DE10060746A1 - Maleinimid-Linker mit geschützter Thiol- oder Disulfid-Funktionalität - Google Patents

Maleinimid-Linker mit geschützter Thiol- oder Disulfid-Funktionalität

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Abstract

Synthese und Einsatz von heterotrifunktionellen Crosslinkermolekülen zur kovalenten Dimerisierung von Proteinen und kovalenten Immobilisierung der gecrosslinkten Proteine auf Edelmetall-, Glas- oder funktionalisierten Festphasenoberflächen. Als Funktionalitäten enthalten die Linker eine schwefelhaltige Kopplungsgruppe, z. B. SH, und ein oder zwei mit Thiolen reagierende Gruppen wie beispielsweise Maleinimide. Die Trifunktionalität der Linkermoleküle erlaubt den Aufbau dendritischer Spacerstrukturen, was eine vielschichtige Oberflächenbelegung ermöglicht.

Description

Die Erfindung betrifft die Synthese bi- oder tridentaler Linker, die zumindestens eine Thiol-bindende Gruppe sowie eine Thiol- oder Disulfid- Funktionalität enthalten, sowie die Verwendung dieser Linker zur Herstellung von Konjugaten.
Die Kopplung biologischer Substanzen an Makromoleküle oder an Basis­ träger erfolgt unter Verwendung von bifunktionellen Linkem oder, falls zusätzliche Verknüpfungen erzielt werden sollen, mit trifunktionellen Linkem. So offenbart EP-A-0 446 071 trifunktionelle Linker mit drei Maleinimidgruppen. Derartige Linker sind für die Bindung und Vernetzung von biologischen Substanzen wenig geeignet, da unkontrollierte Vernetzungen zu erwarten sind. EP-A-0 618 192 offenbart trifunktionelle Linker mit zwei Maleinimidgruppen und einer aktivierten Estergruppierung. Maleinimidgruppen weisen eine Spezifität für Thiolgruppen auf, wie sie in nativen Proteinen vorkommen oder durch Mutation oder Derivatisierung eingeführt werden können. Jedoch weist die aktivierte Esterfunktion der in EP-A-0 618 192 offenbarten Linker eine sehr breite Reaktivität auf. Sie bindet unter anderem an Amino- oder Hydroxylgruppen, wie sie grund­ sätzlich in zumeist größerer Zahl an biologischen Substanzen anzutreffen sind. Insbesondere finden sich derartige Gruppen in den aktiven Zentren von Enzymen. Reagieren derartige Linker mit Gruppierungen aus dem aktiven Zentrum, so wird die enzymatischen Aktivität im allgemeinen blockiert. Somit ist das Problem der unkontrollierten Vernetzung nur teilweise vermieden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, di- oder trifunktionelle Linker zur Verfügung zu stellen, die zum einen durch die Reaktion ihrer thiolbindenden Funktionen eine definierte, reproduzierbare Kopplung von Proteinen ermöglichen, zum anderen jedoch zusätzlich eine selektive Anbindung an Trägermaterialien erlauben.
Um eine selektive Bindung an Trägrmaterialien zu gewährleisten, sind in den erfindungsgemäßen Linkem schwefelhaltige Gruppierungen, wie beispielsweise SH-Gruppen, vorgesehen. Diese Funktionalitäten sind jedoch, wie unmittelbar ersichtlich, nicht uneingeschränkt mit der Verwendung von Maleinimidgruppen oder anderen Thiol-reaktiven Gruppen verträglich. Durch Bereitstellung der erfindungsgemäßen Linker, sowie des Verfahrens zu ihrer Herstellung wird dieses Problem gelöst.
