mit gepulsten Magnetfeldgradienten verwirklichen. Diese verschiedenen Messbedingungen sind ausge wählt aus verschiedenen Magnetfeldgradienten und variierenden Temperaturen. Dabei werden mehrere NMR-Spektren für z.B. eine Plasma- oder Serumprobe jeweils bei verschiedenen Magnetfeldgradienten und/oder verschiedenen Temperaturen aufgenommen. Die unterschiedlichen Auswirkungen der verschiedenen Magnetfeldgradienten und verschiedenen Temperaturen auf die Signalform, z.B. die Intensität und/oder Linienbreite der NMR-Signale der einzelnen Lipoproteinklassen werden anschließend ermittelt und den einzelnen Lipoproteinklassen aufgrund der unterschiedlichen Auswirkungen eine bestimmte Dichte- und Größenverteilung zugeordnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann durch die Variation von anderen Parametern wie Probenzusammensetzung (Lösungsmittel, chemische Modifikationen) unterstützt werden. Dabei werden in der Regel mehrere NMR-Spektren unter verschiedenen Bedingungen aufgenommen und gemeinsam analysiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann dabei zur Analyse von verschiedensten Proben aus Körperflüssigkeiten, z. B. Blutplasma- und Blutserumproben jeder beliebigen Herkunft angewandt werden. Als Körperflüssigkeiten kommen dabei alle Lipoprotein-haltigen Körperflüssigkeiten von verschiedenster Herkunft, z.B. Blut, Lymphflüssigkeiten oder Rückenmarksflüssigkeit in Frage. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt dabei die Analyse von inhomogen zusammengesetzten NMR-Signalen in NMR-Spektren, die auf die variierende inhomogene Verteilung innerhalb von Lipoproteinklassen zurückzuführen sind. So können z. B. je nach Konstitution eines Patienten die Cholesterinanteile, die Dichte- und Größenverteilungen der Partikel innerhalb einer Lipoproteinklasse variieren.

Die Größenverteilung von Lipoproteinpartikeln innerhalb einer Lipoproteinklasse, z.B. HDL- oder LDL-Partikeln, kann dabei erfindungsgemäß dadurch bestimmt werden, dass zur Erzeugung der diffusionsgewichteten NMR-Spektren der zu analysierenden Probe, z. B. einer Blutprobe zusätzlich zu den Hochfrequenzpulsen verschiedene Magnetfeldgradienten angelegt werden. Dies kann dadurch geschehen, dass zusätzlich zu dem bereits im NMR-Spektrometer vorhandenen Magnetfeld, beispielsweise mittels Gradientenspulen ein zusätzliches örtlich variierendes Magnetfeld in der zu analysierenden Probe erzeugt wird.

Als nur ein mögliches Beispiel für diffusionsgewichtete NMR-Spektroskopie ist ein Spin-Echo-Experiment, bei dem zusätzlich ein Magnetfeldgradient erzeugt wird, schematisch in 2 dargestellt. Bei diesem Spinechoexperiment wird zuerst die von den Spins der Wasserstoffatome herrührende Magnetisierung durch einen sogenannten 90°-Puls (π/2) in die Detektionsebene gedreht und detektiert. In dieser Detektionsebene dephasiert anschließend die Magnetisierung einzelner Spinpakete. So diffundieren beispielsweise Lipoproteinpartikel aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe unterschiedlich weit. Wird in dieser Zeit zusätzlich zum bereits bestehenden Magnetfeld ein sogenannter Magnetfeldgradient auf das z-Feld der Probe gelegt, so befinden sich die verschiedenen Lipoproteinpartikel aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe und damit ihres unterschiedlichen Diffusionsverhaltens unter dem Einfluss verschiedener Magnetfeldstärken. Wird nun ein 180°-Puls, ein π-Puls eingestrahlt, so wird die Magnetisierung der Spins derjenigen Lipoproteinpartikel refokussiert, die während des Auseinanderlaufens der Spins in der Detektionsebene nicht allzu weit diffundiert sind (größere Lipoproteinpartikel beispielsweise VLDL-Partikel = Very Low Density Lipoproteins). Kleinere Lipoproteinpartikel, beispielsweise HDL-Partikel sind in dieser Zeit bereits weiter diffundiert und befinden sich unter dem Einfluss einer anderen z-Feldstärke, so dass deren Magnetisierung durch den 180°-Puls nur ungenügend oder je nach Stärke des Magnetfeldgradienten sogar überhaupt nicht refokussiert werden kann. Dies hat zur Folge, dass in Abhängigkeit des angelegten Magnetfeldgradienten NMR-Signale kleinerer Lipoproteinpartikel selektiv unterdrückt bzw. die Intensität dieser Signale defineirt verringert werden kann (siehe beispielsweise auch die 3 und 6). Neben diesem Spinechoexperiment sind eine Vielzahl von anderen Pulsfolgen bei Varianten von erfindungsgemäßen Verfahren möglich.

10 kann entnommen werden, dass auch innerhalb einer Lipoproteinklasse die Größe der Lipoproteinpartikel variiert (z.B. bei der von den Erfindern willkürlich gewählten Subklasseneinteilung LDL [A] bis LDL [C]). Die oben genannte diffusionsgewichtete Magnetfeldgradientenmessmethode bietet damit auch eine Möglichkeit, die Größenverteilungen innerhalb von Lipoproteinklassen bzw. -subklassen zu bestimmen. Diese Größenverteilung kann ebenfalls ein Indikator für das persönliche Risiko von Herzkreislauferkrankungen sein (Kuller et al., (2002), Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy of lipoproteins and risk of coronary heart disease in the cardiovascular health study, Aterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22, 1175-1180; Blake et al., (2002), Low-density lipoprotein particle concentration and size as determined by nuclear megnetic resonance spectroscopy as predictors of cardiovascular disease in women, Circulation 106, 1930-1937; Rosenson et al., (2002), Relations of lipoprotein subclass levels and low-density lipoprotein size to progression of coronary artery disease in the pravastatin limitation of artherosclerosis in the coronary arteries (PLRC-I Trial), Am. J. Cardiol. 90, 89-94; Rosenson et al., (2002), Effects of pravastatin treat ment on lipoprotein subclass profiles and particle size in the PLAC-I trial, Atherosclerosis 160, 41-48).

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem verschiedene Magnetfeldgradienten an der zu analysierenden Probe angelegt werden, ist es beispielsweise auch möglich, bislang schwer nachweisbare Lipoproteinklassen, z.B. Lp(a) und Small Dense LDL nachzuweisen, die als sehr gefährlich im Bezug auf das Risiko von Herzkreislauferkrankungen eingestuft werden (siehe auch 1).

