DE10125893A1

DE10125893A1 - Arzneimittel zur Inhibierung des Wachstums glatter Gefäßmuskelzellen

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Publication number: DE10125893A1
Application number: DE2001125893
Authority: DE
Inventors: Georg Nickenig
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-05-28
Filing date: 2001-05-28
Publication date: 2002-12-12

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere als Arzneimittel zur Inhibierung des Wachstums glatter Gefäßmuskelzellen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein die Zusammensetzung umfassendes Arzneimittel sowie dessen Verwendung zur Prävention oder/und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Arzneimit tel und insbesondere Arzneimittel zur Inhibierung des Wachs tums glatter Gefäßmuskelzellen. Derartige Arzneimittel sind geeignet zur Prävention oder -und Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen wie beispielsweise Atherosklerose, Restenose, Bluthochdruck, Herzinfarkt oder/und Schlaganfall.

Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen die häufigste Todesursa che in den westlichen Industrienationen dar. Pathoanatomisch liegt den meisten Herz-Kreislauf-Erkrankungen (Herzinfarkt, Schlaganfall) die Atherosklerose zugrunde. Die Atherosklerose ist durch eine Dysfunktion der Endothelzellen, durch ein Ein wandern weißer Blutzellen in die Gefäßwand und insbesondere durch ein pathologisches Wachstum glatter Gefäßmuskelzellen charakterisiert. Hierdurch kommt es in der Gefäßwand zu einer Ausbildung einer atherosklerotischen Läsion. Diese Plaque be dingt durch ihre Lumeneinengung einen verminderten Blutstrom und damit eine verminderte Sauerstoffversorgung des durch das betroffene Blutgefäß versorgten Gewebes. Eine Ruptur einer solchen Plaque führt zum völligen Gefäßverschluß und damit z. B. zum Herzinfarkt.

Eine Stenose in einem Koronargefäß wird sehr häufig durch eine Ballonangioplastie behandelt. Hierbei wird durch mecha nischen Druck das Gefäßvolumen erweitert. In ca. 40% der Fälle kommt es nach 4-6 Monaten zu einer erneuten Stenosie rung des dilatierten Gefäßes. Auch nach Implantation eines Stents kommt es in ca. 20% der Fälle zu einer Restonsierung. Die Entwicklung dieser Restenose wird in erster Linie durch das pathologische Wachstum glatter Gefäßmuskelzellen hervor gerufen.

Pathologisches Wachstum glatter Gefäßmuskelzellen ist somit für die Entstehung der Atherosklerose und der Restenose und damit für Herzinfarkt und Schlaganfall von zentraler Bedeu tung.

Das Wissen über die Regulation des Zellwachstums in glatten Gefäßmuskelzellen sowie der zellulären und molekularen Grund lagen dafür ist jedoch bisher fragmentarisch. Bekannt ist beispielsweise, daß das Wachstum glatter Gefäßmuskelzellen von verschiedenen intrazellulären Faktoren abhängig ist. Hierzu gehören die "cyclin-dependent kinases" (CdK), die zur Phosphorylierung weiterer Faktoren führen und damit zum Zell wachstum beitragen. Diese CdK werden ihrerseits durch Inhibi toren (CKI) wie etwa p15, p16, p18, p21, p27 und p57 gehemmt. Weiterhin führen verschiedene Wachstumsfaktoren wie bei spielsweise PDGF, EGF oder bFGF über die Stimulation oder In hibition der oben genannten Faktoren zur Stimulation des Wachstums der Gefäßmuskelzellen.

Weiterhin ist aus dem Stand der Technik eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren bekannt, welche zumindest zum Teil Zelltyp-spezifisch oder/und Zellzyklus-spezifisch exprimiert werden. Diese Transkriptionsfaktoren können durch Bindung an Promotoren und gegebenenfalls durch Interaktion mit weiteren Faktoren die Transkription der diesen Promotoren zugehörigen Genen steuern. Sofern diese Gene bzw. deren. Translationsprodukte einen Einfluß auf das Zellwachstum aus üben, erfolgt eine Steuerung des Zellwachstums über die dazu gehörigen Transkriptionsfaktoren.