Die Aufgabe erfüllen Verbindungen der allgemeinen Formel I.
worin
Y ein Kernbaustein ausgewählt aus der Gruppe C-R1 oder N ist, wobei
R1 = H oder verzweigtes oder unverzweigtes Alkyl mit 1-5 C-Atomen,
Q eine schwefelhaltige Kopplungsgruppe,
X eine mit Thiolen reagierende Gruppe,
S' H oder ein verzweigtes oder unverzweigtes Alkyl mit 1-5 C-Atomen oder Z3-X
Z1, Z2, Z3 unabhängig voneinander Brückenglieder der Form (CH2)m mit m = 1-50, worin ein oder mehrere nicht benachbarte Methylengruppen durch -NR1-, -O-, -CO-, -HC=CH-, -C=C-, -NR1CO-, -CONR1-, -O-CO-, -CO-O-, -NR1CO-O-, -O-CONR1-, -NR1CONR1-, -CHR2-, -NR1-CHR2-, -CHR2-NR1-, -CO-NR1-CHR2-, -CHR2-NR1-CO-, -CO-O-CHR2-, -CHR2-O- CO-, mit
R2 = OH, NH2, COOH, verzweigtes oder unverzweigtes Alkyl mit 1-5 C- Atomen, ersetzt sein können, bedeuten.
Gegenstand der Erfindung sind daher Verbindungen der allgemeinen Formel I, die neben ein oder zwei mit Thiolen reagierenden Gruppen eine weitere schwefelhaltige Kopplungsgruppe tragen.
Besonders bevorzugt sind dabei Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei denen S' = Z3-X bedeutet.
Besonders bevorzugt sind weiterhin Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei denen S' = Z3-X bedeutet und der Kernbaustein Y entweder CR1 mit R1 = H oder Y = N bedeutet.
Gegenstand der Erfindung ist zudem die Darstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, wobei S' = Z3-X und der Kernbaustein Y = CR1 mit R1 = H bedeutet, durch
  • a) zweifache Malonestersynthese von Verbindungen der Formel II an Malonsäurediester zu Verbindungen der Formel III
  • b) Abspaltung der Phtalimidogruppen und Freisetzung der Aminofunktionen
  • c) Spaltung des Malonsäurediesters und Decarboxylierung
  • d) Einführung von Aminoschutzgruppen
  • e) Konjugation der Carbonsäure mit Aminoverbindungen der Form H2N-Z2-Q.
  • f) Abspaltung der Aminoschutzgruppen
  • g) Einführung von zwei Maleinimidylresten durch Behandlung mit Alkoxycarbonylmaleinimid.
Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung die Synthese von Verbindungen der allgemeinen Formel I, wobei S' = Z3-X und der Kernbaustein Y = N bedeutet, durch
  • a) Einführung von Aminoschutzgruppen in ein Molekül der Form H2N-Z1- NH-Z3-NH2
  • b) Konjugation eines Carbonsäurelinkers der Form HOOC-Z2-Q an das zentrale sekundäre Amin
  • c) Abspaltung der Aminoschutzgruppen
  • d) Einführung von zwei Maleinimidylresten durch Behandlung mit Alkoxycarbonylmaleinimid.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung zur kovalenten Dimerisierung von Proteinen, wobei die Konjugation über die Gruppen X des Linkers erfolgt.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Immobilisierung derartiger Konjugate über die schwefelhaltige Kopplungsgruppe an Festphasen­ oberflächen.
Gegenstand der Erfindung ist auch der Aufbau dendritischer Strukturen auf Trägermaterialien mittels erfindungsgemäßen Linkerbausteinen und die Immobilisierung von Proteinen auf den Oberflächenstrukturen.
In Abb. 1 und 2 ist ein allgemeiner Syntheseweg für Verbindungen entsprechend Anspruch 3 dargestellt, wobei die Brückenglieder Z1 und Z3 nur Methylengruppen enthalten.
In Abb. 3 und 4 ist ein allgemeiner Syntheseweg für Verbindungen entsprechend Anspruch 4 dargestellt, wobei die Brückenglieder Z1 und Z3 nur Methylengrupen enthalten.
Abb. 5 zeigt ein allgemeines Schema zur immobilisierung von Proteinen an Trägeroberflächen.
Abb. 6 zeigt das Beispiel einer mit dendritischen Strukturen belegten Oberfläche.