Weiterhin besteht noch die Möglichkeit, beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Lipoproteinklassen als weitere Messbedingungen die Messtemperaturen zu variieren. Variationen in der Messtemperatur haben vor allem einen Einfluss auf die Linienbreite der NMR-Signale der Lipoproteinpartikel und deren Komponenten. Mit steigender Temperatur kann dabei die Linienbreite der NMR-Signale kleiner werden (Änderung der transversalen Relaxationszeit T2), da die Lipoproteinpartikel bei steigender Temperatur beweglicher werden, wobei die longitudinale Relaxationszeit T1 und die transversale Relaxationszeit T2 normalerweise größer werden. Abhängig von der gewählten Gradientenpulsfolge kann definiert zusätzlich zu der Diffusionswichtung auch eine T1- und T2-Wichtung eingeführt werden. Bei besonders dicht gepackten Partikeln, beispielsweise HDL-Partikeln hat im allgemeinen eine Temperaturerhöhung keinen so großen Einfluss als bei weniger dicht gepackten Partikeln, beispielsweise LDL- oder VLDL-Partikeln. Dies hat zur Folge, dass bei unterschiedlich dicht gepackten Lipoproteinpartikeln eine Änderung der Temperatur sich unterschiedlich auf die Veränderung der Linienbreiten der NMR-Signale der jeweiligen Lipoproteinpartikel auswirkt. Somit kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens auch eine Dichtever teilung innerhalb der Lipoproteinklassen ermittelt werden. Typische Messtemperaturen wären hier Temperaturen bei etwa 278 K, 298 K, 308 K und 318 K.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren können dabei gleichzeitig der Magnetfeldgradient und die Messtemperatur variiert werden. Es ist aber auch möglich, nur den Magnetfeldgradienten bei konstanter Temperatur zu verändern, oder umgekehrt bei konstantem Magnetfeld nur die Messtemperatur zu verändern. Neben der weiter oben beschriebenen einfachen Spin-Echo-Methode können alle in der Literatur beschriebenen Methoden wie PFG-STE, PFG-LED etc. zur Diffusionsgewichtung herangezogen werden.

In einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein mehrdimensionales Set von charakteristischen Referenzparametern eines NMR-Spektrums für jede Lipoproteinklasse bestimmt (siehe beispielsweise 9). Dieses mehrdimensionale Set kann beispielsweise aus einer Serie von geeignet aufgenommenen NMR-Spektren – wobei im Grenzfall für jede Lipoproteinklasse ein Spektrum aufgenommen wird – bestimmt werden. Die charakteristischen Referenzparameter sind dabei ausgewählt aus den Verteilungen der chemischen Verschiebungen, den Verteilungen der NMR-Signalintensitäten, den Verteilungen der NMR-Signalbreiten und Linienformen in Abhängigkeit vom Magnetfeldgradienten und möglichen anderen äußeren Parametern wie der Temperatur. Mittels dieser charakteristischen Referenzparameter können NMR-Spektren berechnet und an die experimentellen Spektren mittels in der Literatur bekannter multidimensionaler Optimierungsverfahren angepasst werden.

Da die Referenzparameter bekannt oder ermittelt sind, lassen sich hieraus primär die Konzentrationen der Lipoproteinpartikel der verschiedenen Klassen ermitteln. Sekundär können dann weitere physikalische und chemische Eigenschaften innerhalb einer Klasse wie Lipidzusammensetzung und genaue Größe der Lipoproteinpartikel ermittelt werden.

Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erhält man für jede Lipoproteinklasse i eine sogenannte Klassenfunktion f_i(G, δ, p₁, .., p_N), die von der Gradientenstärke G, der chemischen Verschiebung δ und anderen experimentellen Parametern p_j wie der Temperatur T, der benutzten Pulsfolge, und der Stärke des äußeren Magnetfeldes abhängt.

Die Klassenfunktion f_i wird dann aus den M Basisfunktionen g_k aufgebaut als

mit a_k einer komplexwertigen Funktion, die die Abhängigkeit der Amplitude und Phase von den Parametern beschreibt und L(δ)eine um δ = 0 zentrierte Linienformfunktion (z. B. eine Gauß- oder Lorentzfunktion der Breite Δδ_1/2 ^k). Das gesamte experimentelle Spektrum S kann dann für N Klassen mit den Konzentrationen c_i durch

beschrieben werden. Für Partikel und freie Einzelmoleküle (annähernd) gleicher Größe kann der Effekt der Gradientenstärke G in den Klassenfunktionen separiert werden durch fi = fi·hi(G) (3)

In einer in der Regel gültigen Vereinfachung ist der von der Partikelgröße (genauer von der zugehörigen Diffusionskonstante D_i) abhängige Effekt der Gradientenstärke G durch

angenähert.

Der Vorteil dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die charakteristischen Referenzparameter jeweils die reine Lipoproteinklasse bzw. -subklasse charakterisieren und in der Regel über grundsätzliche physikalische Überlegungen direkt an Geräteparameter wie Messfrequenz und Magnetfeldstärke des NMR-Spektrometers, mit dem die NMR-Spektren aufgenommen wurden, angepasst werden können. Im Gegensatz dazu wird bei dem oben genannten in der Druckschrift EP 0 361 214 B1 beschriebenen Messverfahren die auf einem spezifischen NMR-Spektrometer gemessenen Spektren reiner Lipoproteinbestandteile direkt mittels einfacher mathematischer Methoden aufsummiert und variiert, um so das experimentell gemessene Spektrum der zu analysierenden Blutprobe zu rekonstruieren. Dieses Verfahren ist daher viel stärker von den spezifischen Messbedingungen insbesondere von den Geräteparametern des verwendeten NMR-Spektrometers abhängig. Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren hingegen kann aufgrund der Parametrisierung mit den charakteristischen Referenzpara metern ohne Probleme auf verschiedensten NMR-Spektrometern mit verschiedenen Frequenzen durchgeführt werden.

Diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht auf der Überlegung, dass Partikel einer gegebenen Lipoproteinklasse aus verschiedenen chemischen Komponenten mit verschiedenen Mustern von chemischen Verschiebungen und Relaxationszeiten aufgebaut sind und daher durch inhomogene Resonanzlinien charakterisiert werden, dass aber Partikel gleicher Größe auf die Variation der Magnetfeldgradienten dieselbe Antwort zeigen. Dies wird durch das obige Messverfahren besonders gut ausgenutzt, um Lipoproteinklassen spektroskopisch zu separieren und durch das oben beschriebene Verfahren mathematisch zu beschreiben. Unter gegebenen experimentellen Bedingungen müssen dann lediglich die Partikelkonzentrationen c_i (siehe Gleichung 2) angepasst werden. Dies kann durch fast jedes beliebige Optimierungsverfahren sicher bewerkstelligt werden.

Günstigerweise umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren die folgenden Verfahrensschritte:
A) Ermittlung eines parametrisierten NMR-Referenzmodels für jede zu analysierende Lipoproteinklasse, das die jeweiligen charakteristischen Referenzparameter der Lipoproteinklasse und ihr Verhalten unter den verschiedenen Messbedingungen enthält. Dabei werden auch die Auswirkungen der verschiedenen Messbedingungen auf die Signalintensitäten und/oder Linienbreiten jeder Lipoproteinklasse berechnet (siehe z.B. die Auswirkungen der Magnetfeldgradienten auf die Signalintensität in dem Datensatz von 9).