Vor kurzem wurde eine Familie von Säuger-Transkriptionsfakto ren identifiziert, die durch die Gegenwart einer DNA-Bin dungsdomäne mit drei Zinkfingern gekennzeichnet sind. Auf grund der Homologie dieser Finger zum Entwicklungsfaktor "Krüppel" aus Drosophila Melanogaster werden diese Transkrip tionsfaktoren als KLF (Krüppel-like-transcription-factors) bezeichnet (J. Turner and M. Crossley, TIBS 24: 236- 240, 1999).

Ein Vertreter dieser Familie ist gut-enriched Krüppel-like factor (GKLF), welcher auch als KLF4 bezeichnet wird. GKLF ist ein Transkriptionsfaktor, der insbesondere in den Epithelzellen des Gastrointestinaltrakts (J. M. Shields et al, J. Biol. Chem. 271: 20009-20017, 1996) vermehrt nachweisbar ist. Weiterhin exprimieren auch Endothelzellen, Hautzellen und Thymusgewebe dieses Gen. Bezüglich der Wirkung von GKLF wird von einer wachstumsinhibierenden Wirkung in Epithelzellen oder einer Wirkung im Zusammenhang mit der Differenzierung zum Epithel-Phänotyp ausgegangen (Shields et al, siehe oben).

Ein weiterer Faktor, der das Wachstum glatter Gefäßmuskelzel len beeinflußt, ist der sogenannte oxidative Streß, der auf einer vermehrten Freisetzung freier Radikale wie Superoxida nion, Wasserstoffperoxid und Hydroxylanion beruht, und in der Pathogenese von Atherosklerose und Restenose eine große Rolle spielt. Diese freien Radikale fangen das vasoprotektive Stickstoffmonoxid ab und wirken toxisch auf Endothelzellen und glatte Gefäßmuskelzellen. Darüber hinaus sind die Radi kale involviert in Proliferation und Wachstumsarrest ver schiedener Zelltypen. In glatten Gefäßmuskelzellen führen Su peroxidanionen zu Zellproliferation. Die Rolle anderer Radi kale ist in diesem Zusammenhang jedoch ungeklärt.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, eine Zusammensetzung bereitzustellen, welche als Arzneimittel geeignet ist. Insbesondere sollte ein derartiges Arzneimittel zur Inhibierung des Wachstums glatter Gefäßmuskelzellen geeignet sein.

Es hat sich nunmehr überraschenderweise herausgestellt, daß GKLF in glatten Gefäßmuskelzellen exprimiert wird, und unter Bedingungen, welche in glatten Gefäßmuskelzellen zu Wachs tumsarrest führen, verstärkt exprimiert wird. Weiterhin wurde herausgefunden, daß eine Überexpression von GKLF zum Wachs tumsarrest glatter Gefäßmuskelzellen führt.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine Zu sammensetzung zur Verwendung als Arzneimittel, umfassend eine Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleo tidsequenz mindestens einen offenen Leserahmen mit einer Länge von mindestens 60 Nukleotiden umfaßt, der eine Sequenzhomologie von mindestens 70% zu mindestens einem Abschnitt der in SEQ. ID.: Nr. 1 gezeigten oder der zu SEQ. ID.: Nr. 1 komplementären Sequenz aufweist.

Unter der, zu SEQ. ID.: Nr. 1 komplementären Sequenz wird der antisense-Strang verstanden, der die umgekehrte Richtung besitzt und aus den komplementären Nukleotiden zusammengesetzt ist, wie dem Fachmann bekannt ist. Der Einfachheit halber wird in der nachfolgenden Beschreibung eine Bezugnahme auf SEQ. ID.: Nr. 1 oder einen Teil davon (z. B. SEQ. ID.: Nr. 2, 3, 4) als eine Bezugnahme sowohl auf diese Sequenz (sense-Strang) als auch auf die dazu komplementäre Sequenz (antisense-Strang) verstanden.

Der offene Leserahmen gemäß der vorliegenden Erfindung hat das selbe Leseraster wie der offene Leserahmen der GKLF- Sequenz gemäß SEQ. ID.: Nr. 1. In anderen Worten beginnt der offene Leserahmen der Erfindung mit einem Nukleotid, entsprechend Pos. (3n + 1) von SEQ. ID.: Nr. 1, wobei n 0 oder eine ganze Zahl ist.

Die Sequenzhomologie des offenen Leserahmens beträgt minde stens 70% zu einem entsprechenden Abschnitt der in SEQ. ID.: Nr. 1 gezeigten Sequenz. Stärker bevorzugt beträgt die Sequenzhomologie mindestens 80%, noch stärker bevorzugt min destens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%.

