DE10128541A1

DE10128541A1 - Screening-Verfahren mit BNPI und DNPI

Info

Publication number: DE10128541A1
Application number: DE10128541A
Authority: DE
Original assignee: Gruenenthal GmbH
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 2001-06-13
Filing date: 2001-06-13
Publication date: 2003-02-20
Also published as: WO2002101394A3; CA2450472A1; WO2002101394A2; AU2002348807B2; DE50210279D1; EP1395834B1; ES2288556T3; EP1395834A2; ATE364180T1; US20040219573A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen unter Verwendung von BNPI und/oder DNPI und die Verwendung dadurch identifizierter Verbindungen, an BNPI und/oder DNPI bindender Wirkstoffe, gegen BNPI und/oder DNPI gerichteter Antikörper, von Antisensenukleotiden gegen BNPI und/oder DNPI oder von BNPI und/oder DNPI bzw. Teilproteinen davon bzw. entsprechenden Polynukleotiden für Arzneimittel zur Schmerztherapie und Diagnostika.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen unter Verwendung von BNPI und/oder DNPI und die Verwendung dadurch identifizierter Verbindungen, an BNPI und/oder DNPI bindender Wirkstoffe, gegen BNPI und/oder DNPI gerichteter Antikörper, von Antisensenukleotiden gegen BNPI und/oder DNPI, oder von BNPI und/oder DNPI bzw. Teilproteinen davon, bzw. entsprechenden Polynukleotiden für Arzneimittel zur Schmerztherapie und Diagnostika.
Zur Therapie von Schmerzen stehen unterschiedliche Arzneimittel zur Verfügung wie z. B. Acetylsalicylsäure, Paracetamol, Dipyrone, Tramadol, Morphin und Fentanyl; aber auch Substanzen wie Amitryptilin und Ketamin kommen zur Behandlung von Schmerzpatienten zum Einsatz. Trotz zunehmend verfeinerter Therapieschemata kann jedoch insbesondere bei chronischen Schmerzzuständen oft keine dauerhafte Verbesserung für die Patienten erzielt werden. Hierfür ist unter anderem auch die Tatsache verantwortlich, daß es beim chronischen Schmerz zu dauerhaften Veränderungen beteiligter Nervenzellen kommt.
Die Schmerzforschung der letzten Jahre erbrachte die grundlegende Erkenntnis, daß der Entwicklung gerade chronischer Schmerzzustände plastische Veränderungen des Nervensystems, insbesondere in den nozizeptiven Neuronen der Hinterwurzelganglien und der Neurone im Bereich der Dorsalhörner des Rückenmarks, zugrunde liegen (als Überblick siehe: Coderre et al. 1993; Zimmermann & Herdegen, 1996). Die neuronale Plastizität geht einher mit Veränderungen in der Expression bestimmter Gene und führt zur langanhaltenden Veränderung des Phänotyps der betroffenen Neuronen. Das Konzept der neuronalen Plastizität wurde bisher vor allem auf Entwicklungs-, Lern- und Regenerationsprozesse angewandt, doch die neueren Befunde aus der Schmerzforschung zeigen, daß dieses Konzept auch bei pathophysiologischen Vorgängen greift (Tölle, 1997).
Die Chronifizierung des Schmerzes ist tierexperimentell auf phänomenologischer Ebene bereits relativ gut charakterisiert. Die Induktion chronischer Schmerzzustände führt zu folgenden Veränderungen:

- Erhöhte Empfindlichkeit und verringerte Reizschwelle peripherer Nozizeptoren
- Aktivierung sogenannter stiller Nozizeptoren
- Reorganisation rezeptiver Felder
- Erregbarkeitszunahme im Rückenmark.

Diese plastischen Veränderungen sind sowohl für die in den Ganglien vorkommenden primären Afferenzen, als auch für die im Rückenmark lokalisierten nachgeschalteten Neurone beschrieben worden und werden auch supraspinal z. B. im Thalamus vermutet. In Analogie zu den für Lern- und Gedächtnisprozesse beschriebenen Mechanismen ist anzunehmen, daß in den beteiligten Zellen ein spezifisches Genprogramm abläuft, das die koordinierte Regulation relevanter Gene beinhaltet, deren Expression dann maßgeblich zur pathophysiologischen Ausprägung chronischer Schmerzen beiträgt.
Ausgangspunkt der Erfindung war daher die Identifizierung derartiger schmerzregulierter, die in ihrer Expression unter Schmerzbedingungen verändert und deshalb wahrscheinlich an der Entstehung und Verarbeitung von insbesondere chronischen Schmerzen beteiligt sind, über ihre Regulationszusammenhänge.
Für eine Reihe bekannter Gene wurde bereits eine Regulation in verschiedenen Schmerzmodellen nachgewiesen (s. Tabelle 1), so zum Beispiel für Neurotransmitter (Substanz P, CGRP), Rezeptoren (Substanz P-Rezeptor, µ, κ, δ-Opiatrezeptoren, NMDA-Rezeptor) und Transkriptionsfaktoren (cJun, JunB, cFos oder Krox24). Die Tatsache, daß die genannten Rezeptoren bereits als molekulare Targets für die Entwicklung neuer Analgetika verwendet werden (Dickenson, 1995), gibt einen deutlichen Hinweis darauf, daß auch die Identifizierung neuer schmerzregulierter Gene für die Entwicklung von Analgetika, insbesondere für entsprechende Screeningverfahren, von großem Interesse ist. Die zentrale Idee ist hierbei, die Entstehung oder Persistenz von Schmerzen, insbesondere chronischer Art, zu unterbrechen, indem solche Proteine in ihrer Funktion beeinflußt werden, die in Schmerz-Zuständen verstärkt oder vermindert gebildet werden. Tabelle 1 Regulation bekannter Gene/Genprodukte in Schmerz-Tiermodellen
Daraus folgend war primäre Aufgabe der Erfindung, ein Screeningverfahren zur Identifizierung im Schmerz relevanter, insbesondere schmerzregulierender Substanzen zu entwickeln. Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten:

a) Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit dem Protein BNPI oder DNPI und/oder einem Protein gemäß einer der Abb. 1b), 1d), 1f), 2b) oder 2d) und/oder einem zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90% ähnliches Protein und/oder einem Protein, für das ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder ein dazu zu mindestens 90% ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder deren Antisense Polynukleotide binden, oder einem mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Aminosäuren langes Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder einer Zelle und/oder einer Präparation aus einer solchen Zelle, die mindestens eines der vorgenannten Proteine und Teilproteine synthetisiert hat,
b) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von der Zelle synthetisierten Protein oder Teilprotein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein oder Teilprotein veränderten funktionellen Parameter.

Dieses neuartige Screeningverfahren basiert darauf, daß hier eine potentielle Schmerz-Wirksamkeit einer Substanz über ihre Wechselwirkung mit einer schmerzregulierten Proteinstruktur, BNPI oder DNPI oder verwandte Strukturen, aufgefunden werden kann.
Dabei bezieht sich der Begriff schmerzregulierend auf einen potentiellen regulierenden Einfluß auf das physiologische Schmerzgeschehen, insbesondere auf eine analgetische Wirkung. Der Begriff Substanz umfaßt jede als Arzneimittel-Wirkstoff geeignete Verbindung, insbesondere also niedermolekulare Wirkstoffe, aber auch andere wie Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide oder Proteine wie Antikörper.
Die Inkubation unter geeigneten Bedingungen ist hier so zu verstehen, daß die zu untersuchende Substanz mit der Zelle oder der entsprechenden Präparation in einem wässrigen Medium eine definierte Zeit vor der Messung reagieren kann. Dabei kann das wässrige Medium temperiert werden, beispielsweise zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Inkubationszeit kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren Stunden variiert werden, je nach der Wechselwirkung der Substanz mit dem Teilprotein oder Protein. Bevorzugt sind aber Zeiten zwischen 1 min und 60 min. Das wäßrige Medium kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so daß bei der Inkubation beispielsweise ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0-7,5 im Medium herrscht. Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe etc. beigefügt werden. Die geeigneten Bedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem Teilprotein oder Protein aufgrund seiner Erfahrung, der Literatur oder weniger, einfacher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im Verfahren einen möglichst deutlichen Meßwert zu erhalten.
Eine Zelle, die ein bestimmtes Teilprotein oder Protein synthetisiert hat, ist eine Zelle, die dieses Teilprotein oder Protein bereits endogen exprimiert hat oder eine solche, die gentechnisch verändert wurden, so daß sie dieses Teilprotein oder Protein exprimiert und entsprechend vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens das Teilprotein oder Protein enthält. Die Zellen können Zellen aus evt. immortalisierten Zellinien sein oder native aus Geweben stammende und aus diesen isolierte Zellen sein, wobei der Zellverband meist aufgelöst ist. Die Präparation aus diesen Zellen umfaßt insbesondere Homogenate aus den Zellen, das Cytosol, eine Membranfraktion der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen etc.
Die hier aufgezählten Proteine und Teilproteine wurden im Rahmen dieser Erfindung als durch Schmerz reguliert oder schmerzrelevant verteilt identifiziert, in dem in einem Tier Schmerz ausgelöst wurde und nach angemessener Zeit durch Schnitte im Rückenmark das Expressionsmuster des Tieres mit denen eines Kontroll-Tieres ohne schmerzauslösende Maßnahmen verglichen. Die dabei gefundenen verändert exprimierten sind BNPI sowie insbesondere bezüglich der schmerzrelevanten Verteilung die DNPI.
Aus welcher Spezies diese Proteine stammen, ist für die Funktion des Verfahrens unerheblich, es ist aber bevorzugt, die humane, Maus- oder Ratten-Variante zu verwenden. BNPI und DNPI sind in Hinblick auf die kodierende DNA- und die Aminosäure-Sequenz bekannt und auch in Ihrer generellen Funktion beschrieben. BNPI, der "brain Na+ dependent inorganic phosphate cotransporter" ist in der WO 96/34288 beschrieben und der DNPI, der "differentiation-associated Na+ dependent inorganic phosphate Cotransporter", wurde von Aihara et al. (2000) im J. Neurochem. 74, 2622-2625 beschrieben.
Keiner dieser Transporter wurde aber bisher im Stand der Technik in einen Zusammenhang mit Schmerz und insbesondere der Schmerzregulation gebracht. Da hier die Identifizierung der Proteine über eine Veränderung der Expression oder die Expressionsverteilung in einem In-vivo- Schmerzmodell erfolgte, hat das daraus abgeleitete erfindungsgemäße Screening-Verfahren für zukünftige Arzneimittel unter Verwendung dieser Proteine den erheblichen Vorteil, nicht nur auf theoretischen Überlegungen aufzubauen, sondern vermutlich eine starke In-vivo-Relevanz zu besitzen. Da mit diesem Verfahren die Wechselwirkung von Substanzen mit im Schmerzbereich bisher nicht verwendeten Proteinen und Peptiden als Maßstab für das Auffinden schmerzregulierender Substanzen ermöglicht wird, sind mit diesem Verfahren jetzt möglicherweise schmerzrelevante Substanzen aufzufinden, die bei den im Stand der Technik bisher bekannten Verfahren mit anderen Peptiden oder Proteinen nicht aufgefallen wären. Auch dies ist ein erheblicher Vorteil des neuen erfindungsgemäßen Verfahrens.
Der Maßstab über den das Verfahren die Auffindung interessanter Substanzen erlaubt, ist entweder die Bindung an das Protein oder Teilprotein, die z. B. durch Verdrängung eines bekannten Liganden oder das Ausmaß gebundener Substanz nachgewiesen werden kann, oder die Veränderung eines funktionellen Parameters durch die Wechselwirkung der Substanz mit dem Teilprotein oder Protein. Diese Wechselwirkung kann insbesondere in einer Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen liegen und veränderte funktionelle Parameter können beispielsweise die Genexpression, das Ionenmilieus, der pH oder das Membranpotentials, bzw. die Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2^nd messenger sein.
Zur Erläuterung der Erfindung werden im folgenden neben den im allgemeinen Text zu Begriffen gegebenen Erklärungen weitere Definitionen angegeben, um klarzustellen, wie bestimmte, insbesondere in den Ansprüchen verwendete Begriffe im Sinne dieser Erfindung zu verstehen und auszulegen sind.

