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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der Expression
eines Zielgens in eukaryontischen Zellen oder Gewebe. Sie umfasst außerdem ein
Kit, das Reagenzien zur Hemmung der Transkription eines Zielgens
in einer Zelle enthält.
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Die
spezifische Hemmung der Genexpression ist für die therapeutische Forschung
von enormer Bedeutung. Genauer gesagt könnte sie eingesetzt werden,
um eine Technik zu entwickeln, mit der spezifisch die Funktion einzelner
Gene gehemmt werden kann.
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Insbesondere
könnte
sie verwendet werden, um die Progression spezifischer Krankheiten
zu verhindern, etwa bei Krebserkrankungen, Infektionskrankheiten
oder neurologischen Störungen,
indem z.B. die Funktion spezifischer Gene gehemmt wird.
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Außerdem könnte sie
eingesetzt werden, um die Unterschiede zwischen einem normalen und
einem erkrankten Gewebe analysieren zu können.
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Ferner
wäre sie
von Vorteil für
die Untersuchung der Zellproliferation, für die Analyse der Genfunktion
oder der funktionellen Veränderung
der Genexpression. Bestimmte Gene sind möglicherweise nur in bestimmten
Entwicklungsstadien für
die Lebensfähigkeit
einer Zelle oder eines Organismus erforderlich.
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Klassische
genetische Techniken wurden eingesetzt, um Mutationen in Organismen
mit einer verminderten Expression ausgewählter Gene zu charakterisieren.
Für solche
Techniken sind aufwendige Absuchverfahren erforderlich, außerdem sind
sie auf Organismen beschränkt,
bei denen sich die genetische Manipulation bereits etabliert hat.
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Diese
Schwierigkeiten lassen sich mit einem Verfahren umgehen, bei dem
die Genexpression in Säugerzellen
gehemmt wird, indem sie durch doppelsträngige (ds)-RNA gestört wird.
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Die
Technik beruht auf dem Einführen
von ds-RNAs in Zellen, wo es zu einer Störung spezifischer messenger-RNA(mRNA)-Moleküle kommt, wodurch
die Genexpression gehemmt wird.
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In
der internationalen Patentanmeldung WO 99/32619 wird ein Verfahren
beschrieben, mit dem die Genexpression in einem wirbellosen Modellorganismus
spezifisch gehemmt wird. Dieses Verfahren. beruht auf der Verwendung
von ds-RNAs und deren Einführen
in eine lebende Zelle, wodurch die Genexpression eines Zielgens
in dieser Zelle gehemmt wird. Die ds-RNAs werden in die Zelle, d.h.
intrazellulär,
oder extrazellulär,
d.h. in eine Körperhöhle, eingeführt.
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In
der internationalen Patentanmeldung WO 99/32619 kann ein in ein
Viruspartikel verpacktes virales Konstrukt verwendet werden, um
ein Expressionskonstrukt in die Zelle einzuführen und die durch das Expressionskonstrukt
codierte RNA wirksam zu transkribieren.
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WO
00/63364 beschreibt ein Verfahren zur Hemmung der Funktion eines
Zielgens, das auf der Verabreichung einer partiell doppelsträngigen RNA basiert,
die zu dem Zielgen homolog ist. Diese RNA kann z.B. als Bestandteil
eines aktivierten oder inaktivierten Virus vorliegen.
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Konstrukte
mit sowohl Sense- als auch Antisense-Sequenzen im gleichen viralen
Vektor bewirkten keine erfolgreiche Hemmung der Genexpression, was
höchstwahrscheinlich
auf einer unzulänglichen Wechselwirkung
mit der Ziel-mRNA zurückzuführen ist.
Es wurde postuliert, dass, wenn die Sense- und die Antisense-RNA durch ein einziges
Konstrukt codiert werden, die Bildung des RNA-Doppelstrangs unmittelbar erfolgt und
deshalb keine Wechselwirkung mit den mRNAs möglich ist.
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Kürzlich wurde
in einer wissenschaftlichen Veröffentlichung
(F. Wianny und M. Zernicka-Goetz, „Specific interference with
gene function by double stranded RNA in early mouse development", Nature Cell Biology,
Bd. 2, Februar 2000, S. 70–75)
beschrieben, dass synthetische ds-RNAs sowohl in Maus-Oocyten als
auch Präimplantations-Embryos mittels
Mikroinjektion eingeführt
wurden und eine spezifische Hemmung der Genexpression bewirkten.
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Eine
Hauptschwierigkeit besteht zurzeit darin, die ds-RNA effizient in
die Zellen einzuführen.
Auf diesem Gebiet wurde noch keine genetische Technik entwickelt,
mit der ds-RNAs direkt in Zellen eingeführt werden können.
