DE10148553A1

DE10148553A1 - Proteinaseinhibitoren zur Therapie und Diagnose von neurodegenerativen Krankheiten

Info

Publication number: DE10148553A1
Application number: DE2001148553
Authority: DE
Inventors: Helmut E Meyer; Joachim Prof Dr Dr Klose; Claus Zabel
Original assignee: Protagen GmbH
Current assignee: Protagen GmbH
Priority date: 2001-10-01
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2003-04-17
Also published as: WO2003028621A3; AU2002362488A1; WO2003028621A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel, enthaltend (Serin-)Proteinaseinhibitoren, wie alpha-1-Antitrypsin, zur Prävention/Therapie und Diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens ein Proteinaseinhibitor mit mindestens einem Chaperon bzw. alpha-B-Kristallin kombiniert.

Description

Neurodegenerative Erkrankungen sind erbliche oder sporadisch auftretende Zustände, welche durch fortschreitende Fehlfunktion des Nervensystems gekennzeichnet sind. Diese Erkrankungen stehen oft mit der Atrophie der betroffenen Regionen des zentralen oder peripheren Nervensystems in Verbindung. Neurodegenerativen Erkrankungen sind sowohl Alzheimer, Parkinson, Pick als auch Huntington's Chorea. Die Erkrankung Huntington's Chorea beginnt normalerweise im mittleren Lebensalter und ist durch das Auftreten von charakteristischen, sich verschlimmernden choreiformen Bewegungen welche im Endstadium den gesamten Körper befallen, Persönlichkeitsveränderungen und allmählichem geistigen Verfall gekennzeichnet¹. Die Erkrankung wird durch eine pathologische Verlängerung des "Polyglutaminrepeats" im ersten Exon des Gens IT15, welches das Protein "Huntingtin" codiert hervorgerufen². Die Erkrankung manifestiert sich im Gehirn durch eine schwere Atrophie (Verkümmerung) des Striatums (Streifenhirn), welches aus dem Putamen, dem Nukleus Kaudatum und dem Globus Pallidus besteht. Der zerebrale Kortex ist ebenfalls betroffen jedoch nicht in dem Ausmaß wie das Striatum³.
Neben dem verursachenden Gen bei Huntington's Chorea, IT 15², oder den Genen für amyloides Vorläuferprotein (APP) und den Presenilinen 1 und 2 bei Alzheimer⁴ existieren noch weitere Proteine, welche beim Verlauf einer neurodegenerativen Erkrankung eine Rolle spielen können. Zu diesen Proteinen gehören sowohl Proteasen als auch Serinproteaseinhibitoren. Die Proteasen, welche bei Alzheimer involviert sind, heißen Sekretase alpha, beta und gamma. Sekretase alpha ist für das normale und die Sekretasen beta und gamma für die abberrante Prozessierung des amyloiden Vorläuferproteins zuständig⁴. Es handelt sich also um "fehlgeleitete" Proteolyse. In den für Alzheimer charakteristischen "senilen" oder "neuritischen" Plaques kommt der Serinproteinaseinhibitor alpha-1-Antichymotrypsin vor⁴.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, Wirkstoffe bereitzustellen, die zur Therapie samt Prävention und Diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen geeignet sind.
Die Erfindung bedient sich der modernen Methoden der Proteomanalyse. Erfindungsgemäß werden gezielt Hirnproteome mittels Großgel-2D identifiziert^5,6, sowohl aus dem Maus-Modell-System R6/2 für Huntington's Chorea (The Jackson Laboratory, 600 Main Street, Bar Harbor, ME, 04609, USA; Stammname: B6CBA- TgN(HDexon1)62Gpb, Stock Number: 002810), als auch aus Gehirnregionen des Menschen hergestellt und relevante Proteine durch Vergleich zu gesundem Maus bzw. menschlichem Gehirngewebe und Nervengewebe (siehe Beispiele und Figuren) identifiziert.
Überraschender Weise konnten Proteinaseinhibitoren und Chaperone identifiziert werden, die einen präventiven oder lindernden bis heilenden (kurativen) Effekt zur Behandlung und Prävention von neurodegenerativen Erkrankungen inne haben. Die Identifizierung erfolgt im Zuge der (differentiellen) Änderung des Expressionsmusters des Proteinaseinhibitors (siehe Beispiele und Figuren).
Die gestellte Aufgabe konnte daher durch Proteinaseinhibitoren, vorzugsweise Serinproteaseinhibitoren, besonders bevorzugt alpha-1-Antitrypsin, ggfs. in Kombination mit geeigneten Chaperonen, besonders bevorzugt alpha-B-Krystallin, gelöst werden.
Daher betrifft die Erfindung ein Arzneimittel enthaltend mindestens einen Proteinaseinhibitor zur Behandlung und Prävention von neurodegenerativen Erkrankungen.
Im Rahmen dieser Erfindung wird unter Proteinaseinhibitoren ein Polypetid verstanden, welches in der Lage ist, Proteinasen, die in neurodegenerativen Erkrankungen involviert sind, zu inhibieren.
In einer weiteren Ausführungsform sind Serinproteinaseinhibitoren bevorzugt. Im Rahmen dieser Erfindung sind Serinproteasen eine Gruppe von Enzymen die Proteine hydrolysieren, hierbei befindet sich die Aminosäure Serin oder Histidin im aktiven Katalysezentrum. Serinproteasen spielen bei der Verdauung, bei Blutgerinnung, bei Immunreaktionen, der Befruchtung der Eizelle eine Rolle. Serinproteaseinhibitoren sind Polypeptide oder Proteine, welche eine durch eine Serinproteinease vermittelte Enzymreaktion verlangsamen oder zum erliegen bringen.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt als Proteinaseinhibitor ist der Serinproteaseinhibitor alpha-1-Antitrypsin. Eine bekannte Zielserinprotease von alpha-1-Antitrypsin ist die neurophile Elastase, ebenfalls sind Interaktionen mit der pankreatischen Elastase und Trypsin beschrieben⁷. Neutrophile Elastase wird von neutrophilen Zellen nach deren Aktivierung z. B. bei Immunantworten sekretiert.
Es wurde bereits in der Literatur mit Hilfe der Immunocytochemie nachgewiesen, daß alpha-1-Antitrypsin und alpha-1-Antichymotrypsin in den "neurofibrillary tangles" von Alzheimer vorkommen⁸. Es wurde ein protektiver Effekt in Gegenwart von A- beta_1-42 beschrieben⁹. Alpha-B-Kristallin wurde auf erhöhtem Niveau in Gehirnen von Alzheimer Patienten nachgewiesen. Alpha-B-Kristallin wurde in Astrozyten und Mikrogliazellen nur in Regionen mit senilen Plaques und "neurofibrillary tangles" gefunden¹⁰. Mit der hier später beschriebenen Abnahme der Expression von alpha- 1-Antitrypsin im Gehirn der transgenen Maus R6/2 nach 8 Wochen geht eine Zunahme der Expression von den bei der Apoptose beteiligten Kaspasen 1 und 3 voraus¹¹. Es konnte in der Literatur bereits gezeigt werden, daß im Zusammenhang von experimentell eingeleiteter Ischämie¹² und Hepatitis¹³ alpha1-Antitrypsin in der Lage war, die Kaspasen 1 und 3 bzw. 3 und 7 zu inhibieren.
Eine differentielle Expression von alpha-1-Antitrpsin konnte auch in menschlichen Gehirnregionen, wie dem parietalen Kortex und dem Nukleus Kaudatum nachgewiesen werden. Im vorderen Globus Cinguli wurde ebenfalls in 2 von 4 Fällen eine differentielle Expression nachgewiesen. Die im Menschen nachgewiesene Isoform unterscheidet sich von der murinen in Molekulargewicht und Isoelektrischem Punkt. Bei der im Menschen nachgewiesenen Isoform handelt es sich mit ziemlicher Sicherheit um eine prozessierte¹⁴, nicht mehr aktive Form von alpha-1-Antitrypsin wohingegen die murine Form im isoelektrischen Punkt und im Molekulargewicht mit der aktiven Form übereinstimmt¹⁵. Die murine Isoform nimmt im Lauf der Erkrankung ab, wohingegen die im Menschen gefundene Isoform nur bei dem erkrankten Gehirn vorhanden ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist daher Gegenstand der vorliegenden Erfindung Proteine mit der Funktion eines Proteinaseinhibitors und zwar alpha-1- Antitrypsin,