- Substanz: Damit ist eine chemische Verbindung gemeint. Hier handelt es sich im engeren Sinne um Verbindungen, die potentiell eine Wirkung im Körper entfalten können, niedermolekulare Wirkstoffe, Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide oder Proteine, insbesondere hier niedermolekulare Wirkstoffe.
- schmerzregulierend: Im Sinne der Erfindung heißt schmerzregulierend, daß die Substanz die Wahrnehmung von Schmerz direkt oder indirekt beeinflußt, insbesondere natürlich analgetisch wirkt.
- Schmerz: Im Sinne der Erfindung bedeutet Schmerz insbesondere ein Schmerzempfinden, präziser akkuter, chronischer, neuropathischer und entzündlicher Schmerz inclusive Migräne, insbesondere ist der Schmerz zugehörig zu folgenden Arten:
chronischem Schmerz, insbesondere muskuloskelettalem Schmerz; neuropathischem Schmerz, insbesondere allodynischem Schmerz, mechanischer Hyperalgesie oder diabetischer Neuropathie; viszeralem Schmerz, cerebralem Schmerz, peripherem Schmerz oder entzündungsbedingtem Schmerz, insbesondere peripherem Entzündungsschmerz; sowie Migräne, Cluster-Kopfschmerz oder den Schmerz bei Trigeminus Neuralgie.
- Inkubation: Unter Inkubation ist das Einbringen und Belassen eines biologischen Untersuchungsobjektes, beispielsweise einer Zelle oder eines Proteins, in einem temperierten Medium wie in einem Brutschrank oder auf einem Wasserbad zu verstehen. Dabei heiß hier unter geeigneten Bedingungen eine Inkubation unter physiologischen Bedingungen (z. B. 37°C pH 7,2) oder bei den Bedingungen, bei denen eine optimale Messung im Verfahren möglich wird.
- Zelle: Die Zelle ist ein sich selbst regulierendes, offenes, mit seiner Umgebung durch permanenten Stoffaustausch in einem Fließgleichgewicht stehendes System mit eigenem Stoffwechsel, und Vermehrungsfähigkeit. Die Zelle kann separat kultiviert oder Teil eines Gewebes, insbesondere aus einem Organ, sein, und dort vereinzelt oder noch im Zellverband vorliegen.
- Präparation aus einer Zelle: Darunter versteht man Präparate, die mittels chemischer, biologischer, mechanischer oder physikalischer Methoden unter Änderung der Zellstruktur hergestellt werden, beispielsweise Membranfragmente, isolierte Zellkompartimente, isoliertes Cytosol, oder aus Gewebe gewonnenes Homogenat.
- Peptid: Verbindung aus über peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften Aminosäuren. Ein Oligopeptid besteht aus zwischen 2 und 9 Aminosäuren, ein Polypeptid aus zwischen 10 und 100 Aminosäuren.
- Protein: Verbindung aus über peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften mehr als 100 Aminosäuren u. U. mit einer definierten Raumstruktur.
- Teilprotein: Verbindung aus über peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften mehr als 10 Aminosäuren u. U. mit einer definierten Raumstruktur aber ausgeschnitten bzw. ausgewählt aus einem definierten Priotein. Ein Teilprotein kann ein Peptid sein.
- PIM1-Kinase: PIM3-Kinase: Ein Proto-Oncogen und eine Serin- Threonin-Kinase.
- Polynukleotid: Das zugrundeliegende Nukleotid ist ein grundsätzlich aus Nucleinbase, Pentose und Phosphorsäure bestehender Grundbaustein der Nucleinsäuren. Diese entspricht einem hochmolekularen Polynucleotid aus mehreren Nukleotiden, die über Phosphorsäure- Pentose-Veresterung miteinander verknüpft sind. Unter die Erfindung fallen aber auch modifizierte Polynukleotide, die zwar die Basenabfolge beibehalten, aber über ein modifiziertes Rückrat statt der Phosphorsäure-Pentose verfügen.
- zu mindestens 90 (95, 97)% ähnlich: Darunter ist zu verstehen, daß die mit erfaßten Polynucleotide in ihrem kodierenden Bereich bezüglich der Basenabfolge zu mindestens 90% (95%, 97%) identisch mit der Referenz (Abbildung etc.) sind und die mit erfaßten Peptide und Proteine in ihrer Primärstruktur, der Abfolge der Aminosäuren zu mindestens 90% (95%, 97%) mit der Referenz identisch sind.
- Gen: Mit dem Begriff Gen wird ein Genomabschnitt mit einer definierten Nukleotidsequenz bezeichnet, der die Information zur Synthese einer m- oder prä-mRNA oder einer sonstigen RNA (z. B. tRNA, rRNA, snRNA etc.) enthält. Es besteht aus kodierenden und nicht kodierenden Abschnitten.
- Genfragment: Nukleinsäureabschnitt, der in seiner Basenabfolge einen Teilbereich eines Gens beinhaltet
- Bindung an das Peptid. Teilprotein oder Protein: Wechselwirkung zwischen Substanz und Peptid, Teilprotein oder Protein, die zu Fixierung führt.
- funktionelle Parameter: darunter versteht man Meßgrößen eines Experimentes, die mit der Funktion eines Proteins (Ionenkanal, Rezeptor, Enzym) korrelieren
- gentechnisch manipuliert: Manipulation von Zellen, Geweben oder Organismen derart, daß hier genetisches Material eingebracht wird
- endogen exprimiert: Expression eines Proteins, die eine Zelllinie unter geeigneten Kulturbedingungen aufweist, ohne das dieses entsprechende Protein durch gentechnische Manipulation zur Expression veranlasst wurde
- G-Protein: International übliche Abkürzung für ein Gunaosintriphosphat (GTP)-bindendes Protein, das als Signalprotein durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktiviert wird
- Reportergen: Generelle Bezeichnung für Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer Methoden oder histochemischer Methoden einfach nachweisen lassen, wie z. B. Luziferase, alkalische Phosphatase oder Green Fluorescent Protein (GFP).
- (rekombinantes) DNA-Konstrukt: Generelle Bezeichnung für jede Art von DNA-Molekülen, die durch die in vitro-Verknüpfung von DNA- Molekülen entstanden sind.
- Klonierungsvektor: Generelle Bezeichnung für Nukleinsäure-Moleküle, die beim Klonieren als Träger von Fremdgenen oder Teilen dieser Gene dienen.
- Expressionsvektor: Bezeichnung für speziell konstruierte Klonierungsvektoren, die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in den Vektor einklonierten Fremdgens erlauben.
- LTR-Sequenz: Abkürzung für Long terminal repeat. Generelle Bezeichnung für längere Sequenzbereiche, die an beiden Enden eines linearen Genoms zu finden sind. Derartige Sequenzbereiche kommen z. B. in den Genomen von Retroviren und an den Enden eukaryontischer Transposons vor.
- Poly-.A-Schwanz: die am 3'-Ende von messenger-RNAs durch Polyadenylierung angeheftenen Adenyl-Reste (ca. 20-250).
- Promotor-Seauenz: Bezeichnung für einen DNA-Sequenzbereich, von dem aus die Transkription eines Gens, d. h. die Synthese der mRNA, gesteuert wird.
- ORI-Sequenz: Abkürzung für Origin of replication. Die ORI-Sequenz erlaubt einem DNA-Molekül, sich als autonome Einheit in der Zelle zu vermehren.
- Enhancer-Sequenz: Bezeichung für relativ kurze, zum Teil als Repetitionen auftretende, genetische Elemente, die in der Regel die Expression mancher Gene in unterschiedlichem Maße verstärken.
- Transkriptionsfaktor: Bezeichnung für ein Protein, das über eine Bindung an spezifische DNA-Sequenzen, die Transkription eines Gens beeinflußt.
- kultivieren: Zellen oder Gewebe unter geeigneten Kulturbedingungen halten
- Bedingungen, die eine Expression erlauben, darunter versteht man die Auswahl und Anwendung von Kulturbedingungen die eine Expression des interessierenden Proteins erlauben, darunter gehören Temperaturänderung, Mediumwechsel, Zusatz von induzierenden Substanzen, Weglassen hemmender Substanzen.
- Inkubationszeit: Zeitdauer für die Zellen oder Gewebe inkubiert, d. h. einer definierten Temperatur ausgesetzt werden.
- Selektionsdruck: Anwendungen von Kulturbedingungen die Zellen mit einem bestimmtem Genprodukt, dem sog. Selektionsmarker, einen Wachstumsvorteil verschaffen.
- Amphibienzelle, Zelle aus einem Tier der Klasse der Amphibia
- Bakterienzelle, Zelle die dem Überreich der Eubacteria oder Archaebacteria zuzuordnen ist, oder von ihr abstammt.
- Hefezelle, Zelle die der Ordnung der Endomycetalse zuzuordnen ist, oder von ihr abstammt.
- Insektenzelle, Zelle die der Ordnung der Hexapoda zuzuordnen ist, oder von ihr abstammt.
- native Säugetierzelle, aus einem Säugetier stammende Zelle, die in ihren relevanten Merkmalen der im Organismus befindlichen Zelle entspricht.
- immortalisierte Säugetierzelle: Zelle die durch die angewendeten Kulturbedingungen oder gentechnische Manipulation die Eigenschaft erlangt hat, sich über die normalerweise übliche Teilungshäufigkeit hinaus (ca. 100) in der Kultur zu teilen.
- markiert: durch entsprechende Modifizierung oder Derivatisierung für eine Nachweisreaktion zugänglich gemacht. Beispielsweise radioaktiv, fluoreszierend oder lumineszierend.
- Ligand: Substanz, die an ein im Körper oder einer Zelle befindliches Molekül, im speziellen einen Rezeptor, bindet
- Verdrängung: vollständiges oder partielles Entfernen eines Liganden von seiner Bindungsstelle
- gebundene Aktivität: Biochemisch oder physikalisch erfaßter Meßwert, der mit der an einem Rezptor gebundenen Ligandenmenge korreliert
- Regulation: die als Teil eines Regelprozese erfolgte Hemmung oder Aktivierung eines Vorgangs
- Hemmung: als Sonderfall der Regulation die Verhinderung/Minderung eines Vorgangs
- Aktivierung: als Sonderfall der Regulation die Verstärkung eines Vorgangs
- Rezeptoren, Im weitesten Sinne alle im pro- oder eukaryoten Organismus vorhandenen Moleküle, an die ein Wirkstoff binden kann. Im engeren Sinne membrangebundene Proteine oder Komplexen mehrerer Proteine, die durch Bindung eines Wirkstoffes eine Änderung in der Zelle hervorrufen.
- Ionenkanäle: Membrangebundene Proteine oder Komplexe mehrerer Proteine, durch die Kationen oder Anionen durch die Membran hindurchgelangen können.
- Enzyme: Bezeichnung für Proteine oder Komplexe aus einer aktivierenden Nichteiweißkomponente mit einem Protein, die katalytische Eigenschaften besitzen.
- Genexoression (exprimieren/exprimierbar): das Übersetzen der genetischen Information eines Genes in RNA (RNA-Expression) oder in Protein (Proteinexpression).
- Ionenmilieu: Ionenkonzentration eines oder mehrerer Ionen in einem bestimmten Kompartiment.
- Membranpotential: Spannungsdifferenz über eine Membran aufgrund eines Überschusses an Kationen auf der einen Seite und Anionen auf der anderen Seite der Membran.
- Veränderung der Enzymaktivität: Hemmung oder Induktion der katalytischen Aktivität eines Enzyms.
- 2^nd messenger: kleines Molekül, das als Antwort auf ein extrazelluläres Signal entweder im Cytosol gebildet wird oder in das Cytosol hineinwandert und dabei hilft die Information an das Zellinnere weiterzugeben, wie zum Beispiel cAMP, IP₃.
- (Gen-)Sonde: Bezeichnung für jede Art von Nukleinsäuren, mit deren Hilfe man ein gesuchtes Gen oder eine bestimmte DNA-Sequenz nachweisen kann. Durch Derivatisierung der Gensonde (z. B. Biotin, magnetische Beads, Digoxinin) können zudem DNA-Moleküle aus einem Gemisch herausgezogen werden. Als Sonden werden klonierte Gene, Genfragmente, chemisch synthetisierte Oligonukleotide und auch RNA verwendet, die meist radioaktiv markiert ist.
- DNA: Internationale Bezeichnung für Desoxyribonukleinsäure
- genomische DNA: Generelle Bezeichnung für die bei eukaryontischen Organismen aus dem Zellkern einer Zelle stammenden DNA.
- cDNA: Abkürzung für complementary DNA. Bezeichnung für die einzel- bzw. doppelsträngige DNA-Kopie eines RNA-Moleküls.
- cDNA-Bank/Bibliothek: Bezeichung für eine Sammlung von willkürlich klonierten cDNA-Fragmenten, die zusammengenommen die Gesamtheit aller von einer Zelle oder einem Gewebe synthetisierten RNA repäsentieren.
- cDNA-Klon: Bezeichnung für eine Population genetisch einheitlicher Zellen, die sich von einer einzigen Zelle ableiten, derart, daß diese Zelle eine künstlich eingebrachtes cDNA-Fragment enthält.
- Hybridisierung: Durch Basenpaarung bewirkte Ausbildung eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls aus zwei getrennten Einzelsträngen.
- stringente Bedingungen: Bedingungen, unter denen nur perfekt basengepaarte Nukleinsäure-Stränge gebildet werden und stabil bleiben.
- isolieren: ein gesuchtes Molekül aus einem Gemisch herausfinden und abtrennen.
- DNA-Sequenzierung: Bestimmung der Abfolge der von Basen in einem DNA-Molekül.
- Nukleinsäuresequenz: Bezeichnung für die Primärstruktur eines DNA- Moleküls, d. h. die Abfolge der einzelnen Basen, aus denen sich eine DNA zusammensetzt.
- Genspezifische Oliqonukleotid Primer: Oligonukleinsäuren, also 10-40 Basen lange Nukleinsäurefragmente, die in ihrer Basenzusammensetzung eine stringente Hybridisierung an das gesuchte Gen oder die gesuchte cDNA erlauben.
- Ermitteln von Oligonukleotid Primern: Die manuelle oder Computerunterstützte Suche von Oligonukleotiden zu einer vorgegebenen DNA-Sequenz, die für eine Hybridisierung und/oder eine Polymerase-Ketten Reaktion optimal geeignet sind.
- PCR: Abkürzung für Polymerase-Kettenreaktion. In vitro-Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nucleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure- Molekülen.
- DNA-Template: Nukleinsäuremolekül oder ein Gemisch von Nukleinsäuremolekülen, aus denen ein DNA-Abschnitt mit Hilfe der PCR (s. o.) vervielfältigt wird.
- RNA: International gebräuchliche Abkürzung für Ribonukleinsäuren
- mRNA: International gebräuchliche Abkürzung für messenger- Ribonukleinsäuren, die am Transfer der genetischen Information aus dem Kern in die Zelle beteiligt sind und die Information für die Synthese eines Polypetids oder eines Proteins beinhalten.
- Antisense Polynukleotid: Eine aus mehreren natürlichen oder modifizierten Nukleinsäuren bestehendes Molekül, deren Basenabfolge komplementär zur Basenabfolge eines Teilbereiches einer in der Natur vorkommenden RNA ist.