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Natürlich wäre es vorteilhaft,
wenn ds-RNAs biologisch und nicht mechanisch in Zellen eingeführt werden
könnten.
Ein solches Einführen
würde die Manipulationen
reduzieren und verhindern, dass mechanische Zellschäden entstehen.
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Außerdem wäre die Fähigkeit,
ein spezifisches Zielgen hemmen zu können, ohne andere Gene der
Zelle zu beeinträchtigen,
von großer
Wichtigkeit.
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Schließlich wäre es von
wesentlichem Interesse, ein spezifisches Zielgen zu einem spezifischen Zeitpunkt
und an einer definierten Stelle in einem Gewebe oder Organismus
hemmen zu können,
ohne dass permanente Mutationen in das Zielgenom eingeführt werden
müssen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Hemmung der Expression
eines Zielgens in Zellen oder Gewebe bereit, umfassend die Infektion der
Zellen oder des Gewebes mit (a) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA)
enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln,
die einzelsträngige
Ribonucleinsäure
(ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei
der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen enthalten,
die zu einem Teil des Zielgens homolog sind.
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Der
hier verwendete Begriff „ds-RNA" bedeutet doppelsträngige RNA.
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Der
hier verwendete Begriff „ss-RNA" bedeutet einzelsträngige RNA.
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Der
hier verwendete Begriff „Sense" bedeutet eine RNA-Sequenz,
die dem Strang der mRNA entspricht.
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Der
hier verwendete Begriff „Antisense" bedeutet eine RNA-Sequenz,
die zu dem Sense-Strang der mRNA komplementär ist.
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Der
hier verwendete Ausdruck „eine
Sequenz, die spezifisch ist für" bedeutet, dass die
Sequenz des Sense- und des Antisense-RNA-Strangs mit dem Zielgen
in mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, stärker bevorzugt 99 % und am
stärksten
bevorzugt 100 % der Basen identisch ist.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Hemmung der Expression
eines Zielgens in Zellen oder Gewebe umfasst die Infektion der Zellen oder
des Gewebes mit (a) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA)
enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln,
die einzelsträngige
Ribonucleinsäure (ss-RNA)
enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense-
und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen enthalten, die zu
einem Teil des Zielgens homolog sind.
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Die
vorliegende Erfindung kann für
eine selektive Hemmung spezifischer Genfunktionen eingesetzt werden,
indem ds-RNAs in den Zellen biologisch erzeugt werden, im Gegensatz
dazu, dass ds-RNAs in die Zellen oder in das Gewebe mechanisch eingeführt werden.
Insbesondere kann sie zur Behandlung oder Verhinderung spezifischer
Krankheiten oder pathologischer Befunde eingesetzt werden, wobei
eine spezifische Überexpression
von Genen gehemmt wird, die für
das Ausbrechen oder die Fortdauer der Krankheiten oder der pathologischen Befunde
erforderlich ist.
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Eine
Behandlung würde
eine Besserung beliebiger Symptome, die bei der Krankheit auftreten, oder
klinischer Indikationen umfassen, die mit den pathologischen Befunden
assoziiert sind.
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Z.B.
kann die vorliegende Erfindung zur Behandlung oder zur Vorbeugung
bei Patienten eingesetzt werden, die an Tumoren leiden, indem eine
spezifische Genfunktion gehemmt wird. Tumoren umfassen Krebserkrankungen
des Ovars, der Prostata, der Brust, des Colons, der Leber, des Magens,
des Gehirns, von Kopf und Hals sowie der Lungen.
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Eine
weitere Verwendung der vorliegenden Erfindung könnte ein Verfahren darstellen,
mit dem eine Genfunktion in einem Organismus durch eine spezifische
Hemmung der Expression identifiziert wird.
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Außerdem kann
die vorliegende Erfindung für
die Analyse und Verhinderung des Mechanismus für Wachstum, Entwicklung, Stoffwechsel,
Widerstandsfähigkeit
gegenüber
einer Krankheit oder andere biologische Prozesse eingesetzt werden.
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Der
vorliegende Erfindung weist die folgenden Vorteile auf: die Einfachheit
einer biologischen Erzeugung von ds-RNAs in Zellen oder Gewebe,
die hocheffiziente Amplifikation der eingeführten ss-RNAs, die Stabilität von ds-RNAs
in Zellen und Gewebe und die Wirksamkeit der Hemmung sowie die biologische
Sicherheit.