Es wurde gefunden, daß kovalente Verknüpfungen von Proteinen und die spätere definierte Immobilisierung an der Festphase, wie sie durch die erfindungsgemäßen Linker ermöglicht werden, einen großen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik mit sich bringen. Eine Vielzahl von Enzymen bestehen aus mehreren, beispielsweise zwei, Proteinunter­ einheiten, die nur über hydrophobe und/oder ionische Wechselwirkungen zusammengehalten werden. Solche Enzyme stehen oft in einem empfindlichen Dissoziations-Reassoziations-Gleichgewicht und dissoziieren bereits aufgrund von geringen pH-Wertänderungen, Änderungen der Ionenstärke oder der Gegenwart von Detergenzien oder chaotropen Salzen im umgebenden Medium. Meist sind die monomeren Untereinheiten der oligomeren Enzyme katalytisch inaktiv.
Bei herkömmlichen Methoden zur Immobilisierung oligomerer Proteine erfolgt die Anknüpfung der Enzyme an eine Trägermatrix oft nur über die kovalente Anbindung einer Untereinheit. Deshalb beobachtet man infolge der Dissoziation der Untereinheiten oft eine irreversible Reduktion der enzymatischen Aktivität oder ein Auswaschen von Enzymen.
Die erfindungsgemäßen Linker ermöglichen die kovalente Verknüpfung von dimeren Enzymen und ihre nachträgliche Immobilisierung ohne Reduktion der enzymatischen Aktivität. Die Immobilisierung erfolgt erfindungsgemäß über eine schwefelhaltige Kopplungsgruppe, die eine selektive Anbindung an entsprechend funktionalisierte Träger erlaubt. Auf diese Weise ist es möglich, beispielsweise für Biosensoren, Chromatographiematerialien oder Enzymmembranen, immer wieder neue, für die jeweilige Anwendung speziell angepasste Linker zu entwickeln, die es erlauben, zwei Proteinuntereinheiten oder zwei strukturell unterschiedliche Proteine kovalent zu verbinden und definiert an eine gegebene Matrix zu immobilisieren. Diese Methode erlaubt die Durchführung detaillierter Studien zu kooperativen Effekten von Proteinen, dimerisierten Proteinen oder Proteinuntereinheiten bezüglich ihrer enzymatischen Aktivität. Ist eine vorangehende Dimerisierung in der Anwendung nicht von Bedeutung, können die erfindungsgemäßen Linker zur Immobilisierung in einer heterobifunktionellen, bidentalen Form gewählt werden.
Die heterotrifunktionellen Linker der vorliegenden Erfindung können zudem zum Aufbau dendritischer Oberflächenstrukturen auf Matrizes verwendet werden. Konvergente und divergente Synthesen sind durchführbar. Die schwefelhaltige Gruppe der Linker dient dabei nicht nur zur direkten Anbindung an die Matrix. Zugleich besteht die Möglichkeit zur Reaktion mit den Thiol-bindenden Gruppen anderer Linker-Moleküle. Dadurch kommt es zur Ausbildung einer dendritischen raumerfüllenden Oberflächenbelegung. Diese stark vergrößerte Oberfläche kann ihrerseits zur Immobilisierung von Proteinen oder dimerisierten Proteinen oder auch zur Beladung mit Peptiden oder niedermolekularen Affinitätsmarkern verwendet werden. Durch die dendritischen Strukturen lassen sich sehr hohe Beladungsgrade erreichen.
Gleichermaßen durchführbar ist die Darstellung von dimeren Proteinkonjugaten mittels der erfindungsgemäßen Linker, eine nachfolgende Freisetzung der SH-Funktion und Umsetzung mit weiteren Linkermolekülen. Die so erzeugten dendritischen Strukturen können ebenfalls zur Belegung entsprechender Matrizes verwendet werden.