- PNA: International gebräuchliche Abkürzung für peptidic Nucleic Acids. Hierbei bilden peptidisch verknüpfte Aminosäuren eine Kette, wobei die Aminosäuren als Seitenkette eine für die Hybridisierung mit DNA oder RNA fähigen Base trägt.
- Sequenz: Abfolge von Nukleotiden oder Aminosäuren. Im spezifischen Sinne dieser Erfindung ist damit die Nukleinsäuresequenz gemeint.
- Ribozym: Bezeichnung für eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure (z. B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease)
- DNA-Enzym: Bezeichnung für ein DNA-Molekül, das katalytische Aktivität beinhaltet (z. B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease)
- katalytische RNA/DNA: generelle Bezeichnung für Ribozyme bzw. DNA- Enzyme (s. o.).
- Adenovirus: bei Vertebraten vorkommender cytopathogener Virus
- Adenoassoziiertes Virus (AAV): Gehört zur Familie der Parvoviren. Für eine effektive Vermehrung des AAV ist eine Coinfektion der Wirtszellen mit Helferviren (z. B. Herpes-, Vaccina- oder Adenoviren) erforderlich. Die Eigenschaft von AAV, stabil in das Wirtsgenom zu integrieren, macht es als Transduktionsvektor für Säugetierzellen besonders interessant.
- Herpesvirus: Viraler Erreger der Herpes-Infektion
- posttranslationale Modifikation: Veränderung an Proteinen oder Polypetiden, die nach der Translation durchgeführt wird, hierzu zählen z. B. Phosphorylierung, Glykosylierung, Amidierung, Acetylierung oder Proteolyse.
- glykosilieren: Bezeichnung für das Anhängen von einzelnen Zuckermolekülen oder ganzen Zuckerketten an Proteine.
- phosphorylieren: Bezeichnung für das Anhängen von einem oder mehreren Phosphatresten an ein Protein, bevorzugt an die OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin oder Tyrosin.
- amidieren. Die Bezeichnung für das Umwandeln einer Carboxylfunktion in eine Amidfunktion, z. B. an den carboxyterminalen Aminosäurerest eines Peptides oder Proteins.
- mit Membrananker versehen: Posttranslationelle Modifikation eines Proteins, oder eines anderen organischen Moleküls, derart daß es durch Anhängen eines hydrophoben Moleküls, geeigneterweise eine Fettsäure oder ein Derivat derselben, an die Lipiddoppelschicht- Membran von Zellen verankert wird.
- spalten: in diesem spezifischen Fall die Spaltung eines Peptids oder Proteins in mehrere Untersequenzen.
- verkürzen: Ein aus mehreren Einzelteilen bestehendes Molekül um eine oder mehrere Teile zu verkürzen.
- Antikörper: Lösliche, oder an Zellmembranen gebundene, als Immunglobuline bezeichnete Proteine mit einer spezifischen Bindungsstelle für Antigene.
- monoklonaler Antikörper: sind gegen eine einzige antigene Determinante eines Antigens gerichtete Antikörper mit extrem hoher Selektivität
- polyklonaler Antikörper: Gemisch aus Antikörpern, die gegen mehrere Determinanten eines Antigens gerichtet sind.
- transgen: genetisch verändert
- nichthumanes Säugetier: Die Gesamtheit der Säugetiere (Klasse der Mammalia) mit Ausnahme der Spezies Mensch.
- Keim-Zelle: Zelle mit haploidem Genom, die durch Verschmelzung mit einer zweiten Keimzelle die Bildung eines neuen Organismus ermöglicht.
- somatische Zelle: diploide Zelle als Bestandteil eines Organismus
- chromosomale Einbringung: Eingriff in die Nukleotidsequenz auf chromosomaler Ebene
- Genom: Allgemeine Beschreibung für die Gesamtheit aller Gene in einem Organismus
- Vorfahr des Tieres: Ein Tier (der Vorfahr), das auf natürliche oder künstliche Weise durch Weitergabe an seinem genetischen Material in direkter Linie mit einem anderen Tier (dem Nachfahren) verwandt ist.
- exprimierbar: Ein Nukleinsäuremolekül ist dann exprimierbar, wenn es die Information zur Synthese eine Proteins oder Polypetids beinhaltet und mit ensprechenden regulatorischen Sequenzen versehen ist, die eine Synthese dieses Proteins oder Polypeptids in vitro oder in vivo erlauben. Wenn diese Voraussetzungen nicht mehr gegeben sind, beispielsweise durch Eingriff in der kodierenden Sequenz, ist das Nukleinsäuremolekül nicht mehr exprimierbar.
- Nagetier: Tier aus der Ordnung der Rodentia, z. B. Ratte oder Maus
- als schmerzregulierende Substanz identifizierbar: Substanz die bei Einbringung in einen lebenden Organismus eine Verhaltensänderung bewirkt, die der Fachmann als schmerzhemmend bezeichnet (antinozizeptiv, antihyperalgetisch oder antiallodynisch). Im Falle des Screeningverfahrens bezieht sich das darauf, daß die Substanz beim Screening durch stärkere Bindung oder Auslösung einer Änderung eines funktionellen Parameters deutlich, beispielsweise 100%, die Bindung oder Wechselwirkung des Durchschnitts der getesteten Substanzen übertrifft.
- Verbindung: ein anderer Name für Molekül, als aus mehreren Atomen bestehend, hier ein durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziertes Molekül.
- Wirkstoff: Eine Verbindung, die bei Anwendung an einem Organismus eine Veränderung in diesem Organismus hervorruft. Im Besonderen werden darunter organisch-chemisch synthetisierte Moleküle verstanden, die auf den Organismus eine heilende Wirkung ausüben. Hier insbesondere Moleküle, die an die erfindungsgemäßen Proteine und Peptide binden.
- niedermolekular: Molekül mit einem Molekulargewicht < 2 kDa
- Arzneimittel: ein Stoff entsprechend der Definition im Artikel 1 §2 des Gesetzes über den Verkehr mit Arzneimitteln
- Diagnostikum: Verbindung oder Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Krankheit zu diagnostizieren
- Behandlung von Schmerz: Verfahren, mit dem Ziel Schmerzen zu lindern oder aufzuheben, oder das zu erwartende Auftreten von Schmerzen zu hemmen (preemptive Analgesie).
- chronischer Schmerz: eine Schmerzempfindung von länger anhaltender Dauer, oft dadurch gekennzeichnet, daß sie über Zeitpunkt und Ort des initialen Stimulus hinausreicht, die Schmerzempfindlichkeit des Körpers steigert.
- Gentherapie: Unter Gentherapie versteht man alle Verfahren, die das Ziel haben, genetische Erkrankungen durch geeignete Veränderungen des Genoms kausal zu behandeln.
- In-vivo-Gentherapie: Einbringen von genetischem Material in den lebenden Organismus mit dem Ziel der Gentherapie. Man kann zwischen somatischem und Keimbahn-Eingriff unterscheiden, der einmal an diploiden Zellen und einmal an haploiden Zellen stattfindet.
- In-vitro-Gentheragie: Einbringen von genetischem Material in Zellen außerhalb des menschlichen Körpers mit dem Ziel diese nachher wieder durch Einbringen in den menschlichen Körper zur Gentherapie zur verwenden.
- Diagnostik: Verfahren, um eine Krankheit zu identifizieren.
- Wirksamkeitsuntersuchung: Untersuchung mit dem Ziel die Wirksamkeit einer Verbindung nach Einwirkung auf einen lebenden Organismus zu untersuchen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Zelle vor dem Schritt (a) gentechnisch manipuliert. Dabei wird genetisches Material in die Zelle eingebracht, insbesondere eine oder mehrere Polynukleotidsequenzen. In einer weiter bevorzugten Variante dieser Ausführungsform erlaubt die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter. In dieser Ausführungsform werden durch gentechnische Manipulation Voraussetzungen geschaffen unter denen die Veränderung eines funktionellen Parameters überhaupt oder verbessert gemessen werden kann. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, daß durch die gentechnische Manipulion eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines G-Proteins exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird. Darunter ist insbesondere die gentechnische Einführung eines endogen nicht vorhandenen oder physiologisch nicht exprimierten G-Proteins (GTPbindenden Proteins) in die Zelle zu verstehen, beispielsweise die Einführung eines chimären G-Proteins, das eine Veränderung des Signalweges erlaubt oder eines promiskuitiven G-Proteins, das sehr bindungsfreudig ist. Die Einführung eines Reportergens wiederum erlaubt die Messung einer (extrazellulär ausgelösten) induzierten Expression des Genproduktes.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zelle gentechnisch so manipuliert, daß die Zelle mindestens ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder ein dazu zu mindestens 90% ähnliches Polynukleotid enthält. Damit kann beispielsweise erreicht werden, daß ein Teilprotein oder Protein, das in der im Verfahren verwendeten Zelle oder Präparation nicht endogen exprimiert wird, von der Zelle synthetisiert wird. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn das Polynukleotid in einem rekombinanten DNA-Konstrukt enthalten ist. Unter einem (rekombinanten) DNA-Konstrukt versteht man ein in-vitro hergestelltes DNA-Molekül.
Wenn beim Verfahren vor dem Schritt a) die Zelle gentechnisch manipuliert wird, ist es bevorzugt, daß die Zelle nach der gentechnischen Manipulation und vor dem Schritt (a) unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird, gegebenenfalls unter Selektionsdruck. Unter kultivieren versteht man, Zellen oder Gewebe bei Bedingungen, die ein Überleben der Zellen, bzw. deren Nachfolgegeneration sichern, zu halten. Dabei sollten die Bedingungen hier so gewählt werden, daß eine Expression des durch die gentechnische Manipulation eingefügten Materials ermöglicht wird. Dazu sollten pH, Sauerstoffgehalt, und Temperatur physiologisch gehalten sein und ausreichend Nährstoffe und notendige Cofaktoren beigefügt sein. Der Selektionsdruck erlaubt, nur die Zellen weiter zu kultivieren, bei denen die gentechnische Manipulation zumindest teilweise erfolgreich war. Dazu gehört beispielsweise die Einführung einer Antibiotikaresistenz über das DNA-Konstrukt.
Es ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt, wenn die verwendete Zelle eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle ist. Beispiele für Amphibienzellen sind Xenopus Oocyten, für Bakterienzellen E- coli-Zellen, für Hefezellen solche auch Saccharomyces cerevisiae, für Insektenzellen Sf9-Zellen, für immortalisierte Säugetierzelle HeLa-Zellen und für native Säugetierzellen die CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zelle.
Bei einer bevorzugten Meßmethode zur Feststellung der Bindung der Substanz an Teilprotein oder Protein im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden vom Teilprotein oder Protein und/oder über die daran gebundene Aktivität einer markierten Testsubstanz. Dabei ist ein Ligand ein mit hoher Spezifität an das Protein oder Teilprotein bindendes Molekül, das durch eine ebenfalls bindende, zu testende Substanz aus der Bindungsstelle verdrängt wird. Unter Markierung ist eine den Nachweis erleichternde künstliche Modifikation am Molekül zu verstehen. Beispiele sind radioaktive, fluoreszierende oder lumineszierende Markierung.
Bei einer anderen bevorzugten Meßmethode zur Feststellung der durch die Bindung der Substanz an Teilprotein oder Protein im erfindungsgemäßen Verfahren ausgelösten Veränderung der funktionellen Parameter, erfolgt die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter über Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen, insbesondere über Messung der Veränderung der Genexpression, des Ionenmilieus, des pH oder des Membranpotentials, über Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2^nd messenger. Damit ist auf der einen Seite direkt die Messung der Wirkung der Substanz über die Beeinflußung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen erfaßt, auf der anderen Seite als bevorzugt zu messende Beispiele sich ändernder Parameter wie Genexpression, Ionenmilieu, pH, Membranpotential, Enzymaktivität oder Konzentration der 2^nd messenger. Dabei versteht man unter Ionenmilieu insbesondere die Konzentration eines oder mehrer Ionen in einem Zellkompartiment, insbesondere dem Cytosol, unter Membranpotential die Ladungsdiffferenz zwischen zwei Seiten einer Biomembran und unter 2^nd messenger Botenstoffe des intrazellulären Signalwegs wie z. B. zyklisches AMP (cAMP), Inosotoltriphosphat (IP3) oder Diacylglycerol (DAG).
In diesem Verfahren erfaßt ist die Verwendung von Teilproteinen und insbesondere Proteinen mit bekannter Sequenz und Funktion, ohne daß für diese im Stand der Technik eine Funktion im Schmerz bekannt war.
Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren worin der durch die aufzufindende Substanz regulierte Schmerz ausgewählt ist aus:
chronischem Schmerz, insbesondere muskuloskelettalem Schmerz; neuropathischem Schmerz, insbesondere allodynischem Schmerz, mechanischer Hyperalgesie oder diabetischer Neuropathie; viszeralem Schmerz, cerebralem Schmerz, peripherem Schmerz oder entzündungsbedingtem Schmerz, insbesondere peripherem Entzündungsschmerz; sowie Migräne, Cluster-Kopfschmerz oder den Schmerz bei Trigeminus Neuralgie.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Verbindung identifizierbar als schmerzregulierende Substanz durch ein erfindungsgemäßes Verfahren. Hierbei bezieht sich Verbindung insbesondere auf niedermolekulare Wirkstoffe, aber auch auf Peptide, Proteine und Nukleinsäuren. Dabei bedeutet identifizierbar, daß die Verbindung das Merkmal aufweist, daß es beim erfindungsgemäßen Screeningverfahren bezüglich der Bindung deutlich stärker, vorzugsweise doppelt so stark bindet wie der Durchschnitt der zu testenden Substanzen oder bezüglich der Änderung der funktionellen Parameter deutlich vom Durchschnitt der zu testenden Substanzen abweicht. Besonders bevorzugt ist es, wenn die erfindungsgemäße Verbindung eine niedermolekulare Verbindung ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung