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Der
Begriff „Alphavirus" hat seine herkömmliche
Bedeutung nach dem Stand der Technik und umfasst die verschiedenen
Arten von Alphaviren, wie Eastern Equine Encephalitis-Virus (EEE),
Venezuelan Equine Encephalitis-Virus (VEE), Everglades-Virus, Mucambo-Virus,
Pixuna-Virus, Western Equine Encephalitis-Virus (WEE), Sindbis-Virus, South
African Arbovirus Nr. 86, Semliki Forest-Virus, Middelburg-Virus, Chikungunya-Virus,
O'nyong-nyong-Virus,
Ross River-Virus, Barmah Forest-Virus, Getah-Virus,
Sagiyama-Virus, Bebaru-Virus, Mayaro-Virus, Una-Virus, Aura-Virus, Whataroa-Virus,
Babanki-Virus, Kyzylagach-Virus, Highlands J-Virus, Fort Morgan-Virus,
Ndumu-Virus und Buggy Creek-Virus. Der Begriff „Alphavirus" umfasst auch Vektoren,
die davon hergeleitet sind. Bevorzugte Alphaviren umfassen z.B.
das Semliki Forest-Virus (SFV) (Liljeström und Garoff, 1991, „A new
generation of animal cell expression vectors based on the Semliki
Forest virus replicon",
Bio/Technology 9, 1356-1361), Sindbis-Virus (SIN) (Xiong et al., „Sindbis
virus: An efficient broad host range vector for gene expression
in animal cells",
Science 243 (1989), 1188-1191)
und Venezuelan Equine Encephalitis-Virus (VEE) (Davis et al., „In vitro
synthesis of infectious venezuelan equine encephalitis virus RNA from
a cDNA clone: Analysis of a viable deletion mutant", Virology 171 (1989),
189-204). Das Alphavirus und davon hergeleitete Vektoren sind dem
Fachmann bekannt und im Handel erhältlich.
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In
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Zellen oder
das Gewebe mit einer Menge von Viruspartikeln, die ss-RNA enthalten,
infiziert, so dass mindestens eine Kopie pro Zelle übertragen werden
kann. Wie hier beschrieben wird die Infektion mit einer Anzahl durchgeführt, die
größer oder
gleich zehn Viruspartikeln pro Zelle entspricht.
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Das
Infektionsverfahren ist dem Fachmann bekannt. Die in vitro-Infektion
von Zell-Linien und primären
Zellkulturen, wie z.B. Fibroblasten, Hepatocyten, Neuronen, erfolgt,
indem SFV-Partikel direkt zu den Zellkulturen zugegeben werden.
Die Viruspartikel erkennen Rezeptoren auf der Zelloberfläche, durchdringen
die Zellmembran entweder durch Fusion oder durch Endocytose (abhängig vom
Zelltyp), wonach die RNA-Moleküle
ins Cytoplasma freigesetzt werden („The Alphaviruses: Gene Expression, Replication
and Evolution",
Strauss, J. H., und Strauss, E. G., Microbiological Reviews 58 (1994), 491-562).
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Für eine in
vivo-Infektion ist die Injektion der SFV-Partikel ins Zielgewebe
erforderlich. Eine Injektion von SFV-Partikeln („Efficient in vivo expression
of a reporter gene in rat brain after injection of recombinant replication-deficient
Semliki Forest virus",
Lundstrom, K., Grayson, J. R., Pink, J. R., und Jenck, F., Gene
Therapy & Molecular
Biology 3 (1999), 15-23) führt
zu einer ähnlichen
Infektionsprozedur wie vorstehend für die in vitro-Situation beschrieben.
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Zellen
oder Gewebe werden im vorstehenden Verfahren mit separaten Viruspartikeln
infiziert, die komplementäre
Stränge,
Sense- und Antisense-RNA-Stränge
exprimieren.
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Wie
hier beschrieben können
Zellen oder Gewebe im vorliegenden Verfahren mit gleichen Mengen
von Viruspartikeln, die den Sense-RNA-Strang enthalten, und von
Viruspartikeln, die den Antisense-RNA-Strang enthalten, gemeinsam infiziert
werden, wodurch die Bildung von ds-RNAs ermöglicht wird, die in der Lage
sind, die Genexpression zu stören.
Durch höhere
Dosen von ds-RNA kann möglicherweise
eine stärkere
Hemmung bewirkt werden.
