DE10120425A1 - Verfahren zur Untersuchung einer Probe und Scanmikroskop - Google Patents
Verfahren zur Untersuchung einer Probe und ScanmikroskopInfo
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Abstract
Ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe (27), die mindestens zwei optische Übergangslinien aufweist und mindestens mit Licht einer ersten und mit Licht einer zweiten Wellenlänge optisch anregbar ist, ist gekennzeichnet durch den Schritt des Beleuchtens der Probe (27) mit Beleuchtungslicht (15), das mindestens ein Vielfaches der ersten Wellenlänge und ein Vielfaches der zweiten Wellenlänge aufweist und durch den Schritt des Detektierens des von der Probe (27) ausgehenden Detektionslichtes (29). Weiterhin ist ein Scanmikroskop (1) mit mindestens einer Lichtquelle (3), die Beleuchtungslicht (15) zur Beleuchtung einer Probe (27) emittiert, wobei die Probe (27) mindestens zwei optische Übergangslinien aufweist und mindestens mit Licht einer ersten und mit Licht einer zweiten Wellenlänge optisch anregbar ist, mit mindestens einem Detektor (41, 43, 65, 77, 79) zur Detektion des von der Probe (27) ausgehenden Detektionslichtes (29) und einem Objektiv (25) zur Fokussierung des Beleuchtungslichtes (15) auf einen Teilbereich der Probe (27), offenbart. Das Scanmikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslicht (15) mindestens ein Vielfaches der ersten Wellenlänge und ein Vielfaches der zweiten Wellenlänge aufweist.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe, die
mindestens zwei optische Übergangslinien aufweist und mindestens mit Licht
einer ersten und mit Licht einer zweiten Wellenlänge optisch anregbar ist.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Scanmikroskop mit mindestens einer
Lichtquelle, die Beleuchtungslicht zur Beleuchtung einer Probe emittiert, wobei
die Probe mindestens zwei optische Übergangslinien aufweist und mindestens
mit Licht einer ersten und mit Licht einer zweiten Wellenlänge optisch
anregbar ist, mit mindestens einem Detektor zur Detektion des von der Probe
ausgehenden Detektionslichtes und einem Objektiv zur Fokussierung des
Beleuchtungslichtes auf einen Teilbereich der Probe.
Zur Untersuchung von biologischen Proben ist es seit langem üblich, die
Probe mit optischen Markern, insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen zu
präparieren. Oft werden, beispielsweise im Bereich der Genuntersuchungen,
mehrere unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe in die Probe eingebracht, die
sich spezifisch an bestimmten Probenbestandteilen anlagern. Aus den
Fluoreszenzeigenschaften der präparierten Probe können beispielsweise
Rückschlüsse auf die Beschaffenheit, die Zusammensetzung der Probe oder
auf Konzentrationen bestimmter Stoffe innerhalb der Probe gezogen werden.
In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um
das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions- oder
Fluoreszenzlicht, zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles
wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch
Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die
Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-,
der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird
beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die
Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die
Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung
ausgerüstet.
Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus
eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle,
eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die
sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine
Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine
Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw.
Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler
eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht
gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert
diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden,
hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird
Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der
Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die
Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch
sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des
Beleuchtungslichtstrahles zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird
ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
Kommerzielle Scanmikroskope bestehen meist aus einem Scanmodul, dass
an das Stativ eines klassischen Lichtmikroskops angeflanscht wird, wobei das
Scanmodul alle genannten zur Abrasterung einer Probe zusätzlich nötigen
Elemente beinhaltet.