a) eines Polynukleotids, vorzugsweise einer DNA oder RNA, kodierend für BNPI oder DNPI oder eines Polynukleotids, vorzugsweise einer DNA oder RNA, welches einer der in einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,
b) eines Polynukleotids, insbesondere eines Antisense Polynukleotids oder einer PNA, vorzugsweise eines DNA- Enzyms oder Ribozyms, eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA, das eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
c) eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), insbesondere eines Expressionsvektors und/oder insbesondere abgeleitet von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder insbesondere enthaltend mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI- Sequenz,
d) von BNPI oder DNPI und/oder eines Proteins gemäß einer der Abb. 1b), 1d), 1f), 2b) oder 2d) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90% ähnlichen Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder ein dazu zu mindestens 90% ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder dessen Antisense Polynukleotide bindet oder eines mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Aminosäuren langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine, wobei das Protein oder Teilprotein gegebenenfalls posttranslational modifiziert, insbesondere glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde,
e) eines Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers, gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
f) einer Zelle, vorzugsweise einer Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder einer immortalisierten oder nativen Säugetierzelle, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e)
g) einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 und/oder
h) eines Wirkstoffs, vorzugsweise eines niedermolekularen Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt a) bindet,

Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Behandlung des chronischen, insbesondere neuropathischen oder entzündungsbedingten Schmerzes.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung

a) eines Polynukleotids, vorzugsweise einer DNA oder RNA, kodierend für BNPI oder DNPI oder eines Polynukleotids, vorzugsweise einer DNA oder RNA, welches einer der in einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,
b) eines Polynukleotids, insbesondere eines Antisense Polynukleotids oder einer PNA, vorzugsweise eines DNA- Enzyms oder Ribozyms, eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA, das eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
c) eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), insbesondere eines Expressionsvektors und/oder insbesondere abgeleitet von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder insbesondere enthaltend mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI- Sequenz,
d) einer Zelle, vorzugsweise einer Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder einer immortalisierten oder nativen Säugetierzelle, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b) oder einen Vektor gemäß Punkt c)

Bevorzugt beim Einsatz in der Gentherapie ist auch die Verwendung eines Polynukleotids, beim dem es sich um ein Antisense Polynukleotid oder PNA handelt, oder das Teil eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung

a) eines Polynukleotids, vorzugsweise einer DNA oder RNA, kodierend für BNPI oder DNPI oder eines Polynukleotids, vorzugsweise einer DNA oder RNA, welches einer der in einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,
b) eines Polynukleotids, insbesondere eines Antisense Polynukleotids oder einer PNA, vorzugsweise eines DNA- Enzyms oder Ribozyms, eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA, das eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
c) eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), insbesondere eines Expressionsvektors und/oder insbesondere abgeleitet von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder insbesondere enthaltend mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI- Sequenz,
d) von BNPI oder DNPI und/oder eines Proteins gemäß einer der Abb. 1b), 1d), 1f), 2b) oder 2d) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90% ähnlichen Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder ein dazu zu mindestens 90% ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder dessen Antisense Polynukleotide bindet oder eines mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Aminosäuren langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine, wobei das Protein oder Teilprotein gegebenenfalls posttranslational modifiziert, insbesondere glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde,
e) eines Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers, gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
f) einer Zelle, vorzugsweise einer Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder einer immortalisierten oder nativen Säugetierzelle, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e),
g) einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 und/oder
h) eines Wirkstoffs, vorzugsweise eines niedermolekularen Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt a) bindet,

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Peptids oder Proteins, bei dem eine erfindungsgemäße Zelle, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält, kultiviert und gegebenfalls das Peptid oder Protein isoliert wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung

a) eines Polynukleotids, vorzugsweise einer DNA oder RNA, kodierend für BNPI oder DNPI oder eines Polynukleotids, vorzugsweise einer DNA oder RNA, welches einer der in einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,
b) eines Polynukleotids, insbesondere eines Antisense Polynukleotids oder einer PNA, vorzugsweise eines DNA-Enzyms oder Ribozyms, eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA, das eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
c) eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), insbesondere eines Expressionsvektors und/oder insbesondere abgeleitet von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder insbesondere enthaltend mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI-Sequenz,
d) von BNPI oder DNPI und/oder eines Proteins gemäß einer der Abb. 1b), 1d), 1f), 2b) oder 2d) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90% ähnlichen Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder ein dazu zu mindestens 90% ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder dessen Antisense Polynukleotide bindet oder eines mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Aminosäuren langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine, wobei das Protein oder Teilprotein gegebenenfalls posttranslational modifiziert, insbesondere glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde,
e) eines Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers, gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
f) einer Zelle, vorzugsweise einer Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder einer immortalisierten oder nativen Säugetierzelle, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e)

Generell ist es bei allen vorgenannten erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wenn der Schmerz ausgewählt ist aus
chronischem Schmerz, insbesondere muskuloskelettalem Schmerz; neuropathischem Schmerz, insbesondere allodynischem Schmerz, mechanischer Hyperalgesie oder diabetischer Neuropathie; viszeralem Schmerz, cerebralem Schmerz, peripherem Schmerz oder entzündungsbedingtem Schmerz, insbesondere peripherem Entzündungsschmerz; sowie Migräne, Cluster-Kopfschmerz oder dem Schmerz bei Trigeminus Neuralgie.
Mit den erfindungsgemäß verwendeten Polynukleotid sind auch die dargestellten Genfragmente selbst umfaßt, wie auch ein Polynukleotid, das entweder vollständig oder zumindest Teilen der kodierenden Sequenz des dem Fragment entsprechenden Gens entspricht. Damit sind auch Polynukleotide gemeint, die mindestens 90%-ige, vorzugsweise 95%-ige, insbesondere wenigstens 97%-ige Übereinstimmung in der Basenabfolge mit der kodierenden Sequenz der abgebildeten Polynukleotide oder der kodierenden Sequenz der Gens aufweisen. Es ist weiter bevorzugt, daß es sich bei dem Polynukleotid um RNA bzw. ein- oder doppelstängige DNA, insbesondere mRNA oder cDNA handelt. Ebenso ist es bevorzugt, daß es sich bei dem Polynukleotid um ein Antisense-Polynukleotid oder PNA handelt, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polynukleotid zu binden. Dabei versteht man unter PNA "peptidic nucleic acid" (peptidische Nukleinsäure), die zwar die Basenpaare trägt, aber dessen Rückrat peptidisch gebunden ist. Ein Antisense-Polynukleotid zeigt die komplementäre Basenabfolge zu mindestens einem Teil einer Basis-Nukleinsäure. Ebenfalls bevorzugt ist es, daß das Polynukleotid Teil eines Ribozym oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA bzw. DNA ist. Unter Ribozym ist eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure zu verstehen, unter DNA-Enzym ein entsprechende Desoxyribonukleinsäure, also katalytische RNA beziehungsweise DNA.
Unter dem erfindungsgemäß verwendeten Vektor versteht man ein Nukleinsäuremolekül, das bei gentechnischer Manipulation dazu dient, Fremdgene zu enthalten bzw. zu übertragen. Besonders bevorzugt ist dabei, daß es sich um einen Expressionsvektor handelt. Er dient damit der Expression des enthaltenen Fremdgens, des Polynukleotids. Weiter bevorzugt ist ein derartiger Vektor, der abgeleitet ist von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder er mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI- Sequenz enthält. Ein LTR ist ein "Long-TerminalRepeat", ein am Ende befindlicher Abschnitt beispielsweise bei Viren. Poly-A-Sequenz ist ein mehr als 20 Adenosinreste langer Schwanz. Eine Promotorsequenz ist der Steuerungsbereich für die Transkription.
Bevorzugt ist es für ein verwendetes Protein bzw. ein daraus abgeleitetes Teilprotein, wenn diese posttranslational modifiziert wurde, es insbesondere glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde. Posttranslationale Modifikationen sind beispielsweise dem Voet/Voet, Biochemistry, 1^st Edition, 1990, S. 935-938 zu entnehmen.
Dabei ist es für eine erfindungsgemäße Verwendung besonders bevorzugt, wenn das Polynukleotid (gegebenfalls gemäß Punkt a) und/oder Punkt b)) eine RNA oder eine ein- oder doppelstängige DNA, insbesondere mRNA oder cDNA ist.
Dabei ist es für eine erfindungsgemäße Verwendung besonders bevorzugt, wenn das Polynukleotid (gegebenfalls gemäß Punkt b)) Teil eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA ist.
Dabei ist es für eine erfindungsgemäße Verwendung besonders bevorzugt, wenn der Vektor (gegebenfalls gemäß Punkt c)) ein Expressionsvektor ist.
Dabei ist es weiter für eine erfindungsgemäße Verwendung besonders bevorzugt, wenn der Vektor (gegebenfalls gemäß Punkt c)) abgeleitet ist von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder er mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI-Sequenz enthält.
Dabei ist es für eine erfindungsgemäße Verwendung (nicht Gentherapie) besonders bevorzugt, wenn das Protein oder Teilprotein (gegebenfalls gemäß Punkt d)) posttranslational modifiziert wurde, es insbesondere glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde.
Dabei ist es für eine erfindungsgemäße Verwendung (nicht Gentherapie) besonders bevorzugt, wenn der Antikörper (gegebenenfalls gemäß Punkt e)) ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
Dabei ist es für eine erfindungsgemäße Verwendung besonders bevorzugt, wenn es sich bei der Zelle (gegebenenfalls gemäß Punkt f)) um eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle handelt.
Dabei ist es für eine erfindungsgemäße Verwendung besonders bevorzugt, wenn es sich bei der Verbindung (gegebenenfalls gemäß Punkt g)) um eine niedermolekulare Verbindung handelt.
Dabei ist es für eine erfindungsgemäße Verwendung besonders bevorzugt, wenn der genannte Wirkstoff gemäß Punkt h) ein niedermolekularer Wirkstoff ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Schmerzbehandlung, eines nichthumanen Säugetieres oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronischer Schmerzen, benötigt, durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, insbesondere solche enthaltend eine erfindungsgemäße Substanz und/oder einen an BNPI und/oder DNPI bindenden Wirkstoff.
Die Verabreichung kann beispielsweise in Form eines Arzneimittels wie oben beschrieben erfolgen.
Insgesamt ist eine wichtige Grundlage der Erfindung die Identifizierung schmerzregulierter Gene und Genfragmente. Darauf basiert das Screeningverfahren. Aber auch die Verwendung zur Diagnose oder Therapie bietet sich wie bereits ausgeführt an. Im folgenden werden entsprechende Anwendungsmöglichkeiten und weitere Ausführungsbeispiele erläutert.