a) einem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 1 (SWISS PROT No.: Q00898 (Maus)) oder SEQ ID No. 2 (SWISS PROT No.: P01009 (Mensch))
b) einem Polypeptid, das im Vergleich mit der Sequenz nach a) eine oder mehrere Aminosäuredeletionen, Aminosäureaustausche, Aminosäureadditionen und/oder Aminosäureinsertionen aufweist,

a) DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 1 (SWISS PROT No.: Q00898 (Maus)) oder SEQ ID No. 2 (SWISS PROT No.: P01009 (Mensch)) codieren;
b) DNA-Sequenzen, die mit den zu den Sequenzen unter a) komplementären Sequenzen hybridisieren und befähigt sind, vorzugsweise ein Protein mit der Funktion des alpha-1-Antitrypsin zu codieren; und
c) DNA-Sequenzen, die in ihrem genetischen Code bezüglich der unter a) oder b) genannten Sequenzen degeneriert sind;

Die Aufzählungen verstehen sich alternativ und nicht kumulativ.
Unter "Proteine mit der Funktion eines Proteinaseinhibitors und zwar alpha-1- Antitrypsin (nachstehend erfindungsgemäßes Protein)" ist hierbei jedes Polypeptid zu verstehen, das im wesentlichen die Eigenschaften des natürlich vorkommenden, vorzugsweise des humanen alpha-1-Antitrypsin gewährleistet.
Die Aktivität von Proteinaseinhibitoren, vorzugsweise Serinproteinaseinhibitoren, besonders bevorzugt alpha-1-Antitrypsin, kann wie in den Beispielen ausgeführt gemessen werden.
Der Begriff Hybridisierung bedeutet hier eine Hybridisierung unter üblichen Hybridisierungsbedingungen, insbesondere unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wie sie dem Fachmann bekannt sind [vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)].
Bevorzugt besitzt das erfindungsgemäße Protein die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 (SWISS PROT No.: Q00898 (Maus)) oder SEQ ID No. 2 (SWISS PROT No.: P01009 (Mensch)). Das Protein kann jedoch auch ein oder mehrere Aminosäuredeletionen, Aminosäureaustausche oder Aminosäureadditionen oder - Insertionen aufweisen, solange die Funktion des erfindungsgemäßen Proteins dadurch nicht wesentlich beeinträchtigt wird. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein ebenfalls fremde Proteinsequenzen enthalten (z. B. als Fusionsprotein).
Das bevorzugte erfindungsgemäße Protein mit einer Länge von 413 Aminosäuren (Maus, SEQ ID No. 1) oder 418 Aminosäuren (Mensch, SEQ ID No. 2) besitzt ein apparentes Molekulargewicht, bestimmt durch SDS-Page, von ungefähr 61 kD und ein berechnetes Molekulargewicht von 45,9 kD (Maus) oder 46,7 kD (Mensch).
Ein weiterer Gegenstand sind die für dieses Protein codierenden Nukleinsäuren, vorzugsweise DNA-Sequenzen, zu diesen Sequenzen komplementäre Sequenzen, sowie Fragmente davon (nachstehend erfindungsgemäße Nukleinsäuren oder DNA- Sequenzen), wie beispielsweise SEQ ID No. 3 codierend für ein Protein gemäß SEQ ID No. 1 (beginnend bei ATG) mit der Funktion eines murinen Serinproteaseinhibitors oder SEQ ID No. 4 (beginnend bei ATG) kodierend für ein Protein gemäß SEQ ID No. 2 mit der Funktion eines humanen Serinproteaseinhibitors.
Diese erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können mit anderen DNA-Sequenzen, insbesondere Sequenzen, die die Expression des Proteins in einem gewünschten Wirtsorganismus ermöglichen, verknüpft werden. Solche Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Es handelt sich hierbei beispielsweise um regulatorische Sequenzen wie Promotorsequenzen, Shine-Dalgarno-Sequenzen, Transkriptionsterminationssignale, Polyadenylierungssignale oder Enhancer- Elemente. Auf diese Weise läßt sich das erfindungsgemäße Protein kostengünstig in großen Mengen gewinnen (z. B. mit CHO-Zellen oder ähnliches).
Gegenstand der Erfindung sind daher auch rekombinante DNA-Moleküle, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten.
Die rekombinanten DNA-Moleküle können entweder direkt in den gewünschten Wirtsorganismus eingeschleust werden oder zuerst in Vektoren eingebaut werden, mit denen die Wirtsorganismen anschließend in an sich bekannter Weise transformiert werden. Solche Vektoren sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Als Vektoren können die im Stand der Technik üblichen Vektoren, beispielsweise Plasmide, Bakteriophagen oder Viren, verwendet werden. Bevorzugte Vektoren sind Expressionsvektoren.
In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure daher in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor enthalten.
Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, vorzugsweise Adenovirusvektoren, insbesondere replikationsdefiziente Adenovirusvektoren, oder Adenoassoziierte Virusvektoren, z. B. ein Adenoassoziierter Virusvektor, der ausschließlich aus zwei insertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR) besteht.
Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel geeignet, das die erfindungsgemäße Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen komplexierter Form enthält.
Als geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe eignen sich z. B. eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren etc.
Geeignete Adenovirusvektoren sind beispielsweise in McGrory, W. J. et al. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman, Y. et al. (1982) in "Eukaryotic Viral Vectors" (Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, New York; Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280; Karlsson, S. et al. (1986) EMBO J.. 5, 2377 oder WO 95/00655 beschrieben.
