DE102004007795A1 - Enzymatisches Umesterungsverfahren zur Herstellung von Diglyceriden und Diglycerid-Konzentraten - Google Patents

Enzymatisches Umesterungsverfahren zur Herstellung von Diglyceriden und Diglycerid-Konzentraten Download PDF

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Abstract

Die Erfindung beschreibt ein enzymatisches Verfahren zur Gewinnung von Diglyceriden und Diglycerid-Konzentraten durch Umesterung von Triglyceriden mit Monoglyceriden, wobei die Reaktionspartner ohne Lösungsmittel in Gegenwart von Lipasen im Vakuum reagieren. Die entstandenen Diglyceride und Diglycerid-Konzentrate werden durch Entsäuerung, Kurzweg-Vakuumdestillation oder chromatographische Verfahren gereinigt. Diglyceride und Diglycerid-Konzentrate können als Nahrungsergänzungen, Diätetika und Emulgatoren für Lebensmittel Verwendung finden.

Description

  • Die Erfindung ist charakterisiert durch die lösungsmittelfreie Umesterung von Triglyceriden (Triacylglycerinen) mit Monoglyceriden (Monoacylglycerinen), wobei die Reaktionspartner in Gegenwart von Lipasen im Vakuum zu Diglyceriden (Diacylglycerinen) reagieren.
  • Die allgemeine chemische Struktur der Ausgangs- und Endprodukte, die dieser Umesterungsreaktion zu Grunde liegen, ist in 1 dargestellt.
  • Figure 00010001
    Abbildung 1: Chemische Struktur von Tri-, Di- und Monoglyceriden (R = geradkettige oder verzweigte gesättigte sowie einfach oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen)
  • Diglyceride finden vielseitige Anwendung als Emulgatoren für Lebensmittel oder Bestandteile von Kosmetika und Pharmazeutika, vor allem im Gemisch mit Monoglyceriden (Krog, N. Food emulsifiers, in: Lipid technologies and applications [F.D. Gunstone and F.B. Padley, Eds.] Marcel Dekker, New York 1997, S. 521-534; EP 0744899 und EP 0744900 : Diglyceride enthaltende Fettmischungen; DE 19934943 A1 bis DE 19934946 A1 : Kosmetische und dermatologische Zubereitungen auf der Grundlage von O/W-Emulsionen; EP 1003551 : System zur Verabreichung von Antigenen, das Monoglyceride oder Diglyceride als Adjuvantien enthält). In der Lebensmittelindustrie werden Gemische von Mono- und Diglyceriden als Lebensmittelzusatzstoffe (EWG-Nr.: E472) eingesetzt. In jüngster Zeit wurde gefunden, dass Diglyceride, vor allem 1,3-Diglyceride, die Speicherung von Triglyceriden in den Fettgeweben des menschlichen Körpers und die Entstehung von Lipämien verringern. Sie können daher als Diätetika oder „funktionelle Lebensmittel" zur Verhinderung von Adipositas und Lipämien Verwendung finden (Nagao, T.; Watanabe, H.; Goto, N.; Onizawa, K.; Taguchi, H.; Matsuo, N.; Yasukawa, T.; Tsushima, R.; Shimasaki, H.; Itakura, H. Dietary diacylglycerol suppresses accumulation of body fat compared to tiacylglycerol in men in a double-blind controlled trial. J. Nutr., 2000, 