DE10103694A1 - Verwendung von EST-Sequenzen oder Varianten der Unigene-Cluster HS1, HS2 und/oder HS3 für die Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen sowie therapeutische Mittel - Google Patents

Verwendung von EST-Sequenzen oder Varianten der Unigene-Cluster HS1, HS2 und/oder HS3 für die Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen sowie therapeutische Mittel

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von EST-Sequenzen oder Varianten der Unigene-Cluster HS1, HS2 und/oder HS3 (Unigene HS169395, Unigene HS127144, Unigene HS132793 für die Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen. Es wurde festgestellt, dass eine erhöhte mRNA-Expression dieser ESTs mit einer ungünstigen Prognose der Tumorerkrankungen korreliert. Der Nachweis der gesteigerten Expression wird erfindungsgemäß als Prognosemarker für das Überleben von Krebspatienten eingesetzt. Darüber hinaus führ eine Blockade der Expression zu einer verbesserten Prognose. Therapeutische Mittel zur Expressionshemmung der ESTs sind deshalb ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von EST-Sequenzen oder Varianten der Unigene- Cluster HS1, HS2 und/oder HS3 (Unigene HS169395, Unigene HS127144, Unigene HS132793 für die Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen sowie therapeutische Mittel zur Expressionshemmung der ESTs. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
In verschiedenen Datenbanken liegen zahlreiche Sequenzinformationen vor, die als ESTs (Expressed Sequence Tags) bezeichnet werden. Es handelt sich dabei um Sequenzen oder Splicing Varianten von bekannten Genen, die zwar in ihrer Sequenz aufgeklärt sind, für die jedoch bisher keine Funktionsbeschreibungen vorliegen.
Es wurde gefunden, dass 3 ESTs der Unigene Cluster (HS1 = Unigene HS169395, HS2 = HS127144 und HS3 = HS132793) für die Diagnose und die Therapie von Tumorerkrankungen verwendet werden können, da nachgewiesen werden konnte, dass eine erhöhte mRNA-Expression dieser ESTs mit einer ungünstigen Prognose der Tumorerkrankungen korreliert. Das Unigene Cluster (156 EST-Sequenzen) aus der NCBI- Datenbank von HS1 = Unigene HS169395 ist ein Teil des Gens Homo sapiens cDNA FLJ12015 fis, clone HEMBB1001695 mit der ACCESSION AK022077, das auf Chromosom 8 liegt und von dem die Proteinsequenz BAB13960, die 145 Aminosäuren umfaßt, beschrieben wurde. Bisher ist keine Funktion dieses Gens bekannt. Das Unigene Cluster aus der NCBI-Datenbank von HS2 = HS127144 umfaßt 12 EST-Sequenzen. Das Unigene Cluster aus der NCBI-Datenbank von HS3 = HS132793 umfaßt 27 EST- Sequenzen.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten. Die Erfindung betrifft somit die Verwendung der EST-Sequenzen oder Varianten der Unigene-Cluster HS1, HS2 und/oder HS3 (Unigene HS 169395, Unigene HS127144, Unigene HS132793 für die Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen, insbesondere für Tumorerkrankungen, bei denen das Überleben der Patienten mit der Bildung von Metastasen korreliert, wie im Fall von kolorektalen Karzinomen aber auch Magen- und Mammakarzinomen.
Der Nachweis einer gesteigerten Expression dieser Sequenzen oder der Gene zu denen diese Sequenzen gehören wird erfindungsgemäß als Prognosemarker für das Überleben von Krebspatienten eingesetzt. Darüber hinaus führt eine Blockade der Expression zu verbesserten Überlebenschancen bzw. Heilungsaussichten.
Gegenstand der Erfindung ist der Einsatz dieser Sequenzen (HS1, HS2 und/oder HS3) oder der Gene zu denen diese Sequenzen gehören, wobei ihre Expression bestimmt wird, z. B. Bestimmung der m-RNA Expression mittels RT-PCR oder Expressionsbestimmung mit Hilfe von Microarrays durch Immobilisierung einer entsprechenden Oligonukleotidsequenz.