In der konfokalen Scanmikroskopie kann im Falle der Zweiphotonenanregung
(oder Mehrphotonenanregung) auf eine Detektionsblende verzichtet werden,
da die Anregungswahrscheinlichkeit vom Quadrat der Photonendichte und
damit vom Quadrat der Beleuchtungslichtintensität abhängt, die naturgemäß
im Fokus viel höher ist als in den Nachbarregionen. Das zu detektierende
Fluoreszenzlicht stammt daher mit großer Wahrscheinlichkeit zum aller
größten Teil aus der Fokusregion, was eine weitere Differenzierung von
Fluoreszenzphotonen aus dem Fokusbereich von Fluoreszenzphotonen aus
den Nachbarbereichen mit einer Blendenanordnung überflüssig macht.
Zur simultanen Beleuchtung mit Licht mehrerer Wellenlängen werden meist
mehrere Laser eingesetzt. Aus der EP 0 495 930: "Konfokales
Mikroskopsystem für Mehrfarbenfluoreszenz" ist eine Anordnung mit einem
einzelnen mehrere Laserlinien emittierenden Laser bekannt. In der Praxis
werden hierfür in der Regel Mischgaslaser, insbesondere ArKr-Laser,
eingesetzt. Zur Detektion sind in der Regel mehrere Detektoren für
Detektionslicht unterschiedlicher Wellenlängen vorgesehen. Eine besonders
flexible Anordnung zur simultanen Mehrfarbdetektion von Detektionslicht
mehrerer Wellenlängen ist in der deutschen Patentschrift DE 199 02 625
"Vorrichtung zur gleichzeitigen Detektion mehrerer Spektralbereiche eines
Laserstrahls" offenbart.
Viele Fluoreszenzfarbstoffe sind nur mit ultraviolettem Beleuchtungslicht
anregbar. Die Verwendung von ultraviolettem Beleuchtungslicht hat
insbesondere für lebende Proben den Nachteil einer sehr viel stärkeren
Probenschädigung. Außerdem müssen alle optischen Bauteile für
ultraviolettes Licht und für das Fluoreszenzlicht, das auf Grund der Stokesshift
eine höhere Wellenlänge aufweist, transparent sein und dürfen durch die
Beleuchtung mit ultraviolettem Licht nicht beschädigt werden. Insbesondere
bei verkitteten optischen Bauteilen, wie Linsengruppen in einem
Mikroskopobjektiv, tritt durch Beleuchtung mit ultraviolettem Licht eine
irreversible Schädigung des Kitts und der Linsen auf. Ein weiterer Nachteil der
Beleuchtung mit ultraviolettem Licht liegt in der geringeren Eindringtiefe in
biologische Proben begründet. Die Nachteile lassen sich durch Zwei- oder
Mehrphotonenanregung vermeiden. In der Mehrphotonen-Scanmikroskopie
werden die Fluoreszenzphotonen detektiert, die auf einen Zwei- oder
Mehrphotonenanregungsprozess zurückzuführen sind. Die Wahrscheinlichkeit
eines Zwei-Photonenüberganges ist vom Quadrat der Anregungslichtleistung
abhängig. Um hohe Lichtleistungen zu erzielen, ist es daher zweckmäßig, das
Beleuchtungslicht zu pulsen, um hohe Pulsspitzenleistungen zu erreichen.
Diese Technik ist bekannt und beispielsweise in der amerikanischen
Patenschrift US 5,034,613 "Two-photon laser microscopy" und in der
deutschen Offenlegungsschrift DE 44 14 940 offenbart. Ein weiterer Vorteil
der Mehrphotonenanregung insbesondere in der konfokalen Scanmikroskopie
liegt im verbesserten Bleichverhalten; da die Probe nur im Bereich
ausreichender Leistungsdichte, also im Fokus eines
Beleuchtungslichtstrahles, ausbleicht. Außerhalb dieses Bereichs findet im
Gegensatz zur Ein-Photonen-Anregung nahezu kein Bleichen statt.