Geeignete Adeno-assoziierte Virusvektoren sind beispielsweise in Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97; WO 95/23867; Samulski, R. J. (1989) J. Virol, 63, 3822; WO 95/23867; Chiorini, J. A. et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531 oder Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793 beschrieben.
Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert. Hierzu eignen sich Lipidmischungen wie bei Felgner, P. L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84, 7413; Behr, J. P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982; Felgner, J. H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 oder Gao, X. & Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195 beschrieben. Bei der Herstellung der Liposomen wird die DNA ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die DNA vollständig von den Liposomen komplexiert wird.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Wirtsorganismen, die die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle oder Vektoren enthalten.
Geeignete Wirtsorganismen sind beispielsweise prokaryontische oder eukaryontische Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien wie Escherichia Coli, Hefen oder Gewebezellen.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Fragmente davon können dazu verwendet werden, homologe DNA-Sequenzen in verschiedenen Organismen oder Gewebetypen aufzufinden, die eine ähnliche oder gleiche Funktion wie das erfindungsgemäße Protein besitzen (sogenannte Sonde).
Das erfindungsgemäße Protein und die für dieses Protein codierenden DNA- Sequenzen lassen sich ferner vorteilhaft als Diagnostika verwenden.
Überraschender Weise zeigen Chaperone aus der Gruppe der "kleinen Hitzeschockproteine"¹⁶, welche in der Lage sind Proteine in Lösung zu halten, insbesondere alpha-B-Kristallin, einen positven, synergistischen und systemischen Effekt auf die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Arzneimittels (siehe Beispiele). Insofern betrifft die Erfindung ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung aus mindestens einem Proteinaseinhibitor und einem geeigneten Chaperon, wobei alpha-B-Kristallin besonders bevorzugt ist. Alpha-B-Kristallin (SWISS PROT Nr.: P23927 für Maus) besitzt einen durch Elektrophorese bestimmten pl-Wert von 7,5, welcher vom Berechneten um 0,6 pH-Einheiten abweicht. Das berechnete Molekulargewicht von 20,5 kd stimmt mit dem experimentell bestimmten Gewicht von 23 kd gut überein.
Daher wird alpha-B-Kristallin vorzugsweise aus einer Sequenz gemäß SWISS PROT Nr.: P23927 ausgewählt oder eine funktionelle Variante davon. Eine solche funktionelle Variante soll eine "Chaperonfunktion" aufweisen und stellen daher ebenfalls erfindungsgemäß geeignete Chaperone dar.
In der Literatur wurde bereits die Chaperonfunktion von alpha-B-Kristallin "in vitro" beschrieben¹⁷. Die geringere Expression von alpha-B-Kristallin im Verlauf der Erkrankung bei Mausmodell R6/2 könnte ein Grund für eine verminderte Fähigkeit des erkrankten Gewebes sein mit den trunkierten N-terminalen Peptiden des Exon 1 von Huntingtin fertig zu werden^18,19 zusammenfällt. Hierfür spricht, daß die Abnahme der alpha-B-Kristallin Expression im Alter von 4 Wochen mit dem Zeitpunkt des vermehrten Auftretens von zytoplasmatischen Einschlüssen (Neuropilen Aggregaten) bei R6/2 Mäusen im Alter von 3 bis 4 Wochen¹⁹. Es wurde bereits in der Literatur beschrieben, daß andere Chaperone aus der Gruppe der kleinen Hitzeschockproteine, Hsp40 und Hsp70, einen inhibitorischen Effekt auf die Ausbildung fibrillärer Strukturen besitzen²⁰.
Andere Chaperone sind erfindungsgemäß mit einbezogen. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter geeignete Chaperone Proteine verstanden, die die Faltung oder Oligomerisierung anderer Proteine kontrollieren, indem sie deren nicht-native Konformationen oder noch nicht zusammengetretene Untereinheiten binden und stabilisieren, aber nicht Bestandteil der resultierenden Struktur werden ("Chaperonfunktion").
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wobei mindestens ein Proteinaseinhibitor mit ggfs. mindestens einem Chaperon, vorzugsweise alpha-B- Kristallin, in einer Zusammensetzung und gegebenenfalls mit pharmazeutisch annehmbarem Zusatz- und/oder Hilfsstoffen formuliert wird.
Die Dosierung und Applikation kann in weiten Bereichen erfolgen und zwar derart dass die Überwindung der Blut/Hirnschranke erfolgt. Gentherapeutische Verfahren sind nicht ausgeschlossen.
Ebenfalls betrifft die Erfindung ein Diagnostikum enthaltend mindestens ein Proteinaseinhibitor und ggfs. mindestens ein Chaperon, vorzugsweise alpha-B- Kristallin zur Diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen, sowie ggfs. weitere Hilfs- und Zusatzstoffe.
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Proteinaseinhibitor und ggfs. mindestens ein Chaperon, vorzugsweise alpha-B-Kristallin, vorzugsweise in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger versetzt wird.
Im Rahmen dieser Erfindung wird als annehmbarer Träger vorzugsweise sämtliche Gegenstände der mehrdimensionalen Protein-Gel-Chromatograhie verstanden⁵. Jedoch sind ebenfalls gelfreie Highthroughput-Ansätze nicht ausgeschlossen.
Die nachfolgenden Beispiele und Figuren dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung, ohne sie auf diese Beispiele und Figuren einzuschränken.