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In
der vorliegenden Erfindung enthalten die Viruspartikel den ss-RNA-Strang,
der Nucleotidsequenzen umfasst, die zu einem Teil des Zielgens homolog
sind, und dieser ss-RNA-Strang wird in den Vektor des Alphavirus
cloniert. Der ss-mRNA-Strang kann
entweder in Sense- oder in Antisense-Orientierung in den Vektor
cloniert werden. Die anderen Gene, die im Vektor vorliegen, sind
die Nicht-Strukturgene des Alphavirus, insbesondere die Gene nsP-1-4 („The Alphaviruses:
Gene Expression, Replication, and Evolution", Strauss, J. H., und Strauss, E. G.,
Microbiological Reviews 58 (1994), 491-562), die für die RNA-Replikation
in Wirtszellen verantwortlich sind. Die Expression von nsP-1-4 führt zur
Bildung des Replicase-Komplexes, der eine intensive RNA-Replikation
in Gang setzt, d.h. die Erzeugung großer Mengen von Sense- und Antisense-RNA,
die zu einer effizienten Bildung von ds-RNA in der Lage sind.
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Das
hier beschriebene Verfahren ermöglicht allgemein
die Hemmung vieler verschiedener Arten von Zielgenen in eukaryontischen
Zellen oder Gewebe. Das Zielgen kann ein eukaryontisches Gen, ein Virusgen,
ein Gen eines Krankheitserregers oder ein synthetisches Gen sein.
Natürlich
kann das Zielgen ein aus der Zelle stammendes Gen, d.h. ein zelluläres Gen,
ein Transgen, d.h. ein Genkonstrukt, das an einer ektopischen Stelle
im Genom der Zelle eingefügt
ist, oder ein Gen aus einem Krankheitserreger sein, der einen Organismus
infizieren kann, aus dem die Zelle stammt.
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Die
Zielgene können
ein beliebiges Gen von Interesse sein, wobei bereits eine große Zahl
von Proteinen von Interesse identifiziert und isoliert wurde. Das
Zielgen kann z.B. ein die Entwicklung betreffendes Gen, wie Cyclinkinase-Inhibitoren,
Wachstums-/Differenzierungs-Faktoren und ihre Rezeptoren, Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT),
ein Onkogen, ein Tumorsuppressor-Gen oder ein Enzym sein. Ein von
einem beliebigen Krankheitserreger stammendes Gen kann das Ziel
der Hemmung sein.
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Da
die Hemmung der vorliegenden Erfindung sequenzspezifisch ist, umfassen
die in die Zellen oder ins Gewebe eingeführten Sense- und Antisense-RNA-Stränge eine
komplementäre
Nucleotidsequenz eines Teils des Zielgens.
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Zum
Durchführen
der vorliegenden Erfindung ist es nicht erforderlich, dass eine
vollständige Homologie
zwischen der RNA und dem Zielgen vorliegt. Wie hier beschrieben
werden Sequenzvariationen toleriert, die z.B. auf genetischen Mutationen, Polymorphismen
oder evolutionären
Abweichungen beruhen. Es wurde gefunden, dass RNA-Stränge für Hemmungen
wirksam sind, die im Vergleich zum Zielgen Insertionen, Deletionen
und einzelne Punktmutationen aufweisen.
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Die
Länge der
homologen Nucleotidsequenz sollte mindestens 50 Basen, vorzugsweise
75, 100 oder 125 Basen ausmachen.
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In
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung äußert sich die Hemmung der Expression
des Zielgens durch einen phänotypischen
Verlust. Abhängig vom
Zielgen und der intrazellulären
Dosis der ds-RNA kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu
einem teilweisen oder vollständigen
Verlust der Funktion des Zielgens in den Zellen oder im Gewebe des
Organismus führen.
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Die
Hemmung der Genexpression bezieht sich auf das Fehlen oder die Abnahme
des Spiegels des Proteins und/oder der mRNA aus dem Zielgen. Die
Folgen der Hemmung auf Eigenschaften der Zelle oder des Organismus
können
durch Verfahren der Molekularbiologie getestet werden, wie z.B.
RNA-Lösung-Hybridisierung,
Northern-Hybridisierung (Sambrook et al., Molecular Cloning, Bd.
1, 7. 37 und 7.39) und biochemische Tests, wie z.B. Enzyme-linked
Immunosorbent Assay (ELISA), Western Blotting (Towbin et al., 1979;
Bunette, 1981, oder Sambrook et al., Molecular Cloning, Bd. 3, 18.60)
oder Radioimmuntest (RIA) (Sambrook et al., Molecular Cloning, Bd.
3, 18.19-18-20).
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Das
Ausmaß der
Hemmung kann bestimmt werden, indem die Werte aus unbehandelten
Zellen mit denen verglichen werden, die aus Zellen erhalten wurden,
die gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung behandelt wurden.
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Wie
hier beschrieben können
die eukaryontischen Zellen oder das Gewebe mit dem Zielgen einen
beliebigen Zell- oder Gewebetyp darstellen, der mit einem Alphavirus
infiziert werden kann. Sie können
z.B. aus dem vaskulären
oder extravaskulären Kreislauf,
aus dem Blut- oder Lymphsystem, aus Muskeln, Leber, Gehirn oder
aus der Zerebrospinalflüssigkeit
stammen.