Alle bekannten Verfahren und Anordnungen zur Untersuchung einer Probe
auf der Basis der Mehrphotonenanregung, beschränken sich auf die Anregung
eines einzigen Fluoreszenzfarbstoffes. Für viele Anwendungen ist es
unverzichtbar, die Probe mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen oder
anderen Markern spezifisch zu markieren, um durch gleichzeitige Anregung
aller Fluoreszenzfarbstoffe und Mehrfarbdetektion Informationen über die
räumliche Struktur oder die Zusammensetzung der Probe zu erhalten. Die
gleichzeitige Anregung mehrerer UV-Fluoreszenzfarbstoffe ist derzeit nur mit
Ein-Photonen-Anregung möglich, so dass die negativen Auswirkungen des
Einstrahlens von ultraviolettem Licht voll zum Tragen kommen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren vorzuschlagen,
das eine simultane Mehrfarbdetektion bei verbessertem Bleichverhalten,
insbesondere bei im ultravioletten Spektralbereich anregbaren Proben,
ermöglicht.
Obige Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das gekennzeichnet ist durch
folgende Schritte:
- - Beleuchten der Probe (27) mit Beleuchtungslicht (15), das mindestens ein Vielfaches der ersten Wellenlänge und ein Vielfaches der zweiten Wellenlänge aufweist und
- - Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes.
Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung ein Scanmikroskop anzugeben, das
eine simultane Mehrfarbdetektion bei verbessertem Bleichverhalten,
insbesondere bei im ultravioletten Spektralbereich anregbaren Proben
ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop, das die Merkmale des
kennzeichnenden Teils des Anspruchs 13 beinhaltet, gelöst
Die Erfindung hat den Vorteil, dass mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen
markierte Proben bei simultaner Anregung und bei wesentlich verbessertem
Bleichverhalten untersuchbar sind.
In einem weiteren Verfahrensschritt erfolgt das Fokussieren des
Beleuchtungslichts auf einen Teilbereich der Probe, wodurch eine höhere
Leistungsdichte und damit eine höhere Wahrscheinlichkeit für die
Mehrphotonenanregung entsteht. In einem weiteren Schritt wird die Probe
durch sukzessives Führen des Beleuchtungslichtes über mehrere Teilbereiche
abgerastert. Zum Führen des Beleuchtungslichtes dient vorzugsweise eine
Strahlablenkeinrichtung mit drehbar gelagerten Spiegeln, die von
Galvanometern angetrieben werden.
Ganz besonders vorteilhaft ist eine Ausführungsvariante, bei der das
Detektieren des von der Probe ausgehenden Lichtes konfokal erfolgt. Hierzu
ist eine Detektionsblende den Detektoren vorgeordnet, die nur Licht, das aus
dem beleuchteten Teilbereich stammt, passieren lässt. Eine andere
Ausführungsform arbeitet in der sog. Non-Descan-Detektion ohne
Detektionsblende. Da die Anregungswahrscheinlichkeit beispielsweise einer
Zwei-Photonenanregung vom Quadrat der Photonendichte und damit vom
Quadrat der Beleuchtungslichtintensität abhängt, die naturgemäß im Fokus
viel höher ist als in den Nachbarregionen, stammt das am Detektor
eintreffende Licht mit großer Wahrscheinlichkeit zum aller größten Teil aus der
Fokusregion, was eine weitere Differenzierung von Fluoreszenzphotonen aus
dem Fokusbereich von Fluoreszenzphotonen aus den Nachbarbereichen mit
Hilfe einer Detektionsblende entbehrlich macht.
Zum Detektieren sind in einer Ausgestaltung dichroitische Filter vorgesehen,
die das von der Probe ausgehende Detektionslicht, das mehrere
Wellenlängen beinhaltet, entsprechend der Wellenlänge bzw. entsprechend
einzelner Wellenlängenbereiche mehreren Detektoren zuordnet. Die
Detektoren können beispielsweise Photomultiplier, Halbleiterdetektoren, wie
Photodioden oder Avalanche-Photodioden, sein. Sie wandeln das
Detektionslicht in ein Detektionssignal, dessen Amplitude von der Leistung
des Detektionslichtes abhängt, vorzugsweise zu diesem proportional ist, um.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltung ist der Detektor ein
Multibanddetektor.