Anschließend werden in einem Verfahrensschritt B) NMR-Spektren einer zu analysierenden Plasma- oder Serumprobe bei den verschiedenen in A) verwendeten Messbedingungen erfasst. In einem Verfahrensschritt C) werden anschließend die Dichte- und/oder Größenverteilungen für jede Lipoproteinklasse anhand einer Gewichtung der Referenzparameter ermittelt.

Ein im Verfahrensschritt A) ermittelter NMR-Referenzdatensatz ist für die von den Erfindern so benannte Lipoproteinsubklasse LDL [A] in 9 gezeigt. Ein derartiger NMR-Referenzdatensatz kann beispielsweise dadurch erhalten werden, dass im Verfahrensschritt A) NMR-Referenzspektren für jede zu analysierende Lipoproteinklasse bei den verschiedenen Messbedingungen, also z.B. in verschiedenen Magnetfeldgradienten erfasst werden und anschließend NMR-Spektren berechnet und mittels Gaus- und Lorenzfunktionen an die NMR-Referenzspektren angenähert werden, wobei eine mathematische Funktion für die charakteristischen Referenzparameter der Referenzspektren erhalten wird. Bei der Aufnahme der NMR-Referenzspektren für jede einzelne Lipoproteinklasse und Lipoproteinsubklasse sollte dabei die Konzentration dieser Lipoproteinklasse in der Referenzprobe bekannt sein. Möglich ist es auch die Referenzparameter einzelner Lipoproteinklassen bei nicht bekannten Konzentrationen mittels statistischer Verfahren aus mehreren Referenzproben zu ermitteln.

Alternativ ist auch möglich, die charakteristischen Parameter für jede Lipoproteinklasse nicht aus Referenzproben zu ermitteln, sondern mittels mathematischer Modelle zu berechnen (Gounarides et al., Nuclear magnetic resonance chromatography: applications of pulse field gradient diffusion NMR to mixture analysis and ligand-receptor interaction, Journal of chromatography B; 725 (1999), Seiten 79-90).

Vorteilhafterweise wird bei beiden alternativen Methoden zur Bestimmung der charakteristischen Referenzparameter eine mathematische Funktion, die Basisfunktion erhalten, die die charakteristischen Referenzparameter beschreibt. Im Verfahrensschritt B) können dann die NMR-Spektren der zu analysierenden Plasma- oder Serumprobe bei den gleichen Messbedingungen (gleiche Magnetfeldgradienten bzw. gleiche Messtemperatur) erfasst werden, wie dies bei den Referenzproben der Fall war oder im Falle der Berechnung der Referenzparameter mittels mathematischer Modelle wie die Messbedingungen entsprechend in den mathematischen Modellen gesetzt wurden.

Im Verfahrensschritt C) werden berechnete NMR-Spektren an die in B) erfassten Spektren anhand einer Gewichtung der Referenzparameter jeder Lipoproteinklasse angenähert. Diese Gewichtung kann dadurch erfolgen, dass die Basisfunktionen für jede Lipoproteinklasse und von den Erfindern eingeteilte – subklasse, die wie oben besprochen, die charakteristischen Referenzparameter jeder Lipoproteinklasse beschreiben mittels Proportionalitätsfaktoren für jede Basisfunktion so verändert werden, dass berechnete NMR-Spektren an die gemessenen NMR-Spektren angenähert werden können. Diese Proportionalitätsfaktoren werden dann noch mit Gewichtungsfaktoren, Eichfaktoren multipliziert, aus denen direkte Rückschlüsse auf die Konzentration der jeweiligen Lipoproteinklassen sowie ihre Größen und/oder Dichteverteilung möglich sind. Somit lassen sich vorteilhafterweise die Konzentrationen von Partikeln der einzelnen Lipoproteinklassen und -subklassen, deren Zusammensetzung und Dichte- und/oder Großenverteilungen in einer Blutplasma- oder -serumprobe gemeinsam bestimmen.

In den Verfahrensschritten A) und B) werden vorteilhafterweise aus Gründen der Einfachheit eindimensionale Protonen NMR- Spektren von Referenzproben und den zu analysierenden Serum- oder Blutplasmaproben erfasst. Bei eindimensionalen NMR-Spektren wird bei der Puls-Fourier-Transformations-NMR der Abfall der transversalen Magnetisierung, des free induction decay (FID) gemessen, wobei im Gegensatz zu mehrdimensionalen NMR-Spektren nur eine Frequenzvariable vorhanden ist (Hesse, Meier, Zeeh: Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie; 4. Auflage 1991 Thieme-Verlag, Seite 132). Somit sind 1-D-NMR Spektren leichter zu messen als mehrdimensionale Spektren. Es ist aber auch möglich, mehrdimensionale NMR-Spektren, z. B. HSQC-Pulsfolgen (heteronuclear single quantum coherence spectroscopy) unter Verwendung nicht nur von H¹, sondern auch C¹² und N¹⁵-Kernen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen. Mehrdimensionale Spektren sind zeitaufwändiger aufzunehmen, können aber detaillierte Informationen über die Partikeleigenschaften geben.

Weiterhin ist es möglich, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens zusätzlich zu der Klassifizierung der Lipoproteine, der Bestimmung der Konzentration und Zusammensetzung der Lipoproteinpartikel der einzelnen Klassen und deren Größen- und/oder Dichteverteilungen auch die Konzentrationen von Nicht-Lipoprotein-Komponenten in der Plasma- oder Serumprobe zu ermitteln. Dazu werden im Verfahrensschritt A) ähnlich wie bei den Lipoproteinklassen NMR-Referenzdatensätze für jede Nicht-Lipoprotein-Komponente mit bekannter Konzentration unter den gleichen Messbedingungen wie im Verfahrensschritt B) aufgenommen und dann die jeweiligen charakteristischen Referenzparameter jeder Nicht-Lipoprotein-Komponente ähnlich wie bei den Lipoprotein-Komponenten bestimmt. Diese Referenzparameter sind ähnlich wie bei den Lipoproteinen ausgewählt aus den Linienbreiten, den chemischen Verschiebungen der NMR-Signale und den Intensitäten der NMR-Signale in Abhängigkeit von den Magnetfeldgradienten. Wenn zusätzlich die NMR-Referenzdatensätze dieser Nicht-Lipoprotein-Komponenten vorliegen, können dann besonders vorteilhaft im Verfahrensschritt C) zusätzlich die Konzentrationen dieser Nicht-Lipoprotein-Bestandteile zusammen mit den Konzentrationen der Lipoprotein-Komponenten bestimmt werden. Die Nicht-Lipoprotein-Komponenten können dabei beispielsweise ausgewählt sein aus Metaboliten, insbesondere Lactat, Alkoholen, insbesondere Ethanol, Fettsäuren, Kohlenhydraten, Pharmazeutika und Proteinen. Weiterhin können Nukleinsäuren wie DNA und RNA entweder als Einzelstrang oder Doppelstrang bestimmt werden.