130, 792-797; Matsuo, N.; Tokimitsu, I. Metabolic characteristics of diacylglycerol. An edible oil that is less likely to become body fat. Int. News Fats Oils Relat. Mat., 2001, 12, 1098-1102; Murase, T.; Mizuno, T.; Omachi, T.; Onizawa, K.; Komine, Y.; Kondo, H.; Hase, T.; Tokimitsu, I. Dietary diacylglycerol suppresses high fat and high sucrose diet-induced body fat accumulation in C57BL/6J mice. J. Lipid Res., 2001, 42, 372-378; Murase, T.; Aoki, M.; Wakisaka, T.; Hase, T.; Tokimitsu, I. Anti-obesity effect of dietary diacylglycerol in C57BL/6J mice: Dietary diacylglycerol stimulates intestinal lipid metabolism. J. Lipid Res., 2002, 43, 1312-1319; Maki, K.C.; Davidson, M.H.; Tsushima, R.; Matsuo, N.; Tokimitsu, I.; Umporowicz, D.M.; Dicklin, M.R.; Foster, G.S.; Ingram, K.A.; Anderson, B.D.; Frost, S.D.; Bell, M. Consumption of diacylglycerol oil as part of a reduced-energy diet enhances loss of body weight and fat in comparison with consumption of a tiacylglycerol control oil. Am. J. Clin. Nutr., 2002, 76, 1230-1236; Flickinger, B.D.; Matsuo, N. Nutritional characteristics of DAG oil. Lipids, 2003, 38, 129-132; Taguchi, H.; Watanabe, H.; Onizawa, K.; Nagao, T.; Gotoh, N.; Yasukawa, T.; Tsushima, R.; Shimasaki, H.; Itakura, H. Double-blind controlled study on the effects of dietary diacylglycerol on postprandial serum and chylomicron triacylglycerol responses in healthy humans. J. Amer. Coll. Nutr., 2000, 19, 789-796; Yamamoto, K.; Asakawa, H.; Tokunaga, K.; Watanabe, H.; Matsuo, N.; Tokimitsu, I.; Yagi, N. Long-term ingestion of dietary diacylglycerol lowers serum triacylglycerol in type II diabetic patients with hypertriglyceridemia. J. Nutr., 2001, 131, 3204-3207; Tada, N.; Yoshida, H. Diacylglycerol on lipid metabolism. Curr. Opin. Lipidol., 2003, 14, 29-33; Taguchi, H.; Omachi, T.; Nagao, T.; Matsuo, N.; Tokimitsu, I.; Itakura, H. Dietary diacylglycerol suppresses high fat diet-induced hepatic fat accumulation and microsomal triacylglycerol transfer protein activity in rats. J. Nutr. Biochem., 2002, 13, 678-683). In Japan haben Diglyceride daher bereits im Jahr 1999 den sog. FOSHU (Food for specified health use)-Status für spezielle gesundheitsfördernde Lebensmittel erhalten (Sakaguchi, H. Marketing a healthy oil. Oils Fats Internat., 2001, 18-19). In den USA erteilte die Food and Drug Administration (FDA) einem Speiseöl mit einem Diglycerid-Anteil von 80%, sog. DAG Oil (DAG = Diacylglycerin, Diglycerid), den GRAS (Generally Recognized As Safe)-Status (Sakaguchi, H. Marketing a healthy oil. Oils Fats Internat., 2001, 18-19). "DAG Oil" ist auch als Bestandteil weiterer Lebensmittel bekannt, etwa spezieller Speiseöle und Majonäsen, die als „funktionelle Lebensmittel" angeboten werden (Watkins, C. Time for an oil change. Int. News Fats Oils Relat. Mat., 2003, 14, 70).