Beschreibung der Figuren und Beispiele

Erfindungsgemäß wird gezeigt, daß alpha-1-Antitrypsin und alpha-B-Kristallin in erkrankten Mäusen differentiell exprimiert werden. Das Expressionsniveau nimmt im Verlauf der Erkrankung bei beiden Proteinen ab. In menschlichen Gehirnregionen konnte die Akkumulation eines Abbauproduktes von alpha-1-Antitrypsin nachgewiesen werden.

Materialien und Methoden

Tiere und Gewebe

Gehirne von 4, 8 und 12 Wochen alten, transgenen R6/2 Mäusen sowie CBA × C57Bl/6 Kontrolmausgehirne wurden in unseren Studien verwendet. R6/2 Mäuse wurden durch Rückkreuzung auf (C57Bl/6 × CBA)F₁ Mäuse vermehrt. Die Genotypisierung und die Bestimmung der Länge des CAG-Repeats wurde wie bereits beschrieben durchgeführt²¹. C57Bl/6 Mäuse wurden von Charles River, Deutschland, erworben. Menschliche Gehirnproben wurden von verschiedenen Quellen erworben. Striaten und Parietallappen von einem Huntintington Chorea Patienten und einer Patientin, wie auch die in Alter und Geschlecht übereinstimmenden Kontrollen, waren eine Spende vom Institut für Neuropathologie der "Ludwig Maximillian" Universität München. Proben des vorderen Globus Cinguli (Brodmann Bereich 24) von Grad 4³ Gehirnen und die in Alter und Geschlecht übereinstimmenden Kontrollen wurden vom Harvard Brain Tissue Resource Center, MA, USA bereitgestellt.
Gewinnung von Gehirnregionen und anderen Geweben. Mausgehirne wurden präpariert wie an anderer Stelle bereits beschrieben²². Mäuse wurden enthauptet, das Fell wurde entfernt, der Schädel geöffnet und das Gehirn völlig entfernt. Das Rückenmark wurde am Rhombencephalon abgetrennt. Das Gehirn wurde in eine auf Eis gelagerte Petrischale, welche mit 0,9% (w/v) Kochsalzlösung (NaCl) gefüllt war, verbracht. Am Gehirn verbliebenes Blut wurde durch vorsichtiges spülen mit der Kochsalzlösung entfernt. Das Gehirn wurde nun mit Kimwipes™ trockengetupft, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C für den weiteren Gebrauch gelagert. Die folgenden Gehirnregionen wurden von einem Pathologen von drei weiblichen, 20,5 Wochen alten, C57Bl/6 Mäusen präpariert: Nervus Trigeminus, Hypophyse, Motor Kortex (mit Amygdala und Area Entorhinalis), Hippocampus, Bulbi Olfaktorii, Cerebellum, Striatum, Frontaler Kortex, Mittelhirn, Rhombencephalon, Thalamus (mit Hippothalamus) und das Septum, Leber, Herz und Testes wurden auf gleiche Wiese präpariert wie das Gehirn.

Herstellung von Proteinproben

Die Methode zur Extraktion von Proteinen wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben²². Maximal drei Fraktionen wurden von jeder Gewebeprobe hergestellt: die erste Fraktion enthält die pufferlöslichen Proteine, die Zweite beinhaltet die Harnstoff/Detergenz löslichen Proteine und die Dritte besteht aus den restlichen Proteinen, welche aus der Pelletfraktion in einem letzten Schritt durch DNAse Behandlung freigesetzt wurden. Dieses Verfahren stellt sicher, das die drei erhaltenen Fraktionen das gesamte Spektrum von Proteinen abdecken, welches in einer Gewebeprobe vorhanden ist. Jeder selektive Verlust von Proteingruppen wird wegen dem Fehlen von Reinigungsschritten vermieden. Die Proteinkonzentrationen in den Extrakten sind nahe an den "in vivo" Konzentrationen was den Verlust von Proteinklassen durch Aggregation ausschließt. Die Reproduzierbarkeit der Extraktionsprozedur wurde streng kontrolliert indem errechnete Referenzwerte mit Standardwerten verglichen wurden. (²², Seite 83 Note 4 und dort befindliche Referenzen)

2D Großgel-Elektrophorese

Proteine wurden durch hochauflösende, Großgel 2D Elektrophorese aufgetrennt (siehe^5,6). Obwohl die Lauf zu Lauf Unterschiede mit dieser Technik sehr gering sind, wurden durch zufällige Auswahl aus einem Pool Probenpaare generiert, bestehend aus jeweils einem R6/2 und einem Kontrollgehirn. Diese wurden nun immer parallel beiden Elektrophoresesprozeduren unterzogen. Die erste Dimension (1D), die isoelektrische Fokusierung, basiert auf der "Carrier Ampholyte Technik", bei welcher der Gradient der Isoelektrischen Punkte während des Laufs erzeugt wird. Die Trenndistanz beträgt 40 cm. Bei der Verwendung für die Spotdetektion oder Identifikation hatten die 1D Gele einen Durchmesser von 0,9 mm oder 1,5 mm und ein Probenvolumen von 6 pl/9 µl (Maus/Mensch) oder 50 µl. Nach Beendigung des 1D Laufes wurden die 1D Gele halbiert und jede Hälfte separat zusammen mit der passenden Hallte des Probenpaares der Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) als zweiter Dimension unterzogen.