Durch Messungen in Tumorgewebe aus Resektaten oder Biopsien von Patienten können Prognosen für das Überleben (die Lebenserwartung z. B. nach Operationen oder chemotherapeutischen Behandlungen) eines Patienten gemacht werden. Ist die Expressionsrate hoch (mehr als 50% der Expression von β-Aktin) leben im Fall von HS1 und HS3 nach 30 Monaten noch etwa 35% der Patienten. Bei einer geringen Expression (weniger als 50% der Expression von β-Aktin) leben im Fall von HS1 und HS3 nach 30 Monaten noch etwa 70% der Patienten.
Gegenstand der Erfindung sind ferner therapeutische Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen, welche Substanzen enthalten, die die Expression dieser Gene blockieren. Diese therapeutischen Substanzen werden in die jeweiligen Tumorzellen bzw. in die Lymphknoten transfiziert. Vorzugsweise werden Tumorerkrankungen behandelt, die Lymphknoten-Metastasen und Fernmetastasen bilden, wobei eine Metatasenbildung gehemmt wird. Bevorzugt liegen die therapeutische Mittel in Formulierungen zur parenteralen Applikation oder zur gentherapeutischen Anwendung vor. Bevorzugt weisen sie Antisense-Nukleotide in Form eines Vektors zur gentherapeutischen Anwendung auf.
Ausgehend vom HS1 gelang es darüber hinaus eine Sequenz mit 2326 bp zu sequenzieren, die Teil des Gens Homo sapiens cDNA FLJ12015 fis, clone HEMBB1001695 mit der ACCESSION AK022077 ist, das auf Chromosom 8 liegt und von dem die Proteinsequenz BAB13960, die 145 Aminosäuren umfaßt, beschrieben wurde. Bisher ist keine Funktion dieses Gens bekannt. Das Gen, das Protein sowie auch diese neue Sequenz können ebenfalls zur Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen verwendet werden. Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch diese Sequenz und ihre Verwendung.
Ausführungsbeispiele Nutzung von HS1, HS2 und HS3 als Prognosemarker
Die Ergebnisse zeigen, daß durch anhand der quantitative RT-PCR Daten Aussagen über das Überleben der Patienten gemacht werden können. Es wurden exprimierte Kandidatengene des Unigene Clusters auf den Zusammenhang mit dem Überleben von Patienten mit kolorektalen Karzinomen getestet. Diese Kandidatengene wurden über RT- PCR Expressionsanalysen in einem gut dokumentierten Panel von Proben aus kolorektalem Tumorgewebe und normaler Mukosa weiter analysiert. Eine erhöhte mRNA- Expression der ESTs wird dabei als Marker für eine schlechte Prognose bezüglich der Überlebensrate von Tumorpatienten verwendet. Die Expression der Gene wurde durch eine Duplex RT-PCR getestet. Anschließend wurde die Expression von Kandidaten mit differentieller Expression in einer Kohorte von 40-50 Patienten mit dokumentiertem Verlauf durch quantitative real-time (Taqman) RT-PCR bestimmt.
Eingesetzte RT-PCR Methodik Semiquantitative duplex RT-PCR
Verschiedene kryostatische Gewebeproben (Sektionen 5-10 µm) wurden von einem Pathologen geprüft und Sektionen, die überwiegend Krebsgewebe enthielten (< 75%), wurden weiter untersucht. Unter Verwendung des RNeasy RNA-Extraktionskits wurde total-RNA extrahiert und mit RNase-freier DNase behandelt. Die RNA-Ausbeute wurde spektrophotometrisch bestimmt. Die Reverse Transkription der RNA (500 ng) erfolgte unter Verwendung von M-MLV Reverse Transkriptase mit Oligo-dT primern 1 Stunde bei 40°C.