1. Therapie chronischer Schmerzen

Die mRNA-Expression der Kinasen wurde durch in-situ-Hybridisierung im Rückenmarksgewebe untersucht. Im Rückenmark projizieren die primären sensorischen Neurone auf nachgeschaltete zentralnervöse Neurone, es handelt sich hierbei neben supraspinalen Vorgängen um die zentrale Umschaltstelle für nozizeptive Information. Zahlreiche Experimente konnten zeigen, daß der Entwicklung chronischer Schmerzzustände plastische Veränderungen des Nervensystems zugrundeliegen (als Überblick siehe Corderre et al., 1993; Zimmermann und Herdegen, 1996). Insbesondere in den Neuronen der dorsalen Wurzelganglien und des Rückenmarks sind plastische Veränderungen beschrieben worden, die mit der Regulation schmerzrelevanter Gene einhergeht. So ist für eine Reihe von Neurotransmitter-Rezeptoren, die für die Schmerztherapie von Bedeutung sind, eine Gen-Regulation im Rückenmark beschrieben worden (siehe Tabelle 1). Auf dieser Grundlage könnten die gefundenenen, unter Schmerz regulierten cDNA-Sequenzen zur Therapie (Gentherapie, Antisense, Ribozyme) und Diagnose chronischer Schmerzzustände verwendet werden.

1.1 Antisense-Strategien

Hierbei werden, abgeleitet von der Nukleinsäuresequenz der vollständigen cDNA oder von Teilbereichen Konstrukte erstellt, die die mRNA oder Proteinkonzentration herabsetzen können. Dies können z. B. antisense- Oligonukleotide (DNA oder RNA) sein, die eventuell unter Verwendung modifizierter Nukleotidbausteine (z. B. O-Allyl-Ribose) eine erhöhte Stabilität gegenüber Nukleasen aufweisen. Zudem ist die Verwendung von Ribozymen denkbar, die als enzymatisch aktive RNA-Moleküle eine spezifische Spaltung der RNA katalysieren. Daneben könnten auch Vektoren eingesetzt werden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen oder Teilbereiche dieser Nukleotidsequenzen unter Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimieren und somit für eine in-vivo oder ex-vivo Therapie geeignet sind. Zusätzlich sind auch Antisense-Konstrukte möglich, die unter Austausch des Phosphatrückgrats von Nukleotidsequenzen (z. B. PNAs, d. h. Peptide Nucleic Acids) oder Verwendung nichttraditioneller Basen wie Inosine, Queosine oder Wybutosine sowohl wie Acetyl-, Methyl-, Thio- und ähnlich modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanosin u, Thymidin und Uridin nicht oder in geringerem Masse durch endogene Nukleasen abgebaut werden können.

1.2. Antagonisten/Agonisten bzw. Inhibitoren/Aktivatoren der im Screeningverfahren verwendeten erfindungsgemäßen Genprodukte

Dies umfaßt Substanzen, die durch eine Bindung an das Genprodukt dessen Funktion verändern. Dies können sein:

1. 1.2.1. Organisch-chemische Moleküle, die im Rahmen eines Wirkstoffscreenings unter Verwendung der Genprodukte der erfindungsgemäßen cDNA als Bindungspartner gefunden werden.
2. 1.2.2. Antikörper, seien es polyklonale, chimäre, single-chain, F_ab- Fragmente oder Fragmente aus Phagen-Banken, die bevorzugt als neutralisierende Antikörper über eine Bindung an die Genprodukte spezifisch die Funktion beeinflussen.
3. 1.2.3. Aptamere, d. h. Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivate mit Proteinbindenden Eigenschaften. Dazu gehören auch sog. Spiegelmere, die durch Spiegelevolution gewonnene spiegelbildliche und damit stabile Oligonukleotide darstellen, die hochaffin und hochspezifisch ein Zielmolekül binden können (Klußmann et al., 1996).

1.3. Gentherapie

Die beschriebenen Sequenzen können zur Therapie neurologischer Erkrankungen insbesondere chronischer Schmerzustände eingesetzt werden, indem sie nach Klonierung in geeignete Vektoren (z. B. Adenovirus-Vektoren oder adeno-assozierter-Virus-Vektoren) zur in vivo oder ex-vivo Therapie verwendet werden, um dort z. B. einer Überexpression oder Unterexpression des endogenen Genproduktes entgegenzusteuern, die Sequenz des defekten Genproduktes zu korrigieren (z. B. durch Transsplicing mit dem exogenen Konstrukt) oder ein funktionelles Genprodukt zur Verfügung zu stellen.

2. Diagnose

Polynukleotidsequenzen (Oligonukleotide, antisense-DNA & RNA- Moleküle, PNAs), die von den im Screeningverfahren etc. verwendeten Nukleotidsequenzen abgeleitet sind, könnten zur Diagnose von Zuständen oder Erkrankungen eingesetzt werden, die mit einer Expression dieser Gensequenzen assoziiert sind. Beispiele dieser Zustände oder Erkrankungen beinhalten neurologische Erkrankungen inklusive chronischer Schmerzen oder neuropathischer Schmerzen (hervorgerufen z. B. durch Diabetes, Krebs oder AIDS) oder neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, Chorea Huntington, Jacob- Creutzfeld, amyotrophe Lateralsklerose und Demenzen. Die Nukleotidsequenzen könne auf vielfältige Weise (Northernblot, Southernblot, FISH-Analyse, PRINS-Analyse, PCR) entweder zur Identifizierung der Genproduktes oder abweichender diagnostisch relevanter Genprodukte oder zur Quantifizierung des Genproduktes dienen. Neben der Nukleinsäurediagnostik können auch Antikörper oder Aptamere gegen das von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierte Protein zur Diagnostik eingesetzt werden (z. B. mittels ELISA, RIA, immuncytochemische oder immunhistochemische Verfahren), um das Protein oder abweichende Formen zu identifizieren und das Protein zu quantifizieren.
Im Hinblick auf eine Gendiagnostik könnten Nukleinsäure-Sonden abgeleitet von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen zur Bestimmung des Gen-Lokus eingesetzt werden (z. B. durch FISH, FACS, artifizielle Chromosomen wie YACs, BACs oder P1-Konstrukte).
Die folgenden Beispiele und Abbildungen sollen die Erfindung erläutern, ohne sie darauf zu beschränken.

Abbildungen und Beispiele

Abbildungen

Fig. 1a) cDNA-Sequenz von BNPI, human; AN: NM_020309
Fig. 1b) Aminosäure-Sequenz von PIM1-Kinase, human; AN: NM_020309
Fig. 1c) cDNA-Sequenz von BNPI, human; Nr.: AAT42064 aus WO 96/34288
Fig. 1d) Aminosäure-Sequenz von BNPI, human; Nr.: AAT42064 aus WO 96/34288
Fig. 1e) cDNA-Sequenz von BNPI, Ratte; AN: U07609
Fig. 1f) Aminosäure-Sequenz von BNPI, Ratte; AN: U07609
Fig. 2a) cDNA-Sequenz von DNPI, human; AN: AB032435
Fig. 2b) Aminosäure-Sequenz von DNPI, human; AN: AB032435
Fig. 2c) cDNA-Sequenz von DNPI, Ratte; AN: AF271235
Fig. 2d) Aminosäure-Sequenz von DNPI, Ratte; AN: AF271235
Fig. 3) Auftrennung von radioaktiv markierten RFDD-PCR-Fragmenten in einem 6%-igen denaturierenden PAA-Gel (s. Beispiel 1)
Fig. 4) Hochregulation der DNPI- und BNPI-Proteinexpression in primären sensorischen Rattten-DRG-Neuronen und Fasern nach Collageninduzierter Arthritis. (s. Beispiel 2)
Fig. 5) Differentielle Expression von DNPI und BNPI in Synapsen der Schmerzleitung und motorischen Arealen des lumbaren Rückenmarks der Ratte (s. Beispiel 3a)
Fig. 6) Differentielle Expression von DNPI und BNPI in Synapsen der Dorsalhorn-Schmerzleitung-Arealen des lumbaren Rückenmarks der Ratte (s. Beispiel 3b)
Fig. 7) Differentielle Expression von DNPI und BNPI in Synapsen der Schmerzleitung des sakralen Rückenmarks der Ratte (s. Beispiel 3c)
Fig. 8) Differentielle Expression von DNPI und BNPI in Synapsen der medullo-cervicospinalen Schmerzleitung des Trigeminalnervs der Ratte (s. Beispiel 3d)
Fig. 9) Differentielle Expression von DNPI und BNPI in schmerzrelevanten Hinregionen der Ratte (s. Beispiel 3e)
Fig. 10) Differentielle Expression von DNPI und BNPI in schmerzrelevanten Hinregionen der Ratte (s. Beispiel 3f)
Fig. 11) Differentielle Expression von DNPI und BNPI in schmerzrelevanten Hinregionen der Ratte (s. Beispiel 3g)
Fig. 12) Differentielle Expression von DNPI und BNPI in schmerzrelevanten Hinregionen der Ratte (s. Beispiel 3h)

Beispiele

Beispiel 1

Identifizierung schmerzregulierter Gene miitels RFDD-PCR

A) Vorgehen

Es wurde folgendes Vorgehen gewählt:
Als Ausgangspunkt für die Isolierung schmerzregulierter Gene wurde die CFA-induzierte Arthritis an der Ratte gewählt, bei der das Complete Freund Adjuvans in die Schwanzwurzel injiziert wird. Das Zielgewebe, in dem die schmerzregulierte Expression der erfindungsgemäßen Gene nachgewiesen wurde, waren die dorsalen Wurzelganglien des fünften Lumbalsegmentes. Zur Isolierung differentiell regulierter Gene stehen vier Methoden zur Verfügung:

- cDNA-RDA (cDNA-representational difference analysis; Hubank & Schatz, 1994)
- DDRT-PCR (Differential Display RT-PCR; Liang & Pardee 1992, Bauer et al., 1994), Hiervon gibt es inzwischen verbesserte Modifikationen, wie die sogenannte "Restriction-fragment-differential-display-PCR" (RFDD- PCR), die druch zusätzliche Restriktionsfragmentierung der cDNA in Verbindung mit einer optimierten PCR-Amplifikation eine reproduzierbarere Reaktion erlaubt und zudem vermehrt Fragmente in der kodierenden Regoin detektiert (Ivanova et al., 1995).
- Subtraktive Hybridisierung (Watson & Margulies, 1993)
- SAGE (Serial Analysis of Gene expression, Velculescu et al., 1995).

Eine vergleichende Bewertung der genannten Methoden führte zur Auswahl der RFDD-PCR, da diese Methode im Gegensatz zur subtraktiven Hybridisierung und der SAGE in der Lage ist, sowohl hoch- und herunterregulierte Gene als auch seltene Transkripte zu erfassen und darüberhinaus innerhalb kurzer Zeitspannen eine Fülle von Ergebnissen liefert.