Unter einer Sequenzhomologie von x% wird eine Übereinstimmung von x Nukleotiden dividiert durch die Sequenzlänge der beiden Sequenzen in einem Alignment, und multipliziert mit 100 verstanden.

Der offene Leserahmen kann neben Mutationen auch Insertionen oder Deletionen bezogen auf die Sequenz nach SEQ. ID.: Nr. 1 aufweisen, die jedoch nicht zu einer Verschiebung des Leserahmens führen. Solche Insertionen oder Deletionen umfassen somit jeweils 3 Nukleotide oder ein Vielfaches davon. Zur Berechnung der Sequenzhomologie bedeutet die Gegenwart von zwei Abschnitten mit einer Sequenzhomologie von mindestens 70% und einer Länge von jeweils mindestens 60 Nukleotiden, welche einen nicht-homologen Abschnitt mit einer Länge von mindestens 30 Nukleotiden flankieren, die Gegenwart zweier offener Leserahmen. Ein nicht-homologer Abschnitt bedeutet eine Sequenzhomologie unter 70% aufgrund von Mutationen oder/und Fehlen von Nukleotiden in einer der Sequenzen in einem Alignment aufgrund einer Insertion/Deletion.

Die Nukleotidsequenz weist weiterhin eines oder mehrere Ele mente auf, die eine Funktion des offenen Leserahmens oder seines Translationsprodukts gestatten, wobei diese Elemente operativ mit dem offenen Leserahmen verknüpft sind. Beispiele für derartige Elemente umfassen beispielsweise ein Startkodon, ein Kern-Lokalisierungssignal, eine Bindungsstelle für eine RNA-Polymerase, oder ein Polyadenylierungssignal. Bevorzugt weist die Nukleotidsequenz weiterhin Elemente auf, die die Transkription des offenen Leserahmens oder/und die Translation einer davon transkribierten m-RNA begünstigen. Derartige Elemente wie beispielsweise Promotoren, Enhacer oder Ribosomenbindungsstellen sind dem Fachmann bekannt und bedürfen keiner weiteren Erläuterung.

Bevorzugt weist der offene Leserahmen eine Länge von minde stens 180 Nukleotiden, stärker bevorzugt von mindestens 240 Nukleotiden auf.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der offene Le serahmen die Sequenzhomologie zu mindestens einer der in SEQ. ID.: Nr. 2, 3 und 4 gezeigten Sequenzen auf. Stärker bevor zugt weist der offene Leserahmen die Sequenzhomologie zu dem Abschnitt von SEQ. ID.: Nr. 1 auf, welcher die Sequenzen nach SEQ. ID.: Nr. 2, 3 und 4 umfaßt (d. h. Pos. 1162-1407).

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der offene Leserahmen die Sequenzhomologie zu SEQ. ID.: Nr. 1, Posi tion 1 bis 327 auf.

Gemäß einer nochmals weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die Nukleotidsequenz zwei offene Leserahmen auf, welche gegebenenfalls durch einen Linker miteinander verbunden sind, wobei einer der Leserahmen eine Sequenzhomologie zu Position 1 bis 327 der kodierenden Sequenz nach SEQ. ID.: Nr. 1, und der zweite Leserahmen eine Sequenzhomologie zu mindestens einer der in SEQ. ID.: Nr. 2, 3 und 4 gezeigten Sequenzen, weiter be vorzugt zu dem Abschnitt von SEQ. ID.: Nr. 1, welcher die in SEQ. ID.: Nr. 2, 3 und 4 gezeigten Sequenzen umfaßt, aufweist.

Gemäß einer nochmals weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Nukleotidsequenz einen offenen Leserahmen, der eine Sequenzhomologie von mindestens 70% zu der in SEQ. ID.: Nr. 1 gezeigten Sequenz hat. In einer besonderen Ausführungsform umfaßt der offene Leserahmen die in SEQ. ID.: Nr. 1 gezeigte Sequenz, die gegebenenfalls im Rahmen des genetischen Codes degeneriert sein kann.