Wenn zusätzlich zu den Referenzparametern der Lipoprotein-Komponenten auch die Referenzparameter der Nicht-Lipoprotein-Bestandteile für die Annäherung der berechneten NMR-Spektren an die zu analysierenden NMR-Spektren im Verfahrensschritt C) verwendet werden, kann die Genauigkeit dieser Annäherung erhöht werden. Dies hat zur Folge, dass genauere Ergebnisse bezüglich der Konzentrationen und Dichte- bzw. Größenverteilungen der Lipoprotein-Komponenten und Nicht-Lipoprotein-Bestandteile der Blutprobe im Verfahrensschritt C) erzielt werden können.

Bei einer Variante eines erfindungsgemäßen Verfahrens werden ausschließlich die Magnetfeldgradienten als Messbedingung variiert und die zu analysierenden Blutproben bei konstanter Temperatur gemessen. Dabei werden dann die unterschiedlichen Auswirkungen der verschiedenen Magnetfeldgradienten auf die Intensität der NMR-Signale der einzelnen Lipoproteinklassen bestimmt. In diesem Fall ist es vorteilhaft, vier eindimensionale NMR-Spektren einer zu analysierenden NMR-Probe bei keinem bzw. voneinander abweichenden Magnetfeldgradienten aufzu nehmen. Es können aber auch weniger als vier oder mehr als vier eindimensionale NMR-Spektren aufgenommen werden.

Zusätzlich besteht noch die Möglichkeit, die Unterschiede in den longitudinalen und transversalen Relaxationszeiten durch eine Variation der Messbedingungen zur Diskriminierung der Lipoproteine zu verwenden.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Messanordnung zur Analyse von Lipoproteinklassen in Körperflüssigkeiten mit:

– einer ersten Vorrichtung zur Bestimmung von NMR-Referenzdatensätzen für jede Lipoproteinklasse mit den jeweiligen Referenzparametern in Abhängigkeit von unterschiedlichen Messbedingungen, wobei die Messbedingungen ausgewählt sind aus verschiedenen Magnetfeldgradienten und variierenden Temperaturen,
– einer zweiten Vorrichtung zur Erfassung der NMR-Spektren einer zu analysierenden Plasma- oder Serumprobe bei den verschiedenen Messbedingungen der ersten Vorrichtung,
– einer dritten Vorrichtung zur Klassifizierung der Lipoproteine, zur Ermittlung der Konzentrationen der Lipoproteinpartikel der einzelnen Klassen, der Bestimmung der Zusammensetzung und deren Dichte und/oder Größenverteilungen für jede Lipoproteinklasse anhand einer Annäherung von berechneten NMR-Spektren an die in der zweiten Vorrichtung erfassten zu analysierenden NMR-Spektren mittels einer Gewichtung der mit der ersten Vorrichtung bestimmten Referenzparameter.

Bei der ersten Vorrichtung handelt es sich bevorzugt um ein NMR-Spektrometer, das mit einer Datenverarbeitungsanlage verbunden ist, die aus den NMR-Spektren der Referenzproben der Lipoproteinklassen die entsprechenden Basisfunktionen berechnet, die die charakteristischen Referenzparameter jeder Lipoproteinklasse beschreiben. Alternativ kann die erste Vorrichtung auch nur eine Datenverarbeitungsanlage umfassen, die z.B. aus den bereits oben genannten mathematischen Modellen die Referenzparameter ermittelt, so dass keine NMR-Referenzspektren von Referenzproben gemessen werden müssen.

Bei der zweiten Vorrichtung handelt es sich bevorzugt ebenfalls um ein NMR-Spektrometer und bei der dritten Vorrichtung um eine Datenverarbeitungsanlage, beispielsweise einen Computer, der die entsprechende Annäherung der berechneten Spektren an die mit der zweiten Vorrichtung erfassten zu analysierenden Spektren mittels einer Gewichtung der Basisfunktionen vornimmt, wobei dann die Konzentrationen der Lipoproteinklassen sowie ihre Größe und/oder Dichteverteilung berechnet werden können.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin auch ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Lipoproteinklassen und Lipoproteinsubklassen in Körperflüssigkeiten,

– bei dem charakteristische Referenzparameter eines NMR-Spektrums für jede Lipoproteinklasse und Lipoproteinsubklasse bestimmt und berechnete NMR-Spektren mittels einer Gewichtung dieser Referenzparameter durch Gewichtungsfaktoren an die gemessenen NMR-Spektren der zu analysierenden Plasma- oder Serumprobe angenähert werden,
– wobei mittels der Gewichtungsfaktoren die Konzentrationen der Lipoproteinklassen und Lipoproteinsubklassen bestimmt werden.

Die Konzentrationen der Lipoproteinklassen und Lipoproteinsubklassen lassen sich dann besonders einfach mittels einer Gewichtung der Basis- und Klassenfunktionen, die diese Referenzparameter beschreiben, wie bereits auf den Seiten 8 bis 11 beschrieben, ermitteln. Den Gewichtungsfaktoren können dabei die Konzentrationen der Lipoproteinklassen und Lipoproteinsubklassen im Blut zugeordnet werden.

Die Referenzparameter der Basisfunktionen sind dabei ausgewählt aus: chemischer Verschiebung, NMR-Signalintensität und NMR-Signalbreite, die der Klassenfunktion aus der bekannten Abhängigkeit der sie aufbauenden Basisfunktionen von äußeren Parametern.

Vorteilhafterweise umfasst diese weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die folgenden Verfahrensschritte.

A1) Ermittlung eines NMR-Referenzdatensatzes mit den jeweiligen, für jede Lipoproteinklasse bzw. -subklasse charakteristischen Referenzparametern,
B1) Erfassung zumindest eines NMR-Spektrums einer zu analysierenden Plasma- oder Serumprobe,
C1) Annäherung eines berechneten NMR-Spektrums an das in B1) erfasste NMR-Spektrum mittels einer Gewichtung der in A1) erhaltenen Referenzparameter.

In einer vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens können während der Aufnahme des NMR-Spektrums der zu analysierenden Blutplasma- oder Blutserumprobe im Verfahrensschritt B1) auch Messbedingungen ausgewählt aus Magnetfeldgradienten und Messtemperatur geändert werden. In diesem Fall erhält man zusätzliche Informationen über die Dichte- und/oder Größenverteilung der Lipoproteinklassen und beliebig einteilbaren Lipoproteinsubklassen in der zu analysierenden Probe, wie bereits auf den Seiten 3-7 beschrieben. In diesem Fall werden dann analog im Verfahrensschritt A1) als zusätzliche Refe renzparameter die Intensitäten der NMR-Signale jeder Lipoproteinklasse und Lipoproteinsubklasse in Abhängigkeit von den Magnetfeldgradienten und die Linienbreiten der NMR-Signale in Abhängigkeit von den Messtemperaturen bestimmt. Im Verfahrensschritt C1) werden dann durch Annäherung der berechneten NMR-Spektren an die in B1) erfassten NMR-Spektren neben den Konzentrationen der Lipoproteinklassen und Lipoproteinsubklassen auch deren Dichte- und/oder Größenverteilungen bestimmt.