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Die
eukaryotischen Zellen oder das Gewebe können in einem beliebigen Organismus
enthalten sein, einschließlich
z.B. Fisch, Amphibien, Reptilien, Insekten oder Säuger, wie
Rind, Schwein, Hamster, Maus, Ratte, Primat und Mensch.
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Außerdem beansprucht
die vorliegende Erfindung ein Kit, das Reagenzien zur Hemmung der Expression
eines Zielgens umfasst, wobei das Kit mindestens eine ausreichende
Menge von einzelsträngigen
viralen RNA-Partikeln enthält,
die entweder den Sense- oder den Antisense-RNA-Strang darstellen,
die zueinander komplementär
sind und eine ds-RNA bilden, umfassend eine Nucleotidsequenz, die
zu einem Teil des Zielgens homolog ist, und die in der Lage sind,
die Expression des Zielgens zu stören.
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Ein
solches Kit kann Reagenzien umfassen, die erforderlich sind, um
die RNA in vivo oder in vitro in die Testproben oder Individuen
einzuführen.
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Ein
solches Kit kann auch Anweisungen enthalten, anhand dessen ein Anwender
des Kits die Erfindung durchführen
kann.
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Die
Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird auch für die Behandlung
oder Verhinderung von Krebs beansprucht.
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Zur
Behandlung kann ein Zielgen ausgewählt werden, das während der
Entwicklung der Krebserkrankung exprimiert wird oder das die Ursache
des pathologischen Befunds ist.
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Zur
Verhinderung einer Krankheit oder eines pathologischen Befunds kann
ein Zielgen ausgewählt
werden, das für
das Aubrechen und/oder die Fortdauer der Krankheit oder des pathologischen
Befunds erforderlich ist.
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Die
vorliegende Erfindung kann für
die Behandlung oder Verhinderung von Krebs eingesetzt werden, einschließlich solider
Tumoren oder Leukämien,
indem Tumoren mit den viralen Vektoren, die Sense- und Antisense-RNA
enthalten, gemeinsam infiziert werden, mit dem Ziel, ds-RNA für die Hemmung
der mRNA-Translation
eines Gens zu erzeugen, das für
die Fortdauer des karzinogenen/tumorigenen Phänotyps erforderlich ist.
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Die
vorliegende Erfindung kann z.B. für die Behandlung oder Verhinderung
von Infektionskrankheiten eingesetzt werden, die auf einen Krankheitserreger
zurückzuführen sind.
Zellen oder Gewebe, die/das mit dem menschlichen Immundefizienzvirus (HIV)
infiziert sind/ist oder die/das damit infiziert werden können/kann,
können/kann
gemäß der vorliegenden
Erfindung als Ziel dienen, um die Expression eines spezifischen
Gens zu hemmen, das für
das Ausbrechen und/oder die Fortdauer der Infektion verantwortlich
oder dafür
erforderlich ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von (a) Viruspartikeln,
die einzelsträngige
Ribonucleinsäure
(ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln, die
einzelsträngige
Ribonucleinsäure
(ss-RNA) enthalten,
die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der
Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen umfassen, die zu einem Teil
eines Zielgens homolog sind, zur Herstellung eines Medikaments zur
Behandlung oder Verhinderung von Krebs.
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Die
vorliegende Erfindung läßt sich
anhand der folgenden Beispiele besser verstehen, wobei diese lediglich
der Erläuterung
dienen und die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen.
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Die
nachstehenden Beispiele werden zusammen mit den folgenden Figuren
präsentiert.
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Figuren
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1: Hemmung
der Expression von Aldolase A mit Block-Stammpräparaten.
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- Abbildung A: Schematische Darstellung des menschlichen Aldolase-A-Gens
und von Sonden, die für
die Expressionsanalyse verwendet wurden. A und B sind Fragmente,
die als Sonde zum Testen von Northern-Blots eingesetzt wurden (2).
V und G sind Primerpaare, die entweder die durch die Virus-Stammpräparate dargestellte
RNA oder andere selektiv chromosomale Transkripte amplifizieren.
- Abbildung B: Nachweis von entweder viral codierter Aldolase-mRNA
mit VA/VB (die ersten zwei Darstellungen von oben) oder von endogen
codierter mRNA unter Verwendung von GA/GB (die unteren Darstellungen).
Co sind nicht-infizierte Kontrollzellen, s ist mit dem Sense-Strang-Virus
und as mit dem Antisense-Virus infiziert, und ds stellt ein 1:1-Gemisch
aus beiden Virus-Stammpräparaten
dar (Block-Stammpräparat).