Als Kernbaustein, von dem die Arme des Linkers ausgehen, wird Stickstoff oder Kohlenstoff verwendet. Der Kohlenstoff kann alkylsubstituiert sein oder vorzugsweise ein Wasserstoffatom tragen. Die von dem Kernbaustein als Linkerarme abgehenden Brückenglieder können in ihrer Länge und Polarität der jeweiligen Aufgabenstellung angepaßt werden. Ihre Kettenlänge kann im Bereich von 1 bis 50 Methylengruppen liegen. Neben den vorzugsweise verwendeten Methylengruppen können auch einmal oder mehrfach Funktionalitäten, wie Ether, Carbonyl, Acetyl, Amid, Ethylen, Acetylen, Amin, Urethan, Harnstoff oder substituerte Methylengruppen eingefügt werden.
Als schwefelhaltige Kopplungsgruppen werden vorzugsweise substituierte Disulfide verwendet. Besonders bevorzugt sind dabei die Reste S-3-Nitro- 2-pyridin-sulfenyl-, S-Alkoxycarbony-sulfenyl- oder S-tert-Butylmercapto-. Weiterhin möglich ist der Einsatz als Ether oder Ester geschützter Thiole, wie sie dem Fachmann aus T. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, J. Wiley & sons inc., second ed. 1991, ISBD 0-471-62301-6, 279-307 bekannt sind.
Als mit Thiolen reagierende Gruppe werden bevorzugt die Maleinimidyl- und die 2-Pyridyl- Gruppe oder auch Haloacetyl-Reste, von denen Iodoacetyl- besonders hervorzuheben ist, eingesetzt.
Bevorzugte Angriffspunkte für die Dimerisierung von Proteinen sind die Mercaptogruppen von Cysteinseitenketten. Dazu können auch durch gezielte Mutation Cystein-Reste in ein Protein eingeführt werden oder Mercaptogruppen mit Reagenzien wie 2-Iminothiolan erzeugt werden.
Die Maleinimidgruppen an den erfindungsgemäßen trifunktionellen Linkem reagieren hochselektiv mit SH-Gruppen unter Ausbildung einer stabilen Thioetherbindung. Besonders vorteilhaft ist die Durchführung der Reaktion bei pH-Werten zwischen 6,5 und 7,5. Oberhalb von pH 7,5 erfolgt zunehmend auch eine Reaktion mit primären Aminen. Die auf diese Weise gebunden Proteine können Proteine gleicher oder unterschiedlicher Art sein, es kann sich um Proteinuntereinheiten, Multienzymkomplexe oder Peptidfragmente handeln.
Die Immobilisierung der kovalent gebundenen Proteine erfolgt über die schwefelhaltige Kopplungsgruppe. Eine Disulfidfunktion erlaubt auch die direkte Bindung des Linkers an Goldoberflächen. In reduziertem Zustand dient die SH-Gruppe zur selektiven Bindung an funktionalisierte Oberflächen wie Membranen, Magnetpartikel, Hohlfasern, Elektroden, Glas, Chromatographiegele oder Polymere. Die Funktionalisierung erfolgt bevorzugt mit Maleinimidgruppen, 2-Pyridyl-, Haloacetyl- oder Haloacyl- Resten.
Die Synthese von erfindungsgemäßen Linkem, in denen S' = Z3-X und Y = CH ist, wobei die genannten Reste S', X, Y und Z3 die in Formel I genannte Bedeutung besitzen, kann nach prinzipiell bekannten Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch zweifache Malonestersynthese mit Molekülen der Formel II, wobei G ein Halogen, bevorzugt Brom, ist und Malonsäurediestern, vorzugsweise Malondiethylester.
G = Cl, Br, J
Z1 hat die in Anspruch 1 genannte Bedeutung.
R = verzweigtes oder unverzweigtes Alkyl mit 1-5 C-Atomen
Man erhält Moleküle entsprechend Formel III. Nach Freisetzung der Aminogruppen durch Abspaltung der Phtalimidogruppen (vorzugsweise mittels Hydrazin) erfolgt Spaltung des Malonsäurediesters (bevorzugt mit Salzsäure) und Decarboxylierung. Anschließend werden die primären Aminogruppen geschützt, wofür eine t-Boc-Gruppe bevorzugt wird. Nachfolgend wird eine Aminoverbindung der Form H2N-Z2-Q an die Carbonsäurefunktion konjugiert. Nach erneuter Freisetzung der geschützten Aminogruppen erfolgt die Einführung von zwei Maleinimidylresten durch Behandlung mit Alkoxycarbonylmaleinimid, bevorzugt N-Methoxycarbonylmaleinimid.