Anfärbung der Proteine

Proteinspots wurden durch saure Silberfärbung zur Beurteilung der differentiellen Expression sichtbar gemacht. Diese Methode ist ausführlich und detailliert an anderer Stelle beschrieben worden^6,23,24. Im verwendeten Silberfärbungsprotokoll wird Glyceraldehyd verwendet, welches die Proteine unumkehrbar quervernetzt. Aus diesem Grund kann diese Methode nicht für die Proteinidentifikation mit Hilfe der Massenspektrometrie verwendet werden. Deswegen wurde eine Färbung unter Verwendung von Coomassie Brilliant Blue G 250 benützt, welche für die Verwendung zusammen mit Massenspektrometrie gut etabliert jedoch weniger empfindlich ist. Die Färbung wurde nach einem bereits publizierten Protokoll durchgeführt^25,26. Die Gele wurden über Nacht in 50% (v/v) Methanol (sds, Peypin, Frankreich) und 2% (v/v) Phosphorsäure (Merck, Darmstadt, Deutschland) fixiert. Danach wurden die Gele 30 Minuten lang gewaschen. Der Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Das Gel wurde dann in 34% (v/v) Methanol, 2% (v/v) Phosphorsäure und 17% (w/v) Ammoniumsulfat inkubiert. Nach 1 Stunde wurden 0,66 g/l, Coomassie Brilliant Blue G250 (Roth, Karlsruhe, Deutschland) zugegeben. Das Gel wurde 5 Tage lang unter kräftigem Schütteln inkubiert. Nach dem Ende der Inkubationszeit wurde das Gel mindestens drei Mal gewaschen um überschüssige Coomassie G250 Farbpartikel zu entfernen. Danach wurde das Gel in Plastikfolie verschweißt und bei 4°C aufbewahrt oder sofort weiterverarbeitet.

Spoterkennung

Die silbergefärbten 2D Gele wurden visuell bewertet, indem die beiden Gelhälften eines Probenpaares auf einem Leuchtkasten (Biotec-Fischer, Reiskirchen, Deutschland) miteinander verglichen wurden. Veränderungen der Spots wurden anhand folgender Gesichtspunkte in Betracht gezogen: vorhanden/nicht vorhanden, quantitative Veränderung oder Mobilitätsveranderung; die Mobilittätsvariante definiert einen Spot oder Spots, die sich im Gel an eine andere Position "bewegen" und damit einen Shift des Isoelektrischen Punktes und/oder des Molekulargewichts anzeigen. Das Gesamtmuster und auch die spezifischen Spotunterschiede wurden durch die Z3 Software (Compugen Limited, Israel) bestätigt.

In-Gel Verdau

Die interessanten Proteinspots wurden herausgeschnitten und abwechselnd dreimal mit 10 µl Verdaupuffer (10 mM NH₄HCO₃) und 10 µl modifiziertem Verdaupuffer (10 mM NH₄HCO₃/Acetonitril 1 : 1) gewaschen. Danach werden die Gelstücke in 10 µl Acetonitril geschrumpft und in 2 µl Proteaselösung (0,05 µg/ml Trypsin; Promega, Madison, WI, USA) quellen lassen. Der Verdau fand in einem Zeitraum von 10 bis 12 Stunden bei 37°C statt. Der gewonnene Überstand wurde in eine saubere Quarzküvette überführt und die Gelstücke wurden noch zwei Mal mit je 5 µl Verdaupuffer extrahiert. Die Überstände wurden gepoolt. Eine von zwei verschiedenen Methoden wurde für die MALDI Target Preparation verwendet. Bei der ersten Methode handelt es sich um die konventionelle, "trockene Tropfen" Technik, mit der Aufkonzentrierung der Probe mit Hilfe von Poros 10 R1 Beads (Perseptive BioSystems, Cambridge, England)²⁷. Nach dem Verdampfen des Lösungmittels, wurden die Proben mit den Poros Beads in 1 µl Matrixlösung (HCCA (alpha-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure) in Acetonitril/0,1% (v/v) TFA 1 : 1 v/v) aufgenommen und auf ein konventionelles MALDI Target transferiert. Eine weitere Probenaufbereitungsmethode verwendet die AnchorChip™ Technologie. AnchorChips™ sind mit hydrophoben Patches ("Anker") in einer hydrophilen Umgebung ausgestattet, sodaß der relativ hydrophobe Analyt sich auf den "Ankern" konzentriert. Ein µl Tropfen des gepoolten Überstands wurde auf jeden "Anker" (386/Target) mit 400 µm Durchmesser appliziert. Nachdem die Tropfen auf die Größe des "Ankers" geschrumpft waren, wurden 0,5 µl HCCA (0,2 g/l, Acetonitril/0,1% (v/v) TFA 1 : 1) zugegeben.

MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Zur Analyse und Identifikation der tryptischen Peptide wurde MALDI-TOF Massenspektrometrie²⁸ mit einem Bruker Reflex III Massenspektrometer (Bruker-Daltonik, Bremen, Deutschland) mit einer SCOUT 384 Ionenquelle verwendet. Die Beschleunigungsspannung betrug 25 kV und die Reflektorspannung wurde anfänglich auf 21.6 kV eingestellt. Die interne Kalibrierung basierte auf tryptischen Peptiden (842,510 Da; 2211.105 Da). "Post Source Decay" (PSD) Spektren wurde mit einer "Parent"-Ionen Auswahl von ±30 Da erhalten. Die Reflektionsspannung wurde in 14 Schritten von 21 kV auf 0,65 kV reduziert. Das Zusammenfügen der 14 Einzelspektren basierte auf einer Kalibration mit ACTH. Die Spektren wurden manuell gelabeled. Die Datenaufnahme erfolgte mit einem Sun Ultra Computer unter Zuhilfenahme der XACQ Software, Version 4.0. Die Nachbearbeitung der Daten erfolgte mit Hilfe der XMASS Software.

Datenbanksuche auf Grundlage der Massenfingerabdruck Spektren

Die Peptidmassen Fingerabdruck Spektren wurden unter Zuhilfenahme der nichtredundanten NCBI Proteindatenbank mit Hilfe von ProFound (http:/ / prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound, V 4.8.2) analysiert²⁹.

Automatische Interpretation der Fragmentionen Spektren

Zur automatischen Interpretation der Fragmentionenspektren wurde der SEQUEST Algorithmus^30-32 Version 2 während des Screenens der Maus/Ratten Untereinheit der NCBI Datenbank verwendet.