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2: Analyse
von Aldolase-RNA durch Northern-Blots
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Obere
Abbildung: Die Gesamt-RNA von infizierten Zellen (vgl. 1)
wurde durch Gelanalyse aufgetrennt, auf eine Membran überführt und
entweder mit der markierten Sonde A, die die durch das Virus dargestellte
Region abdeckt, oder mit der Sonde B getestet, die für chromosomale
Kopien von Aldolase-A-RNA spezifisch ist. Für die Sonde A war eine Exposition
von 1,5 Stunden und für
die Sonde B eine Übernacht-Exposition
auf Röntgenfilm
erforderlich. Unten ist ein gescanntes Diagramm der Autoradiographie
des Sonde-B-Blots dargestellt.
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3: Korrelation
zwischen der Hemmung der Gen-Transkription und der Virustitration
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Die
Zellen wurden mit einer MOI (Infektions-Multiplizität) von 0,5
bis 50 mit s/as-Virus-Block-Stammpräparaten infiziert und 24 Stunden inkubiert.
Die Gesamt-RNA wurde
isoliert und in cDNA überführt. Eine
PCR wurde 25 Zyklen lang mit Primern durchgeführt, die entweder für Aldolase
oder für
GAPDH (Kontrolle) spezifisch waren. Die Amplicons wurden durch herkömmliche
Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht. Die Ergebnisse mit zwei unabhängigen Virus-Block-Stammpräparaten
sind dargestellt (1/3 und 4/5).
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4: Kinetiken
der Hemmung durch as/s-Virus-Stammpräparate
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HEK-Zellen
(menschliche embryonale Nierenzellen) wurden mit 1/3 Block-Stammpräparaten oder
mit den einzelnen s- und as-Stammpräparaten infiziert. Die Zellen
wurden die angegebenen Zeiten inkubiert, worauf eine PCR-Analyse
der Transkriptebenen folgte.
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5: Messung
der Enzymaktivität
von Aldolase A
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Co
bedeutet den Enzymwert in nicht-infizierten Zellen, und B stellt
einen Puffer als negative Kontrolle dar, as-, s- und Block-Stammpräparate (ds) wurden
zur 24-stündigen Infektion
von Zellen bei einer MOI von 25 eingesetzt. Die Zellen wurden geerntet,
lysiert und die Enzymaktivität
unter Verwendung eines kommerziellen Tests anhand von 3 oder 5 μl Lysat gemessen.
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6: Anhalten
des Zellzyklus durch Abwärts-Regulation
von Cyclin
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- Von links nach rechts: 1. Kontrolle Medium; 2. nicht-infizierte
Zellen (maximale Proliferation); 3. Zellen, die mit einem Virus
infiziert waren, das das grüne fluoreszierende
Protein (GFP) exprimierte (Kontrolle der Infektion); 4. und 5. Kontrolle
des Tests mit den Antibiotika G418 und Zeocin; 6. ds-RNA der menschlichen
Aldolase A (Kontrolle der Hemmung); 7. Cyclin A-Sense-SFV; 8. Cyclin
A-Antisense SFV; 9. Cyclin A-Sense- und Antisense-SFV (ds); 10.
Cyclin B-Sense-SFV; 11. Cyclin B-Antisense-SFV; 12. Cyclin B-Sense-
und Antisense-SFV (ds); 13. Cyclin A-Sense- und Cyclin B-Sense- und Antisense-SFV
(ds).
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7:
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- Mikroskopische Abbildung einer Kultur von Zellen, infiziert
mit einem GFP-exprimierenden Virus, und einer Kultur von Cyclin
A- und Cyclin B-Sense- und Antisense-SFV.
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Die
in den nachstehenden Beispielen erforderlichen Verfahren und Techniken
sind aus der Literatur bekannt und werden z.B. in Sambrook et al., 1989,
beschrieben.
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In
den nachstehenden Beispielen ist der verwendete SFV-Vektor eine
nicht-cytopathogene
Version mit zwei Punktmutationen im SFV-Nicht-Strukturgen nsP2 (Ser259Pro
und Arg650Asp), beschrieben von Lundstrom, K., Schweitzer, C., Richards,
J. G., Ehrengruber, M. U., Jenck, F., und Muelhardt, C., 1999, „Semliki
Forest virus vectors for in vitro und in vivo applications", Gene Therapy and
Molecular Biology 4 (1999), 23-31. Dieser modifizierte SFV-Vektor bewirkt
in den infizierten Wirtszellen keine Hemmung der endogenen Genexpression,
so dass eine gezielte und spezifische Genhemmung durch die ds-RNA-Technologie
möglich
ist.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Hemmung der Expression
von Aldolase A in BHK-Zellen (Baby Hamster Nierenzellen) (registrierte
ATCC-Nummer: CCL-10) (1)
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Auf
Grundlage des menschlichen Aldolase-A-Gens (M. Sakakibara, T. Mukai
und K. Hori, „Nucleotide
sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in
the liver", Biochem.
Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420) wurden drei Paare von
Oligonucleotid-Primern ausgewählt, um
die erforderlichen Genregionen zu amplifizieren. VA (Nt. 210 bis
240, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori, „Nucleotide
sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in
the liver", Biochem.
Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben) und VB (Nt.
740 bis 710, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori, „Nucleotide sequence
of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in the liver", Biochem. Biophys.
Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben) amplifizieren eine
Region von etwa 600 Nucleotiden, die für die Konstruktion der Sense-
und Antisense-Virus-Stammpräparate
verwendet wurde. GA (Nt. 170 bis 200, wie von M. Sakakibara, T.
Mukai und K. Hori, „Nucleotide
sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in
the liver", Biochem.
Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben) und GB (Nt.
780 bis 750, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori, „Nucleotide
sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in
the liver", Biochem.
Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben) amplifizieren
eine chromosomale Region des Aldolase-Gens. Die Northern-Sonde A
wird unter Verwendung der Primer VA und VB hergestellt, und die
Sonde B wird mit einem Primerpaar der Stromaufwärts-Region amplifiziert (Nt.
951 bis 980 und Nt. 1330 bis 1301, wie von M. Sakakibara, T. Mukai
und K. Hori, „Nucleotide
sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in
the liver", Biochem.
Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben). Die Zellen
wurden infiziert und 24 Stunden gezüchtet. Die RNA wurde isoliert
und gemäß herkömmlichen
Verfahren in cDNA überführt. Alle
PCR-Produkte wurden für
die Sequenzierung in herkömmliche
Clonierungsvektoren subcloniert. VA/VB wurde weiter in den SFV-Vektor
cloniert, um infektiöse
SFV-Partikel zu erzeugen. Die viral codierte Aldolase-mRNA ist reichlich
vorhanden und lässt
sich nach 15 PCR-Zyklen in Virusinfizierten Zellen nachweisen. In
Zellen ohne Virus wird kein Signal erhalten. Unter Verwendung der genomischen
Primer für
Aldolase-mRNA wird eine Bande der erwarteten Größe in den nicht-infizierten Zellen
und in Zellen, die mit Sense- oder Antisense-produzierenden Viren
infiziert waren, nachgewiesen. Das Gemisch aus sowohl Sense- als
auch Antisense-Viren ist eine wirksamer Inhibitor der Expression
des chromosomalen Aldolase-Gens, während die Expression der viralen
Gene unbeeinflusst bleibt.
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Beispiel 2
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Analyse von Aldolase-RNA
durch Northern-Blots (2)
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Die
Gesamt-RNA aus nicht-infizierten Zellen oder aus Zellen, die mit
den angegebenen Virus-Stammpräparaten
infiziert waren, wurde auf einem herkömmlichen Formamid-Gel aufgetrennt, nach
der Elektrophorese auf eine Nitrocellulose-Membran überführt und
anschließend
entweder mit dem radiomarkierten Fragment A oder B als Sonde getestet
(vgl. Beispiel 1). Die Sonde A weist aufgrund der kurzen Expositionszeit
von 45 Minuten fast ausschließlich
die aus dem Virus stammende Aldolase-RNA nach. Die Sonde B weist
nach 16 Stunden Exposition des hybridisierten Blots mit dem Film
lediglich chromosomal codierte Aldolase-mRNA nach. Ein gefärbtes Gel
mit ribosomaler RNA wurde verwendet, um das Auftragen zu kontrollieren
(unter der Sonde B). Insbesondere aus dem gescannten Diagramm des
Gels ist deutlich ersichtlich, dass die Spiegel der Aldolase-mRNA
in den Zellen am niedrigsten sind, die mit beiden Viren infiziert
sind.
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Beispiel 3
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Die Hemmung der Gen-Transkription
ist von den Virustitern abhängig
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Wie
aus 3 ersichtlich ist, beginnen die Spiegel der Aldolase-mRNA
im Vergleich zur Kontrolle bei einer MOI von 12,5 abzunehmen, und
bei 50 kann unter Verwendung dieses empfindlichen Tests im wesentlichen
keine mRNA nachgewiesen werden. Dagegen werden die Spiegel eines
anderen chromosomalen Kontrollgens (GAPDH) mit steigender MOI nicht
verändert.