Die Einführung anderer mit Thiolen reagierender Gruppen statt der Maleinimide kann nach bekannten Methoden durchgeführt werden. Die Grundzüge derartiger Syntheseverfahren und geeigneter Verfahrensvarianten sind dem Fachmann bekannt. Die verwendeten Ausgangssubstanzen sind kommerziell erhältlich oder in der Literatur beschrieben.
Die Synthese von erfindungsgemäßen Linkem mit S' = Z3-X und Y = CH, wobei die genannten Resten S', X, Y und Z3 die in Formel I genannte Bedeutung besitzen, kann durchgeführt werden ausgehend von einem Molekül der Form H2N-Z1-NH-Z3-NH2. Nach Schutz der primären Aminogruppen (bevorzugt mit t-Boc) erfolgt die Konjugation der zentralen sekundären Aminogruppe mit einem Carbonsäurelinker der Form H2N-Z2- Q. Nach Abspaltung der Aminoschutzgruppen kann dann die Maleinimidgruppe durch Behandlung mit Alkoxycarbonylmaleinimid, bevorzugt N-Methoxycarbonylmaleinimid, eingeführt werden.
Abb. 5 zeigt ein allgemeines Schema zur Dimerisierung und Immobilisierung eines Proteins, wie beispielsweise der S140C-Sma- Nuklease, mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Crosslinkers. Beispielhaft wurde der Linker 5-Maleinimido-2-(3-(maleinimido)-propyl)-pentansäure-(2- tert.-butyldisulfanyl-ethyl)-amid gewählt. In Schritt A erfolgt zunächst die Dimerisierung der Enzymuntereinheiten. In Schritt B wird die SH-Gruppe freigesetzt. Abschließend erfolgt in Schritt C die Immobilisierung an ein Maleinimid-funktionalisiertes Trägermaterial.
Abb. 6 zeigt schematisch baumartige, dendritische Spacerstrukturen, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen trifunktionellen Linkers hergestellt wurden. Die Stärke der Vernetzung kann durch entsprechende Reaktionsbedingungen eingestellt werden.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fach­ mann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offen­ barung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, insbesondere der korrespondierenden Anmeldung DE 199 61 701, eingereicht am 21.12.1999, ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
In den nachfolgend aufgeführten Beispielen bedeuten die Abkürzungen:
EDAC = 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
HOBT = 1-Hydroxybenzotriazol
Beispiel 1 1.1 Bis-(3-phtalimidopropyl)-malonsäurediethylester Literatur
A. Reissert, Chem. Ber. 26 (1893) 2137.
9 g (0,39 mol) Natrium wurden portionsweise und vorsichtig unter Rühren in 108 ml getrocknetem Ethanol gelöst. Zu der entstandenen milchig­ weißen Lösung wurden bei RT unter kräftigem Rühren 28,5 ml (0,19 mol) Diethylmalonat in 30 ml getrocknetem Ethanol zugetropft. Die Reaktionslösung wurde dabei 2 × mit je 50 ml Ethanol verdünnt und gerührt bis eine klare Lösung entstand.
Anschließend wurden 100 g (0,37 mol) festes, ungelöstes N-(3- Brompropyl)-phtalimid unter kräftigem Rühren portionsweise zugegeben und die Reaktionslösung über Nacht unter Rückfluß erhitzt.
Das aus der Reaktionslösung ausgefallene weiße Produkt wurde 2 × mit 100 ml Wasser und anschließend 2 × mit 100 ml heißem Ethanol gewaschen. Das Reaktionsprodukt wurde im Vakuum-Exsikkator über CaCl2 getrocknet.
Man erhält 54,7 g weiße Kristalle (55% d. theor. Ausbeute) mit einem Schmelzpunkt von 156,9°C.