Ergebnisse

R6/2 Mausgehirne im Enstadium der Erkrankung zeigen keine oder reduzierte Expression von alpha-1-Antitrypsin beziehungsweise alpha-B-Kristallin. Das Gehirnproteome von htt exon 1 transgenen Mäuse (R6/2) wurde untersucht und mit Kontrollmäusen gleichen Geschlechts, Alters und genetischem Hintergrund mit Hilfe der Großgel 2D-Gelelektrophorese verglichen. Das Proteom von 12 Wochen alten R6/2 Mäusen zeigte signifikante Unterschiede beim Expressionslevel von zwei Proteinen. Auf der sauren Seite fehlten den R6/2 2D Gelen eine drei Spotgruppe in allen acht untersuchten Gelpaaren (Fig. 1, Tabelle 1). Auf der basischen Seite war ein quantitativer Unterschied bei einem Spot in allen acht Gelpaaren zu sehen (Fig. 2, Tabelle 2). Alle drei Proteinspots auf der sauren Seite wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert und gehören zum alpha-1-Antitrypsin (Swiss Prot. No.: Q00898). Ein weiterer Spot in der Nachbarschaft der Dreiergruppe fehlt im Endstadium der Erkrankung ebenfalls. Das zeitliche Expressionsmuster korreliert nicht vollständig mit dem Dreispotmuster an den untersuchten Zeitpunkten, der Trend stimmt jedoch überein. Der Proteinspot ist schwer zu identifizieren, da er so nah bei einem anderen Spot mit höherer Intensität liegt (Fig. 1 und 3). Der Spot auf der basischen Seite wurde dem Protein alpha-B-Kristallin mittels Massenspektrometrie zugeordnet (Swiss Prot. Nr.: P23927). Der beobachtete isoelektrische Punkt von 5,3 bei alpha-1-Antitrypsin stimmt gut mit dem berechneten isoelektrischen Punkt von 5,4 überein. Das beobachtete Molekulargewicht von 61 kd unterscheidet sich beträchtlich von dem berechneten Gewicht von 46 kd (+15 kd). Das Molekulargewicht von 23 kd, welches für alpha-B-Krytsallin bestimmt wurde stimmt relativ gut mit dem berechneten Wert von 20,5 kd überein. Der isolektrische Punkt kann aus dem Gel mit 7,5 abgelesen werden. Dies ist ein Unterschied von 0,6 pH-Einheiten zum berechneten Wert. Neben der differentiellen Expression dieser beiden Proteine zeigten die 2D Gele sehr reproduzierbare Spotmuster wie aus den Fig. 1 und 2 durch Vergleich der nicht differentiell exprimierten Proteine geschlossen werden kann. Zusätzlich zur zytoplasmatischen Fraktion des Gehirns wurden noch zwei Fraktionen von 12 Wochen alten Mäusen getestet bei denen die Proteine durch Harnstoff und Detergenzbehandlung (Fraktion 2) oder anschließend durch Freisetzung mit DNAse aus der Probe (Fraktion 3) gewonnen wurden. Trotz des Scannens durch zwei weitere Proteinfraktionen konnten keine weiteren Proteine gefunden werden, die sich die sich nachvollziehbar in allen Probenpaaren zwischen kranken und gesunden Mäusen unterschieden. Alpha-1-Antitrypsin konnte in geringen Mengen in der Membranfraktion nachgewiesen werden, was wahrscheinlich auf Überlappung der Proteinverteilung mit der zytoplasmatischen Fraktion zurückzuführen ist. Das Protein war in der DNAse Fraktion nicht mehr nachweisbar, was wiederum für eine zytoplasmatische Lokalisation des Proteins spricht. alpha-B-Kristallin wurde in allen drei Fraktionen gefunden wobei die Expression im Gewebe von R6/2 Mäusen geringer war.

Verminderung von alpha-1-Antitrypsin und alpha-B-Kristallin Verfügbarkeit während des Krankheitsverlaufes

Das Gehirngewebe von 12 Wochen alten R6/2 Mäusen repräsentiert das Endstadium der Erkrankung. Um ein zeitliches Expressionsprofil der Proteine zu erhalten, wurden zwei frühere Stadien untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 und Tabelle 1 für alpha-1-Antitrypsin und in Fig. 4 und Tabelle 2 für alpha-B-Kristallin gezeigt. Bei R6/2 Mäusen ist alpha-1-Antitrypsin im Alter von 4. Wochen heterogen expremiert (Tabelle 1). In einer R6/2 Maus ist die alpha-1- Antitrypsin Expression auf einem vergleichbaren Niveau wie bei 12 Wochen alten Kontrollmäusen wohingegen andere Mäuse überhaupt keine Expression zeigen. Die Expression von alpha-1-Antitrypsin bei 4 Wochen alten Kontrollmäusen ist genauso heterogen wie bei R6/2 Mäusen. Dies deutet darauf hin, dass alpha-1-Antitrypsin bei R6/2 Mäusen auf normalem Niveau expremiert wird. Nach 8 Wochen kann das Protein bei R6/2 Mäusen nur nach in geringen Mengen gefunden werden, nach 12 Wochen ist keine Expression mehr nachweisbar. Kontrollmäuse zeigen eine hohe Expession im Alter von 8 und 12 Wochen (Fig. 3 und Tabelle 1). Die Abnahme aller drei Spots ist miteinander verknüpft, was auf eine Beteiligung aller drei Varianten im gleichen Prozeß hindeutet (Fig. 1 und 3). Die Menge an exprimiertem alpha-B- Kristallin steigt bei Kontrollmäusen im Verlauf der Zeit an. Die Expression bei R6/2 Mäusen verbleibt auf dem Level von 4 Wochen (Fig. 4 und Tabelle 2). Dies deutet darauf hin, dass das Protein schneller verbraucht oder/und in geringerem Maße produziert wird.

Geschlechtsspezifität der differentiell exprimierten Proteine

Da bisher nur männliche Mäuse untersucht worden sind, war es von Interesse, ob Unterschiede in der Expression zwischen den Geschlechtern existieren. Ein erster Schritt zur Beantwortung dieser Frage war die Untersuchung von Organen von C57Bl/6 Mäusen. Die 2D Gel Spotmuster von CBA × C57Bl/6 und C57Cl/6 Mäusen stimmen ziemlich gut überein und die Positionen und Intensitäten der Spots (Kontrolltiere) der beiden Proteine von Interesse sind in beiden Mäusestämmen identisch. Auf der Ebene des Gesamtorgans war alpha-1-Antitrypsin nur in männlichen Tieren nachweisbar (Tabelle 3A). Eine Untersuchung von Gehirnregionen, welche von drei 20,5 Wochen alten, weiblichen Mäusen stammen, ergab, dass bestimmte Gehirnregionen das Protein in mittlerer bis geringer Menge exprimieren. Alpha-B- Kristallin wird im Gewebe von männlichen und weiblichen Tieren exprimiert. Diese Ergebnisse konnten anhand von Studien mit CBA × C57Bl/6 Mäusen bestätigt werden (Fig. 5).