Für diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch alle bereits bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Dichte- und/oder Größenverteilung möglichen Ausführungsformen und Messanordnungen eingesetzt werden.

Alle oben genannten Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch zur Bestimmung der Dichte- und/oder Größenverteilung sowie der Bestimmung der Konzentration von anderen inhomogenen Partikeln außer Lipoproteinen in beliebigen komplexen, inhomogenen Gemischen verwendet werden.

Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und Figuren noch näher erläutert werden.
1 zeigt eine von den Erfindern vorgenommene Einteilung der verschiedenen Lipoproteinklassen in Lipoproteinsubklassen im menschlichen Blut, die anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden können.
2 zeigt schematisch den Verlauf eines Spinechoexperiments mit einem Magnetfeldgradienten.
3 zeigt das Intensitätsverhalten der NMR-Signale verschiedener Lipoproteinklassen unter dem Einfluss keiner bzw. verschieden starker Magnetfeldgradienten.
4 zeigt verschiedene eindimensionale NMR-¹H-Spektren einer Blutplasmaprobe mit und ohne Magnetfeldgradienten.
Die 5 und 6 zeigen die Region der Methyl- und Methylen-Signale von NMR-¹H-Spektren einer Blutplasmaprobe aufgenommen mit und ohne Magnetfeldgradienten.
Die 7 und 8 zeigen die Annäherung von einem berechneten Spektrum an ein zu analysierendes NMR-Spektrum mittels einer Gewichtung der Klassenfunktionen der einzelnen Lipoproteinklassen.
9 zeigt beispielhaft einen NMR-Referenzdatensatz mit charakteristischen Referenzparametern für eine Lipoprotein-Subklasse.
10 zeigt tabellarisch die chemischen Verschiebungen, die Größen und die Dichten von mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmbaren Lipoproteinklassen sowie Nichtlipoproteinbestandteilen.
1 zeigt eine Partikelgrößen- und Dichtenverteilung verschiedener mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens im Blutplasma nachweisbarer Lipoproteine. Auf der x-Achse ist dabei der Partikeldurchmesser in μm und auf der y-Achse die Partikeldichte in g/cm³ aufgetragen. Die Dichte der Lipoprotein partikel verschiedener Klassen ist im wesentlichen durch ihre Lipidzusammensetzung bestimmt. Die mit 1 bezeichneten Bereiche kennzeichnen die Chylomikronen, die mit 2 bezeichneten Bereiche die Chylomikronen Remnants, die mit 3 bezeichneten Bereiche die VLDL-Partikel (Very Low Density Lipoproteins), die mit 4 bezeichneten Bereiche die IDL-Partikel (Intermediate Density Lipoproteins), die mit 6 bezeichneten Balken kennzeichnen die Dichte- und Partikelgrößenverteilung von LDL-Partikeln, der mit 5 bezeichnete Bereich die Dichten- und Partikelgrößenverteilung von Small Dense LDL-Partikeln und die mit 8 und 9 bezeichneten Bereiche die Dichte- und Partikelgrößenverteilungen von HDL2- und HDL3-Partikeln. Der mit 7 bezeichnete Bereich kennzeichnet Lp(a)-Partikel. Die Einteilung der im Blut bisher gefundenen Lipoproteine in Lipoproteinklassen ist z.B. in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben: Kuller et al., (2002), Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy of lipoproteins and risk of coronary heart disease in the cardiovascular health study, Aterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22, 1175-1180; Blake et al., (2002), Low-density lipoprotein particle concentration and size as determined by nuclear megnetic resonance spectroscopy as predictors of cardiovascular disease in women, Circulation 106, 1930-1937; Rosenson et al., (2002), Relations of lipoprotein subclass levels and low-density lipoprotein size to progression of coronary artery disease in the pravastatin limitation of artherosclerosis in the coronary arteries (PLAC-I Trial), Am. J. Cardiol. 90, 89-94; Rosenson et al., (2002), Effects of pravastatin treatment on lipoprotein subclass profiles and particle size in the PLAC-I trial, Atherosclerosis 160, 41-48. Die Einteilung der verschiedenen Lipoproteine in Lipoproteinklassen anhand ihrer Dichte- und Größenverteilung sowie Apoproteinkomponenten variiert dabei je nach Literaturstelle, wobei die hier gezeigte Einteilung von den Erfindern vorge nommen wurde. Die Einteilungen lassen sich dabei je nach den Anforderungen (z.B. Feinere Einteilung der HDL-Partikel in mehr als zwei HDL-Subklassen HDL 2 und HDL3 zur genaueren Analyse) beliebig verändern.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich alle in 1 gezeigten Partikel, insbesondere z.B. Lp(a) und Small Dense LDL, die als sehr gefährlich in Bezug auf das Risiko für Herzkreislauferkrankungen eingestuft werden, besonders zuverlässig bestimmen. Die NMR-Signale aller dieser Lipoproteinklassen und Lipoproteinsubklassen weisen dabei ein von der Größenverteilung abhängiges Abschwächungsverhalten in Magnetfeldgradienten auf. Chylomikronen sind dabei so groß, dass die Intensitäten ihrer Signale in NMR-Spektren von Blutproben durch das Anlegen von Magnetfeldgradienten nicht oder kaum beeinflusst werden.
2 zeigt schematisch den Verlauf eines Spinechoexperiments mit einem angelegten Magnetfeldgradienten, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur selektiven Unterdrückung bzw. Abschwächung von NMR-Signalen kleinerer Lipoproteinklassen verwendet wird. 2A zeigt dabei, wie ein π/2-Puls, ein 90°-Puls eingestrahlt wird, wobei die Spins der Wasserstoffatome aus der z-Richtung in die Detektionsebene, die x'-y'-Ebene geklappt werden. Dabei liegt an der Probe ein Magnetfeld B₀ in z-Richtung an.
2B zeigt wie die Spins unmittelbar nach dem π/2-Puls mit geringfügig verschiedener Frequenz in der x'-y'-Ebene präzessieren. Dabei kommt es zur transversalen Relaxation, dem Zerfall des FID (Free Induction Decay) in der x'-y'-Ebene, der durch die transversale Relaxationszeit T2 beschrieben wird. Dieser FID in der Zeitdomäne kann mittels ei ner dem Fachmann bekannten Fourier-Transformation in ein klassisches NMR-Spektrum in der Frequenzdomäne überführt werden.