1.2 2-(3-Aminopropyl)-5-aminopentansäure Literatur
S. Löfås und P. Ahlberg, J. Heterocyclic Chem. 21 (1984) 583.
Eine Lösung von 53,46 g (0,1 mol) Bis-(3-phtalimidopropyl)- malonsäurediethylester in 500 ml Ethanol wurde mit 9,7 ml (0,2 mol 100 %igem Hydrazinhydrat versetzt und 1,5 h unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde nach Zugabe von 100 ml Wasser verdampft und der Rückstand in 300 ml konzentrierter Salzsäure für 12 h unter Rückfluß erhitzt.
Das Reaktionsgemisch wurde zweimal verdünnt, filtriert und im Vakuum bis zur Tockene eingeengt. Das Produkt wurde in 200 ml 1 M Natronlauge neutralisiert. Das Lösungsmittel wurde abgezogen und das Produkt ohne weitere Aufarbeitung in die nachfolgende Reaktion eingesetzt.
1.3 2-(3-BOC-aminopropyl)-5-BOC-aminopentansäure
17,4 g (0,1 mol) 2-(3-Aminopropyl)-5-aminopentansäure wurden in 250 ml 1 M NaOH gelöst und mit 250 ml tert.-Butanol versetzt. Zu dieser Emulsion wurden bei RT unter Rühren 43,6 g (0,2 mol) Di-tert.-butyldicarbonat zugetropft. Der aus dem Reaktionsgemisch ausfallende weiße Feststoff wurde abfiltriert und die verbleibende Emulsion dreimal mit 200 ml n- Pentan extrahiert. Die wäßrige Phase wurde mit einer 1,1 M Lösung KHSO4 auf pH 3 eingestellt und dreimal mit 200 ml Diethylether extrahiert, die etherische Phase mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und verdampft. Man erhält 25,4 g eines weißen Pulvers (68% d. theor. Ausbeute).
1.4 2-Aminoethyl-2-aminoethanthiolsulfonat-dihydrochlorid Literatur
Field, L. et al., J. Am. Chem. Soc., 83 (1961) 4414-4417.
Zu einer gut gerührten, auf 0°C gekühlten Lösung von 40 g (0,35 mol) Cysteaminiumchlorid in 100 ml Wasser wurden 50 ml (0,58 mol) Wasserstoffperoxid (35%ig) zugetropft. (als Katalysator wurden einige wenige Kristalle Kaliumiodid zugesetzt). Das Reaktionsgemisch wurde noch 1 h bei 0°C und anschließend noch weitere 20 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen und der gelbliche Rückstand aus 250 ml Eisessig rekristallisiert.
Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Man erhält 42,4 g einer weißen kristallinen Substanz (94% d. theor. Ausbeute), die sich bei 162°C zersetzt und sehr gut in Wasser löslich ist.
1.5 2-(tert.-Butyldithio)-ethylamin-hydrochlorid Literatur
Field, L. et al., J. Am. Chem. Soc., 83 (1961) 4414-4417.
Zu einer gut gerührten, auf 25°C temperierten Lösung von 51,4 g (0,2 mol) 2-Aminoethyl-2-aminoethanthiolsulfonat-dihydrochlorid in 100 ml Wasser wurden 18 g (0,2 mol) tert.-Butylmercaptan in 50 ml Ethanol langsam zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde noch 1 h bei 25°C weitergerührt und anschließend über Nacht bei 4°C stehengelassen.
Der weiße, kristalline Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat bei 40 °C im Vakuum verdampft. Der weiße Rückstand wurde in 100 ml Wasser aufgenommen, mit 100 ml Diethylether versetzt und mit KHCO3 neutralisiert.
Die Etherphase wurde mit 8,5 ml 37%iger HCl in 50 ml Wasser extrahiert und mit 100 ml Wasser gewaschen. Das saure Extrakt und die Waschlösung wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Der weiße feste Rückstand wurde in Isopropanol/Hexan umkristallisiert.
