DE10062851A1

DE10062851A1 - Verfahren zur quantitativen Auswertung einer Bildvorlage von gefärbten Präparaten

Info

Publication number: DE10062851A1
Application number: DE2000162851
Authority: DE
Inventors: Wolfdietrich Meyer; Katrin Friedrich; Gunter Haroske; Franz Theissig; Klaus Dietmar Kunze
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Meyer Wolfdietrich Dr De
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2000-12-12
Publication date: 2002-06-13

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Auswertung einer Bildvorlage von einem mit mehreren Farbstoffen gefärbten Präparat, die im Durchlicht gewonnen wird, deren einzelne Bildpunkte mit n >= 3 Farben repräsentiert werden. Die Bildvorlage wird in bis zu n - 1 Teilbilder zerlegt. Die Teilbilder werden aus den Absorptionsspektren der verwendeten Farbstoffe berechnet. Eine Überlagerung der Teilbilder ergibt die Bildvorlage. Die Absorptionsspektren der verwendeten Farbstoffe können selbständig ohne eine weitere Vorgabe bestimmt werden. Durch die Verwendung der Absorptionsspektren der Farbstoffe ist das Verfahren unabhängig von Präparationseinflüssen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Auswertung einer Bildvorlage von einem mit mehreren Farbstoffen gefärbten Präparat, die im Durchlicht gewonnen wird, deren einzelne Bildpunkte mit n <= 3 Farben repräsentiert werden.

Die Auswertung von verschiedenfarbigen Reaktionen ist eine tägliche Aufgabe in der Pathologie. Eine Abbildung einer solchen Reaktion ist in Abb. 1 dargestellt. Im Original sind die Zellkerne blau eingefärbt, einige dunkle Stellen des Bildes sind mit einer braunen Färbung überlagert.

Der größte Teil der Auswertungen erfolgt qualitativ bzw. semiquantitativ durch visuelle Betrachtung und Einteilung in ein grobes Punkteschema. Rechnergestützte Auswertungen haben Probleme mit der Überlagerung der Farben und den Unterschieden in der Präparation. Das Rechnersystem muß an den Farbverhältnissen im Präparat angelernt werden. Diese Belehrung ist nicht auf beliebig viele Präparate anwendbar. Die Farberkennung wird teilweise im RGB Farbraum, häufiger im HSI Farbraum durchgeführt.

Bekannte Lösungen sind nicht für viele gleichartige Präparate einsetzbar. Es muß mit weitgehender Standardisierung der Präparation gearbeitet werden, die durch die Variabilität der Proben nicht immer zu befriedigenden Ergebnissen führt.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren anzugeben, das die Auswertung der Präparate ohne Anpassung an die konkrete Situation des Präparates gestattet. Die Anforderungen an die Standardisierung der Präparation sollen gering sein.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in Verbindung mit den im Oberbegriff des Anspruchs 1 genannten Merkmalen dadurch gelöst, dass bis zu n-1 die Farbstoffe kennzeichnende Teilbilder erzeugt werden, welche aus den Absorptionsspektren der Farbstoffe berechnet werden und welche die örtliche Verteilung der Farbstoffe im Bild beschreiben und deren überlagerte Teilbilder der Originalvorlage entsprechen.

Vorteilhaft wird zur Bestimmung noch unbekannter Absorptionskoeffizienten oder Materialkonstanten von willkürlichen Startwerten ausgehend die Materialkonstanten der Farbstoffe der bis zu n-1 Teilbilder so lange verändert, bis die Abweichung der überlagerten Teilbilder von der Originalvorlage ein absolutes Minimum erreicht.

Eine Unabhängigkeit der Auswertung von variablen Einflüssen ist durch die Betrachtung der optischen Eigenschaften der verwendeten Farbstoffe möglich. Jeder Farbstoff hat definierte Eigenschaften, Licht verschiedener Wellenlänge (Farbe) zu absorbieren. Diese Absorptionsspektren sind in ihrem Verlauf von Präparat und Präparation unabhängig und ändern sich nur geringfügig bei unterschiedlichen Herstellungschargen.