Expression von alpha-1-Antitrypsin und alpha-B-Kristallin in verschiedenen Geweben

Huntington's Chorea befällt hauptsächlich das Gehirn und kaum andere Gewebe sind betroffen. Da alpha-1-Antitrypsin in Gesamtgehirnextrakten von weiblichen Mäusen nicht gefunden wurde, war es von Interesse ob bestimmte Gehirnregionen dieses Protein exprimieren. Einer der Bereiche mit der höchsten Expression war der "Nervus Trigeminus", jedoch wurden auch Regionen wie die Hypophyse und der motorische Kortex positiv für das Protein getestet. Sehr geringe Mengen wurden im Hippocampus, den Bulbii Olfactorii und dem Cerebellum gefunden (Tabelle 3B). Alpha-B-Kristallin wird mit Ausnahme der Hypophyse (gering) und dem "Nervus Trigeminus" (sehr hoch) in ungefähr homogenem Level exprimiert. Nun wurde die Expression der beiden Proteine in verschiedenen Organen untersucht. Alpha-1-Antitrypsin wird im Gehirn, Herz, Leber und Testes von männlichen C57Bl/6 Mäusen aber nicht im Gehirn, Leber, Herz und Milz von weiblichen Mäusen exprimiert. Alpha-B-Kristallin wurde nur im Gehirn von weiblichen und männlichen Mäusen nachgewiesen (Tabelle 3A und B). Wie aus der Literatur bekannt ist, ist der Hauptproduktionsort für alpha-1-Antitrypsin die Leber. Aus diesem Grund untersuchten wir die Expression von alpha-1-Antitrypsin in der Leber von R6/2 Mäusen. Fig. 5 zeigt eine stark verminderte Expression von alpha-1- Antitrpsin in der Leber von 12 Wochen alten, transgenen Mäusen. Von 9 betroffenen Spots sind 7 unterhalb des Detektionslimits exprimiert. Alpha-B-Kristallin wurde in der Leber nicht gefunden, was die mit C57Bl/6 Mäusen gewonnen Resultate bestätigt.

Veränderte alpha-1-Antitrypsin Expression im Endstadium der Erkrankung beim Menschen

Es wurde nun die Frage untersucht, ob veränderte Proteinexpression derselben oder verwandter Proteine, welche bei den R6/2 Mäusen gefunden wurden, ebenfalls in menschlichen HD (Huntington Disease) Gehirnregionen vorhanden ist. Eine Gruppe aus 6 Spots wurde auf der sauren Seite der Gele von menschlichen HD Gehirnregionen gefunden welche zu nur drei Spots in Kontrollgelen (Fig. 5) korreliert. Dies deutet auf Spotduplizierung hin, welche durch eine Erhöhung des Molekulargewichts oder durch eine Veränderung der Proteinstruktur hervorgerufen worden sein könnte. Diese veränderte Expression wurde im Striatum und Parietallappen von einer weiblichen und einer männlichen Person mit HD gefunden. Zwei von vier Proben vom vorderen Globus Cinguli von weiblichen HD Patienten zeigten das gleiche Muster (Fig. 5). Die vier am stärkten gefärbten Spots (von rechts gesehen) wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie als alpha-1-Antitrpsin identifiziert (Swiss Prot. Nr.: P01009), das gleiche Protein, das im Mausmodell differentiell exprimiert wurde. Das Molekulargewicht dieser Spotgruppe liegt im Bereich von ca. 39 bis 42 kd. Der Unterschied zum Isoelektrischen Punkt des Proteins, welches bei der Maus gefunden wurde, liegt bei 0.6 pH Einheiten und der Molekulargewichtsunterschied bei 20 kd. Diese Unterschiede deuten möglicherweise auf eine Prozessierung hin. In einem Fall war die Spotduplizierung auch bei einem Kontrollgehirn des vorderen Globus Cinguli zu sehen (Resultat wird nicht gezeigt). Dieses Gehirn war von einer frischen Blutung im zerebralen und subarachnoiden Raum und einer moderaten, akuten Enzephalopathie des hypoxisch-ischemischen Typs (Bericht der Neuropathologie bereitgestellt durch das "Havard Brain Tissue Resource Center") betroffen. In zwei der drei verbleibenden Kontrollgehirne wurden keine Abnormitäten diagnostiziert. Das dritte Gehirn zeigte einen schwach differenzierten Tumor, welcher mit den Kriterien für ein metastasierendes Melanom übereinstimmt. Dieses Kontrollgehirn zeigte keine Spotduplizierung. Ein Expressionsmuster für alpha-B-Kristallin, welches sich durch die Erkrankung ändert, konnte bei den untersuchten, menschlichen Gehirnregionen nicht gefunden werden. Tabelle 1 Alpha-1-Antitrypsin (3 Spotgruppe) 4 Wochen

8 Wochen

12 Wochen
Abnahme der Verfügbarkeit von alpha-1-Antitrypsin im Gehirn im Verlauf der Erkrankung. Es werden mindestens acht Probenpaare pro Zeitpunkt gezeigt. Wegen der heterogenen Expression von alpha-1-Antitrypsin bei 4 Wochen alten Mäusen wurden hier 12 Probenpaare untersucht. Fig. 1 zeigt drei repräsentative Probenpaare von den hier gezeigten 12 Wochen alten Mäusen. Fig. 3 zeigt jeweils ein repräsentatives Probenpaar von allen drei gezeigten Zeitpunkten. Tabelle 2 Alpha-B-Kristallin (1 Spot) 4 Wochen