B) MATERIAL UND METHODEN

Isolierung und Charakterisierung schmerzregulierter cDNA- Sequenzen

Tiermodell: CFA-induzierten Polyarthritis

Die Adjuvans Arthritis (AA) ist eine induzierte Form der (sub)chronischen Arthritis. Sie wird durch Immunisierung von Ratten mit einer Suspension von Mycobakterien in Öl induziert. Bei der dadurch ausgelösten Erkrankung handelt es sich um eine T-Zell-vermittelte Autoimmun-Arthritis, die - da bei der Induktion jedoch kein definiertes Autoantigen eingesetzt wird - einer spontan auftretenden Arthritis im Menschen entspricht. Die AA wird häufig für Untersuchungen immunologischer Aspekte der Rheumatoiden Arthritis genutzt. Darüber hinaus wird das Modell zur Testung antiinflammatorischer und analgetischer Substanzen herangezogen. Die AA ist eine ziemlich aggressive Form der Arthritis. Der Entzündungsprozess der AA ist zwar selbstheilend, dennoch bleiben schwere Gelenkveränderungen bestehen. Die Schwere der Erkrankung kann über das Aufstellen eines Arthritis Indexes quantifiziert werden. Dabei werden alle vier Pfoten auf Rötung, Schwellung und Deformation der Gelenke untersucht. Ferner kann der Krankheitsverlauf über die Bestimmung des Körpergewichts, der Pfotenschwellung mittels Plethysmographie sowie durch histologische Untersuchungen der Gelenke näher charakterisiert werden.
Die Arthritis wird durch intracutane Injektion von CFA (100 µl der 5 mg/ml Stammlösung) in die Schwanzwurzel (dorsal) induziert. Durch tägliche Beobachtung der Tiere auf Beweglichkeit, Hautrötungen, Schwellungen von Tarsal- und Carpalgelenk wird der Schweregrad der Arthritis anhand eines Scoring-Indexes bestimmt. Das Einsetzen sichtbarer Entzündungen von Tarsal- oder Carpalgelenk beginnt etwa an Tag 10 nach Immunisierung. Die Schwere der Erkrankung nimmt über einen Zeitraum von 10-14 Tagen zu, erreicht ein Optimum, das für etwa 6-7 Tage gehalten wird, um dann wieder abzuklingen. Wurden Ratten nur mit IFA immunisiert, wurde keine Arthritis ausgelöst.

Gewebeentnahme

Die Tier werden dekapitiert, und die dorsalen Wurzelganglien nach Lubalektomie herauspräpariert und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren.

RNA-Isolierung

Aus den Gewebeproben wurde die Gesamt-RNA mit dem Trizol-Kit (Life Technologies) nach Angaben des Herstellers isoliert. Die RNA wurde UV-spektrometrisch quantifiziert (Extinktion bei 260 nm) und durch denaturierende Gelelektropherese in einem Formaldehyd-Agarosegel (Sambrook et al., 1989) auf Integrität überprüft.

DNase-Verdau

Vor Einsatz in die DDRT-PCR werden eventuelle Spuren an genomischer DNA durch DNase-Verdau entfernt. Hierbei wurden je 6 µg RNA in einem Gesamtvolumen von 100 µl in 1X First- Strandbuffer (Life Techn.) und 10 Units RNase-freie DNasel (Boehringer Mannheim) für 15 Minuten bei 37°c inkubiert. Nach Phenol-Chloroform- Extraktion wurde die RNA durch Zugabe an 1/10 Vol. Natriumacetat pH 5.2 und 2.5 Vol. Ethanol präzipitiert, in DEPC-Wasser gelöst, UV- spektrometrisch quantifiziert und durch erneute Formaldehyd-Agarose- Gelelektrophorese charakterisiert.

Reverse Transkription

Je 1 µg DNasel-verdaute RNA wurden mit Hilfe des displayProfile-Kits (Firma Display Systems Biotech, Vista, USA) nach Angaben des Herstellers revers transkribiert und Doppel-Strang cDNA erzeugt. Nach Aufreinigung der cDNA durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation wurde die Effizienz der cDNA-Synthese durch Gelektrophorese in einem 1.5%igen Agarosegel nachgewiesen.

Tag1-Restriktionsverdau

Je 10 µl der doppelsträngigen cDNA wurden mit dem Restriktionsenzym Tag1 verdaut. Dies wurde ebenfalls mit Hilfe des displayProfile-Kits (Firma Display Systems Biotech, Vista, USA) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Ausgehend von diesem Ansatz werden Adaptoren an die verdaute cDNA ligiert.

³³P-Endmarkierungsreaktion

Zur nachfolgenden Detektion der Fragmente wurde einer der beiden Primer (sog. O-Extension Primer) durch eine Endmarkierungsreaktion mit der T4 Polynukleotidkinase und [γ³³P]ATP radioaktiv markiert. Dies wurde ebenfalls mit Hilfe des displayProfile-Kits (Firma Display Systems Biotech, Vista, USA) nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

PCR-Amplifikation der cDNAs

Nach Liagation werden in parallelen Reaktionsansätzen je 0.2 µl der cDNA mit dem markierten o-Extension- Primer und einem der 64 Eu-Primer amplifziert und adie Reaktionsansätze in einem 6%igen Tris-Taurin-EDTA-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend für eine Stunde bei 80°C getrocknet und über Nacht auf einem BASIII-Detektionsscreen (Fa. Fuji) exponiert. Zur Auswertung wurde der STORM-Phosphor-Imager (Fa. Molecular Dynamics) unter Verwendung der ImageQuant-Software verwendet. Die Autoradiographie-Daten wurden im gleichen Größenmaßstab auf Folie gedruckt, die dann zum Auschneiden der Fragmente verwendet wurde.

Reamplifikation der DDRT-PCR-Fragmente

Differentiell regulierte PCR-Banden wurden mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und durch 15minütiges Kochen in 50 µl Tris-EDTA-Puffer aus dem Gelstück eluiert mit Hilfe des displayProfile-Kits (Firma Display Systems Biotech, Vista, USA) nach Angaben des Herstellers durch PCR reamplifiziert. Das Temperaturprofil entsprach der originalen PCR-Reaktion (s. o.). Die PCR- Ansätze anschließend mit 10 µl Probenpuffer (0.25% Bromphenolblau, 0.25% Xylenecyanol FF, 30% Glycerin) versetzt und in einem 3%igen TAE-Agarosegel mit 10 µg/ml Ethidiumbromid gelelektrophoretisch aufgetrennt und PCR-Produkte der erwarteten Größe aus dem Gel ausgeschnitten.

Klonierung in TA-Klonierungsvektoren

Die ausgeschnittenen Fragmente wurden mit dem Qiaquick-Gel-Extraktionskit (Fa. Qiagen) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt, bis zur Trockne eingeengt und in 5 µl bidest. Wasser aufgenommen. Anschließend wurden sie in den pCRII- TOPO-Vektor mittels des TOPO TA Cloning Kits (Fa. Invitrogen) nach Angaben des Herstellers ligiert und in TOP10F'-E.coli-Zellen transformiert. Der Transformationsansatz wurde auf LB-Agar-Platten mit 100 µg/ml Ampicillin ausgestrichen, die vorher mit 50 µl 2% X-Gal (Fa. Sigma) und 50 µl Isopropylthiogalactosid (Fa. Sigma) behandelt wurden. Die nach 15 stündiger Inkubation bei 37°C erhaltenen weißen Bakterien-Klone wurden in 5 ml LB-Flüssigmedium mit 100 µg/ml Ampicillin (100 µg/ml) überführt und über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Aus diesen Kulturen wurde Plasmid-DNA unter Verwendung des Qiagen-Spin-Miniprep-Kits (Fa. Qiagen) nach Angaben des Herstellers isoliert und je 5 µl der Plasmid-DNA durch EcoRI-Restriktionsverdau und anschließende TAE-Agarose- Gelelektrophorese charakterisiert.

Sequenzanalyse

Hierbei wurden je 500 ng der Plasmid-DNA mit dem T7-PCR-Primer unter Verwendung des Dye Terminator Cycle Sequencing Kits (Fa. Perkin-Elmer) nach Angaben des Herstellers sequenziert und die Reaktionen mittels des automatischen Sequencers ABI 370 (Fa. Applied Biosystems Inc.) analysiert. Die DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung der bioSCOUT-Software (Fa. LION, Heidelberg) mit den Gendatenbanken abgeglichen.

C) Ergebnis

In Abb. 3 ist ein entsprechendes Autoradiogramm gezeigt. Das Autoradiogramm zeigt die Auftrennung von PCR-Fragmenten die durch Amplifikation verschiedener cDNAs entstanden sind. Die cDNAs wurden durch reverse Transkription aus Gesamt-RNA aus L5-Spinalganglien synthetisiert. Die Gesamt-RNA wurde aus Kontrolltieren (-) und CFA- behandelten Tieren (+) isoliert. Mit einem Pfeil ist das Fragment ab50-24 gekennzeichnet, das, wie mittels der RFDD-Methode gezeigt, eine Hochregulation aufweist. Das Fragment ab50-24 zeigt eine hochsignifikante Homologie zur cDNA-Sequenz AC-Nr. AAT42064 von hBNPI (s. Abb 1c).
Damit ist nachgewiesen, daß BNPI unter den Bedingungen einer CFA- Behandlung stärker exprimiert wird.

Beispiel 2

Identifizierung schmerzregulierter Gene über immunzytochemische Färbung

Es wurde folgendes Vorgehen gewählt
Als Ausgangspunkt für die Isolierung schmerzregulierter Gene wurde das sogenannte CIA-Model (Collagen-induzierte Arthritis) an der Ratte gewählt, bei dem Colagen injiziert wird, um in der Ratte Arthritis auszulösen.
Das Vorgehen entsprach dem bei Persson S., Schäfer MK-H., Nohr D., Ekström G., Post C., Nyberg F. und Weihe E. (1994), Neuroscience 63; 313-326 bzw. Nohr D., Schäfer MK-H., Romeo H., Persson S., Nyberg F. Post C. und Weihe E. (1999), Neuroscience 93; 759-773 beschriebenen Verfahren, wobei die Offenbarung dieser Artikel ausdrücklich zum Teil der hier vorgelegten Offenbarung der Erfindung gemacht wird.
Zur immunhistochemischen Anfärbung wurden polyklonale Kanichen- Antiseren gegen das rekombinante DNPI- bzw. BNPI-Fusionsprotein verwendet. Es zeigte sich in Abb. 4, daß die Intensität der DNPI- und BNPI-Immunfärbung im lumbaren Dorsal-Root-Ganglion der arthritischen Ratte (B und D/CIA) im Vergleich zu den Kontrolltieren (A und C/CTLR) zunahm. Zu beachten ist die Zunahme sowohl in den Zellkörpern und der Faseranfärbung bei B im Vergleich zu A und bei C im Vergleich zu D.

Beispiel 3

Differentielle Betrachtung der Expression zwischen DNPI und BNPI über immuncytochemische Färbung

Zur immunhistochemischen Anfärbung wurden polyklonale Kanichen- Antiseren gegen das rekombinante DNPI- bzw. BNPI-Fusionsprotein verwendet. Generell wurden Schnitte verschiedener Regionen des ZNS angelegt und die Expression von DNPI mit der von BNPI verglichen.

Beispiel 3a zu Abb. 5

Es ist die differentielle Verteilung der Immunreaktivität von BNPI und DNPI im lumbaren Rückenmark der Ratte zu sehen. Die angrenzenden deparafinierten Abschnitte A- bis D sind wie folgt gefärbt:
A = anti-DNPI;
B = anti-DNPI präadsorbiert mit DNPI-Fusionsprotein;
C = anti-BNPI;
D = anti-BNPI präadsorbiert mit BNPI-Fusionsprotein;
Die DNPI-(A) und BNPI-(C)Immunfarbstoffe waren voll mit homologem rekombinanten BNPI-(D) und BNPI-(B)Fusionsprotein präadsorbierbar, was die Spezifität der Immunreaktion beweist.
Bemerkenswert ist das gegenseitig ausschließende Verteilungsmuster von DNPI und BNPI-Immunfärbung im äußeren und tiefen Dorsalhorn. (A; C). Punktierte Immunfärbung von DNPI ist in den synaptischen Emndungen des äußeren Dorsalhorns (Lamina 1 und Substantia gelatinosaa) (Pfeil in A), während BNPI Immunreaktivität vollständig fehlt (Pfeile in B). Akkumulation von starker positiver ppunktierter BNPI- Immunfärbung liegt im tieferen Dorsalhorn vor, während DNPI-Färbung relativ niedrig ist. DNPI ist präsent in der lateralen spinalen Nukleus (LSN in A), während BNPI völlig fehlt (LSN in C). DNPI ist in der Lamina X. um den zentralen Kanal abundant, während BNPI selten ist. BNPI Immunfärbung ist im lateralen Ventralhorn schwach und gering oder fehlend im medialen Ventralhorn. Durch das ganze Ventralhorn ist punktförmige DNPI-Färbung abundant, etwas weniger im lateralen Horn im Vergleich zum medialen Ventralhorn. Es gibt eine schwache BNPI und DNPI Färbung in einigen Zellkörpern des Ventralhorn Motoneurons, was aber nicht durch die homologen transporter Fusionsproteine präadsorbiert wurde und daher als nichtspezifisch eingestuft wurde.