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Beispiel 4
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Kinetiken einer Hemmung
durch as/s-Virus-Stammpräparate
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BHK-Zellen
(registrierte ATCC-Nummer: CCL-10) wurden mit as- oder s- oder einem
as/s-Gemisch von Aldolase-RNA-Virus-Stammpräparaten infiziert. Zu den in
der Figur angegebenen Zeitpunkten wurde die RNA isoliert und in
cDNA überführt. Nach der
PCR wurden die Produkte durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert.
Nach acht Stunden zeigt sich eine geringfügige Zerstörung der genomischen Aldolase-RNA,
und die höchste
Aktivität lässt sich
nach 48 Stunden nachweisen. In diesem bestimmten Experiment beeinflusste
auch das Sense-darstellende Virus die Stabilität der RNA. Die GAPDH-RNA bleibt
unverändert,
außer
in den 48- und 72-Stunden-Proben,
in denen eine Verringerung der RNA-Spiegel in den Zellen deutlich
wird, die mit dem s/as-Virus-Gemisch infiziert waren. Dies hängt möglicherweise
mit dem Absterben der Zellen zusammen, da es sich bei der Aldolase
um ein essentielles Enzym handelt.
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Beispiel 5
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Verringerung der Aldolase-Enzymkaktivität durch s/as-Aldolase-Virusstammpräparate
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BHK-Zellen
(registrierte ATCC-Nummer: CCL-10) wurden mit den angegebenen Stammpräparaten
infiziert und 24 Stunden unter herkömmlichen Bedingungen für die Zellkultur
gezüchtet.
Die Zellen wurden geerntet und in 1 × PBS, enthaltend 0,2 % Triton
X-100, lysiert. Nach zehnminütiger
Zentrifugation bei 16 000 × g
und bei 4°C
wurde der Überstand
gewonnen und entweder 3 μl
(graue Balken) oder 5 μl
(schwarze Balken) anhand eines kommerziellen Kits (SIGMA, Katalog-Nr.
752-A) und des gelieferten Protokolls getestet. Die deutlichste
Verringerung der Enzymaktivität
tritt wie erwartet in der Probe auf, die mit den beiden s- und as-Virus-Stammpräparaten
infiziert war.
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Beispiel 6
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Das „Niederschlagen" („knock
down") von Cyclin führt zu einem
Anhalten des Zellzyklus
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Anhalten
des Zellzyklus durch eine Abwärts-Regulation
von Cyclin Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293-Zellen) (registrierte ATCC-Nummer:
CRL-1573) wurden zum Zeitpunkt Null mit den angegebenen SFV-Viruspartikeln
infiziert und die Proliferation nach 20 (hellgraue Balken) und 40
Stunden (dunkelgraue Balken) in Kultur unter Verwendung eines kommerziellen
Farbtests getestet (Promega G5421 gemäß dem technischen Merkblatt TB245).
Das Gemisch der Cyclin A- und
B-blockierenden Viruspräparate
war am effektivsten und sogar noch wirksamer als die Hemmung des
Zellwachstums durch Antibiotika (Neomycin und Zeocin).
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Die
Sequenz von Cyclin A ist wie beschrieben („Hepatitis B virus integration
in a cyclin A gene in a hepatocellular carcinoma", Wang, Chevenisse X., Henglein, B.,
Brechot, C., Nature 343 (1990), 555-557), und die Sequenz von Cyclin
B ist wie be schrieben (Kim, D. G., Choi, S. S., Kang, Y. S., Lee, K.
H., Kim, U.-J., Shin, H.-S., eingereicht (6. Mai 1997) bei den EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken, Hinterlegungsnummer
AF002822, Life Science, Pohang University of Science and Technology,
San 31, Pohang, Kyungbuk 790-784, Korea).
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Beispiel 7
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Züchten von Zellen, die mit Sense
und Antisense in einem Vektor infiziert waren
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Sense-
und Antisense-Fragmente der Cyclin A- und B-Gene wurden in einen
einzelnen SFV-Vektor cloniert, indem ein zweiter subgenomischer 26S-Promotor
eingeführt
wurde. Die Konstrukte waren wie folgt:
- SFV 26S – Sense-Cyclin
A – SFV
26S – Antisense-Cyclin
A und
- SFV 26S – Sense-Cyclin
B – SFV
26S – Antisense-Cyclin
B.
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Infektionen
von HEK293-Zellen mit SFV-Cyclin A oder SFV-Cyclin B alleine oder
mit beiden zusammen bewirkten keinerlei Anhalten der Zellproliferation.
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Dies
zeigte, dass Konstrukte mit sowohl Sense- als auch Antisense-Fragmenten im gleichen
Vektor nicht in der Lage sind, die Expression chromosomaler Cyclin-Gene
zu hemmen.