Beim Abrastern der Probe werden die Detektionssignale der Position der
abgerasterten Teilbereiche zugeordnet., um die Detektionssignale auf einem
Display zu einem zwei- oder dreidimensionalen Bild angeordnet darzustellen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Beleuchtungslicht
gepulst. Die Lichtquelle beinhaltet hierzu mindestens zwei Pulslaser, die
Lichtimpulszüge, die ein Vielfaches der ersten und ein Vielfaches der zweiten
Wellenlänge aufweisen emittieren, wobei die Lichtimpulszüge mit einem
dichroitischen Strahlteiler zu einem Beleuchtungslichtstrahl zusammengeführt
sind. Die Pulslaser sind vorzugsweise derart ausgeführt, dass die Lichtimpulse
kürzer als 1 ps sind.
In einer anderen Ausführungsvariante beinhaltet die Lichtquelle nur einen
Pulslaser, der Licht der erforderlichen Wellenlängen simultan emittiert.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung beinhaltet die Lichtquelle
einen Pulslaser und einen diesem nachgeordneten Strahlteiler, der das
emittierte Licht zu einem ersten und einem zweiten Teilstrahl aufteilt. In einem
der Strahlengänge der Teilstrahlen ist ein wellenlängenveränderndes Mittel,
wie beispielsweise ein Optisch-Parametrischer-Oszillator oder ein Kristall zur
Frequenzvervielfachung angeordnet.
Besonders vorteilhaft ist weiterhin eine Ausführungsvariante, bei der die
Lichtquelle ein mikrostrukturiertes optisches Element umfasst, auf das das
Licht eines Lasers fokussiert ist, wobei in dem mikrostrukturierten optischen
Element eine Umwandlung in Licht anderer Wellenlängen, vorzugsweise in ein
breites Wellenlängenspektrum, stattfindet.
Das mikrostrukturierte optische Element ist in einer bevorzugten
Ausgestaltung des Scanmikroskops aus einer Vielzahl von mikrooptischen
Strukturelementen aufgebaut, die zumindest zwei unterschiedliche optische
Dichten aufweisen. Ganz besonders bevorzugt ist eine Ausgestaltung, bei der
das optische Element einen ersten Bereich und einen zweiten Bereich
beinhaltet, wobei der erste Bereich eine homogene Struktur aufweist und in
dem zweiten Bereich eine mikroskopische Struktur aus mikrooptischen
Strukturelementen gebildet ist. Von Vorteil ist es außerdem, wenn der erste
Bereich den zweiten Bereich umschließt. Die mikrooptischen Strukturelemente
sind vorzugsweise Kanülen, Stege, Waben, Röhren oder Hohlräume.
Das mikrostrukturierte optische Element besteht in einer anderen
Ausgestaltung aus nebeneinander angeordnetem Glas- oder
Kunststoffmaterial und Hohlräumen. Besonders zu bevorzugen ist die
Ausführungsvariante, bei der das mikrostrukturierte optische Element aus
Photonic-Band-Gap-Material besteht und als Lichtleitfaser ausgestaltet ist.
Vorzugsweise ist zwischen dem Laser und der Lichtleitfaser eine optische
Diode vorgesehen, die Rückreflexionen des Lichtstrahles die von den Enden
der Lichtleitfaser herrühren, unterdrückt.
Eine ganz besonders bevorzugte und einfach zu realisierende
Ausführungsvariante beinhaltet als mikrostrukturiertes optisches Element eine
herkömmliche Lichtleitfaser mit einem Faserkerndurchmesser von ca. 9 µm,
die zumindest entlang eines Teilstücks eine Verjüngung aufweist.