Zur Auswertung der Proben wird nicht wie bisher üblich die Helligkeit sondern die Absorption bei verschiedenen Lichtwellenlängen (Farben) verwendet. Das Bild wird als eine Überlagerung von 2 oder mehr Teilbildern betrachtet, die den Absorptionseigenschaften der betrachteten Farbstoffe entsprechen. Bei der üblicherweise verwendeten Fernsehtechnik (3 Farben RGB, rot, grün, blau) können die Absorptionsspektren von 2 Farbstoffen berechnet werden. Bei multispektralen Vorlagen mit n Farben können (n-1) Absorptionsspektren getrennt werden.

Es werden nur geringe Anforderungen an die verwendete Bildaufnahmetechnik gestellt:
Schwarzwertkorrektur (kein Licht ergibt kein Ausgangssignal) und Linearität (Lichthelligkeit und Ausgangssignal sind linear Abhängig), ein Weißabgleich (gleiche Empfindlichkeit in den Farbkanälen) ist nicht erforderlich.

Die zur Auswertung des Bildes benötigten Daten (spektrale Absorption der verwendeten Farbstoffe) können aus Tabellen bzw. an einer beliebigen Probe gewonnen werden. Diese Daten sind unabhängig von der Beleuchtung und der Färbeintensität des Präparates.

Die im Ergebnis der Auswertung entstehenden Bilder entsprechen der Konzentration des Farbstoffes und enthalten damit keine Farbinformationen. Diese Bilder können wie Schwarzweißbilder verarbeitet werden.

Der Vorteil der Erfindung besteht darin, dass durch eine Aufspaltung des Bildes in eine entsprechende Anzahl von Farbkomponenten die Auswertung verbessert wird.

Die Erfindung wird an nachfolgendem Ausführungsbeispiel noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:

Abb. 1 ein Nachweis von Apoptosen mit der TUNEL-Methode; Gegenfärbung mit Hämatoxylin, Mammakarzinom (im schwarzweiß Bild nicht sichtbar: Im Original sind die Zellkerne blau eingefärbt, einige dunkle Stellen des Bildes sind mit einer braunen Färbung überlagert).

Abb. 2 ein Überlagerungsbild aus zwei Farbstoffen, wie Abb. 1, zeigt, dass Modell zutrifft.

Abb. 3 mit Hämatoxylin gefärbte Zellkerne, Darstellung entsprechend Abb. 1, blauer Farbstoff.

Abb. 4 eine Apoptosereaktion entsprechend Abb. 1, brauner Farbstoff.

Abb. 5 ein Ergebnis der Verarbeitung des Absorptionsbildes mittels EUROQUANT Server.

Zunächst werden die mathematisch-physikalischen Zusammenhänge des Verfahrens erläutert werden.

Für eine gegebene Farbe (Lichtwellenlänge) gilt für die Absorption:

mit
I_f: durch Absorption geschwächte Intensität der Farbe f
I_f0: einfallende Intensität der Farbe f
µ_f: Materialkonstante der Lichtabsorption der Farbe f
d: Dicke des absorbierenden Materials.

Zur Bestimmung der Materialkonstanten der Farbstoffe dient:

mit
IM_f: Intensität der Farbe f nach dem Modell
I_f0: einfallende Intensität der Farbe f
µ_f,k: Materialkonstante der Komponente k der Lichtabsorption der Farbe f
d_k: Dicke des absorbierenden Materials der Komponente k.

Bei gegebenen Materialeigenschaften µ_f,k können die Farbstoffkonzentrationen d_k bestimmt werden durch Lösung der Beziehung

(IG_f-IM_f)²→Min! (3)

mit
IG_f: Gemessene Intensität der Farbe f in einem Bildpunkt
IM_f: Intensität der Farbe f nach dem Modell in einem Bildpunkt.