  • Eine ganze Reihe von Methoden zur Herstellung und Gewinnung von Diglyceriden sind bekannt. Chemisch präparative sowie enzymatische Methoden eignen sich für die Synthese stereochemisch reiner sn-1,2-, sn-2,3- und sn-1,3-Diglyceride (Mangold, H.K.; Muramatsu, T. Preparation of reference compounds, in: CRC Handbook of chromatography, Lipids, Vol. II [H.K. Mangold, Ed.] CRC Press, Boca Raton, FL, USA, 1984, S. 319-329; Buchnea, D. Synthesis of C-18 mixed acid diacyl-sn-glycerol enantiomers. Lipids 1971, 6, 734-739; Krabisch, L.; Borgström, B. Synthesis of racemic 1,2-diolein. J. Lipid Res. 1965, 6, 156-157; Aha, B.; Berger, M.; Jakob, B.; Machmüller, G.; Waldinger, C.; Schneider, M.P. Lipasecatalyzed synthesis of regioisomerically pure mono- and diglycerides, in: Enzymes in lipid modification [U.T. Bornscheuer, Ed.] Wiley-VCH, Weinheim 2000, S. 100-115). Industriell werden Gemische von Mono- und Diglyceriden, die insbesondere als Emulgatoren für Fette und andere Lipide verwendet werden, durch lipasekatalysierte oder alkalikatalysierte partielle Hydrolyse von Triglyceriden und Umesterung von Triglyceriden mit Glycerin gewonnen (Weiss, A. Enzymatische Herstellung von festen Fettsäuremonoglyceriden. Fat Sci. Technol., 1990, 92, 392-396; Fischer, W. Herstellung hochkonzentrierter Monoglyzeride. Fette, Seifen, Anstrichm. 1981, 83, 507-510; Szelag, H.; Zwierzykowski, W. Esterification kinetics of glycerol with fatty acids in the presence of sodium and potassium soaps. Fett/Lipid 1998, 100, 302-307). Die enzymkatalysierte partielle Hydrolyse von Triglyceriden und Umesterung von Triglyceriden mit Glycerin zur Gewinnung von Diglyceriden ist ebenfalls bekannt (Mukherjee, K.D. Lipasecatalyzed reactions for modification of fats and other lipids. Biocatalysis, 1990, 3, 277-293; Bornscheuer, U.T. Lipase-catalyzed syntheses of monoacylglycerols. Enzyme Microb. Technol., 1995, 17, 578-586; Diks, R.M.M.; Bosley, J.A. The exploitation of lipase selectivities for the production of acylglycerols, in: Enzymes in lipid modification [U.T. Bornscheuer, Ed.] Wiley-VCH, Weinheim 2000, S. 3-22). „DAG Oil" wird in Japan durch lipasekatalysierte Veresterung von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit Glycerin hergestellt (Nagao, T.; Watanabe, H.; Goto, N.; Onizawa, K.; Taguchi, H.; Matsuo, N.; Yasukawa, T.; Tsushima, R.; Shimasaki, H.; Itakura, H. Dietary diacylglycerol suppresses accumulation of body fat compared to tiacylglycerol in men in a double-blind controlled trial. J. Nutr., 2000, 130, 792-797; Rosu, R.; Yasui, M.; Iwasaki, Y; Yamane, T. Enzymatic synthesis of symmetrical 1,3-diacylglycerols by direct esterification of glycerol in solvent-free system. J. Am. Oil Chem. Soc., 1999, 76, 839-843; Watanabe, T.; Shimizu, M.; Sugiura, M.; Sato, M.; Kohori, J.; Yamada, N.; Nakanishi, K. Optimization of reaction conditions for the production of of DAG using immobilized 1,3-regiospecific lipase Lipozyme RM IM. J. Am. Oil Chem. Soc., 2003, 80, 1201-1207).
    •
  • Im Unterschied zu den bekannten, oben erwähnten Verfahren, werden Diglyceride und Diglycerid-Konzentrate im folgenden, ausführlich beschriebenen Verfahren durch Umesterung von Triglyceriden mit Monoglyceriden unter Verwendung von Lipasen als Biokatalysatoren hergestellt (2), wobei die chromatographisch gereinigten Gemische von 1,2- und 1,3-Diglyceriden als "Diglyceride" und die durch Behandlung mit verdünnter Natriumcarbonat-Lösung entsäuerten oder durch Kurzweg-Vakuumdestillation gereinigten Reaktionsprodukte im Folgenden als "Diglycerid-Konzentrate" bezeichnet werden. Die Reaktion wird ohne Lösungsmittel und ohne Trockenmittel bei moderaten Temperaturen im Vakuum durchgeführt. Vielmehr werden Gemische der Reaktionspartner, d.s. Triglyceride und Monoglyceride, enzymkatalytisch in Gegenwart von Lipasen umgesetzt; vorhandenes Wasser wird im Vakuum aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Über solche lipasekatalysierten Umesterungsreaktionen von Triglyceriden mit Monoglyceriden zur Herstellung von Diglyceriden unter Vakuum ist bisher nichts bekannt.