Wenn während des Auseinanderlaufens der Spins in der x'-y'-Ebene zusätzlich zum Magnetfeld B₀ ein Magnetfeldgradient B₀' entlang der z-Achse angelegt wird, befinden sich die Spins unterschiedlicher Lipoproteinpartikel je nach ihrem Aufenthaltsort in unterschiedlichen Magnetfeldern (2C). Dabei bewegen sich die kleineren und kompakteren Lipoproteinpartikel (z.B. HDL-Partikel) aufgrund ihrer erhöhten Diffusion schneller als entsprechende größere Lipoproteinpartikel (z.B. VLDL- oder LDL-Partikel). 2C zeigt schematisch, dass sich die Spins 10, 30 der kleineren Lipoproteinpartikel aufgrund ihrer erhöhten Diffusion schneller bewegen, als die Spins 15, 20 von entsprechend größeren Lipoproteinpartikeln. Somit befinden sich beim Zerfall der Quermagnetisierung in der x'-y'-Ebene aufgrund der unterschiedlichen Diffusionsgeschwindigkeiten die unterschiedlichen Lipoproteinpartikel an unterschiedlichen Orten und somit unter dem Einfluss verschiedener z-Magnetfeldstärken. Dabei sind vor allen Dingen die Präzisionsphasen von Spins kleinerer Lipoproteinpartikel, die aufgrund schnellerer Diffusion in einem Bereich mit einem anderen Magnetfeld bewandert sind, durch einen anschließenden 180°-Puls, einem π-Puls wie in 2D gezeigt, nicht mehr voll refokussierbar. Dementsprechend werden wie in 2D schematisch gezeigt, aufgrund des 180°-Pulses lediglich die Spins 15, 20 der größeren Lipoproteinpartikel um 180° umgeklappt, so dass nur diese refokussieren und ein Spinecho, wie in 2E gezeigt, ergeben. Im Gegensatz dazu werden die Spins 10, 30 der kleineren Lipoproteinpartikel, die sich bereits in einem anderen Magnetfeld befinden, nicht refokussiert. Dies hat zur Folge, dass in Abhängigkeit von der Stär ke der Magnetfeldgradienten die NMR-Signale kleinerer Lipoproteinpartikel die eine höhere Diffusionsrate aufweisen, als größere Lipoproteinpartikel, selektiv geschwächt oder sogar komplett unterdrückt werden können.
3 zeigt die Abnahme von NMR-Signalen verschiedener Lipoproteinklassen unter dem Einfluss verschiedener starker Gradientenwirkungen. Auf der y-Achse ist die relative Signalintensität und auf der X-Achse die Gradientenwirkung (Gradientenstärke × Zeit) aufgetragen. Die mit 40 bezeichnete Kurve kennzeichnet die Abnahme der Signalintensität von Chylomikronensignalen, die mit 50 bezeichnete Kurve die Abnahme der Signalintensität von NMR-Signalen von VLDL-Partikeln und die mit 60 bezeichnete Kurve die Abnahme der NMR-Signalintensität von IDL-Partikeln. Bei der mit 70 bezeichneten Kurve handelt es sich um die Signalintensität von LDL-Partikeln und bei den mit 80 und 85 bezeichneten Kurven um die Abnahme der Signalintensität von HDL2- und HDL3-Partikeln in Abhängigkeit von der Stärke der Magnetfeldgradienten.
Der Übersichtlichkeit halber ist auch die Abnahme der Signalintensitäten von einigen anderen im Serum enthaltenen Stoffen, die nicht zur Lipoproteinfraktion gehören mit 86 gekennzeichnet. Diese Stoffe würden experimentell in einem lipoproteinfreien Serum (LPDS = Lipoprotein defizientes Serum) zu finden sein. Den Kurven kann deutlich entnommen werden, dass die Abschwächung der NMR-Signale mit sinkender Größe der Lipoproteinpartikel und steigendem Magnetfeldgradienten zunimmt.
4 zeigt verschiedene eindimensionale ¹H-NMR-Spektren einer Blutplasmaprobe ohne und mit Magnetfeldgradienten. In 4 und bei allen folgenden Figuren, die NMR-Spektren zei gen sind auf der x-Achse die chemische Verschiebung in ppm und auf der y-Achse die Intensität aufgetragen. Das mit 90 bezeichnete eindimensionale NMR-Spektrum wurde ohne Magnetfeldgradienten und die mit 100 und 110 bezeichneten NMR-Spektren mit von 100 zu 110 steigenden Magnetfeldgradienten aufgenommen. Man erkennt, dass bei steigenden Magnetfeldgradienten die Signale aller im Blut gelösten kleinen Stoffe (Proteine, Salze, Aminosäuren), die alle kleiner als 1 nm sind, praktisch vollständig unterdrückt werden.
Die 5 und 6 zeigen die gleiche Region von 1,4 ppm bis 0,8 ppm in einem ¹H-NMR-Spektrum, den Bereich der Methyl- und Methylenpeaks der im Blut vorhandenen Lipoproteinklassen. In 6 ist dabei der in 5 gezeigte Bereich vergrößert dargestellt. Das mit 120 bezeichnete Spektrum wurde ohne Magnetfeldgradienten aufgenommen und die mit 130, 140 und 150 bezeichneten Spektren mit steigenden Magnetfeldgradienten aufgenommen. Dabei ist deutlich zu erkennen, dass die Signalintensität aller Signale mit steigendem Magnetfeldgradienten abnimmt. In 6 stellen die mit 130A gekennzeichneten NMR-Signale die Methyl- und Methylenpeaks von VLDL-Partikeln und die mit 130B gekennzeichneten Signale die Methyl- und Methylenpeaks von HDL-Partikeln dar. Die HDL-Partikel sind dabei wesentlich kleiner als die VLDL-Partikel (siehe z.B. 1). 6 zeigt dabei deutlich, dass mit steigendem Magnetfeldgradienten die Intensität der HDL-Signale stärker abnimmt als die Intensität der entsprechenden VLDL-Signale. Bei dem mit 150 bezeichneten Spektrum, das bei dem stärksten Magnetfeldgradienten aufgenommen wurde, sind dabei die HDL-Signale fast vollständig unterdrückt.
7 zeigt die Annäherung eines berechneten Spektrums 210 an ein zu analysierendes Spektrum einer Blutplasma- oder Se rumprobe 200. Die Annäherung wird dabei mittels einer Variation und Addition der verschiedenen Basisfunktionen 220 für die einzelnen Lipoproteinklassen durchgeführt. Die mit 230 bezeichnete Linie zeigt dabei den Untergrund der Messung, der in 7 noch ziemlich stark ist, da das NMR-Spektrum ohne Magnetfeldgradienten aufgenommen wurde.
8 zeigt das bereits in 7 gezeigte NMR-Spektrum, allerdings unter dem Einfluss leichter Magnetfeldgradienten. Die Intensität des Hintergrunds 230 hat sich dabei entsprechend reduziert, da die Signalintensität der NMR-Signale der kleinen gelösten Stoffe praktisch vollständig unterdrückt wird.