Lichtleitfasern dieser Art sind als sog. "tapered fibers" bekannt. Vorzugsweise
ist die Lichtleitfaser insgesamt 1 m lang und weist eine Verjüngung auf einer
Länge von 30 mm bis 90 mm auf. Der Durchmesser der gesamten Faser
beträgt in einer bevorzugten Ausgestaltung im Bereich der Verjüngung ca. 2 µm.
In einer weiteren Ausführungsform sind zumindest einige der Photonen des
Beleuchtungslichtes verschränkt. In der Patentschrift US 5,796,477 ist ein
Verschränkte-Photonen-Mikroskop offenbart, das die Vorteile der
Mehrphotonenanregung aufweist, das jedoch extrem hohe
Anregungslichtleistungen und die damit verbundenen Nachteile vermeidet.
Anstelle von unabhängig voneinander entstandenen Photonen, werden
verschränkte Photonen zur Anregung der Probe verwendet. Die Photonen
befinden sich in einem sog. quantenmechanisch verschränkten Zustand. Die
Wahrscheinlichkeit der Anregung eines Fluorophors in der Probe ist bei der
Beleuchtung mit verschränkten Photonen linear von der
Anregungslichtleistung und nicht, wie bei der bekannten
Zweiphotonenanregung, vom Quadrat der Anregungslichtleistung abhängig;
denn im Fokus passen bei geeigneten Randbedingungen verschränkte
Photonen hinsichtlich Zeit und Ort prinzipiell immer zueinander.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und
wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende
Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
Fig. 1 ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
Fig. 2 ein weiteres erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
Fig. 3 ein weiteres erfindungsgemäßes Scanmikroskop mit
einem Multibanddetektor,
Fig. 4 ein weiteres erfindungsgemäßes Scanmikroskop mit
einem Multibanddetektor und
Fig. 5 eine Lichtquelle für ein erfindungsgemäßes
Scanmikroskop.
Fig. 1 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop 1 mit einer
Lichtquelle 3, die einen ersten und einen zweiten Laser 5, 7, die als
modenverkoppelte Titan-Saphir-Laser ausgeführt sind, beinhaltet. Das von
dem ersten Laser 5 emittierte Licht 9, das eine Wellenlänge von 780 nm auf
weist, und das von dem zweiten Laser 7 emittierte Licht 11, das eine
Wellenlänge von 960 nm aufweist, wird mit einem dichroitischen Strahlteiler
13 zu dem Beleuchtungslicht 15 vereinigt. Das zu einem Strahl geformte
Beleuchtungslicht 15 gelangt zu einer Strahlablenkeinrichtung 17, die einen
kardanisch aufgehängten Spiegel 19 beinhaltet. Durch die Scanoptik 21, die
Tubusoptik 23 und das Objektiv 25, wird das zu einem Strahl geformte
Beleuchtungslicht 15 über bzw. durch die Probe 27, die zwei bei 390 nm bzw.
bei 480 nm optisch anregbare Fluoreszenzfarbstoffe beinhaltet, geführt. Das
von der Probe 27 ausgehende Detektionslicht 29 wird von einem Kondensor
31 kollimiert und von einem Spiegel 33 zu einem dichroitischen Strahlteiler 35
reflektiert, der das Detektionslicht räumlich spektral in zwei
Teildetektionslichtstrahlen 37, 39 aufteilt, die von zwei Detektoren 41, 43, die
beide als Photomultiplier ausgeführt sind detektiert werden und jeweils in ein
in der Amplitude zur Leistung der Teildetektionslichtstrahlen 37, 39
proportionales elektrisches Signal umgewandelt werden.