Beispiel 3b zu Abb. 6

Es ist die differentielle Verteilung der Immunreaktivität von BNPI und DNPI im linken lateralen oberflächlichen dorsalen lumbaren Rückenmark (left lateral superficial dorsal lumbar spinal cord) der Ratte zu sehen. A und B jeweils für BNPI (A) und DNPI (B) gefärbt zeigen viele punktförmige Anfärbungen für DNPI, die in der Lamina I und substantia gelatinosa konzentriert sind wo BNPI fast vollständig fehlt. Weiter sind dichte Komplexe von DNPI positiven Punkten im lateralen spinalen Nukleus zu sehen, wo BNPI fast vollständug fehlt. Feine DNPI positive Punkte sind auch in den tieferen dorsalen Horn zu finden, wenn auch mit geringerer Dichte.

Beispiel 3c zu Abb. 7

Es ist die differentielle Verteilung der Immunreaktivität von BNPI und DNPI im sakralen Rückenmark der Ratte zu sehen. Die angrenzenden Abschnitte A und B jeweils für BNPI (A) und DNPI (B) gefärbt zeigen gegenseitige Exclusions-Zonen punktierter DNPI- und BNPI-Immunfärbung im Dorsalhorn. DNPI ist in der gesamten Grey Matter präsent und ist in den sehr äußeren Schichten des Dorsalhorns konzentriert, wo es es eine schmale Bande an der Grenze zu White Matter bildet. DNPI ist asbundant im lateralen spinalen Nukleus und in der Lamina X wie auch in der Lamina V/VI und im ganzen ventralen Horn. BNPI ist abundant im tiefen Dorsalhorn und selten in Ventralhorn.

Beispiel 3d zu Abb. 8

Es ist die differentielle Verteilung der Immunreaktivität von BNPI und DNPI in der unteren Medulla oblongate am Übergang zum cervicalen Rückenmark zu sehen. Die angrenzenden Abschnitte A und B jeweils für BNPI (A) und DNPI (B) gefärbt zeigen eine bevorzugte Akkumulation der BNPI-Färbung im medialen Teil des spinalen trigeminalen Nukleus und in dem mittleren und unteren Teil der dorsalen Medulla. es ist nur eine sehr schwache Färbung mit BNPI in den ventralen Medulla zu sehen. DNPI ist abundant in Grey Matter der Medulla. DNPI-Färbung überlappt mit der BNPI-Färbung im inneren spinalen Nucleus V. Es ist zu beachten, daß BNPI auch im oberen spinalen trigeminalen Nukleus, der gleich der spinalen substantia gelöatinosa ist, zu finden ist. DNPI-Färbung ist in Gebieten schwächer, in denen BNPI präsent ist, schwächer als in Gebieten, wo BNPI niedrig ist oder fehlt. Einige wenige BNPI Punkte sind im ventralen Grey Motor Gebiet zu sehen.

Beispiel 3e zu Abb. 9

Komplemebntär differentielle Verteilung von DNPI und BNPI Imunreaktivität in 2 Folgeschnitten des Rattenhirnsd in schmerzrelevanten Hirnregionen wie sensorischer parietaler Cortex; cingulärer Cortex, Thalamus, Corpus amygdaloideum sowie auch Hypothalamus. DNPI ist im Cortex in den granulären sensorischen Schichten insbesondere in Lamina IV konzentriert; BNPI ist im Cortex abundant aber schwächer in der Lamina IV als in anderen Laminae. Im cingulären Cortex (C vs D als Hochvergrößerung) ist die Verteilung von DNPI und BNPI komplementär wechselseitig excludierend bzw. reziprok in der Dichte der jeweiligen Synapsen. DNPI überwiegt im Thalamus eindeutig über BNPI, BNPI ist im Hypothalamus spärlich, DNPI abundant. Abundantes BNPI überwirgt im Hypocampus über spärliches DNPI bei wechselseitig komplementärer Verteilung.
Thalamus = Th,
Amygdala = Amyg.
Hippocampus = Hip,
Cinguläerer Cortex = Cg,
Hypothalamus = Hy,
parietaler Cortex = PC.

Beispiel 3f zu Abb. 10

Komplementär differentielle Verteilung von DNPI und BNPI Immunreaktivität in schmerzrelevanten Hirnregionen wie cingulärer Cortex (Cg) und Tectum sowie dorsalem periaquäductalen Grau. DNPI Dominanz im Tectum und dorsalem Grau. Folgeschnitte eines Rattenhirns durch das obere Mesencephalon.

Beispiel 3g zu Abb. 11

Komplementär differentielle Verteilung von DNPI und BNPI mmunreaktivität in schmerzrelevanten Hirnregionen wie Tectum (T) sowie periaquäductalen Grau (PAG). DNPI Dominanz im Tectum und dorsalem Grau. Man notiere differentielle Verteilung von DNPI und BNPI im corpus geniculatum mediale (cgm) der Hörbahn. Folgeschnitte eines Rattenhirns durch das obere Mesencephalon; Ebene colliculus superior.

Beispiel 3h zu Abb. 12

Abundanz von DNPI über BNPI in den Habenulae (Hb). DNPI ist präsent im gesamten Habenularkomplex (niedrige Vergrößerung, obere Abbildung; hohe Vergrößerung, mittlere Abbildung). BNPI ist nur im medialen Habenufarkern (mHb untere Abbildung, Folgeschnitt zu mittlerer Abbildung).

Analyse zu Beispiel 3 allgemein

Die differentielle Verteilung von BNPI und DNPI in Synapsen des primärafferenten, spinalen trigeminalen und supraspinalen nociceptiven Systems ist eine starke Evidenz für eine selektive Beeinflußbarkeit nociceptiver Funktionen durch selektive Modulation des DNPI bzw. BNPIvermittelten Glutamat-Transports. Die Verteilung von BNPI im tiefen Hinterhorn ist eine Indikation für eine präferentielle Rolle des BNPI bei glutamaterg getriebenen neuropathischen Schmerzen.
Die präferentielle Verteilung von DNPI in der lamina 1 und der substantia gelationosa des spinalen und trigeminalen nociceptiven Systems spricht für eine proimäre und präferentielle Rolle von DNPI bei Entzündungsschmerz. Da DNPI-Synapsen auch im tieferen Hinterhorn liegen, ist DNPI auch ein Kandidat bei neuropathischem Schmerz.
BNPI ist ein präferentieller Kandidat für Allodynie und mechanische Hyperalgesie bei Entzündungsschmerz. Glutamat-vermittelter Aß-Input auf spinale nociceptive Projektions-Neurone konvergierend könnte ein wesentlicher Mechanismus für chronischen tiefen muskuloskelettalen Schmerz sein, ein Hauptproblem des chronischen Schmerzes.
Die Präsenz in visceralen sakralen Afferenzen deutet auf Indikation bei viszeralem Schmerz.
Trigeminale Afferenz: Migräne, Cluster-Kopfschmerz, Trigeminus- Neuralgie.

Beispiel 4

Durchführung des Screeningverfahrens mit Messung der Bindung über die Verdrängung eines radioaktiv markierten Liganden

Ein Nukleinsäureabschnitt, der für BNPI kodiert, wird in einem Expressionsvektor kloniert, der eine konstitutive Expression (z. B. CMV- Promoter) oder eine induzierbare Expression in eukaryonten Zellen erlaubt. Die DNA wird mit geeignetem Transfektionsverfahren, z. B. mit Lipofectamin (Fa. Roche Diagnostics) in eukaryontischen Zellen (z. B. CHO-Zellen, HEK293-Zellen oder NIH-3T3-Zellen) hineingebracht. Die Zellen werden in Anwesenheit eines Selektionsreagenzen (z. B. Zeocin, Hygromycin oder Neomycin) kultiviert so daß nur die Zellen überleben, die das DNA- Konstrukt aufgenommen haben, und bei länger andauernder Selektion, auch in das Genom inkorporiert haben.
Ausgehend von diesen Zellen werden Membranfraktionen gewonnen, die BNPI in großer Menge enthalten und für einen Bindungsassay verwendet werden können. Dieser besteht aus 1.) dem BNPI enthaltenden Membranen 2.) einem radioaktiv markierten Liganden 3.) einem Bindungspuffer (z. B. 50 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA) und dem auf Bindung zu untersuchenden Liganden. Nach Inkubation der oben genannten Reaktionsgemische (für z. B. 30-60 min) bei einer geeigneten Temperatur (meistens Raumtemperatur) werden die nichtgebundenen radioaktiven Ligandenmoleküle abfiltriert. Die Restmenge an gebundenem Liganden wird nach Zugabe eines Szintillationscocktails in einem β-Counter (z. B. Trilux, Fa. Wallac) vermessen. Zeigt die Testsubstanz eine Bindung an BMPI, so wird dies als verringerter radioaktiver Einbau detektiert. Dieses Verfahren wird geeignetermaßen so miniaturisiert, daß es in (96-, 384- oder 1536-well) Mikrotiterplatten durchgeführt werden kann, um dieses Verfahren mittels eines Roboters im sogenannten Hightroughput-Screening (HTS)-Verfahren durchzuführen.

Beispiel 5

Durchführung des erfindungsgemäßen Screeningverfahrens mit BNPI und Messung der durch die Bindung der Substanz veränderten funktionellen Parameter

Ein Nukleinsäureabschnitt, der für BNPI kodiert, wird in einem Expressionsvektor kloniert, der eine induzierbare Expression in Prokaryonten, wie z. B. E.coli erlaubt. Hierbei wird der Nukleinsäureabschnitt so modifiziert, daß er als Fusionsprotein mit einer zusätzlichen N- oder C-terminalen Aminosäuresequenz exprimiert wird. Diese Sequenz sollte bei unveränderter Funktion des BNPI eine Aufreinigung über ein spezifisches Verfahren erlauben, z. B. Glutathion S- Transferasefragment, das über Bindung an Glutathion eine Isolierung aus dem Proteingemisch erlaubt. Nach Transfektion der Bakterien, Induktion des Genes (z. B. mit IPTG beim lac-Promoter) und Aufschließen der Bakterien werden die Fusionsproteine aufgereinigt und in einem in vitro- Kinase Experiment eingesetzt. Hierbei werden 5 µg Protein bei 30°C für 30 Minuten in 50 µl Kinasepuffer (20 mM PIPES, pH 7.0, 5 mM MnCl₂, 7 mM β-Mercaptoethanol, 0.4 mM Spermin, 10 mM rATP) ergänzt mit 10 µCi [γ³²P] ATP. Als Substrate werden gereinigtes Histon H1-Protein (Fa. Sigma) oder bakteriell exprimiertes GST-NFATc1-Fusionsprotein hinzugegeben. Nach der Inkubationszeit wird das nicht-inkorpierte [γ-³²P] ATP abfiltriert und die Menge an eingebautem ³²Phosphat durch β-Szintillation (Trilux, Fa. Wallac) bestimmt. In einem Experiment zum Aufspüren neuer BNPI- Inhibitoren werden in diesem Ansatz die Testsubstanzen mitinkubiert und eine Abnahme der ³²P-Inkorporation als Indikator für einen Inhibitor benutzt. Dieses Verfahren wird geeignetermaßen so miniaturisiert, daß es in (96-, 384- oder 1536-well) Mikrotiterplatten durchgeführt werden kann, um dieses Verfahren mittels eines Roboters im sogenannten Hightroughput- Screening (HTS)-Verfahren durchzuführen.

Beispiel 6

Durchführung des erfindungsgemäßen Screeningverfahrens mit DNPI und Messung der durch die Bindung der Substanz veränderten funktionellen Parameter

Das Verfahren wird wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt mit der Ausnahme, daß statt eines Nukleinsäureabschnitt, der für BNP1 kodiert, ein Nukleinsäureabschnitt eingesetzt wurde, der für DNPI kodiert.