  • Figure 00030001
    Abbildung 2: Lipasekatalysierte Umesterung von Tri- und Monoglyceriden zu isomeren Diglyceriden (R = geradkettige oder verzweigte gesättigte sowie einfach oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen)
  • Zur Herstellung von Diglyceriden werden insbesondere Triglycerid-Gemische natürlicher Pflanzenöle, wie z.B. erucasäurearmes Rapsöl („Doppelnull-Rapsöl"), konventionelles und ölsäurereiches Sonnenblumenöl, Sojaöl, Palmöl und Palmkernöl, Cocosöl und andere Pflanzenöle, eingesetzt. Auch fraktionierte Pflanzenöle, wie z.B. Stearin- und Olein-Fraktionen aus Palmöl und anderen Pflanzenölen kommen als Triglyceride in Frage. Weiterhin können Tierfette, wie z.B. Schweineschmalz, Rindertalg, Milchfett und fraktionierte Tierfette als Acyl-Donoren eingesetzt werden. Fischöle (Trane) eignen sich insbesondere zur Herstellung von Diglyceriden mit hohem Anteil an sehr langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Mikrobielle Öle (Öle aus niederen Pilzen und Einzellern), sog. Single Cell Oils (SCO) und Algenöle werden ebenfalls in diesem Bereich eingesetzt. Synthetische Triglyceride mit mittelkettigen Fettsäuren, beispielsweise sog. MCT-Öle, sowie andere synthetische Triglyceride mit geradkettigen oder verzweigten gesättigten und einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen können gleichfalls Verwendung finden.
  • Als Monoglyceride, die für die Umesterungsreaktion zur Gewinnung von Diglyceriden Verwendung finden, kommen sowohl kommerzielle Produkte in Frage als auch solche, die durch chemische oder enzymatische Verfahren aus natürlichen oder synthetischen Triglyceriden hergestellt wurden. Monoglyceride mit unterschiedlichen Fettsäure-Resten, wie z.B. Palmitin- und Stearinsäure-Reste sowie anderen gesättigten geradkettigten und verzweigten Carbonsäure-Resten oder Öl- und Linolsäure-Resten sowie anderen einfach und mehrfach ungesättigten Carbonsäure-Resten mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen, finden als Reaktionspartner Verwendung.
  • Die Umesterung (Alkoholyse) von Triglyceriden mit Hydroxy-Gruppen von Monoglyceriden benötigt grundsätzlich kein Vakuum, da gemäß der obigen Reaktionsgleichung (2) kein Wasser gebildet wird, das aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt werden muss. Dennoch erhöht sich auch hier die Ausbeute, wenn die Reaktion zur Entfernung von Restwasser aus dem Reaktionsgemisch im Vakuum durchgeführt wird.
  • Für die Herstellung von Diglyceriden können alle bekannten Lipasen als Enzymkatalysatoren verwendet werden, insbesondere immobilisierte Lipasen aus Mikroorganismen, wie z.B. aus Rhizopus arrhizus, Candida antarctica, Candida rugosa (= C. cylindracea), Rhizomucor miehei und Geotrichum candidum, Pankreaslipase aus verschiedenen Tierspezies sowie Lipasen aus Pflanzen, wie z.B. Papaya, Raps, Rizinus, Reis, Vernonia und Ananas.
  • Die lipasekatalysierten Synthesen von Diglyceriden können bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen durchgeführt werden, die insbesondere von den ausgewählten Lipasen abhängen. Im Allgemeinen werden Temperaturen zwischen 10 und 100°C angewendet, bevorzugt werden solche zwischen 30 und 80°C. Die molaren Verhältnisse zwischen den Reaktionspartnern, d.s. Triglyceride und Monoglyceride, sowie die Anteile der zugesetzten Lipasen unterliegen keinen Einschränkungen. Die Reaktionszeit ist ebenfalls nicht beschränkt. Rühren des Reaktionsgemisches und Erhöhung der Lipasemenge im Versuchsansatz steigern die Reaktionsgeschwindigkeit und beschleunigen die Bildung von Diglyceriden. Wiederholte Verwendung der in einem Reaktionsansatz benutzten Lipase in einem neuen Ansatz ist ohne nennenswerten Leistungsverlust des Biokatalysators möglich.