Für die Prüfung der cDNA-Ausbeute, der Integrität und einer möglichen Verunreinigung mit genomischer DNA wurde die Expression des Referenzgens β-Aktin untersucht. Dazu wurde ein intronumspannender spezifischer β-Aktinprimersatz entwickelt, der sich aus dem β-Aktin-Vorwärtsprimer: 5'-GGC ATC GTG ATG GAC TCC G-3' und dem reversen: 5'-GCT GGA AGG TGG ACA GCG A-3' zusammensetzt. Der Expressionsgrad von HS1, HS2, HS3 und von Gen21 wurde unter Anwendung der folgenden Primerpaare bestimmt. HS1-Vorwärtsprimer: 5'-CCA ATC CCA GGC ATG TTA AC-3' und rückwärts 5'-CTG CGT AGG AGA GGG AGA TG-3', was zu einem HS1- Reaktionsprodukt mit 320 bp führt: HS2-Vorwärts-Primer: 5'-TGC AGC CAG AGG AAA AAA AC-3' und rückwärts: 5'-TGT GGT TCT GAC ATT CAC AAT G-3', was zu einem HS2-Reaktionsprodukt mit 178 bp führt; HS3-Vorwärtsprimer: 5'-AGG CTG GGA GAG AAG AGT TAT-3' und rückwärts: 5'-CAA AGA GGA AGC TAA TGC TGT-3', was zu einem HS3-Reaktinsprodukt von 290 bp führt; für Gen21 wurde der Vorwärtsprimer: 5'- TCC TGG AGA TGA TGG GCT AC-3' und rückwärts: 5'-TGA ACC CAC CCT GAC TGC-3' benutzt. Die Zyklusbedingungen betrugen für alle Probensequenzen 1 Min. bei 94°C, 1,5 Min. bei 68°C, 2 Min. bei 72°C. Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 2,5 µl PCR-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 8,3, 500 mM KCl, 1,5 mM MgCl2), 2,0 µl 2 mM dNTP, 0,2 µl AmpliTaq-Polymerase, 0,2 µl des jeweiligen β-Aktin-Primers (ursprüngliche Konzentration von 2 µM), 0,6 µl des jeweiligen spezifischen Primers (ursprüngliche Konzentration von 50 µM), 2,5 µl Probe-cDNA und H2O ad 25 µl. Die nach 28 Zyklen erhaltenen Reaktionsprodukte wurden einer Elektrophorese in 2%-iger Agarose mit Ethidiumbromid unterzogen. Alle erhaltenen Reaktionsprodukte wurden sequenziert und mit den veröffentlichten Daten verglichen. Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Fluor-Imager SI (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) durchgeführt. Für die semiquantitative Analyse der RT-PCR-Daten wurde die Fluoreszenz der jeweiligen Probe mit der Fluoreszenz von β-Aktin, ko-amplifziert in der gleichen Röhre, verglichen. Die Dichte des jeweiligen Enzymbandes wurde mit dem entsprechenden Aktinband verglichen durch Berechnung des Verhältnisses (Fluoreszenzeinheiten des Enzymbandes/Fluoreszenzeinheiten von β-Aktin) × 100. Die Nachweisgrenze liegt 1 ng Doppelstrang-DNA. Der lineare Teil des Assays reicht bis zu 25 ng. Die RNA-Expression jeder Probe wurde mindestens in drei unabhängigen Versuchen bestimmt.
