DE10054351A1 - Methoden zur gleichzeitigen Bestimmung von biomolekularen Wechselwirkungen mittels Oberflächenplasmonresonanz und Impedanzmessung - Google Patents
Methoden zur gleichzeitigen Bestimmung von biomolekularen Wechselwirkungen mittels Oberflächenplasmonresonanz und ImpedanzmessungInfo
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Abstract
Es wird ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Bindung des Analyten an eine Festphase durch unabhängige Auswertung der Signale aus einer Oberflächenplasmonresonanz- und Impedanzmessung bestimmt.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, wobei man zum
Nachweis einer Kombination von Oberflächenplasmonresonanz- und
Impedanzmessungen durchführt, so wie je eine Vorrichtung welche zur Durchführung
dieses Verfahrens geeignet ist.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können zum Beispiel biomolekulare
Wechselwirkungen, Reaktionskinetiken und Adsorptionsvorgänge untersucht
werden, aber auch Analyten qualitativ oder/und quantitativ bestimmt werden. Als
Festphase wird für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt ein optisch
durchlässiger Träger, der mit einer Metall oder Metall/Metalloxidschicht überzogen
ist, verwendet.
Der optisch durchlässige Träger beispielsweise aus Glas oder Quarzglas, kann
hierzu zum Beispiel mit einer relativ duennen Metall oder Metall/Metalloxidschicht
bedampft werden. Die Metall/Metalloxidschicht besteht dabei bevorzugt aus einer
Metallschicht welche zuerst auf dem optisch durchlässigen Träger aufgedampft wird
und einer Metalloxidschicht, welche anschließend auf die Metallschicht aufgebracht
wird. Die Dicke der Schicht beträgt bevorzugt zwischen 10 nm und 100 nm. Falls der
Träger mit einer Metallschicht bedampft wird, verwendet man bevorzugt Aluminum,
Gold und Silber. Auch eine simultane Messung von Oberflächenplasmonresonanz
und Fluoreszenzdetekion ist bekannt (Patenanmeldung EP 0 872 733 A1).
Impedanzmessungen können auf Metallschichten für Oberflächenplasmon
resonanzmessungen oder auf einer hiervon separaten Metallschicht durchgeführt
werden; in diesem Fall wird die Metallschicht mittels Bedämpfung durch eine Maske
auf die Oberfläche aufgetragen.
Durch die Verwendung entsprechender Vorrichtungen und Detektion über Scanner
oder CCD-Kameras kann das Verfahren als Kombination von
Oberflächemplasmonresonanzspektroskopie (Nature, 332 (1988) 615) und
Impedanzmessungen mit Elektrodenarrays durchgeführt werden. Ein solches
Verfahren ermöglicht auch die Analyse von Arraystrukturen, d. h. von mehreren
nebeneinander angeordneten Reaktionsflächen auf der Festphase. Eine solche
Arraystruktur kann zum simultanen Nachweis mehrerer Analyten in einer Probe
oder/und zur simultanen Bestimmung mehrerer Proben eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Nachweis eines an
eine Festphase gebundenen Analyten, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß sie
Mittel zur Messung der Oberflächenplasmonresonanz und der Elektrodenimpedanz
und zur unabhängigen Auswertung der Signale aus der
Oberflächenplasmonresonanz- und der Impedanzmessung umfasst. Bevorzugt
umfasst eine solche Vorrichtung einen Laser als Lichtquelle, einen optisch
durchlässigen Träger, der mit einer Metallschicht überzogen ist, als Festphase, eine
Photodiode zur Detektion der Oberflächenplasmonresonanz und ein
Impedanzanalysator, bevorzugt Generator und Lock-in-Verstärker zur
Impedanzmessung.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer solchen Vorrichtung
zum Nachweis eines an einer Festphase gebundenen Analyten, zum Beispiel zur
Durchführung von Immunoassays, Nukleinsäurehybridisierungsassays,
Bindungsassays zum Hochdurchsatzscreening pharmakologisch wirksamer
Substanzen und Einsatzzwecken in der Proteomik. Die Erfindung wird durch die
beigefügten Zeichnungen und die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
Fig. 1 zeigt den experimentellen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 2 zeigt die räumliche Struktur der Goldschicht zu gleichzeitigen Oberflächen
plasmonresonanz- und Impedanzmessungen auf separaten Teilen der
Schicht.