8 Wochen

12 Wochen
alpha-B-Kristallin Verfügbarkeit im Gehirn verbleibt bei R6/2 Mäusen auf dem Niveau von 4 Wochen. Es werden mindestens acht Probenpaare pro Zeitpunkt gezeigt. Wegen der heterogenen Expression von alpha-1-Antitrypsin bei 4 Wochen alten Mäusen wurden hier 12 Probenpaare untersucht. Fig. 2 zeigt drei repräsentative Probenpaare von den hier gezeigten 12 Wochen alten Mäusen. Fig. 4 zeigt jeweils ein repräsentatives Probenpaar von allen drei gezeigten Zeitpunkten.
Fig. 1 Im Endstadium der Erkrankung ist die Expression von alpha-1-Antitrypsin im Gehirn nicht mehr nachweisbar. Drei repräsentative Probenpaare aus zytoplasmatischen Fraktionen von R6/2 und Kontrollmausen werden gezeigt. Das "Drei Spot Muster" wird durch zwei Pfeile auf der rechten Seite angezeigt. Der assoziierte Spot wird mit dem linken Pfeil verdeutlicht (für eine komplette Liste mit allen zytiplasmatischen Extrakten siehe Tabelle 1).
Fig. 2 Das Endstadium der Erkrankung geht mit reduzierter Verfügbarkeit von alpha- B-Kristallin im Gehirn von R6/2 Mäusen einher. Drei repräsentative Probenpaare aus zytoplasmatischen Fraktionen von R6/2 und Kontrollmäusen werden gezeigt. Der alpha-B-Kristallin Spot ist mit einem Pfeil gekennzeichnet (für eine komplette Liste mit allen zytiplasmatischen Extrakten siehe Tabelle 2).
Fig. 3 Verminderung der Verfügbarkeit von alpha-1-Antitrypsin im Gehirn während des Krankheitsverlaufes. Je ein repräsentatives Probenpaar von Mäusen im Alter von 4, 8 und 12 Wochen wird gezeigt. Das Protein alpha-1-Antitrypsin ist als "Drei Spot Gruppe" durch die zwei Pfeile auf der rechten Seite markiert. Ein weiterer Spot, welche mit der Spotgruppe verbundener Spot wird durch den linken Pfeil markiert (für eine komplette Liste mit allen zytiplasmatischen Extrakten aus dem Krankheitsverlauf, siehe Tabelle 1).
Fig. 4 Die zur Verfügung stehende Menge an alpha-B-Krystallin im Gehirn steigt im Krankheitsverlauf bei Kontrollmäusen ständig an, verbleibt aber in R6/2 Mäusen auf dem Niveau von 4. Wochen. Ein repräsentatives Probenpaar von 4, 8 und 12 Wochen alten Mäusen wird gezeigt. Der alpha-B-Kristallin Spot ist mit einem Pfeil gekennzeichnet (für eine komplette Liste mit allen zytiplasmatischen Extrakten aus dem Krankheitsverlauf, siehe Tabelle 2).
Fig. Verminderte alpha-1-Antitrypsin Expression in der Leber von R6/2 Mäusen. Ausschnitte aus drei Gelpaaren von drei erkrankten Tieren und drei Kontrolltieren gleichen Alters und Geschlechts werden gezeigt. Die Pfeile zeigen die differentiell exprimierten Spots. Wichtigste Sequenzen SEQ ID No. 3 Maus Basensequenz (GENBANK Nr.: M75717; 1372 bp; mRNA)

SEQ ID No. 1 Maus Aminosäuresequenz (SWISS PROT Nr.: Q00898)

SEQ ID No. 4 Mensch Basensequenz (GENBANK Nr.: K01396; 1352 bp; mRNA)

SEQ ID No. 2 Mensch Aminosäuresequenz (SWISS PROT Nr.: P01009)

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Claims

1. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Proteinaseinhibitor zur Behandlung und Prävention von neurodegenerativen Erkrankungen.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Proteinaseinhibitor ein Serinproteinaseinhibitor ist.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Proteinaseinhibitor alpha-1- Antitrypsin ist.

4. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die neurodegenerative Erkrankung ausgewählt ist aus Alzheimer, Pick, Huntington und Parkinson.

5. Arzneimittel nach Anspruch 3, wobei alpha-1-Antitrypsin mit der Funktion eines Proteinaseinhibitors ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

a) einem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 1 (SWISS PROT No.: Q00898 (Maus)) oder SEQ ID No. 2 (SWISS PROT No.: P01009 (Mensch))

b) einem Polypeptid, das im Vergleich mit der Sequenz nach a) eine oder mehrere Aminosäuredeletionen, Aminosäureaustausche, Aminosäureadditionen und/oder Aminosäureinsertionen aufweist.

6. Arzneimittel nach Anspruch 5, enthaltend

1. a.) DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 1 (SWISS PROT No.: Q00898 (Maus)) oder SEQ ID No. 2 (SWISS PROT No.: P01009 (Mensch)) codieren;

2. DNA-Sequenzen, die mit den zu den Sequenzen unter a) komplementären Sequenzen hybridisieren und befähigt sind, ein Protein mit der Funktion des alpha-1-Antitrypsin zu codieren; und

3. DNA-Sequenzen, die in ihrem genetischen Code bezüglich der unter a) oder b) genannten Sequenzen degeneriert sind.

7. SEQ ID No. 3 codierend für ein Protein gemäß SEQ ID No. 1.

8. SEQ ID No. 4 codierend für ein Protein gemäß SEQ ID No. 2.

9. Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 8.

10. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 9, worin die für das Protein codierende DNA mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Expression des Proteins in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder humanen Zellen ermöglichen.

11. Vektor, enthaltend eine Sequenz nach Anspruch 5 oder 6 bis 8 oder ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 9 oder 10.

12. Wirtsorganismus, enthaltend ein rekombinantes DNA-Molekül nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 10 oder einen Vektor nach Anspruch 11.

13. Wirtsorganismus nach Anspruch 12, welcher ein prokaryontischer und/oder eukaryontischer Mikroorganismus ist.

14. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 oder eines Fragments davon zur Isolierung homologer DNA- oder RNA- Sequenzen.

15. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthaltend mindestens ein Chaperon, vorzugsweise alpha-B-Kristallin, in einer Zusammensetzung und gegebenenfalls pharmazeutisch annehmbare Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

16. Arzneimittel nach Anspruch 15, wobei alpha-B-Kristallin ausgewählt ist aus einer Sequenz gemäß SWISS PROT No. P23927 oder eine funktionelle Variante davon.

17. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Proteinaseinhibitor, vorzugsweise in einer Zusammensetzung mit alpha-B- Kristallin, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfsstoff formuliert wird.

18. Diagnostikum enthaltend mindestens ein Proteinaseinhibitor und ggfs. mindestens ein Chaperon, vorzugsweise alpha-B-Kristallin zur Diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen.

19. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Proteinaseinhibitor und ggfs. mindestens ein Chaperon, vorzugsweise alpha-B-Kristallin, vorzugsweise in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger versetzt wird.