Man erhält 14,4 g des Produkts (36% d. theor. Ausbeute).
1.6 2-(tert.-Butyldithio)-ethylamin
14,25 g (0,07 mol) 2-(tert.-Butyldithio)-ethylamin-hydrochlorid wurden in 100 ml 1 M wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung aufgenommen und 5 min bei RT gerührt. Anschließend wurde die trübe Lösung mit 3 × 100 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten Etherphasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel anschließend im Vakuum abgezogen.
Man erhält 11,4 g einer farblosen Flüssigkeit als Produkt (98% d. theor. Ausbeute).
1.7 N-(2-(tert.-Butyldithio)-ethyl)-2-(3-BOC-aminopropyl)-5-BOC- aminopentansäureamid
10,2 g (27,2 mmol) 2-(3-BOC-aminopropyl)-5-BOC-aminopentansäure und 8,4 g (43,6 mmol) EDAC wurden in 150 ml Dichlormethan unter Rühren bei RT gelöst. Nachdem sich eine klare Lösung gebildet hattte, wurden 7,4 g (54,5 mmol) HOBT zugegeben und weitere 30 min bei RT gerührt.
Zum klaren Reaktionsgemisch wurden 4,5 g (27,2 mmol) 2-(tert.- Butyldithio)-ethylamin zugegeben und über Nacht bei RT gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit 3 × 100 ml 0,5 M HCl, anschließend mit 3 × 0,5 M Natriumcarbonat-Lösung und schließlich mit 2 × 100 ml Wasser gewaschen. Die verbleibende gelb gefärbte organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und der ölige Rückstand in 30 ml Ethylacetat aufgenommen. Die Lösung wurde über eine mit Kieselgel 60 gefüllte Glasfilternutsche chromatographiert. Das Eluat wurde über Nacht bei -20°C stehengelassen. Der weiße Niederschlag wurde mehrfach mit n-Hexan gewaschen. Es resultieren 8,4 g eines weißen Pulvers (59% d. theor. Ausbeute).
1.8 N-(2-(tert.-Butyldithio)-ethyl)-2-(3-aminopropyl)-5- aminopentansäureamid
2 g (3,8 mmol) N-(2-(tert.-Butyldithio)-ethyl)-2-(3-BOC-aminopropyl)-5- BOC-aminopentansäureamid wurden bei RT unter Rühren in 20 ml wasserfreier Trifluoressigsäure (TFA) gelöst und 2 h bei RT weitergerührt. Anschließend wurde die TFA im Vakuum bei 40°C verdampft. Der Rückstand wurde noch 2 × mit je 40 ml Toluol aufgenommen und im Vakuum abgezogen.
Der Rückstand wurde in 100 ml 0,5 M Natriumcarbonatlösung aufgenommen und mit 3 × 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Der ölige Rückstand (0,65 g) wurde direkt in die nachfolgende Reaktion eingesetzt.
1.9 5-Maleinimido-2-(3-(maleinimido)-propyl)-pentansäure-(2-tert.- butyldisulfanyl-ethyl)-amid
10 mmol N-(2-(tert.-Butyldithio)-ethyl)-2-(3-aminopropyl)-5- aminopentansäureamid wurden in 90 ml gesättigter NaHCO3-Lösung/THF (1 : 1 v/v, ca. 9 ml Lösungsmittel pro Millimol Diaminoverbindung) gelöst. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und unter Rühren 3,7 g (24 mmol; 2,4 equiv.) N-Methoxycarbonylmaleinimid portionsweise zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde 10 min bei 0°C gerührt und weitere 90 ml der NaHCO3/THF-Mischung zugegeben. Anschließend wurde der Reaktionsansatz 3 h bei RT weitergerührt, wobei jede Stunde 90 ml des NaHCO3/THF-Gemisches zugegeben wurden, um die Lösung basisch zu halten. Die Reaktionslösung wurde mit 3 × 100 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden 2 × mit 100 ml Wasser und 1 × 100 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum bei 40°C verdampft. Das zähflüssige Produkt wurde in 20 ml n-Hexan aufgenommen und mit wenigen Millilitern Methylenchlorid zum Kristallisieren gebracht. Die Ausbeute nach dem Umkristallisieren in Ethanol betrug 1,0 g (21% d. theor. Ausbeute); Schmelzpunkt: 113,6°C.