  • Unterdrücke zwischen 900 hPa und 0,1 hPa werden für die Reaktion bevorzugt verwendet; üblicherweise werden Drücke zwischen 200 hPa und 10 hPa eingehalten.
  • Die Anreicherung der Diglyceride kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Nach der Umsetzung wird der Enzymkatalysator durch Zentrifugation, Filtration oder Extraktion mit einem organischen, vorzugsweise apolaren Lösungsmittel vom Reaktionsgemisch abgetrennt. Diglycerid-Konzentrate werden durch Entsäuerung des Reaktionsgemisches mit verdünnter Natriumcarbonat-Lösung, vorzugsweise einer 2-5%igen Natriumcarbonat-Lösung, erhalten oder durch Kurzweg-Vakuumdestillation gewonnen, wobei Diglyceride und Triglyceride im Destillationsrückstand verbleiben. Reine 1,2- und 1,3-Diglyceride werden aus dem Reaktionsgemisch mit Hilfe chromatographischer Verfahren abgetrennt, vor allem durch Adsorptionschromatographie an Kieselgel, wobei das Reaktionsgemisch zunächst an einer Kieselgelsäule adsorbiert und die Diglyceride anschließend fraktioniert mit Lösungsmittelgemischen unterschiedlicher Polarität, beispielsweise Gemischen von iso-Hexan und Diethylether, eluiert werden.
    •
  • Im Folgenden werden verschiedene Ausführungsbeispiele gegeben für die Herstellung von Diglyceriden, die in beheizbaren Rührgefäßen unter Vakuum durchgeführt wird: Beispiel 1
    Triglyceride: Rapsöl-Triglyceride 85 mg (0,1 mmol)
    Monoglyceride: kommerzielles Monoglycerid Monomuls 90-018TM 96 mg (0,3 mmol)
    Lipase: Rhizomucor miehei-Lipase, immobilisiert (Lipozyme RM IM®, 25 mg
    Temperatur: 60°C
    Druck: 20-40 hPa
    Dauer: 45 min
    Aufarbeitung: Nach der Umsetzung wird der Enzymkatalysator vom Reaktionsgemisch durch zweimalige Extraktion mit je 3 mL Dichlormethan und anschließende Filtration abgetrennt. Das Lösungsmittel wird im Stickstoffstrom eingeengt und das Reaktionsgemisch für Lipidanalyse und Derivatisierung eingesetzt.
    Analyse: Die Analyse des Produktes erfolgt durch Gaschromatographie und Hochtemperatur-Gaschromatographie (HT-GC) wie in Beispiel 2 beschrieben.
    Zusammensetzung des Reaktionsproduktes (HT-GC) nach 45 min: Diglyceride 70%; Triglyceride (10%); Monoglyceride (10%); nicht veresterte Fettsäuren (7%)
  • Beispiel 2
  • Analyse der Diglyceride
  • Analytische Dünnschichtchromatographie an Kieselgel-Schichten
  • Anteile der Reaktionsgemische, gelöst in Dichlormethan, werden auf Kieselgel-Dünnschichtplatten (0,3 mm Schichtdicke) punkt- oder strichförmig aufgetragen. Die Platten werden in Diethylether vorentwickelt (ca. 3 cm) und dann in einem Gemisch von iso-Hexan/Diethylether/Eisessig (60:40:1, v/v) entwickelt und die verschiedenen Verbindungen des Reaktionsansatzes getrennt. Durch Besprühen der Platten mit einer wässrigen Schwefelsäure-Lösung und anschließendes Erhitzen auf 200°C oder durch Bedampfen mit Jod werden die unterschiedlichen Verbindungen sichtbar gemacht. Die Identifizierung der einzelnen Verbindungsklassen erfolgt durch Vergleich mit bekannten Standards. Die folgenden Rf-Werte werden für die verschiedenen Verbindungsklassen (langkettige Fettsäuren und deren Glycerin-Derivate) im Reaktionsgemisch unter Verwendung der obigen Laufmittel gefunden: Triglyceride 0,91; Fettsäuren 0,74; 1,3-Diglyceride 0,64; 1,2-Diglyceride 0,56; Monoglyceride 0,16. Für mittelkettige Fettsäuren und deren Glycerin-Derivate werden die folgenden Rf-Werte beobachtet: Triglyceride 0,72; Fettsäuren 0,65; 1,3-Diglyceride 0,22; 1,2-Diglyceride 0,14; Monoglyceride <0,1.
  • Präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel/Borsäure-Schichten
  • In gleicher Weise werden Anteile der Reaktionsgemische auf 0,5 mm Kieselgel/Borsäure-Schichten (Kieselgel mit 5% Borsäure-Anteil) aufgetragen. Die Tennung der verschiedenen Komponenten des Reaktionsgemisches erfolgt nach Vorentwicklung der Dünnschichtplatte in Diethylether (3 cm) mit einem Gemisch von iso-Hexan/Diethylether (3:2, v/v). Die verschiedenen Lipid-Fraktionen, die mit Hilfe von Standards identifiziert wurden, werden isoliert, mit einem Gemisch von Methanol und wasser-gesättigtem Diethylehter (1:1, v/v) extrahiert und getrocknet. Nach Filtration durch ein Spritzenfilter (0,45 μm) werden die folgenden Fraktionen für die Lipidanalyse verwendet: Triglyceride, isomere 1,2- und 1,3-Diglyceride, isomere 1- und 2-Monoglyceride (als Summe), nicht veresterte Fettsäuren.
  • Derivatisierung für die Gaschromatographie
  • Nicht veresterte Fettsäuren werden mit einer Lösung von Diazomethan in Diethylether in die entsprechenden Methylester umgewandelt. Tri-, Di- und Monoglyceride (jeweils etwa 2 mg) werden in Methyl-tert.-butylether gelöst und mit 20 μL Trimethylsulfoniumhydroxid-Reagenz bei 75°C (30 min) derivatisiert, um die entsprechenden Fettsäuremethylester zu gewinnen. Die Fettsäurezusammensetzung der einzelnen Methylester-Fraktionen wurde durch Gaschromatographie an einer J&W 40 m × 0,25 mm i.D. DB-23 Kapillarsäule (0,25 μm Filmdicke) mit Wasserstoff als Trägergas unter Verwendung folgenden Temperaturprogramms bestimmt: 160°C (2 min isotherm) gefolgt von einem linearen Temperaturanstieg mit 1°C/min auf 178°C, dann mit 8°C/min auf 225°C, gefolgt von einem linearen Anstieg mit 10°C/min auf 250°C (2 min isotherm). Für die verschiedenen Fettsäuremethylester der Reaktionsgemische werden beispielsweise folgende Retentionszeiten (Rt) beobachtet: Laurinsäure- 3,87; Myristinsäure-5,58; Palmitinsäure- 8,65; Palmitölsäure- 9,41; Stearinsäure- 14,00; Ölsäure- 14,66; Linolsäure- 16,29; α-Linolensäure- 16,53; Arachinsäure- 20,88 min; Behensäure- 25,27; Erucasäuremethylester 25,65 min. Das Temperaturprogramm für mittelkettige Fettsäure-methylester beginnt mit 100°C, gefolgt von einem linearen Temperaturanstieg von 1°C/min auf 180°C; für die mittelkettigen Fettsäure-methylester werden folgende Retentionszeiten (Rt) beobachtet: Caprylsäure- 5,12; Caprinsäure-methylester 9,93 min.