Wenn die Anzahl der Komponenten k kleiner als die Anzahl der Farben f ist, können die Farbstoffkonzentrationen d_k in diesem Bildpunkt bestimmt werden. Die Abweichung der gemessenen Intensität von der durch das Modell beschriebenen Intensität ist gering, wenn die Materialkonstanten µ_f,k die Farbstoffe korrekt beschreiben. Bei Variation der Materialkonstanten µ_f,k und Anwendung von Gleichung (3) auf viele Bildpunkte kann ein absolutes Minimum der Abweichungen des Modells von den Meßwerten erhalten werden. Die dabei gewonnenen Materialkonstanten µ_f,k beschreiben die Farbstoffe und können für alle weiteren Auswertungen verwendet werden.

Das in Abb. 1 dargestellte Bild wurde mit den an anderen Bildern gewonnenen Materialkonstante µ_f,k nach Formel (2) verarbeitet. Das Ergebnis ist die Konzentration der beiden Farbstoffe in jedem Bildpunkt. Die Überlagerung der beiden Absorptionsbilder zeigt Abb. 2.

Das eigentlich interessierende Ergebnis ist die separate Darstellung der beiden Farbstoffe (Abb. 3 und Abb. 4).

Abb. 4 zeigt das Ergebnis des Verfahrens. Der Untergrund (Zellplasma) und die nicht schwach dargestellten Zellkerne bestimmen den Schwankungsbereich für die nichtreagierenden Zellkerne. Deutlich kräftiger angefärbte Bildteile können durch Vergleich ihrer örtlichen Position mit Abb. 3 Tumorzellkernen, Farbausscheidungen und anderen Artefakten zugeordnet werden. Diese visuelle Auswertung ist an den Abb. 3 und 4 einfacher als an der originalen Abb. 1 durchzuführen. Die interessierende (im Beispiel braune) Reaktion kann mit einer Gegenfärbung (im Beispiel blau) korreliert werden. Die braune Reaktion ist an die blauen Zellkerne gebunden. Außerhalb der Zellkerne treten nur störende Einflüsse auf. Die Abgrenzung störender von interessierenden Färbungen ist durch inhomogene Präparation und von Präparat zu Präparat unterschiedlichen Farbintensitäten teilweise schwierig.

Eine rechnergestützte Auswertung mit einem im Internet zugänglichen Quantitationsserver http:euroquant.med.tu-dresden.de zeigt folgendes Ergebnis (Abb. 5).

Nicht reagierende Zellkerne (Nr. 2, 3, 4, 6, 7, . . .) zeigen Absorptionsmesswerte (Spalte IOD) um den Wert 2 ± 1, die Flächen dieser Zellkerne (Spalte AREA) liegen im Bereich 400 ± 100. Reagierende Zellkerne zeigen Absorptionswerte im Bereich (IOD) 10. Unregelmäßig geformte Objekte können nicht den Zellkerne zugeordnet werden. Diese nicht auf das Einsatzgebiet abgestimmte rechnergestützte Auswertung stimmt mit der visuellen Methode überein.

Die mittleren Unterschiede der Intensität in den 3 Farbkanälen an allen Bildpunkten liegt bei 3%. Diese Unterschiede sind damit vom menschlichen Auge nicht erkennbar. Damit ist die Funktion des erfindungsgemäßen Verfahrens gezeigt.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Auswertung einer Bildvorlage von einem mit mehreren Farbstoffen gefärbten Präparat, die im Durchlicht gewonnen wird, deren einzelne Bildpunkte mit n <= 3 Farben repräsentiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass bis zu n-1 die Farbstoffe kennzeichnende Teilbilder erzeugt werden, welche aus den Absorptionsspektren der Farbstoffe berechnet werden und welche die örtliche Verteilung der Farbstoffe im Bild beschreiben und deren überlagerte Teilbilder der Originalvorlage entsprechen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung noch unbekannter Absorptionskoeffizienten oder Materialkonstanten von willkürlichen Startwerten ausgehend die Materialkonstanten der Farbstoffe der bis zu n-1 Teilbilder so lange verändert werden, bis die Abweichung der überlagerten Teilbilder von der Originalvorlage ein absolutes Minimum erreicht.