Claims (10)

1. Verbindungen der allgemeinen Formel
worin
Y ein Kernbaustein ausgewählt aus der Gruppe C-R1 oder N ist,
R1 H oder verzweigtes oder unverzweigtes Alkyl mit 1-5 C-Atomen,
Q eine schwefelhaltige Kopplungsgruppe,
X eine mit Thiolen reagierende Gruppe,
S' H oder ein verzweigtes oder unverzweigtes Alkyl mit 1-5 C-Atomen oder Z3-X
Z1, Z2, Z3 unabhängig voneinander Brückenglieder der Form (CH2)m mit m = 1-50, worin ein oder mehrere nicht benachbarte Methylengruppen durch -NR1-, -O-, -CO-, -HC=CH-, -C=C-, -NR1CO-, -CONR1-, -O-CO-, -CO-O-, -NR1CO-O-, -O-CONR1-, -NR1CONR1-, -CHR2-, -NR1-CHR2-, -CHR2-NR1-, -CO-NR1-CHR2-, -CHR2-NR1-CO-, -CO-O-CHR2-, -CHR2-O- CO-, mit
R2 = OH, NH2, COOH, verzweigtes oder unverzweigtes Alkyl mit 1-5 C-Atomen,
ersetzt sein können,
bedeuten.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, in denen S' = Z3-X bedeutet, wobei die Reste X und Z3 die in Ansprüch 1 genannte Bedeutung besitzen.
3. Verbindungen nach Anspruch 2, in denen der Kernbaustein Y = CR1 mit R1 = H bedeutet.
4. Verbindungen nach Anspruch 2, in denen der Kernbaustein Y = N bedeutet.
5. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen entsprechend Anspruch 3 durch
  • a) zweifache Malonestersynthese von Verbindungen der Formel II, mit G = Cl, Br, J, Z1 hat die in Anspruch 1 genannte Bedeutung,
    an Malonsäurediester zu Verbindungen der Formel III, wobei R ein verzweigtes oder unverzweigtes Alkyl mit 1-5 C-Atomen bedeutet
  • b) Abspaltung der Phtalimidogruppen und Freisetzung der Aminofunktionen
  • c) Spaltung des Malonsäurediesters und Decarboxylierung
  • d) Einführung von Aminoschutzgruppen
  • e) Konjugation der Carbonsäure mit Aminoverbindungen der Form H2N-Z2-Q, wobei die Reste Z2 und Q die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben
  • f) Abspaltung der Aminoschutzgruppen
  • g) Einführung von zwei Maleinimidylresten durch Behandlung mit Alkoxycarbonylmaleinimid.
6. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen entsprechend Anspruch 4 durch
  • a) Einführung von Aminoschutzgruppen in ein Molekül der Form H2N-Z1- NH-Z3-NH2, wobei die Reste Z1 und Z3 die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben.
  • b) Konjugation eines Carbonsäurelinkers der Form HOOC-Z2-Q, wobei die Reste Z2 und Q die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, an das zentrale sekundäre Amin
  • c) Abspaltung der Aminoschutzgruppen
  • d) Einführung von zwei Maleinimidylresten durch Behandlung mit Alkoxycarbonylmaleinimid.
7. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 2 zur kovalenten Dimerisierung von Proteinen, wobei die Konjugation über die Gruppen X des Linkers erfolgt. X hat die unter Anspruch 1 genannte Bedeutung.
8. Immobilisierung der nach Anspruch 7 erhaltenen Konjugate an Festphasenoberflächen.
9. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 2 zum Aufbau dendritischer Strukturen auf Trägeroberflächen.
10. Verwendung der nach Anspruch 9 erzeugten Oberflächenstrukturen zur Immobilisierung von Proteinen.
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