Fig. 3 zeigt die zeitabhängige Änderung der Kapazität (C) und des Oberflächen
plasmonresonanzwinkels während des Bindungsvorgang des Rinder
serumalbumin an die Goldoberfläche.
Der Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist schematisch in Fig. 1
dargestellt.
Der Teil der Vorrichtung für die SPR-Messungen besteht aus einer Laserdiode
(λ = 670 nm) (1), einem Prisma (2), einem Goniometer (3), einer Photodiode (4),
einem Generator (5), einem Stromverstärker (6), einem Lock-in-Verstärker (7), und
einem durch einen Computer (12) gesteuerten Schrittmotor (8). Der Teil der
Vorrichtung für Impedanzmessungen besteht aus einem Sinusgenerator (9), einem
Spannungsgeber (8), einem Stromverstärker (10) und einem Lock-in-Verstärker (11).
Die selektive Schicht auf dem goldbeschichtetem Prisma ist mit (13) bezeichnet. Für
die Impedanzmessungen verwendet man eine Ag/AgCl-Elektrode (14).
Entsprechende Hard- und Software (12) zur Steuerung und Auswertung der
Messergebnisse ergänzen das Gerät. Der in Fig. 1 dargestellte Aufbau ermöglicht
die simultane, zeitabhängige Messung der Resonanzwinkel und der Impedanz.
Fig. 2 zeigt die räumliche Struktur der Goldschicht zu gleichzeitigen Oberflächen
plasmonresonanz- und Impedanzmessungen auf separaten Teilen der Schicht.
Die Fläche (2) mit dem Anschluß (5) wird für die SPR-Messungen verwendet, die
Flächen (3) mit Anschlüssen (4) für Impedanzmessungen. Der Anschluß (5) kann
dafür hergenommen werden, um ein definiertes Potential auf der Goldoberfläche für
die SPR-Messungen zu halten. Um die Impedanzmessungen nicht zu beeinflussen
kann man Anschluß (5) durch einen großen Wiederstand mit Anschluß (4) verbinden.
Fig. 3 zeigt die zeitabhängige Änderung der Kapazität (C) und des Oberflächen
plasmonresonanzwinkels während des Bindungsvorgang des Rinder-serumalbumin
an die Goldoberfläche. Experimentelle Bedingungen: Referenzelektrode: Ag/AgCl,
Elektrolyt 5 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl, pH 7,4, 22°C. Konzentration der
Protein: 200 µg/mL.
Ein Glasträger mit Brechungsindex 1,61, einer Fläche von 22 mm × 22 mm und einer
Dicke von 1 mm wird in eine heiße 3 : 1 (v/v) Mischung aus konzentrierter
Schwefelsäure und 30%iger Wasserstoffperoxidlösung für 5 Minuten eingetaucht,
gründlich mit destilliertem Wasser gespült und getrocknet.
Schließlich wird in einer Hochvakuum-Beschichtungsanlage eine 5 nm dicke
Chromschicht und eine 45 nm dicke Goldschicht durch eine spezielle Maske (Fig. 2)
aufgedampft. Die größere Fläche der Goldschicht (Fig. 2) wird für Oberflächen
plasmonresonanzmessungen benutzt, die kleinere für Impedanzmessungen.
Oberflächenplasmonresonanzmessungen werden mittels Oberflächenplasmon
resonanzspektrometern BIOSUPLAR-2 (Firma Analytical µ-Systems, Regensburg)
durchgeführt. Impedanzmessungen werden mit Lock-in-Verstärker (EG & G PAR,
Model 5209, USA) und dessen Generator durchgeführt.
Die zeitabhängige Änderung der Kapazität (C) und des
Oberflächenplasmonresonanzwinkels während des Bindungsvorgang des
Rinderserumalbumin an die Goldoberfläche sind in Bild 3 dargestellt. Die Kurven
wurden für maximale Werte normalisiert. Experimentelle Bedingungen:
Referenzelektrode: Ag/AgCl, Elektrolyt 5 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl, pH 7,4,
22°C. Konzentration der Protein: 200 µg/mL.