Die Nukleotidsequenz kann eine RNA-Sequenz sein, wird jedoch im Allgemeinen eine DNA-Sequenz sein. Für den Fall einer RNA- Sequenz sind für die Berechnung der oben angegebenen Sequenzhomologie die Basen "T" und "U" gleichzusetzen. Weiterhin kann die Nukleotidsequenz künstliche Nukleotide umfassen. Die Nukleotidsequenz kann einzelsträngig vorliegen oder doppelsträngig, in Verbindung mit ihrer komplementären Sequenz.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleotidse quenz operativ mit einem Vektor verknüpft, der gegebenenfalls Elemente zur Erhöhung der Transkription oder/und Expression der Nukleotidsequenz enthalten kann. Derartige Elemente um fassen beispielsweise Promoter oder/und Enhancer, die geeig net 5' oder/und 3' der Nukleotidsequenz angeordnet sind.

Derartige Elemente sowie deren Position relativ zu einem zu transkribierenden Gen sind dem Fachmann bekannt. Der Vektor kann ein single copy- oder multi copy-Plasmid sein und umfaßt bevorzugt einen Replikationsursprung, der eine Vermehrung des Vektors in einer geeigneten Säugerzelle gestattet. Bevorzugt ist der Vektor ein Expressionsvektor.

Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Erfindung eine Zusammen setzung zur Verwendung als Arzneimittel, umfassend eine Nu kleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidse quenz mindestens einen offenen Leserahmen mit einer Länge von mindestens 60 Nukleotiden umfaßt, der mit der in SEQ. ID.: Nr. 1 gezeigten oder der zu SEQ. ID.: Nr. 1 komplementären Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

Stringente Bedingungen sind in der vorliegenden Erfindung definiert, daß nach 1 h Waschen mit 1 × SSC, 0.1% SDS bei 50°C, bevorzugt bei 55°C, stärker bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, bevorzugt nach 1 h Waschen mit 0.2 × SSC, 0.1% SDS bei 50°C, bevorzugt bei 55°C, stärker bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, ein positives Hybridisierungssignal erhalten wird. (Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 1.101-1.104)

Bevorzugte Ausführungsformen entsprechen den vorstehend be schriebenen.

Ein nochmals weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung zur Verwendung als Arzneimittel, um fassend ein Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß das Poly peptid mindestens eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 20 Aminosäuren umfaßt, die eine Sequenzhomologie von minde stens 80% zu mindestens einem Abschnitt der in SEQ. ID.: Nr. 5 gezeigten Sequenz aufweist.

Die Länge der Sequenz beträgt mindestens 20 Aminosäuren, be vorzugt mindestens 60 Aminosäuren und noch stärker bevorzugt mindestens 80 Aminosäuren.

Die Sequenzhomologie beträgt bevorzugt mindestens 85%, stär ker bevorzugt mindestens 90% und noch stärker bevorzugt min destens 95% zu mindestens einem Abschnitt der in SEQ. ID.: Nr. 5 gezeigten Aminosäuresequenz.

Die Berechnung der Aminosäure-Sequenzhomologie erfolgt analog. zur Berechnung der Nukleotidsequenzhomologie.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Polypeptid mindestens eine Sequenz, die die entsprechende Sequenzhomolo gie zu mindestens einer der in SEQ. ID.: Nr. 6, 7 und 8 gezeig ten Sequenzen aufweist. Stärker bevorzugt hat die Sequenz die geforderte Sequenzhomologie zur C-terminalen Region der in SEQ. ID.: Nr. 5 gezeigten Sequenz, welche die in SEQ. ID.: Nr. 6, 7 und 8 gezeigten Sequenzen umfaßt, d. h. Pos 388-469 von SEQ. ID.: Nr. 1.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Polypeptid eine Sequenz mit der geforderten Sequenzhomologie zu der N-terminalen Region von SEQ. ID.: Nr. 5. umfassend die Aminosäuren von Position 1 bis 109.

Gemäß einer nochmals weiteren bevorzugten Ausführungsform um faßt das Polypeptid mindestens zwei Sequenzen mit der gefor derten Sequenzhomologie, wovon die erste Sequenz die Sequenz homologie zum N-terminalen Abschnitt der in SEQ. ID.: Nr. 5 ge zeigten Sequenz, Position 1 bis 109, aufweist und die zweite Sequenz die Sequenzhomologie zu mindestens einer der in SEQ. ID.: Nr. 6, 7 und 8 gezeigten Sequenzen aufweist, bevorzugt zum C-terminalen Bereich der in SEQ. ID.: Nr. 5 gezeigten Se quenz, umfassend die SEQ. ID.: Nr. 6, 7 und 8.