9 zeigt beispielhaft den NMR-Referenzdatensatz einer Lipoproteinsubklasse LDL[A], der die charakteristischen Referenzparameter dieser Lipoproteinsubklasse enthält. Die mit „Norm ohne Gradient" kennzeichnete Zeile bezeichnet dabei die Signalintensität der Methyl- und Methylensignale ohne Magnetfeldgradienten, während „Norm Gradient [A]" bis „Norm Gradient [C]" die entsprechenden Referenzparameter für die Signalintensität der NMR-Signale bei drei von [A] bis [C] ansteigenden Magnetfeldgradienten zeigt. Ein weiterer charakteristischer Referenzparameter ist die Linienbreite und die chemische Verschiebung, der „Shift" in ppm. Weiterhin wird der Anteil der Lorenz- bzw. Gausfunktionen an der Basisfunktion angegeben. Ein derartiger NMR-Referenzdatensatz kann für jede Lipoproteinklasse bzw. -subklasse erstellt werden. Analoge NMR-Referenzdatensätze können auch für Nicht-Lipoprotein-Bestandteile der Blutplasma- oder Serumprobe, z.B. Lactat und andere Proteine erstellt werden.
10 zeigt eine Auflistung von 15 Lipoproteinklassen bzw. Lipoproteinsubklassen und ihre jeweiligen minimalen und maximalen Größen in nm, minimalen und maximalen Dichten in g/ml und die entsprechenden chemischen Verschiebungen ihrer Methyl- und Methylen-NMR-Signale. Die Einteilung der Lipoproteine in Lipoproteinklassen, z.B. HDL und weiter in die entsprechenden Lipoproteinsubklassen, z. B. HDL2 und HDL3 anhand von Dichte- und Größenverteilungen ist dabei von den Erfindern vorgenommen worden. Derartige Klassen- und Suklasseneinteilungen können je nach Anforderungen noch feiner unterteilt bzw. vereinfacht werden. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch die exakten Größen- und Dichtenverteilungen für jede Lipoproteinklasse und -subklasse, die ebenfalls ein Indikator für die Anfälligkeit für bestimmte Herzkreislauferkrankungen sein können, bestimmt werden. Weiterhin sind auch noch andere Inhaltsstoffe, z.B. die im Blut gelösten kleinen Stoffe LPDS mit einem Durchmesser < 1 nm angegeben. Weiterhin sind noch Lactat sowie ungesättigte Fettsäuren [A] und ungesättigte Fettsäuren [B] aufgeführt.
Ausführungsbeispiel:
Unter standardisierten Bedingungen (z. B. nach 12-stündigem Fasten, vor oder nach Applikation von Wirkstoffen) werden dem Probanden > 1 ml Blut entnommen und auf Eis kühlgehalten. Mit Standardmethoden wird Blutplasma oder Blutserum gewonnen, das Blutserum wird kühl (bei 277 K) gelagert. Vor der Messung werden zu 400-450 μl Blutplasma oder Blutserum in Eppendorfhütchen 50 μl einer Standardmischung A (0.01 M DSS in D₂O) hinzugegeben und gemischt. Diese Mischung wird dann in ein 5mm NMR-Röhrchen abgefüllt und in das NMR-Spektrometer gegeben. Alternativ können auch Durchflusssysteme verwandt werden, bei denen ein Pipetierroboter die Standardmischung zupi petiert und in definierter Menge in das NMR-Spektrometer transferiert. Während diesen Vorgangs wird gleichzeitig die Messtemperatur eingestellt. Die Proben werden dann bei 308 K gemessen. Am NMR-Spektrometer wird ein 1D ¹H-NMR-Spektrum gemessen (Auflösung: 32768 Datenpunkte mit 0.37 Hz/Punkt, eine Spektralweite von 12000 Hz, einem 10μs 90° Puls, einem d1 delay von 0.7 s und einer Aufnahmezeit von 1.36 s). Mit den gleichen spektralen Parametern werden im weiteren 3 diffusionsgewichtete 1D ¹H NMR-Messungen mit einer modifizierten STE-LED (STimulated Echo und Longitudinal Eddy-current Delay)Pulsfolge durchgeführt. Die diffusionsgewichteten Gradienten betragen hierbei 40 % (40 G/cm) mit einer Länge von 2 ms (Experiment 2), 80 % (80 G/cm) mit einer Länge von 2 ms (Experiment 3) und 80 % (80 G/cm) mit einer Länge von 3 ms (Experiment 4). Die gemessenen FIDs (Free Induction Decay) werden digital gefiltert, fourier-transformiert und mit der Spektrometer-spezifischen Software prozessiert (Phasenkorrektur und Basislinienkorrektur). Diese Spektren werden dann in ein ASCII Format konvertiert, dann in einen PC eingeladen. Hier werden sie mit den Konzentrationsgewichteten mehrdimensionalen Klassenfunktionen evaluiert. Die erhaltenen Partikelkonzentrationen der verschiedenen Lipoproteinklassen werden dann zusammen mit anderen Parametern (z. B. Lipidzusammensetzung) ausgedruckt.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Lipoproteinklassen in Körperflüssigkeiten, – bei dem NMR-Spektren einer zu analysierenden Plasma- oder Serumprobe bei verschiedenen Messbedingungen, die ausgewählt sind aus verschiedenen Magnetfeld-Gradienten und variierenden Temperaturen gemessen werden und – die unterschiedlichen Auswirkungen dieser Messbedingungen auf die Intensität und Linienform der NMR-Signale der einzelnen Lipoproteinklassen ermittelt werden, und den einzelnen Lipoproteinklassen aufgrund der unterschiedlichen Auswirkungen auf die NMR-Signale eine Dichte- und/oder Größenverteilung zugeordnet wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, – bei dem charakteristische Referenzparameter eines NMR-Spektrums für jede zu analysierende Lipoproteinklasse vorab bestimmt und die gemessenen NMR-Spektren der zu analysierenden Plasma- oder Serumprobe mittels berechneter NMR-Spektren angenähert werden, die durch Variation und Kombination dieser Referenzparameter erhalten werden.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, – bei dem die charakteristischen Referenzparameter ausgewählt sind aus: – chemischer Verschiebung, NMR-Signalintensität und NMR-Signalform in Abhängigkeit vom Magnetfeldgradienten.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit den Verfahrensschritten: A) Ermittlung eines NMR-Referenzdatensatzes für jede Lipoproteinklasse mit den jeweiligen charakteristischen Re ferenzparametern und Berechnung der Auswirkungen der verschiedenen Messbedingungen auf die Signalintensitäten und/oder Linienbreiten jeder Lipoproteinklasse in Abhängigkeit ihrer Größen- und/oder Dichteverteilung anhand der Referenzparameter, B) Erfassung der NMR-Spektren einer Plasma- oder Serumprobe bei den verschiedenen in A) verwendeten Messbedingungen, C) Annäherung von berechneten NMR-Spektren an die in B) erfassten Spektren anhand einer Gewichtung der Referenzparameter jeder Lipoproteinklasse.