Quantitative 5'-Nuklease-RT-PCR-Analyse
Die Primer und Sonden wurden unter Verwendung von Primerexpreßsoftware (PE- angewandte Biosysteme), basierend auf den Sequenzdaten der EST-Sequenzen, entwickelt. Die Sonden für den Nachweis von HS1, HS2 und HS3 wurden mit einem fluoreszierenden Farbstoff (6-Carboxy-Fuoreszein, FAM) und einem Löschfarbstoff (6-Carboxy-Tetra- Methylrhodamin, TAMRA) markiert. Die Sonde für den Nachweis von Standard-β-Aktin wurde mit dem fluoreszierenden Farbstoff TET (6-Carboxy-4,7,2',7'- Tetrachlorfluoreszein) markiert. Der Expressionsgrad von HS1, HS2, HS3 und Gen21 wurde unter Verwendung der folgenden Primerpaare bestimmt: HS1-Vorwärts-Primer: 5'- TGC AAT GTC TAG CTG AGC CCT-3'; HS1-rückwärts: 5'- CATGTTGGCCTCCAGTCCTTA-3' und HS1-Sonde 5'- TGCATTGGCCACAAGCATGGTGA-3'; HS2-Vorwärtsprimer: 5'-CAG ACA ATT TTA CAG ATA TGG ACC ATT T-3', rückwärts: 5'-TTC ACA ATG TTT CCA TCT GTT TGT T-3' und HS2-Sonde: 5'-ATA AGC CAA ACA GGA ACG GGA GAA CAT CAT- 3'.; HS3-Vorwärts-Primer: 5'-CAG CCA TCT GTT GTT GGG C-3', rückwärts: 5'-GAA TGC CTA GGA CTC CTG GAA TG-3' und HS3-Sonde: 5'-CTG GGT CTG AAG CTG GAG GTT TGC A-3'; Gen21-Vorwärts-Primer: 5'-TCC TGG AGA TGA TGG GCT AC- 3' und rückwärts: 5'-TGA ACC CAC CCT GAC TGC-3'. Der Nachweis von Gen 21 erfolgte unter Anwendung der SYBR-Grün-Methode (siehe Handbuch). Beta-Aktin- Vorwärts-Primer: 5'-TCA GCA AGC AGG AGT ATG ACG A-3'; rückwärts: 5'-CGC AAC TAA GTC ATA GTC CGC C-3' und β-Aktin-Sonde: 5'-CCA TCG TCC ACC GCA AAT GCT TC-3.
Die RT-PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, registriert und unter Anwendung des ABI 7700 Prisma-Sequenz-Nachweissystems (PE-angewandte Biosysteme) analysiert. Die Reaktionen wurden jeweils drei Mal durchgeführt, d. h. die RNA-Matrize wurde in Anwesenheit von 0,01 U/ml AmpErase UNG PE-ABI) 2 Min. lang auf 50°C erhitzt. Nach der reversen Transkription bei 60°C 30 Min. lang wurde das Reaktionsgemisch bei 95°C für 10 Min. denaturiert, gefolgt von 40 Zyklen PCR bei 95°C für 20 s und bei 62°C für 1,1 Min. in jedem Zyklus in Anwesenheit einer FAM-markierten Oligonukleotidsonde. Nach der Zielamplifikation kühlte die Sonde auf das Amplikon ab und wurde durch die nukleolytische Aktivität der Polymerase in Reporter- und Quenchfarbe verschoben und aufgespalten. Die Produktmenge, die bei einem gegebenen Zyklus in der Exponentialphase der PCR in nachweisbarer Fluoreszenz erzielt wird, ist der ursprünglichen Anzahl der Matrizenkopien proportional. Die Anzahl der PCR-Zyklen (der Schwellenzyklus CT), die für den Nachweis des Amplikon notwendig ist, ist daher ein direktes Maß der Matrizenkonzentration. Die Quantifizierung der EST-Expression erfolgte in klinischen Proben durch Beziehung des aus Gewebeproben erhaltenen PCR-Schwellenzykluses auf eine Standardkurve. Dazu wurden die Reaktionsprodukte von HS1, HS2, HS3 und β-Aktin (Primer und Bedingungen wie oben) aus SW-480 kolorektalen Krebszellen amplifiziert und in den Vektor Topo-pcDNA3.1 (Invitrogen) einkloniert. Aus serienweisen Verdünnungen der Plasmide von 106 Molekülen bis zu 10 Molekülen wurde die Standardkurve ermittelt, nachdem der Logarithmus (die berechnete Kopiezahl) zum Schwellenzyklus aufgetragen wurde. Die Anzahl der Kopien (N) der unbekannten Proben wurde aus der Regressionslinie nach der Formel: log N (CT - b)/m berechnet, wobei CT der Schwellenwert, b der y-Abschnitt und m die Neigung der Standardkurve ist. Da die Probe und β-Aktin in separaten Röhren amplifiziert wurden, wurden die Probenwerte und die β- Aktinwerte separat gemittelt. Die normalisierte Menge der HS1-, HS2- oder HS3- Expression wurde durch Teilung des gemittelten Probenwertes durch den gemittelten β- Aktin-Wert erhalten.