  • Nach Derivatisierung mit Diazomethan werden Anteile der Gesamtlipide (5-20 mg) für die HT-GC mit 100 μL MSHFBA-Reagenz in Gegenwart von 5 μL 1-Methylimidazol bei 100°C (30-60 min) silyliert. Danach werden die Reagenzien im Stickstoffstrom verdampft und die Derivate für die GC-Injektion in Dichlormethan gelöst. Die silylierten Lipid-Derivate werden gaschromatographisch getrennt an einer 12 m × 0,22 mm i.D. SGE HT5 AQ Kapillarsäule (0,1 μm Filmdicke) mit Wasserstoff als Trägergas, Temperaturprogramm: 100°C (2 min isotherm) gefolgt von einem linearen Temperaturanstieg mit 15°C/min auf 420°C (6 min isotherm). Für die verschiedenen Verbindungen der Reaktionsgemische werden beispielsweise folgende Retentionszeiten (Rt) beobachtet: Fettsäuren (als Methylester), z.B. Caprylsäure 0,62; Laurinsäure 4,27; Palmitinsäure 8,66; Linolsäure 10,37; Stearinsäure 10,61; Arachinsäure; 12,40 min. Monoglyceride (silyliert), z.B. Monocaprylin 7,59; Monocaprinin 9,51; Monolaurin 11,14; Monopalmitin 11,51; Monostearin 12,50 min. Diglyceride (silyliert), z.B. 1,2-Dicaprylin 12,71; 1,3-Dicaprylin 12,90; 1,2-Dilaurin 18,20; 1,2-Dilaurin 18,43; 1,2-Dipalmitin 22,56; 1,3-Dipalmitin 22,77; 1,2-Distearin 24,64; 1,3-Distearin 24,85 min. Triglyceride, z.B. Tripalmitin 26,19; Triolein 29,66 min. Response-Faktoren des Flammenionisationsdetektors wurden bestimmt für Mono-, Di- und Triglyceride sowie nicht veresterte Fettsäuren (als Methylester) unter Verwendung von bekannten Standards und von 1-Octacosanol als internem Standard. Beispiel 3
    Triglyceride: Rapsöl-Triglyceride 119 mg (0,14 mmol)
    Monoglyceride: kommerzielles Monoglycerid Mulgprime 90TM 29 mg (0,1 mmol)
    Lipase: Rhizomucor miehei-Lipase, immobilisiert (Lipozyrne RM IM®, 25 mg
    Temperatur: 60°C
    Druck: 20-40 hPa
    Dauer: 45 min
    Aufarbeitung: Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
    Analyse: Die Analyse des Produktes erfolgt durch Hochtemperatur-Gaschromatographie (HT-GC) wie in Beispiel 2 beschrieben.
    Zusammensetzung des Reaktionsproduktes (HT-GC) nach 45 min: Diglyceride 55%; Triglyceride (19%); Monoglyceride (13%); nicht veresterte Fettsäuren (13%) Beispiel 4
    Triglyceride: Rapsöl-Triglyceride 85 mg (0,1 mmol)
    Monoglyceride: kommerzielles Monoglycerid Monomuls 90-018TM 96 mg (0,3 mmol)
    Lipase: Rhizomucor miehei-Lipase, immobilisiert (Lipozyme RM IM®), 25 mg
    Temperatur: 50°C
    Druck: 20-40 hPa
    Dauer: 60 min
    Aufarbeitung: Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
    Analyse: Die Analyse des Produktes erfolgt durch Hochtemperatur-Gaschromatographie (HT-GC) wie in Beispiel 2 beschrieben.
    Zusammensetzung des Reaktionsproduktes (HT-GC) nach 60 min: Diglyceride 65%; Triglyceride (12%); Monoglyceride (12%); nicht veresterte Fettsäuren (10%) Beispiel 5
    Triglyceride: MCT-Öl-Triglyceride 50 mg (0,1 mmol)
    Monoglyceride: kommerzielles Monoglycerid Monomuls 90-018TM 96 mg (0,3 mmol)
    Lipase: Rhizomucor miehei-Lipase, immobilisiert (Lipozyme RM IM®), 25 mg
    Temperatur: 60°C
    Druck: 20-40 hPa
    Dauer: 180 min
    Aufarbeitung: Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
    Analyse: Die Analyse des Produktes erfolgt durch Hochtemperatur-Gaschromatographie (HT-GC) wie in Beispiel 2 beschrieben.