Claims (16)
1. Verfahren zum Nachweis eines Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß man die
Bindung des Analyten an eine Festphase durch unabhängige Auswertung der
Signale aus einer Plasmonenresonanz- und einer Impedanzmessung erhält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen optisch
durchlässigen Träger, der mit einer Metall- oder Metall/Metalloxidschicht überzogen
ist, als Festphase verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger
verwendet, der mit einer Metallschicht überzogen ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger
verwendet, der mit einer Silber-, Aluminium- oder Goldschicht überzogen ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß der Analyt über eine Festphasenbindematrix mit der Festphase verknüpft wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die
Festphasenbindematrix eine selbstassemblierende Monoschicht umfaßt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Lichtquelle für die Oberflächenplasmonenresonanz einen Laser
einsetzt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß die Messzelle zwei oder mehr Elektroden für Impedanzmessungen besitzt. Das
Messystem enthält elektronische Komponenten für die Impedanzanalyse.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß zur Auswertung die Signale aus einer Plasmonenresonanzmikroskopie- und
einer Impedanzmessung verwendet werden.
10. Vorrichtung zum Nachweis eines an eine Festphase gebundenen Analyten,
dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung Mittel zur Messung der
Oberflächenplasmonenresonanz und der Impedanz und zur unabhängigen
Auswertung der Signale aus der Plasmonenresonanz- und der Impedanzmessung
umfaßt.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Laser als
Lichtquelle, einen Polarisator, einen optisch durchlässigen Träger, der mit einer
Metall- und Metall/Metalloxidschicht überzogen ist, als Festphase, eine Photodiode
zur Detektion der Plasmonenresonanz und mindestens zwei Elektroden für die
Messung der Impedanz umfasst.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel zur
Durchführung einer Oberflächenplasmonenresonanzmikroskopie- und einer
Impedanzmessung und zur unabhängigen Auswertung der Signale aus der
Oberflächenplasmonenresonanzmikroskopie- und der Impedanzmessung umfaßt.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die Messzelle auch eine oder mehrere der folgenden Komponenten umfasst:
Komponenten für Fluoreszenzmessungen
Elektroden für amperometrische Messungen
Elektroden für potenziometrische Messungen
Thermosensoren
ionenselektive Elektroden
Sensoren auf Basis oberflächenakkustischer Wellen
Komponenten für Fluoreszenzmessungen
Elektroden für amperometrische Messungen
Elektroden für potenziometrische Messungen
Thermosensoren
ionenselektive Elektroden
Sensoren auf Basis oberflächenakkustischer Wellen
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß
die Festphase einen Träger umfaßt, welcher flächig mit einer Metall- oder
Metall/Metalloxidschicht überzogen ist, auf der mehrere räumlich definierte
Reagenzspots angeordnet sind, die unterschiedliche Festphasenreaktanten oder/und
einen Festphasenreaktanten in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten.
15. Anordnung welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aus einer Vielzahl eng
bei einander liegender Vorrichtungen nach einem oder mehreren der Ansprüche 10
bis 14 besteht.
16. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15 zum
Nachweis eines oder mehreren an eine Festphase gebundenen Analyten.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10054351A DE10054351A1 (de) | 2000-11-02 | 2000-11-02 | Methoden zur gleichzeitigen Bestimmung von biomolekularen Wechselwirkungen mittels Oberflächenplasmonresonanz und Impedanzmessung |
Applications Claiming Priority (1)
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DE10054351A DE10054351A1 (de) | 2000-11-02 | 2000-11-02 | Methoden zur gleichzeitigen Bestimmung von biomolekularen Wechselwirkungen mittels Oberflächenplasmonresonanz und Impedanzmessung |
Publications (1)
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DE10054351A1 true DE10054351A1 (de) | 2002-05-16 |
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ID=7661934
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE10054351A Withdrawn DE10054351A1 (de) | 2000-11-02 | 2000-11-02 | Methoden zur gleichzeitigen Bestimmung von biomolekularen Wechselwirkungen mittels Oberflächenplasmonresonanz und Impedanzmessung |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE10054351A1 (de) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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- 2000-11-02 DE DE10054351A patent/DE10054351A1/de not_active Withdrawn
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