Ergebnisse Unigene cluster HS1 (Unigene HS169395)
Die quantitative RT-PCR von 50 Fällen zeigte eine signifikante Korrelation der HS1 Expression mit der Bildung von Lymphknoten-Metastasen pN (p = 0.011), der Bildung von Fernmetastasen M (p = 0.0001) und dem Überleben der Patienten (log rank, p = 0.05; Abb. 1). Ausgehend vom ursprünglichen EST gelang es, eine Sequenz, die 2363 bps umfaßt zu sequenzieren. Ein BLAST-Lauf zeigte eine Homologie der Sequenz mit einer cDNA- Sequenz (Accession: GI 10433397) ohne zugeordneter Funktion.
Unigene cluster HS2 (HS127144)
Die quantitative RT-PCR of 40 Patienten zeigte eine signifikante Korrelation der Überexpression von HS2 mit der Bildung von Fernmetastasen (p = 0.026) und Lymphknotenmetastasen (p = 0.025).
Unigene cluster HS3 (HS132793)
Die quantitative RT-PCR in 40 Patienten zeigte eine signifikante Korrelation der HS3 Expression mit dem Überleben der Patienten (log rank, p = 0.01; Abb. 2). Die Korrelation mit der Bildung von Lymphknoten-Metastasen pN (p = 0.065), der Bildung von Fernmetastasen M (p = 0.065) waren nur annähernd signifikant, was aber an einer noch ungenügenden Größe des Kollektivs liegen kann.
Desweiteren konnte die Funktion des Gen 21 als Tumor-Suppressorgen bestätigt werden. Der Datenbankeintrag der Sequenz von Gen21 (gi AAC62535) stellt Gen21 als ein mögliches Lungen Tumor-Suppressorgens auf Chromosom 3 dar, mit einer Homologie zu dem "yeast nitrogen permease regulator" NPR2. Der Ausfall der Expression dieses Gens war hoch assoziiert mit dem Überleben (log rank, p = 0.01; Abb. 3) der Patienten, der Bildung von Lymphknoten-Metastasen pN (p = 0.034) und der Bildung von Fernmetastasen M (p = 0.001)
Nachweis des therapeutischen Effektes
Im Tierexperiment werden Antisense-Nukleotide geprüft, die die Metastasierungsrate von kolorektalen oder Mammakarzinomen zu reduzieren.
Anlage
Nukleotidsequenz HS1-Variante
Proteinsequenz

Claims (11)

1. Verwendung von EST-Sequenzen oder Varianten der Unigene-Cluster HS1, HS2 und/oder HS3 (Unigene HS169395, Unigene HS127144, Unigene HS132793) für die Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen, wobei ihre Expressionsrate in Tumorzellen und/oder Lymphknoten bestimmt wird.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die m-RNA Expression der bestimmt wird, vorzugsweise mittels RT-PCR.
3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionsbestimmung mit Hilfe von Microarrays, durch Immobilisierung der entsprechenden Oligonukleotidsequenz, erfolgt.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Diagnose anhand von Gewebeproben aus den Lymphknoten erfolgt.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die ESTs als Prognosemarker für das Überleben von Tumorpatienten eingesetzt werden.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Diagnose und/oder Therapie von soliden Tumoren, vorzugsweise Kolon-, Magen- und Mammakarzinomen.
7. Therapeutische Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie Substanzen enthalten, die die Expression von EST-Sequenzen oder Varianten der Unigene-Cluster HS1, HS2 und/oder HS3 blockieren, wobei diese Substanzen in die Tumorzellen oder Lymphknoten transfiziert werden.
8. Therapeutische Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Formulierungen zur parenteralen Applikation oder zur gentherapeutischen Anwendung vorliegen.
9. Therapeutische Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie Antisense- Nukleotide in Form eines Vektors zur gentherapeutischen Anwendung enthalten.
10. Variante des HS1 mit der Sequenz der Anlage, die Gegenstand des Anspruchs ist, zur Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen.
11. Verwendung des Proteins BAB13960 umfassend 145 Aminosäuren gemäß Anlage zur Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen.
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