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, – bei dem im Verfahrensschritt A) NMR-Referenzspektren für jede Lipoproteinklasse bei den verschiedenen Messbedingungen erfasst und berechnete NMR-Spektren mittels einer Summe von frequenzverschobenen und intensitätsgewichteten Basisfunktionen an die NMR-Referenzspektren angenähert werden, wobei eine mathematische Funktion für die charakteristischen Referenzparameter der Referenzspektren erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 4, – bei dem im Verfahrensschritt A) die charakteristischen Parameter jeder Lipoproteinklasse mittels mathematischer Modelle berechnet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, – bei dem im Verfahrensschritt C) berechnete NMR-Spektren an die in B) erfassten NMR-Spektren der Plasma- oder Serumprobe durch Gewichtung der Referenzparameter anhand von Gewichtungsfaktoren angenähert werden, – bei dem die Dichte und/oder Größenverteilung der einzelnen Lipoproteinklassen in der Plasma- oder Serumprobe mittels der ermittelten Gewichtungsfaktoren bestimmt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, – bei dem im Verfahrensschritt C) zusätzlich die Konzentrationen der einzelnen Lipoproteinklassen erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, – bei dem in den Verfahrensschritten A) und B) 1D-NMR Spektren von Referenzproben und zu analysierenden Serum- oder Blutplasmaproben erfasst werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, – bei dem die Lipoproteinklassen ausgewählt sind aus: – Chylomikronen-A, Chylomikronen-B, Chylomikronen-C, Chylomikronen Remnants, VLDL-A, VLDL-B, VLDL-C, IDL, small dense LDL, LDL-A, LDL-B, LDL-C, HDL-2, HDL-3 und Lp(a).
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, – bei dem zusätzlich die Konzentrationen von Nicht-Lipoprotein-Komponenten in der Plasma- oder Serumprobe ermittelt werden.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, mit den Merkmalen: – NMR-Referenzdatensätze für jede Nicht-Lipoprotein-Komponente mit den jeweiligen charakteristischen Referenzparametern werden im Verfahrensschritt A) bestimmt, – Im Verfahrensschritt C) werden zusätzlich die Konzentrationen der Nicht-Lipoproteinbestandteile bestimmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, – bei dem die Nicht-Lipoprotein-Komponenten ausgewählt sind aus organischen Molekülen insbesondere Lactat, Alkohol, Aminosäuren, Peptide, Nukleinsäuren, insbesondere DNA und RNA, Fettsäuren, Kohlenhydrate, Pharmazeutika und Proteinen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, – bei dem ausschließlich die Magnetfeldgradienten als Messbedingung variiert werden und die unterschiedlichen Auswirkungen der verschiedenen Magnetfeldgradienten auf die Intensität der NMR-Signale der einzelnen Lipoproteinklassen bestimmt werden.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, – bei dem zumindest vier 1D-NMR-Spektren einer zu analysierenden NMR-Probe jeweils bei verschiedenen Magnetfeldgradienten aufgenommen werden.
Messanordnung zur Analyse von Lipoproteinklassen in Körperflüssigkeiten mit: – einer ersten Vorrichtung zur Bestimmung von NMR-Referenzdatensätzen für jede Lipoproteinklasse mit den jeweiligen Referenzparametern in Abhängigkeit von unterschiedlichen Messbedingungen, die ausgewählt sind aus verschiedenen Magnetfeldgradienten und variierenden Temperaturen, – einer zweiten Vorrichtung zur Erfassung der NMR-Spektren einer zu analysierenden Plasma- oder Serumprobe bei den verschiedenen Messbedingungen wie in der ersten Vorrichtung, – einer dritten Vorrichtung zur Ermittlung der Konzentrationen und der Dichte und/oder Größenverteilungen für jede Lipoproteinklasse anhand einer Annäherung von berechneten NMR-Spektren an die in der zweiten Vorrichtung erfassten zu analysierenden NMR-Spektren mittels Gewichtung der mit der ersten Vorrichtung bestimmten Referenzparameter.
Messanordnung nach dem vorhergehenden Anspruch, – bei der die erste Vorrichtung Mittel zur Berechnung der Auswirkungen der verschiedenen Messbedingungen auf jede Lipoproteinklasse in Abhängigkeit ihrer Dichte und/oder Größenverteilung umfasst, – bei der die zweite Vorrichtung Mittel zur Erfassung der tatsächlich in der Plasma- oder Serumprobe auftretenden, von der Dichte und/oder Größenverteilung abhängigen Auswirkungen der Messbedingungen auf jede Lipoproteinklasse umfasst, – bei der die dritte Vorrichtung – Mittel zur Annäherung der berechneten Auswirkungen an die tatsächlich ermittelten Auswirkungen anhand einer Gewichtung der Referenzparameter mittels Gewichtungsfaktoren und – Mittel zur Berechnung der Dichte und/oder Größenverteilung anhand der Gewichtungsfaktoren enthält.
Messanordnung nach einem der vorherigen Ansprüche 16 oder 17, – bei der die erste und/oder zweite Vorrichtung ein NMR-Spektrometer umfasst, – bei dem die dritte Vorrichtung eine Datenverarbeitungsanlage umfasst.
Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen von Lipoproteinklassen und subklassen in einer zu analysierenden Körperflüssigkeit, – bei dem charakteristische Referenzparameter eines NMR-Spektrums für jede zu analysierende Lipoproteinklasse und -subklasse bestimmt und berechnete NMR-Spektren mittels einer Gewichtung dieser Referenzparameter durch Gewichtungsfaktoren an die gemessenen NMR-Spektren der zu analysierenden Plasma- oder Serumprobe angenähert werden, – wobei mittels der Gewichtungsfaktoren die Konzentrationen der Lipoproteinklassen und Lipoproteinsubklassen bestimmt werden.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch mit den Verfahrensschritten, A1) Ermittlung eines NMR-Referenzdatensatzes mit den jeweiligen, für jede zu analysierende Lipoproteinklasse bzw. – subklasse charakteristischen Referenzparametern, B1) Erfassung zumindest eines NMR-Spektrums einer zu analysierenden Plasma- oder Serumprobe, C1) Annäherung eines berechneten NMR-Spektrums an das in B1) erfasste NMR-Spektrum mittels einer Gewichtung der in A1) erhaltenen Referenzparameter.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, – bei dem die charakteristischen Referenzparameter ausgewählt sind aus: chemischer Verschiebung, NMR-Signalintensität und NMR-Signalform.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und 19 bis 21, – bei dem die Dichte- und/oder Größenverteilung sowie die Konzentration von anderen inhomogenen Partikeln außer Lipoproteinen bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, 19 bis 22, – bei dem zusätzlich Variationen der T₁- und T₂-Relaxationszeiten durch Variation der Messbedingungen zur Klassifizierung der Lipoproteine benutzt werden.