Fig. 2 zeigt ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop 1, das ebenso, wie das in
Fig. 1 gezeigte Scanmikroskop in Non-Descan-Detektion arbeitet. Die
Lichtquelle 3 dieser Ausführung beinhaltet einen Laser 45, der als
modenverkoppelte Titan-Saphir-Laser ausgeführt ist. Das Licht 47 des Lasers
45 wird mit einem Strahlteiler 49 in einen ersten und zweiten Teillichtstrahl 51
und 53 aufgespalten. Der Teillichtstrahl 53 gelangt zu einem Optisch-
Parametrischen-Oszillator 55. Der vom Optisch-Parametrischen-Oszillator 55
ausgehende Teillichtstrahl 57 wird zu einem dichroitischen Strahlvereiniger 59
geführt, um dort mit dem ersten Teillichtstrahl 51, der über die Spiegel 61 und
63 geführt ist, zum Beleuchtungslicht 15 vereinigt zu werden.
Fig. 3 zeigt ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop 1, das ebenso, wie das in
Fig. 1 gezeigte Scanmikroskop in Non-Descan-Detektion arbeitet. Zur
Detektion ist ein Multibanddetektor 65 vorgesehen. Das Detektionslicht 29
wird mit einem Prisma 67 räumlich spektral aufgespalten. Eine weitere
Möglichkeit der spektralen Aufspaltung ist die Verwendung eines Reflexions-,
oder Transmissionsgitters. Der spektral aufgespaltene Lichtfächer 69 wird mit
der Fokussieroptik 71 fokussiert und trifft anschließend auf eine
Spiegelblendenanordnung 73, 75. Die Spiegelblendenanordnung 73, 75, die
Mittel zur spektralen, räumlichen Aufspaltung (Prisma 67), die Fokussieroptik
71 und die Detektoren 77 und 79 werden zusammen als Multibanddetektor 65
bezeichnet. Ein Teil des aufgespaltenen Lichtfächers 69 des Detektionslichtes
29, der nur Licht eines vorgewählten Spektralbereichs umfasst, passiert die
Spiegelblendenanordnung und wird von dem Detektor 77, der als
Photomultiplier ausgeführt ist detektiert. Ein anderer Teil des aufgespaltenen
Lichtfächers 69 wird an der Spiegelblendenanordnung 75 reflektiert und
gelangt zu Detektor 79, der ebenfalls als Photomultiplier ausgeführt ist. Die
Spiegelblendenanordnungen sind, in den durch die Doppelpfeile illustrierten
Richtungen verschiebbar, so dass die spektralen Detektionsbereiche des den
Detektoren 77, 79 zugeführten Lichtes kontinuierlich einstellbar sind. Es ist
möglich, jedoch der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt, noch weitere
Detektoren einzubauen und weiteren Spiegelblenden zuzuordnen. In den
Detektoren 77, 79 werden elektrische, zur Leistung des von der Probe 27
ausgehenden Detektionslichtes 29 des jeweiligen Spektralbereichs
proportionale Detektionssignale erzeugt, die in einer nicht gezeigten Steuer-
und Verarbeitungseinheit den in der Strahlablenkeinrichtung mit Hilfe eines
Positionssensors erfassten Positionssignalen zugeordnet werden.
Anschließend werden sie mit einem PC zu einem Abbild zusammengesetzt.
Dieser Vorgang ist dem Fachmann geläufig und der Übersichtlichkeit wegen
nicht dargestellt. Weggelassen sind wegen der besseren Anschaulichkeit
außerdem einige optische Elemente zur Führung und Formung der
Lichtstrahlen. Diese sind einem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann
hinlänglich bekannt.
Fig. 4 zeigt ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop 1 mit Descan-Detektion.
Das Beleuchtungslicht 15 der Lichtquelle 3 wird von einem dichroitischen
Strahlteiler 81 zur Strahlablenkeinrichtung 17 reflektiert und von dieser durch
die Scanoptik 21, die Tubusoptik 23 und das Objektiv 25 hindurch über bzw.
durch die Probe 27 geführt. Das von der Probe 27 ausgehende Detektionslicht
29 gelangt auf demselben Lichtweg über die Strahlablenkeinrichtung 17
zurück zum dichroitischen Strahlteiler 81, passiert diesen und die der
Übersichtlichkeit wegen nicht gezeigte Detektionsblende und trifft
anschließend auf den Multibanddetektor 65.