Gemäß einer nochmals weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Polypeptid eine Sequenz mit einer Sequenzhomologie von mindestens 80% zu der in SEQ. ID.: Nr. 5 gezeigten Sequenz. In einer besonderen Ausführungsform umfaßt das Polypeptid die in SEQ. ID.: Nr. 5 gezeigte Sequenz.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung liegt im Allgemeinen in Form einer wäßrigen Lösung vor, die gegebenenfalls geeignete Puffer, Hilfs- und Zusatzstoffe enthalten kann. Falls ge wünscht, kann die Zusammensetzung in Form eines Lyophylisats vorliegen, welches vor Anwendung in geeigneter Weise, bevor zugt durch Zugabe von Wasser, rekonstituiert wird.

Zur Verabreichung kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung in Form einer wäßrigen Lösung verwendet werden, die gegebe nenfalls in Liposomen oder virale Hüllproteine verpackt sein kann.

Demgemäß ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Liposom, welches eine erfindungsgemäße Zusam mensetzung umfaßt. Liposomen sind in der Technik bekannt und es gibt eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung derarti ger unilamellarer oder multilamellarer Liposomen.

Für ein verbessertes Targeting der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann das Liposom weiterhin ein Molekül umfassen, welches mit einem Molekül an der Oberfläche von glatten Gefäßmuskelzellen bindefähig ist. Ein derartiges Molekül ist an der Oberfläche des Liposoms angeordnet, so daß ein Teil des Moleküls in der Lipiddoppelschicht des Liposoms verankert ist, und ein anderer Teil des Moleküls an der Liposomenoberfläche für Wechselwirkungen mit einem Molekül an der Oberfläche von glatten Gefäßmuskelzellen zugänglich ist.

Ebenso ist es bekannt, Nukleinsäuren in virale Hüllproteine zu verpacken. Virale Vektoren, die zur Transfektion eukaryonter Zellen geeignet sind, werden im allgemeinen vom Fachmann im Labor hergestellt. (Rosenberg, S. A. et al, Human gene marker/therapy clinical protocols, Hum. Gene Ther. 11 (6): 919-79 (2000); Aoki, K. et al, Restricted expression of an adenoviral vector encoding Fas ligand (CD95L) enhances safety for cancer gene therapy, Mol Ther. 1 (6): 555-65 (2000)).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein. Arzneimittel zur Inhibierung des Wachstums glatter Gefäßmus kelzellen, umfassend die erfindungsgemäße Zusammensetzung, die gegebenenfalls in ein Liposom oder/und in virale Hüllproteine verpackt sein kann. Das Arzneimittel umfaßt gegebenenfalls geeignete Puffer, Hilfs-, Träger- und Zusatzstoffe, die in der Technik bekannt sind.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel dient bevorzugt zur Präven tion oder/und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere von Atherosklerose, Restenose, Bluthochdruck, Herzinfarkt oder/und Schlaganfall.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Prävention oder/und Behandlung von Herz- Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere Atherosklerose, Restenose, Bluthochdruck, Herzinfarkt oder/und Schlaganfall.

Gemäß einem nochmals weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder/und Be handlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere Athe rosklerose, Restenose, Bluthochdruck, Herzinfarkt oder/und Schlaganfall.

Gemäß einem nochmals weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder/und Behandlung von Herz-Kreislauf- Erkrankungen, insbesondere Atherosklerose, Restenose, Bluthochdruck, Herzinfarkt oder/und Schlaganfall.

Gemäß einem nochmals weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Prävention oder/und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung einem Säuger, der einem Risiko ausgesetzt ist an einer Herz-Kreislauf-Erkrankung zu erkranken, oder daran erkrankt ist. Bevorzugt ist der Säuger ein Mensch.

Unter einer therapeutisch wirksamen Menge wird diejenige Menge verstanden, die bei Verabreichung zu einer Inhibierung des Wachstums von glatten Gefäßmuskelzellen führt. Diese Menge variiert, neben individuellen Unterschieden, in Abhängigkeit von der spezifischen eingesetzten Zusammensetzung, der Art der Verabreichung, dem Deliverysystem, dem Transfektionssystem und der Gefäßprovinz. Die therapeutisch wirksame Menge wird vom behandelnden Arzt ermittelt werden.

Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erfolgt bevorzugt lokal. Lokale Applikationssysteme, mit der die Zusammensetzung an den Bestimmungsort gebracht wird, sind beispielsweise Ballonkatheter, die in das Gefäß eingebracht werden, wobei anschließend die Zusammensetzung unter hohem Druck durch kleine Poren in die Zellen der Gefäßwand appliziert wird. Solche Ballon-Deliverysysteme sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Boston Scientific unter der Bezeichnung "Dispatch", oder von Interventional Technologies (IVT) unter der Bezeichnung "Infiltrator". Im Fall des Myokards kann die Zusammensetzung mittels Injektion in den Perikardbeutel verabreicht werden (intra-perikardiale Applikation).

SEQ. ID.: Nr. 1 zeigt die für GKLF kodierende Human-DNA-Sequenz (Pos. 330-1742 der publizierten Sequenz gemäß Foster K. W. et al., Cell Growth Differ. 10 (6): 423-434, 1999).

SEQ. ID.: Nr. 2 zeigt einen für einen Zinkfinger kodierenden Se quenzabschnitt aus SEQ. ID.: Nr. 1.

SEQ. ID.: Nr. 3 zeigt einen weiteren für einen Zinkfinger kodie renden Sequenzabschnitt aus SEQ. ID.: Nr. 1.

SEQ. ID.: Nr. 4 zeigt einen weiteren für einen Zinkfinger kodie renden Sequenzabschnitt aus SEQ. ID.: Nr. 1.

SEQ. ID.: Nr. 5 zeigt die Proteinsequenz von GKLF (Foster et al., siehe oben).

SEQ. ID.: Nr. 6 zeigt eine Zinkfingerdomäne aus SEQ. ID.: Nr. 5.

SEQ. ID.: Nr. 7 zeigt eine weitere Zinkfingerdomäne aus SEQ. ID.: Nr. 5. SEQ. ID.: Nr. 8 zeigt eine weitere Zinkfingerdomäne aus SEQ. ID.: Nr. 5.

Fig. 1 zeigt die Wirkung von Superoxidanionen bzw. Hydroxyl anionen auf die basale DNA-Synthese (Fig. 1a) bzw. auf die Zellproliferation (Fig. 1b).

Fig. 2 zeigt die Wirkung von Hydroxyl- und Superoxidanionen auf die RNA-Expression von GKLF.

Fig. 3 zeigt die Wirkung einer GKLF-Überexpression bzw. einer durch GKLF-Antisense vermittelten Inhibition auf die DNA-Synthese.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläu tern.

Beispiel 1 Einfluß von Hydroxylanionen und Superoxidanionen auf das Wachstum glatter Gefäßmuskelzellen

Glatte Gefäßmuskelzellen wurden aus Rattenaorten isoliert, kultiviert und mit Superoxid-(Xanthin 10^-4M, Xanthinoxidase 1,6 10^-3 U/ml) oder Hydroxylanionen (H₂O₂ 10^-4M, Fe³⁺NTA 10^- ⁵M) inkubiert. Anschließend wurde DNA-Synthese und Zellproliferation gemessen. Fig. 1a zeigt, daß die durch Serum (FKS) ausgelöste und vermehrte und die basale DNA- Synthese durch Hydroxylanionen (OH) vermindert wird. Superoxidanionen (O₂) stimulieren die DNA-Synthese. Dieser Befund bestätigt sich auch in der Zellproliferation (Fig. 1b).

Beispiel 2

Expression von GKLF in glatten Gefäßmuskelzellen. Einfluß von Superoxid- und Hydroxylanionen.

Glatte Gefäßmuskelzellen wurden mit Hydroxyl- oder Super oxidanionen stimuliert. Die Polymerase Kettenreaktion in Fig. 2 zeigt die RNA-Expression von GKLF nach Stimulation mit Hydroxyl- und Superoxidanionen. Es zeigt sich, daß Super oxidanionen keinen Einfluß auf die Expression von GKLF haben, während Hydroxylanionen zu einer deutlichen Überexpression von GKLF führen.

Beispiel 3 Einfluß von GKLF auf das Wachstum glatter Gefäßmuskelzellen

GKLF wurde in einen Expressionsvektor (pcDNA3) kloniert und mittels Elektroporation in glatte Gefäßmuskelzellen transfi ziert und überexprimiert. Anschließend wurde die DNA-Synthese als Ausdruck der Zellproliferation gemessen. Fig. 3 zeigt, daß die Überexpression von GKLF zum Wachstumsarrest glatter Gefäßmuskelzellen führt.