    Zusammensetzung der Diglycerid-Fraktion (HT-GC) nach 180 min: Diglyceride, die sowohl mittelkettige als auch langkettige Fettsäurereste enthalten (24%); Diglyceride, die nur kurzkettige Fettsäuren enthalten (<10%); Diglyceride, die nur langkettige Fettsäuren enthalten (>65%)
  • Beispiel 6
  • Die Fettsäurezusammensetzung der Ausgangsprodukte, d.s. Mono- und Triglyceride, ist in Tabelle 1 beschrieben; sie wird gaschromatographisch bestimmt, wie in Beispiel 2 dargestellt. Tabelle 1. Fettsäurezusammensetzung von kommerziellen Monoglyceriden und Rapsöl
    Figure 00080001
  • Beispiel 7
  • Die Fettsäurezusammensetzung verschiedener Lipidfraktionen, die durch Umesterung von Monomuls 90-O18TM-Monoglyceriden mit Rapsöl-Triglyceriden erhalten wurden, wird nach dünnschichtchromatographischer Trennung und Derivatisierung gaschromatographisch bestimmt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Tabelle 2. Fettsäurezusammensetzung von verschiedenen Lipidfraktionen aus Lipozyme RM IM-katalysierter Umesterung von Monomuls 90-O18TM-Monoglyceriden (0,3 mmol) mit Rapsöl-Triglyceriden (0,1 mmol) bei 60°C im Vakuum (20 hPa) für 15 und 120 min
    Figure 00090001
  • Beispiel 8
  • Die Fettsäurezusammensetzung verschiedener Lipidfraktionen, die durch Umesterung von Mulgaprime 90TM-Monoglyceriden mit Rapsöl-Triglyceriden erhalten wurden, wird nach dünnschichtchromatographischer Trennung und Derivatisierung gaschromatographisch bestimmt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Tabelle 3. Fettsäurezusammensetzung verschiedener Lipidfraktionen aus Lipozyme RM IM-katalysierter Umesterung von Mulgaprime 90TM-Monoglyceriden (0,1 mmol) mit Rapsöl-Triglyceriden (0,14 mmol) bei 60°C im Vakuum (20 hPa) für 15 und 120 min
    Figure 00100001
  • Beispiel 9
  • Die Zusammensetzung der verschiedenen durch lipasekatalysierte Umesterung von Mono- und Triglyceriden gewonnenen Lipidfraktionen vor und nach Kurzweg-Vakuumdestillation, wird nach dünnschichtchromatographischer Trennung und Derivatisierung gaschromatographisch bestimmt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Tabelle 4. Zusammensetzung der Lipidfraktionen aus verschiedenen Reaktionen der lipasekatalysierten Umesterung von kommerziellen Monoglyceriden mit Rapsöl-Triglyceriden vor und nach Kurzweg-Vakuum-Destillation
    Figure 00110001

Claims (7)

  1. Enzymatisches Umesterungsverfahren zur Herstellung von Diglyceriden (Diacylglycerinen) und Diglycerid-Konzentraten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Triglyceride (Triacylglycerine) oder Triglycerid-Gemische unter Rühren in Gegenwart von Lipasen mit Monoglyceriden (Monoacylglycerinen) reagieren, wobei vorhandenes Wasser im Vakuum aus dem Reaktionsgemisch entfernt wird.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei pflanzliche Öle und Fette sowie daraus gewonnene Fraktionen als Triglycerid-Gemische eingesetzt werden.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei tierische Fette einschließlich Fischöle und daraus gewonnene Fraktionen als Triglycerid-Gemische eingesetzt werden.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Algenöle oder mikrobielle Öle (Single Cell Oils) als Triglycerid-Gemische eingesetzt werden.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, wobei Gemische von Monoglyceriden mit unterschiedlicher Fettsäurezusammensetzung eingesetzt werden.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, wobei unterschiedliche Lipasen aus Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen als Enzymkatalysatoren eingesetzt werden.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6, wobei die entstandenen Diglyceride durch Entsäuerung, Kurzweg-Vakuumdestillation oder chromatographische Verfahren gereinigt werden.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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