Fig. 5 zeigt eine Lichtquelle 3 für ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop 1,
die einen Laser 45 beinhaltet, der als diodenlasergepumpter,
modengekoppelter Titan:Saphir-Laser ausgeführt ist und der einen gepulsten
Lichtstrahl 83, der gestrichelt gezeichnet ist, emittiert. Die Dauer der
Lichtimpulse beträgt ca. 100 fs bei einer Repetitionsrate von ca. 80 MHz. Der
Lichtstrahl 83 wird mit der Fokussieroptik 85, die als Zoomoptik ausgestaltet
und entlang der Fortpflanzungsrichtung des Lichtstrahles verschiebbar
angeordnet ist, auf ein mikrostrukturiertes optisches Element 87, das aus
einer Lichtleitfaser 89 aus Photonic-Band-Gap-Material besteht, fokussiert. In
dem mikrostrukturierten optischen Element 87 wird das Licht des Lasers
spektral verbreitert. Aus dem Spektrum des spektral verbreiterten Lichts 91,
das Wellenlängen von ca. 300 nm bis 1600 nm aufweist, wird mit einem
Bandfilter 93 Licht zweier zur erfindungsgemäßen Beleuchtung geeigneter
Wellenlängen herausgefiltert, das das Beleuchtungslicht 15 bildet.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform
beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und
Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich
der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
1
Scanmikroskop
3
Lichtquelle
5
erster Laser
7
zweiter Laser
9
Licht
11
Licht
13
dichroitischer Strahlteiler
15
Beleuchtungslicht
17
Strahlablenkeinrichtung
19
kardanisch aufgehängter Spiegel
21
Scanoptik
23
Tubusoptik
25
Objektiv
27
Probe
29
Detektionslicht
31
Kondensor
33
Spiegel
35
dichroitischer Strahlteiler
37
Teildetektionslichtstrahl
39
Teildetektionslichtstrahl
41
Detektor
43
Detektor
45
Laser
47
Licht
49
Strahlteiler
51
Teillichtstrahl
53
Teillichtstrahl
55
Optisch-Parametrischer-Oszillator
57
Teillichtstrahl
59
dichroitischer Strahlvereiniger
61
Spiegel
63
Spiegel
65
Multibanddetektor
67
Prisma
69
spektral aufgespaltener Lichtfächer
71
Fokussieroptik
73
Spiegelblendenanordnung
75
Spiegelblendenanordnung
77
Detektor
79
Detektor
81
dichroitischer Strahlteiler
83
Lichtstrahl
85
Fokussieroptik
87
mikrostrukturiertes optisches Element
89
Lichtleitfaser
91
spektral verbreitertes Licht
93
Bandfilter
Claims (28)
1. Verfahren zur Untersuchung einer Probe (27), die mindestens zwei
optische Übergangslinien aufweist und mindestens mit Licht einer ersten und
mit Licht einer zweiten Wellenlänge optisch anregbar ist, gekennzeichnet
durch folgende Schritte:
- - Beleuchten der Probe (27) mit Beleuchtungslicht (15), das mindestens ein Vielfaches der ersten Wellenlänge und ein Vielfaches der zweiten Wellenlänge aufweist und
- - Detektieren des von der Probe (27) ausgehenden Detektionslichtes (29).
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den weiteren
Schritt:
- - Fokussieren des Beleuchtungslichtes (15) auf einen Teilbereich der Probe (27).
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, gekennzeichnet
durch den weiteren Schritt:
- - Abrastern der Probe (27) durch sukzessives Führen des Beleuchtungslichtes (15) über mehrere Teilbereiche.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, dass das Detektieren konfokal erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet
durch die weiteren Schritte:
- - Umwandeln des Detektionslichtes (29) in ein Detektionssignal, dessen Amplitude von der Leistung Detektionslichtes (29) abhängt.