Beispiel 7

Beispiel für ein Arzneimittel zur Schmerzbehandlung enthaltend eine erfindungsgemäße Verbindung - Tablettenformulierung

Tabletten können durch direktes Verpressen von Mischungen der erfindungsgemäßen Verbindung mit entprechenden Hilfsstoffen oder durch Verpressen von verbindungshaltigen Granulaten (mit gegebenenfalls weiteren Hilfsstoffen) hergestellt werden. Die Granulate können dabei entweder durch Feuchtgranulation mit z. B. wäßrigen Granulierflüssigkeiten und anschließender Trocknung dieser Granulate oder durch Trockengranulation z. B. über Kompaktierung hergestellt werden. Direktverpressung z. B. pro Tablette

25 mg erfindungsgemäße Verbindung

271 mg Ludipress™ (Granulat zur Direkttablettierung aus Lactose monohydrat, Povidon K30 und Crospovidon)

4 mg Magnesiumstearat

300 mg Gesamt

Homogene Mischung des Wirkstoffes mit den Hilfsstoffen herstellen und diese auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem ∅ von 10 mm verpressen.

Trockengranulation z. B. pro Tablette


25 mg	erfindungsgemäße Verbindung
166 mg	Microcristalline Cellulose
80 mg	Niedrig substituierte Hydroxypropylcellulose (I-HPC LH 11™)
5 mg	Hochdisperses Siliziumdioxid
4 mg	Magnesiumstearat
280 mg	Gesamt

Homogene Mischung der Verbindung mit der Mikrokristallinen Cellulose und der I-HPC herstellen und diese Kopaktieren. Nach dem Sieben der Komprimate wird das entstandene Granulat mit Magnesiumstearat und Siliziumdioxid gemischt und auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem ∅ von 9 mm verpreßt. Feuchtgranulation z. B. pro Tablette

25 mg erfindungsgemäße Verbindung

205 mg Mikrokristalline Cellulose

6 mg Povidon K30

10 mg Crospovidon

4 mg Magnesiumstearat

250 mg Gesamt
Homogene Mischung der Verbindung mit der Mikrokristallinen Cellulose und dem Crospovidon herstellen und diese in einem Granulator mit einer wäßrigen Lösung des Povidons granulieren. Das feuchte Granulat wird anschließend nachgranuliert und nach der Trocknung im Trockenschrank (50°C) 10 h getrocknet. Das trockene Granulat wird mit dem Magnesiumstearat zusammen gesiebt, endgemischt und auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem ∅ von 8 mm verpreßt.

Beispiel 8

Beispiel für ein Arzneimittel zur Schmerzbehandlung enthaltend eine erfindungsgemäße Verbindung - parenterale Lösung

1 g einer erfindungsgemäßen Verbindung wird in 1 l Wasser für Injektionszwecke bei Raumtemperatur gelöst und anschließend durch Zugabe von NaCl (Natriumchlorid) auf isotone Bedingungen eingestellt. Literatur Aihara Y, Mashima H. Onda H. Hisano Setsuji, Kasuya H., Hori T. Yamada S., Tomura H. Yamada Y., Inoue, I., Kojima I. und Takeda J. (2000), J. Neurochem. 74: 2622-2625
Akopian AN, Sivilotti L & Wood JN (1995) Nature 379: 257-262
Ausubel FM, Brent R, Kingdton RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA & Struhl K eds.(1190) Current protocols in molecular biology. John Wiley &Sons, Inc. New York, NY.
Baba H, Doubell TP, Woolf CJ 1999: Peripheral inflammation facilitates Aβ flber-mediated synaptic input to the substantia gelatinosa of the adult rat spinal cord. J Neurosci 19: 859-867
Bauer D, Müller H, Reich J, Riedel H, Ahrenkiel V, Warthoe P & Strauss M (1993): Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique (DDRT-PCR) Nucl Acids Res 21: 4272-4280.
Bonini A, Anderson SM, Steiner DF (1997) Molecular cloning and tissue expression of a novel orphan G Protein-coupled receptor from rat lung. Biochem Biophys Res Comm 234: 190-193.
Chih-Cheng et al., (1995): A P2X prinoceptor expressed by a subset of sensory neurons. Nature 377: 428-432
Corderre TJ, Katz J, Vaccarino AL, Melzack R (1993): Contribution of central plasticity to pathological pain: review of clinical and experimental evidence. Pain 52: 259-285.
Dickenson (1995) Novel pharmacological targets in the treatment of pain. Pain Rev., 2, 1-12.
Dubuisson et al., 1997 Pain, 4: 161-174.
Feng Y & Gregor P (1997) Cloning of a novel member of the G Proteincoupled receptor family related to peptide receptors. Biochem Biophys Res Comm 231: 651-654.
Furukawa T, Yang Y, Nakamoto B, Stamatoyannopoulos G, Papayannopoulou T (1996): Identification of new genes expressed in a human erythroleukemia cell line. Bloods Cell Mol & Dis 22: 11-22.
Gungsekar PG, Kanthasamy, AG, Borowitz JL, Isom GE 1995: NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J Neurochem 65: 2016-2021.
Hawes BE, Fried S. Yao X, Weig B, Graziano MP 1998: Nociceptin (ORL1) and µ-Opioid receptors mediate mitogenactivated protein kinase activation in CHO cells through a Gi-coupled signaling pathway: evidence for distinct mechanisms of agonist-mediated desensitization. J Neurochem 71: 1024-1033.
Hubank M & Schatz DG (1994): Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA. Nucl Acids Res 22: 5640-5648.
Klußmann S et al., 1996: Nature Biotechnology 14: 1112-1115.
Li L-Y & Chang K-J 1996: The stimulatory effect of opioids on mitogenactivated protein kinase in chinese hamster ovary cells transfected to express µ-opioid receptors. Mol Pharm 50: 599-602.
Liang P & Pardee AB 1992: Differential Display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257: 967-971.
Methner A, Hermey G, Schinke B, Hermanns-Borgmeyer I (1997): A novel G Protein-coupled receptor with homology to neuropeptide and chemoattractant receptors expressed during bone development. Biochem Biophys Res Comm 233: 336-342.
Mohit AA, Martin JH & Miller CA 1995: p493F12 Kinase: a novel MAP kinase expressed in a subset of neurons in the human nervous system. Neuron 14: 67-78.
Poirier GM-C, Pyati J, Wan JS, Erlander MG 1997: Screening differentially expressed cDNA clones obtained by differential display using amplified RNA. Nucleic Acids Research 25: 913-914.
Sambrook J, Fritsch EF & Maniatis,T 1989: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
Sompayrac L, Jane S. Burn TC, Tenen DG & Danna KJ 1995: Overcoming limitations of the mRNA differential display technique. Nucleic Acids Research 23: 4738-4739.
Tal M 1996: A novel antioxidant alleviates heat hyperalgesia in rats with an experimental painful neuropathy. Neurreport 7: 1382-1384.
Tölle TR (1997): Chronischer Schmerz. In: Klinische Neurobiologie, Herdergen T, Tölle TR, Bähr M (Hrsg.): S. 307-336; Spektrum Verlag, Heidelberg.
U.S. Patent 5.262.311
Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW (1995): Serial analysis of gene expression. Science 270: 484-487.
Wan JS, Sharp JS et al. (1996): Cloning differentially expressed mRNAs Nature Biotech 14: 1685-1691.
Watson JB & Margulies JE (1993) Differential cDNA screening strategies to identify novel stage-specific proteins in the developing mammalian brain. Dev Neurosci 15: 77-86.
Wilks AF (1989) Two putative protein-tyrosine kinases identified by application of the polymerase chain reaction. Poc Natl Acad Sci USA 86: 1603-1607.
WO 96/34288
Woolf CJ, Shortland P, Coggeshall RE 1992: Peripheral nerve injury triggers central sprouting of myelinated afferents. Nature 355: 75-78.
Zimmermann, M & Herdegen, T (1996): Plasticity of the nervous system at the systemic, cellular and molecular levels: a mechanism of chronic pain and hyperalgesia. Progr Brain Res 110: 233-259

Claims

1. Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten:

a) Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit dem Protein BNPI oder DNPI und/oder einem Protein gemäß einer der Abb. 1b), 1d), 1f), 2b) oder 2d) und/oder einem zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90% ähnliches Protein und/oder einem Protein, für das ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder ein dazu zu mindestens 90% ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder deren Antisense Polynukleotide binden, oder einem mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Aminosäuren langes Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder einer Zelle und/oder einer Präparation aus einer solchen Zelle, die mindestens eines der vorgenannten Proteine und Teilproteine synthetisiert hat,

b) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von der Zelle synthetisierten Protein oder Teilprotein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein oder Teilprotein veränderten funktionellen Parameter.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeile vor dem Schritt (a) gentechnisch manipuliert wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß durch die gentechnische Manipulation eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines G-Proteins exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle gentechnisch so manipuliert wird, daß die Zelle mindestens ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder ein dazu zu mindestens % ähnliches Polynukleotid enthält.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid in einem rekombinanten DNA-Konstrukt enthalten ist.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle nach der gentechnischen Manipulation gemäß Anspruch 2 und vor dem Schritt (a) gemäß Anspruch 1 unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird, gegebenenfalls unter Selektionsdruck.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle ist.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden des Teilproteins oder Proteins und/oder über die daran gebundene Aktivität einer markierten Testsubstanz erfolgt.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter über Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen erfolgt, insbesondere über Messung der Veränderung der Genexpression, des Ionenmilieus, des pH oder des Membranpotentials, über Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2^nd messenger.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der durch die aufzufindende Substanz regulierte Schmerz ausgewählt ist aus:
chronischem Schmerz, insbesondere muskuloskelettalem Schmerz; neuropathischem Schmerz, insbesondere allodynischem Schmerz, mechanischer Hyperalgesie oder diabetischer Neuropathie; viszeralem Schmerz, cerebralem Schmerz, peripherem Schmerz oder entzündungsbedingtem Schmerz, insbesondere peripherem Entzündungsschmerz; sowie Migräne, Cluster-Kopfschmerz oder den Schmerz bei Trigeminus Neuralgie.

12. Verbindung identifizierbar als schmerzregulierende Substanz durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.

13. Verbindung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine niedermolekulare Verbindung ist.

14. Verwendung

a) eines Polynukleotids, vorzugsweise einer DNA oder RNA, kodierend für BNPI oder DNPI oder eines Polynukleotids, vorzugsweise einer DNA oder RNA, welches einer der in einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) oder 2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht,

b) eines Polynukleotids, insbesondere eines Antisense Polynukleotids oder einer PNA, vorzugsweise eines DNA- Enzyms oder Ribozyms, eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA, das eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,

c) eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), insbesondere eines Expressionsvektors und/oder insbesondere abgeleitet von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder insbesondere enthaltend mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI- Sequenz,

d) von BNPI oder DNPI und/oder eines Proteins gemäß einer der Abb. 1b), 1d), 1f), 2b) oder 2d) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90% ähnlichen Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder ein dazu zu mindestens 90% ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der Abb. 1a), 1c), 1e), 2a) oder 2c) oder dessen Antisense Polynukleotide bindet oder eines mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Aminosäuren langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine, wobei das Protein oder Teilprotein gegebenenfalls posttranslational modifiziert, insbesondere glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde,

e) eines Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers, gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),

f) einer Zelle, vorzugsweise einer Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder einer immortalisierten oder nativen Säugetierzelle, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e)

g) einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 und/oder

h) eines Wirkstoffs, vorzugsweise eines niedermolekularen Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt a) bindet,

zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz.

15. Verwendung

d) einer Zelle, vorzugsweise einer Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder einer immortalisierten oder nativen Säugetierzelle, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b) oder einen Vektor gemäß Punkt c)

zur Herstellung eines Arzneimittels zum Einsatz in der Gentherapie.

16. Verwendung gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um In-vivo oder In-vitro Gentherapie handelt.

17. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Arzneimittel zur Behandlung von Schmerz handelt.

18. Verwendung

f) einer Zelle, vorzugsweise einer Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder einer immortalisierten oder nativen Säugetierzelle, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e),

g) einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 und/oder

zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose eines Schmerzzustandes.

19. Verwendung

b) eines Polynukleotids, insbesondere eines Antisense Polynukleotids oder einer PNA, vorzugsweise eines DNA-Enzyms oder Ribozyms, eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA, das eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,

c) eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), insbesondere eines Expressionsvektors und/oder insbesondere abgeleitet von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder insbesondere enthaltend mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI-Sequenz,

in einem Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen.

20. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14, 17, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Schmerz ausgewählt ist aus
chronischem Schmerz, insbesondere muskuloskelettalem Schmerz; neuropathischem Schmerz, insbesondere allodynischem Schmerz, mechanischer Hyperalgesie oder diabetischer Neuropathie; viszeralem Schmerz, cerebralem Schmerz, peripherem Schmerz oder entzündungsbedingtem Schmerz, insbesondere peripherem Entzündungsschmerz; sowie Migräne, Cluster-Kopfschmerz oder dem Schmerz bei Trigeminus Neuralgie.