Sowohl das Serum (FKS)- als auch das Superoxid (O₂)-vermit telte Wachstum wird komplett inhibiert. Die Inhibition von GKLF durch eine GKLF-Antisense-Überexpression hebt die durch die Hydroxylanionen (OH) ausgelöste Wachstumshemmung auf (vergleiche mit Fig. 1).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Zusammensetzung zur Verwendung als Arzneimittel, umfassend eine Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz mindestens einen offenen Leserahmen mit einer Länge von mindestens 60 Nukleotiden umfasst, der eine Sequenzhomologie von mindestens 70% zu mindestens einem Abschnitt der in SEQ. ID.: Nr. 1 gezeigten oder der zu SEQ. ID.: Nr. 1 komplementären Sequenz aufweist.

2. Zusammensetzung zur Verwendung als Arzneimittel, umfassend eine Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz mindestens einen offenen Leserahmen mit einer Länge von mindestens 60 Nukleotiden umfasst, der mit mindestens einem Abschnitt der in SEQ. ID.: Nr. 1 gezeigten oder der zu SEQ. ID.: Nr. 1 komplementären Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der offene Leserahmen eine Länge von mindestens 180 Nukleotiden aufweist.

4. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Abschnitt der SEQ. ID.: Nr. 1 mindestens eine der in SEQ. ID.: Nr. 2, 3 und 4 gezeigten oder dazu komplementären Sequenzen umfaßt.

5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Abschnitt von SEQ. ID.: Nr. 1 die Sequenz von Position 1162 bis 1407 oder die dazu komplementäre Sequenz umfaßt.

6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Abschnitt von SEQ. ID.: Nr. 1 die Sequenz von Position 1 bis 327 oder die dazu komplementäre Sequenz umfaßt.

7. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz eine DNA-Sequenz ist.

8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz opera tiv mit einem Vektor verknüpft ist.

9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Expressions vektor ist.

10. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in virale Hüllproteine verpackt.

11. Zusammensetzung zur Verwendung als Arzneimittel, umfassend ein Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mindestens eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 20 Aminosäuren umfasst, die eine Sequenz homologie von mindestens 80 Prozent zu mindestens einem Abschnitt der in SEQ. ID.: Nr. 5 gezeigten Sequenz aufweist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz eine Länge von mindestens 60 Aminosäuren aufweist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekenn zeichnet, dass das Polypeptid mindestens eine Sequenz umfasst, die die Sequenzhomologie zu mindestens einer der in SEQ. ID.: Nr. 6, 7 und 8 gezeigten Sequenzen aufweist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Abschnitt von SEQ. ID.: Nr. 5 die Aminosäuren von Position 388-469 umfaßt.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Abschnitt von SEQ. ID.: Nr. 5 die Aminosäuren 1-109 umfaßt.

16. Liposom, umfassend eine Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

17. Liposom nach Anspruch 16, weiterhin umfassend an der Oberfläche des Liposoms ein Molekül, welches mit einem Molekül an der Oberfläche von glatten Gefäßmuskelzellen bindefähig ist.

18. Arzneimittel, zur Inhibierung des Wachstums glatter Gefäßmuskelzellen, umfassend eine Zusammensetzung, nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Liposoms nach Anspruch 16 oder 17.

19. Arzneimittel nach Anspruch 18 zur Prävention oder/und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

20. Arzneimittel nach Anspruch 19 zur Prävention oder/und Behandlung von Atherosklerose, Restenose, Bluthochdruck, Herzinfarkt oder/und Schlaganfall.

21. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Liposoms nach Anspruch 16 oder 17 zur Prävention oder/und Behandlung von Herz-Kreislauf- Erkrankungen.

22. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Liposoms nach Anspruch 16 oder 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder/und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22 zur Prävention oder/und Behandlung von Atherosklerose, Restenose, Bluthochdruck, Herzinfarkt oder/und Schlaganfall.

24. Verfahren zur Prävention oder/und Behandlung von Herz- Kreislauf-Erkrankungen, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Liposoms nach Anspruch 16 oder 17 einem Säuger, der einem Risiko ausgesetzt ist, an einer Herz-Kreislauf-Erkrankung zu erkranken, oder daran erkrankt ist.

25. Verfahren nach Anspruch 24 zur Prävention oder/und Behandlung von Atherosklerose, Restenose, Bluthochdruck, Herzinfarkt oder/und Schlaganfall.