- - Zuordnen der Detektionssignale zu den abgerasterten Teilbereichen.
6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch den weiteren
Schritt:
- - Darstellen des Detektionssignals auf einem Display.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das
Detektieren in mindestens zwei Detektionskanälen in Abhängigkeit von der
Wellenlänge des Detektionslichtes erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das
Beleuchtungslicht (15) gepulst ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die
Probe (27) einen optisch anregbaren Marker oder einen Fluoreszenzfarbstoff
beinhaltet.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das
Beleuchtungslicht (15) das Doppelte der ersten Wellenlänge aufweist und das
Doppelte der zweiten Wellenlänge aufweist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das
Beleuchtungslicht (15) das Dreifache der ersten Wellenlänge aufweist und das
Dreifache der zweiten Wellenlänge aufweist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das
Beleuchtungslicht (15) verschränkte Photonen beinhaltet.
13. Scanmikroskop (1) mit mindestens einer Lichtquelle (3) die
Beleuchtungslicht (15) zur Beleuchtung einer Probe (27) emittiert, wobei die
Probe (27) mindestens zwei optische Übergangslinien aufweist und
mindestens mit Licht einer ersten und mit Licht einer zweiten Wellenlänge
optisch anregbar ist, mit mindestens einem Detektor (41, 43, 65, 77, 79) zur
Detektion des von der Probe (27) ausgehenden Detektionslichtes (29) und
einem Objektiv (25) zur Fokussierung des Beleuchtungslichtes (15) auf einen
Teilbereich der Probe (27), dadurch gekennzeichnet, dass das
Beleuchtungslicht (15) mindestens ein Vielfaches der ersten Wellenlänge und
ein Vielfaches der zweiten Wellenlänge aufweist.
14. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
dass die Lichtquelle (3) mindestens einen Laser (5, 7, 45) beinhaltet, der
repetierend Lichtimpulse emittiert.
15. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,
dass die Lichtimpulse zeitlich kürzer als 1 ps sind.
17. Scanmikroskop (1) nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (3) ein mikrostrukturiertes optisches
Element (87) beinhaltet.
18. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
dass das mikrosturkurierte optische Element (87) aus einer Vielzahl von
mikrooptischen Strukturelementen aufgebaut ist, die zumindest zwei
unterschiedliche optische Dichten aufweisen.
19. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
dass das mikrosturkurierte optische Element (87) einen ersten Bereich und
einen zweiten Bereich beinhaltet, wobei der erste Bereich eine homogene
Struktur aufweist und in dem zweiten Bereich eine Mikrostruktur aus
mikrooptischen Strukturelementen gebildet ist.
20. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
dass der erste Bereich den zweiten Bereich umschließt.
21. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
dass das mikrostrukturierte optische Element (87) aus nebeneinander
angeordnetem Glas- oder Kunststoffmaterial und Hohlräumen besteht.
22. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
dass die mikrooptischen Strukturelemente Kanülen, Stege, Waben, Röhren
oder Hohlräume sind.
23. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
dass das mikrostrukturierte optische Element aus Photonic-Band-Gap-
Material besteht.
24. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
dass das mikrostrukturierte optische Element als Lichtleitfaser (89)
ausgestaltet ist.
25. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet,
dass die Lichtleitfaser (89) eine Verjüngung aufweist.
26. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
dass die Lichtquelle einen Optisch-Parametrischen-Oszillator (55) beinhaltet.
27. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
dass das Beleuchtungslicht (15) mindestens das Doppelte der ersten
Wellenlänge aufweist und das Doppelte der zweiten Wellenlänge aufweist.
28. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
dass das Beleuchtungslicht das Dreifache der ersten Wellenlänge aufweist
und das Dreifache der zweiten Wellenlänge aufweist.
29. Scanmikroskop (1) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
dass der Detektor (41, 43, 65, 77, 79) ein Multibanddetektor (65) ist.
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